Nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học xử lý mùi hôi chuồng trại phục vụ xây dựng mô hình đệm lót sinh học cho chăn nuôi heo

SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN TP HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC XỬ LÝ MÙI HÔI CHUỒNG TRẠI, PHỤC VỤ CHO VIỆC XÂY DỰNG MƠ HÌNH ĐỆM LĨT SINH HỌC CHO CHĂN NUÔI HEO Mã số: MT01/14-15 Chủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Thị Dung Cán thực hiện: ThS Nguyễn Đặng Hải Đăng KS Nguyễn Mạnh Tùng TP Hồ Chí Minh, tháng 03 năm 2016 MỤC LỤC TÓM TẮT I THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI II NỘI DUNG KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI Đặt vấn đề 2.Ý nghĩa tính khoa học thực tiễn III TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3.1 Chất thải chăn nuôi 3.2 Thành phần chất thải chăn nuôi 3.3.Cơ chế gây mùi hôi chăn nuôi 3.3 Chăn ni đệm lót sinh học 11 3.4 Tổng quan vi sinh vật sử dụng chế phẩm 13 3.4.1 Vi khuẩn Bacillus 13 3.4.2.Nấm men Sacharomyces cerevisiae 14 3.4.3 Xạ khuẩn Streptomyces 15 3.5 Cơ chế phân hủy chất thải chăn nuôi 16 3.6 Tình hình nghiên cứu ứng dụng chế phẩm sinh học nước giới 16 3.6.1 Ở nước 16 3.6.2 Ở nước 17 III NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 18 IV VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 1.VẬT LIỆU 19 2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1.Khảo sát sơ đánh giá nhu cầu sử dụng chế phẩm sinh học để hướng đến sản xuất thử nghiệm 19 2.2.1 Phân lập vi khuẩnBacillusspp xạ khuẩn Streptomyces spp 23 2.2.2.Kiểm tra hoạt tính chủng nghi ngờ Bacillus 23 2.2.3 Phương pháp thử khả đối kháng với vi khuẩn E.coli, Salmonella 23 2.2.4 Phương pháp định tính khả thủy phân enzyme cellulose 23 2.2.5.Kiểm tra hoạt tính chủng nghi ngờ xạ khuẩn 23 2.2.6 Phân lập nấm men 24 2.2.7.Kiểm tra hoạt tính chủng nghi ngờ nấm men 25 2.3.Định danh phương pháp PCR (polymerase chain reaction) 26 2.4 Khảo sát môi trường lên men nguyên liệu rẻ hướng tới quy mô sản xuất công nghiệp 26 Khảo sát nhiệt độ, thời gian lên men tối ưu chủng VSV 26 2.6 Nghiên cứu lựa chọn tỉ lệ chất mang để sản xuất chế phẩm dạng bột 27 2.7 Thử nghiệm chế phẩm sinh học nên đệm lót chăn ni heo,đánh giá hiệu chế phẩm 27 2.7.1 Phương pháp làm đệm lót sinh học 27 2.7.2 Phương pháp đánh giá hiệu chế phẩm 29 2.8 Phương pháp xử lý số liệu 30 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 Kết khảo sát, đánh giá nhu cầu sử dụng chế phẩm sinh học để hướng đến sản xuất thử nghiệm 30 1.1 Thơng tin chung tình hình chăn ni heo Huyện Củ Chi, TP.HCM 30 1.2 Nhu cầu cần thiết sử dụng chế phẩm sinh học xử lý mùi hôi chuồng trại chăn nuôi 32 2.Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật 32 2.1 Kết phân lập vi khuẩnBacillusspp 32 2.2.Thử nghiệm sinh hóa chủng nghi ngờ Bacillus 34 2.3 Kết kiểm tra khả đối kháng với vi khuẩn E.coli, Salmonella 35 2.4 Khả thủy phân cellulose chủng nghi ngờ Bacillus 36 2.5 Kết phân lập xạ khuẩn Streptomyces 37 2.6.Khả sinh enzyme ngoại bào(hoạt tính protease) 39 2.7 Khả thủy phân cellulose chủng nghi ngờ xạ khuẩn 41 2.8 Khả đồng hóa sử dụng nguồn Carbon 42 2.9 Kết phân lập nấm men 42 2.10 Hình thức nảy chồi nhóm nấm men 46 2.11 Khả tạo bào tử môi trường nghèo dinh dưỡng 46 2.12 Khả lên men đường Saccharose 47 Kết định danh giải trình tự 47 Khảo sát môi trường lên men VSV nguyên liệu phổ thông hướng tới quy mô sản suất công nghiệp 51 4.1 Kết thử nghiệm môi trường lên men Bacillus 51 4.2 Kết thử nghiệm môi trường lên men Saccaromyces cerevisiae 51 Kết khảo sát nhiệt độ, thời gian lên men tối ưu chủng VSV 52 Nghiên cứu lựa chọn tỉ lệ chất mang để sản xuất chế phẩm dạng bột 53 Quy trình tạo chế phẩm 53 Thử nghiệm đánh giá hiệu chế phẩm sinh học qua mơ hình đệm lót sinh học cho chăn nuôi heo 56 8.1 Kết xác định tiêu chất lượng đệm lót 56 8.2 Kết xác định tiêu khí thải chuồng ni heo 57 8.3 Hiệu kinh tế sau trình ni heo 58 Tính tốn sơ giá thành sản phẩm chế phẩm sinh học xử lý mùi hôi 60 V SẢN PHẨM, KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC CỦA ĐỀ TÀI 63 VI KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 63 Kết luận 63 Đề nghị 64 VII TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 Tài liệu tiếng Việt 65 Tài liệu tiếng Anh 66 PHỤ LỤC 68 DANH SÁCH BẢNG Bảng Lượng phân nước tiểu vật nuôi thải ngày đêm Bảng Một số tiêu nước thải chăn nuôi heo Bảng Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu chế phẩm 29 Bảng Một số đặc tính dịng phân lập 33 Bảng Một số kết thử nghiệm sinh hóa chủng nghi ngờ Bacillus .35 Bảng Một số đặc tính chủng xạ khuẩn phân lập 37 Bảng Kết khả đồng hóa sử dụng nguồn carbon 42 Bảng Một số đặc tính chủng nấm men phân lập 42 Bảng Kết giải trình tự so sánh Genbank 50 Bảng 10 Một số kết tiêu chất lượng đệm lót chăn ni heo 53 Bảng 11 Kết khảo sát nhiễm khuẩn chuồng nuôi 57 Bảng 12 Chỉ tiêu kinh tế đạt trình thử nghiệm 59 DANH SÁCH HÌNH Hình Yếu tố ảnh hưởng đến phát tán khí 10 Hình Mơ hình đệm lót tham khảo 12 Hình Hình dạng bào tử Bacillus kính hiển vi hình ảnh nhuộm Gram 14 Hình Tế bào nấm men Sacharomyces cerevisiae kính hiên vi 15 Hình Hình ảnh xạ khuẩn Streptomyces 16 Hình 6: Ví dụ thủy phân hợp chất hữu chất thải chăn ni 17 Hình : Bản đồ hành huyện Củ Chi, TP Hồ Chí Minh 21 Hình Bản đồ hành T Đồng Tháp 22 Hình 9: Các mẫu phân lập thu từ đợt khảo sát 22 Hình 10 Thu thập thơng tin từ hộ dân cán địa phương 31 Hình 11 Tham quan mơ hình đệm lót sinh học thí điểm địa phương 32 Hình 12 Đặc điểm khuẩn lạc hình thái nhuộm Gram chủng Bacillus 34 Hình 13 Kết kiểm tra khả đối kháng với vi khuẩn E.coli, Salmonella 36 Hình 14 Hoạt tính phân giải cellulose Bacillus 36 Hình 15: Vịng phân giải cellulose chủng Bacillus 37 Hình16.Hình dạng khuẩn lạc hình dạng tế bào chủng xạ khuẩn phân lập 38 Hình 17 Các chủng xạ khuẩn từ ngân hàng giống VSV, Trung tâm Cơng Nghệ Sinh học 39 Hình18 Vịng phân giải mơi trường casein ( hoạt tính protease) 40 Hình 19 Hoạt tính phân giải protease chủng xạ khuẩn 40 Hình20 Khả thủy phân cellulose chủng nghi ngờ xạ khuẩn 41 Hình 21 Hoạt tính phân giải cellulose chủng xạ khuẩn 41 Hình 22 Hình dạng tế bào nhóm nấm men 45 Hình 23 Hình dạng nảy chồi nhóm nấm men 46 Hình 24 Hình dạng bào tử nhóm nấm men 46 Hình 25 Khả lên men đường dòng nấm men 47 Hình 26.Mật độ Bacillus khảo sát môi trường lên men 51 Hình 27 Mật độ nấm men khảo sát môi trường 52 Hình 28 Ảnh hưởng nhiệt độ, thời gian đến sinh trưởng VSV 53 Hình 29 Mật độ VSV cơng thức thí nghiệm 54 Hình 30 Sơ đồ quy trình tạo chế phẩm 55 Hình 31 Kết đo khí NH3, H2S 61 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VSV: vi sinh vật TN: Thí nghiệm BOD : Nhu cầu oxy hóa sinh học COD: Nhu cầu oxy hóa hóa học SS: Chất rắn lơ lửng FAO: Tổ chức lương thực nông nghiệp Liên hiệp quốc WHO: Tổ chức y tế giời CFU: Colony form unit TSA: Môi trường Tryptic Soy Agar ĐC: Đối chứng PCR: Polymerase chain reaction TCVN: Tiêu chuẩn Việt nam TĨM TẮT Chăn ni xác định ngành Nhà nước quan tâm trọng Tuy nhiên ngành chăn nuôi lại nảy sinh nhiều vấn đề chất lượng môi trường Mùi hôi từ lượng chất thải chăn nuôi thải nguyên nhân chủ yếu gây nhiễm Do vậy, giải tốn nhiễm môi trường hoạt động chăn nuôi theo hướng sinh học thách thức cao hướng tới ngành chăn nuôi “xanh”, phát triển bền vững Để tài nghiên cứu hướng đến tạo chế phẩm xử lý mùi hôi chuồng trại chăn nuôi heo từ chủng vi sinh có ích Đầu tiên nhóm nghiên cứu khảo sát sơ tình hình chăn ni heo huyện Củ Chi- thành phố Hồ Chí Minh, thực tế tình hình nhiễm chăn ni heo gây Đồng Tháp, khảo sát nhu cầu sử dụng chế phẩm xử lý mùi hôi người chăn nuôi, tiếp cận mơ hình đệm lót chăn ni heo hộ chăn nuôi Phân lập chủng vi sinh vật bao gồm: chủng Streptomycesspp, Sacharomyces cerevisiae, Bacillusspp.có tiềm ứng dụng cao việc phân giải nhanh chất hữu phức tạp (protein, cellulose) chất thải chăn nuôi, đối kháng với vi sinh vật gây bệnh, từ giảm mùi chăn ni gây Nhóm nghiên cứu, khảo sát môi trường, nhiệt độ, thời gian tối ưu lên men chủng VSV, kết Bacillus spp lên men môi trường B2,nhiệt độ 37oC, thời gian 48h, Streptomyces spp lên men môi trường Gause II, nhiệt độ 28oC, thời gian 72h, Sacharomyces spp lên men môi trường Y2, nhiệt độ 28oC thời gian 48h.Nhóm tiến hành nghiên cứu lựa chọn chất mang tỉ lệ phối trộn chất mang phù hợp nhằm xác định công thức tối ưu cho quy trình sản xuất chế phẩm Kết chất mang có cơng thức 20% mụn dừa : 30% bột bắp : 50% cám gạo công thức tối ưu (mật độ vi sinh vật đạt >107cfu/g) Đã thử nghiệm hiệu xử lý mùi hôi chế phẩm nghiên cứu đệm lót chăn nuôi heo, kết thu cho thấy nồng độ NH3, H2S :0.45 mg/m3,0.3mg/m3 mơ hình không sử dụng chế phẩm cao lần so với mơ hình thí nghiệm (có sử dụng chế phẩm):0.2mg/m3, 0.11mg/m3 vượt ngưỡng giới hạn cho phép nồng độ khí thải (TCVN 5938-2005) Như việc ứng dụng chế phẩm vi sinh cho chăn nuôi có tác dụng cải thiện tốt mơi trường, giảm mùi chuồng ni, góp phần bảo vệ sức khỏe người chăn ni vật ni I THƠNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI Tên đề tài:“Nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học xử lý mùi hôi chuồng trại, phục vụ cho việc xây dựng mơ hình đệm lót sinh học cho chăn ni heo” Cơ quan quản lý: Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM Đơn chủ trì:Tổ CNSH Mơi trường - Thực phẩm – Trung Tâm Công nghệ Sinh học TP HCM Chủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Thị Dung Cán bộ/Nhóm thực hiện: ThS Nguyễn Đặng Hải Đăng, KS Nguyễn Mạnh Tùng Thời gian thực hiện: 24 tháng ( từ 1/2014-12/2015) Kinh phí duyệt: 350.000.000 đồng 8.Kinh phí sử dụng:374.002.249 VNĐ Các nội dung nghiên cứu thực so với đề cương đăng ký Thời gian Đánh giá SST Nội dung đăng ký (bắt đầu – kết thúc) Khảo sát, đánh giá nhu cầu sử dụng chế phẩm sinh học để hướng đến sản xuất thử nghiệm 3-6/2014 Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật phân giải chất thải chăn nuôi, hạn chế mùi hôi chăn nuôi gây 4-12/2014 Đã thu mẫu phân lập Đạt chủng Bacillus, chủng xạ khuẩn, chủng nấm men, giải trình tự chủng Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm 10/20144/2015 Đã nghiên cứu khảo sát điều kiện Đạt nhiệt độ, thời gian lên men thích hợp cho chủng VSV Kết thực Đã khảo sát thực tế tình hình Đạt chăn nuôi heo H Củ Chi, khảo sát nhu cầu sử dụng chế phẩm sinh học bà nông dân Tham quan mơ hình đệm lót sinh học Đồng Tháp, TP HCM, tiếp cận chủ hộ chăn ni để hiểu rõ ưu nhược điểm hình thức chăn nuôi Đã nghiên cứu khảo sát môi trường lên men nguyên liệu Kết PCR: Phụ lục :Kết giải trình tự CHO2( Bacillus AMYLO) AGGGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCC TAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTG TTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCC TTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAA TTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGG TTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTA CGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTG GCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCGCCCTAT TTGAACGGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTT CATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCC CTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCG ATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCAC CAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCT 70 TTTATGTCTGAACCATGCGGTTCAAACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTC CCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCC GCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTTGCATGTATT AGGCACGCCGCCAG Dt07 (Bacillus SUB) TGTCCACCTTCGGCGGCTGGCTCCTAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGT TACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATT CACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCG AGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACC TCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGG TCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCAC CGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGT TGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAA CCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATT GTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACC ACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTT GCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGG GGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAG GGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAG ACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCAC CGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCC AATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCG CCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTAT TACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCA AGGTGCCGCCCTATTTGAACGGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTAC GATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCA TTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAG TCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTG AGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGT AGCCGAAGCCACCTTTTATGTCTGAACCATGCGGTTCAAACAACCATCCGGT ATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGT GTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCT CGACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGT CH03((Bacillus amyloliquefaciens) TCCCACCTTCGGCGGCTGGCTCCTAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTT ACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTC ACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGA GTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCT CGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGT CATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACC GGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTT 71 GCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAAC CATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTG TCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCA CATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTG CGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGG GCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGG GTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGA CCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACC GCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCA ATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGC CTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATT ACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAA GGTGCCGCCCTATTTGAACGGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACG ATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCAT TGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGT CCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGA GCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTA GCCGAAGCCACCTTTTATGTCTGAACCATGCGGTTCAAACAACCATCCGGTAT TAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGT TACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCG ACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGGTC DH02 (Bacillus subtilis) CCCATCATCTGTCCACCTTCGGCGGCTGGCTCCTAAAAGGTTACCTCACCGGA CTTCGGGTGTTACAAACTCTCCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCC GGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTT CACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGAT TGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTG TAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCCACCTTCCTCC GGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAA GATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAG CTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTA TCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTT CGAATTAAACCCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTG AGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCT GCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAAACACTTAGCACTCATCGTTTACGG CGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCA GCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCT CTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAG TTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGA CTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCCAATAATTCCGGACAACGCT TGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTG GTTAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAA 72 CAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGT CAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCT GGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGC ATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTC CATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTTTGAACCATGCGGTTCAA ACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGC AGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCT CCCATCTGTCCGCTCGACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCG ST02 AGGGGTTGGGCCACCGGCTTCGGGTGTTACCGACTTTCGTGACGTGACGGGC GGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCAATGCTGATCTGCGAT TACTAGCGACTCCGACTTCATGGGGTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGAACTG AGACCGGCTTTTTGAGATTCGCTCCACCTCGCGGTATCGCAGCTCATTGTACC GGCCATTGTAGCACGTGTGCAGCCCAAGACATAAGGGGCATGATGACTTGAC GTCGTCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCGGTCTCCCGTGAGTCCCCAG CACCACAAGGGCCTGCTGGCAACACGGGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGA CTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGTA CACCGACCACAAGGGGGCGCCTGTCTCCAGACGTTTCCGGTGTATGTCAAGC CTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCGTCGAATTAAGCCACATGCTCCGCCGCTTG TGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAG GCGGGGCACTTAATGCGTTAGCTGCGGCACGGACAACGTGGAATGTTGCCCA CACCTAGTGCCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTC GCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTATCGGCCCAGAGATCCGCCTTC GCCACCGGTGTTCCTCCTGATATCTGCGCATTTCACCGCTACACCAGGAATTC CGATCTCCCCTACCGAACTCTAGCCTGCCCGTATCGACTGCAGACCCGGGGTT AAGCCCCGGGCTTTCACAACCGACGTGACAAGCCGCCTACGAGCTCTTTACG CCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCGCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGC ACGTAGTTAGCCGGCGCTTCTTCTGCAGGTACCGTCACTTTCGCTTCTTCCCTG CTGAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGC ATCAGGCTTTCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT CTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGGTCGCCCTCTCAGGCCGGCTACC CGTCGTCGCCTTGGTGAGCCACTACCTCACCAACAAGCTGATAGGCCGCGGG CTCATCCTGCACCGCCGGAGCTTTACACCATCCACCATGCGATGGACAGTCAT ATCCGGTATTAGACCCCGTTTCCAGGGCTTGTCCCAGAGTGCAGGGCAGATT GCCCACGTGTTACTCACCCGTTCGCCACTAATCCCCGCCCGAAAGCGGTTCAT CGTTCGACTTGCA SD3 TTAAGATTTGCGCTTTGCCAACTGTACACCCAACCTCGGTTTATTGTCGAACC TCCCGCTTGTGCCGCCATCTGCATATAGATCCCGGTCAGTCCGTCACATTCTG CCAATTGAGTATCCTCGAAGTCTTATTCCACGTGCTCAAAGCAAGGGTATCGT ACAGTGATAACCGCCTCGTGCAGATCCAAATTCTCGATTAACACTCAAGTACT 73 GATTTTTATCATCAGGTAACTAAAAACTCACAATTTGAAGCACCAGCGAGAA TCGTTCTATTCTCTAGCTTCGCAACATCGACAGTTGTAATGGCATAACTTCGG CATTCATAGTGGCTGAGTTTAGCGGACTAAGCGAAAAACTGGTCGTTAGATC TTCCTCACCATGATTTTACAAGAAAGGTGAACTCAATTTGACGGCGGTAAAG TTAGATGGCTACGCGCGACAAGTCTCCGTATCGTCATGAAATTAGCGAAGAG GTAATGGCAAAGCTTGGCTACGAATACAGGAGCGCGCTGTGATTACAGTAGG GTTAGGATAGCGAAAACGTTCAACGTGGATAGACTCTTATCGGCACACGATC ATATGCTTCCAAGGTTCCCAAGGCGAATTACTAGGGTGCACAGAGCTACGAG TACGCTGTCCGGCTTGATTCGCTCGTACATCCACTGTTCAAAAAGCTCCGATA CCGACGATCACTCTCGATCTCTGTGTGGGACGCACTTATTGTGGAATCAGTCA ACCAGTGAAGCATTCACATGTACGTGGTACGGCACGCCGTGGTATGTTAGCG TTCCCTGCGCCGCAAGTAAACCCTTCAGCTGTCACCTCCTATAGTAACACGCT CGCATGCAGAGCCTAGCACCTTAGCTCTGAGTTGCCTGCCGGAAGGATATAT TCTGTATGTGATTAAAGCGAAGTCAAAGTAAACCCCCCACATGCAGACCTGG GTAAATTCTCACTCAGTTGAAACGTAGGGGCCAATACGTGTGTCCTTGATACT ACT M5( Sacharomyces cereivea) GGATTTGAGGTCAACTTTAAGACATTGTTCGCCTAGACGCTCTCTTCTTATCG ATAACGTTCCAATACGCTCAGTATAAAAAAGATTAGCCGCAGTTGGTAAAAC CTAAAACGACCGTACTTGCATTATACCTCAAGCACGCAGAGAAACCTCTCTTT GGAAAAAAAAAACATCCAATGAAAAGGCCAGCAATTTCAAGTTAACTCCAA AAAGTATCACTCACTACCAAACAAAATGTTTGAAAAGGAAATGACGCTCAAA CAGGCATGCCCCCTGGAATACCAAGGGGCGCAATGGGCGTTCAAAGATTCGA TGATTCACGGAATTCTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTC ATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTTAATATTTTAAAAT TTCCAGTTACGAAAATTCTTGTTTTTGACAAAAATTTAATGGAATAGATAAAA TTGTTTGGGTTTGTTAACCTCTGGGCCCCGATTGCTCGAATGCCCAAAGAAAA AGTTGCAAAGATATGAAAACTCCACAGTGTGTTGTATTGAAACGGTTTTAATT GTCCTATAACAAAAGCACAGAAATCTCTCACCGTTTGGAATAGCAAGAAAGA AACTTACAAGCCCTAGCAAGACCCGCGCACTTTAAGCGCAGGCCCGGCTGGA CTCTCCATCTCTTGTCTTCTTGCCCAGTAAAAGCTCTCATGCTCTTGCCAAAAC M4(Sacharomyces cereivea) GGGTCTCTCGTAGAGTTGACCTGCGGAAGGATCATTTAAAGAAATTTTATAAT TTTGAAAATGGATTTTTTTTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACT GGGCAAGAAGACAAGAGATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCG CGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGAT TTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTG GAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCC AGAGGTTAACAAACACAAACAATTTTATCTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAA CAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGG 74 ATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATG TGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCT TGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCT GTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTC ATTGGATGTTTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAAT GCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTATACTG AGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAGAGCGTCTAGGCGAACAATGTTC TTAAAGTTGACCTCAAATCAAGGTTCGAAAGAACCCCCCAAAG Phụ lục: Các phản ửng test sinh hóa chủng Bacillus -Catalase Dùng que cấy nhặt vi khuẩn để lên lam kính, sau nhỏ lên vi khuẩn dung dịch H202 3% VK cho phản ứng catalase dương tính gây tượng sủi bọt Phản ứng Voges-proskauer (VP) Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 3ml môi trường MR-VP broth +1.5%NaCl trùng, ủ 30oC Sau 48h nhỏ 0.6ml thuốc thử A VÀ 0.2ml thuốc thử B vào ống nghiệm.Lắc đều, để ống nghiệm nghiêng khoảng 30 phút Phản ứng dương cho màu hồng - -Phản ứng tạo nitrite từ Nitrate Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 3ml môi trường Nitrate broth+1.5% NaCl trùng Ủ 30oC,sau 24h nhỏ ml thuốc thử C thêm 1ml thuốc thử D vào ống nghiệm, Phản ứng dương cho màu đỏ vòng 1-2 phút -Khả thủy phân Starch Cấy vi khuẩn lên môi trường gồm: Nutrient agar+0,5% starch+1,5%NaCl trùng Ủ 30oC , Sau nhỏ thuốc thử lugol iodine lên bề mặt Agar Trong khuảng thời gian 30 phút, xuất vòng rõ xung quanh chỗ vi khuẩn phát triển cho phản ứng dương, ngược lại -Khả thủy phân Gelatin Cấy vi khuẩn lên môi trường gồm: Nutrient agar+1% gelatin+1,5%NaCl trùng Ủ 30oC , Sau nhỏ thuốc thử HgCl2 (12g HgCl2+ 80ML nước cất, 16 ml HCl đậm đặc) lên bề mặt Agar Nếu xuất vòng rõ xung quanh chỗ vi khuẩn phát triển cho phản ứng dương, ngược lại -Khả phát triển vi khuẩn nhiệt độ 50oC, 60oC Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm môi trường TSB +1.5NaCl, Ủ nhiệt độ 50oC, 55oC, 60Oc, Làm ống chứng âm Sau 2-3 ngày quan sát độ đục, so với chứng âm, chứng tổ kết dương tính -Methyl red 75 Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm môi trường MR broth +1.5% NaCl, sau 2448h nhỏ giọt thuốc thử Methylred Nếu xuất màu đỏ, cho kết dương tính, màu vàng cho kết âm tính Phụ lục: Kết test sinh hóa chủng Bacillus\ a catalase c Thủy phân Gelatine d Thủy phân Starch b Phản ứng VP d Thủy phân Starch g.Metyl Red e Sinh trưởng nhiệt độ 55oC f Urease hóa h Nitrate hóa Phụ lục: Hình ảnh khả thủy phân tinh bột galetine chủng Bacillus Xử lý số liệu thủy phân xellulose chủng Bacillus 76 Xử lý số liệu thủy phân xellulose chủng xạ khuẩn streptomyces 77 Xử lý sộ liệu khảo sát môi trường lên men Bacillus 78 Xử lý sộ liệu khảo sát môi trường lên men nấm men Phụ lục : Khảo sát nhiệt độ lên men VSV 25 28 37 45 xạ khuẩn 2*106 1.2*108 5*106 1.5*106 vi khuẩn 1.2*107 1*108 1.15*109 4*107 79 nấm men 5*106 3.5*108 1.3*106 1*106 Khảo sát thời gian lên men giá trị Lga VSV 25 28 37 45 xạ khuẩn 6,30 8,08 6,70 6,18 vi khuẩn 7,08 8,00 9,06 7,60 nấm men 6,70 8,54 6,11 6,00 Phụ lục: Khảo sát thời gian lên men 24h 48h 72h 96h xạ khuẩn 1.3*106 1.6*107 4.3*108 5.8*10^5 vi khuẩn 1.6*108 5*109 3*107 1.2*107 nấm men 3*107 1.5*108 3.5*107 1.75*105 giá trị Lga 24 48 72 96 xạ khuẩn 6,11 7,20 8,63 5,76 vi khuẩn 8,20 9,70 7,48 7,08 nấm men 7,48 8,18 7,54 7,24 Xử lý số liệu nhiệt độ, ẩm độ đệm lót 80 ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ MỘT SỐ HÌNH ẢNH THỰ NGHIỆM Công tác thử nghiệm hiệu chế phẩm mơ hình đệm lót sinh học xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi 81 Bao bi sản phẩm thử nghiệm 82 Kết thử nghiệm sản xuất chế phẩm 83 84