Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa một số hợp chất để làm chất đối chiếu sử dụng trong kiểm nghiệm tạp chất liên quan của thuốc

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP.HCM TRUNG TÂM KHCN DƯỢC SÀI GÒN BÁO CÁO NGHIỆM THU NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HÓA MỘT SỐ HỢP CHẤT ĐỂ LÀM CHẤT ĐỐI CHIẾU SỬ DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM TẠP CHẤT LIÊN QUAN CỦA THUỐC Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Nguyễn Đức Tuấn Cán tham gia: TS Hà Diệu Ly ThS Trần Văn Mười Cơ quan chủ trì: TRUNG TÂM KHOA HỌC CƠNG NGHỆ DƯỢC SÀI GỊN Thành phố Hồ Chí Minh, tháng năm 2016 ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP.HCM TRUNG TÂM KHCN DƯỢC SÀI GÒN BÁO CÁO NGHIỆM THU NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HÓA MỘT SỐ HỢP CHẤT ĐỂ LÀM CHẤT ĐỐI CHIẾU SỬ DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM TẠP CHẤT LIÊN QUAN CỦA THUỐC CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI PGS.TS Nguyễn Đức Tuấn CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ GS.TS Lê Quan Nghiệm Thành phố Hồ Chí Minh, tháng năm 2016 i TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Tạp chất chất tạo thành trình sản xuất, bảo quản lưu thơng phân phối nguyên liệu thành phẩm Tạp chất làm ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm, tác động không nhỏ đến hiệu điều trị, làm thay đổi hiệu lâm sàng đặc tính an tồn thuốc gây tác dụng không mong muốn thuốc Nhiều chuyên luận hầu hết dược điển nước dược điển Việt Nam IV bắt buộc phải kiểm tra tạp chất nguyên liệu thành phẩm cephalexin, amlodipin, captopril, nifedipin, Trong đó, tạp chất chuẩn bán với giá đắt phải mua từ nước ngồi mà nhiều khơng có sẵn thị trường, gây khó khăn cho cơng tác kiểm nghiệm tốn nhiều chi phí phải mua tạp chuẩn từ nước ngoài, thời gian đặt hàng không chủ động công tác kiểm nghiệm Hiện nay, cơng trình nghiên cứu nước chưa sâu nghiên cứu tổng hợp chưa thiết lập chất đối chiếu tạp chất liên quan để kiểm nghiệm tạp chất dạng nguyên liệu thành phẩm Trong cơng trình nghiên cứu ngồi nước chủ yếu tổng hợp định lượng tạp chất chưa thiết lập chất đối chiếu để ứng dụng kiểm nghiệm tạp chất liên quan nguyên liệu thành phẩm Do đó, việc nghiên cứu điều chế tiêu chuẩn hóa số tạp chất hướng tới thiết lập chuẩn tạp làm tăng số lượng tạp chuẩn, góp phần thuận lợi cơng tác kiểm tra chất lượng thuốc, giúp giảm bớt chi phí mua tạp chuẩn từ nước ngồi Mục tiêu đề tài Điều chế tiêu chuẩn hóa tạp chất liên quan nhóm kháng sinh cephalosporin nhóm thuốc điều trị bệnh tim mạch dùng làm chất chuẩn đối chiếu để kiểm tra tạp chất liên quan nguyên liệu thành phẩm chứa hoạt chất tương ứng Phương pháp nghiên cứu - Xây dựng qui trình điều chế số tạp chất qui mơ phịng thí nghiệm - Tiêu chuẩn hóa tạp điều chế - Kiểm tra tạp chất liên quan nguyên liệu thành phẩm Kết nghiên cứu Đã điều chế thành công tạp chất captopril disulfid, 7-ADCA, D-phenylglycin, tạp D amlodipin, tạp A tạp B nifedipin dùng làm chất đối chiếu kiểm nghiệm - Captopril disulfid với độ tinh khiết 99,45%, hiệu suất điều chế khoảng 60,24% hiệu suất tinh chế 57,08% khối lượng sản phẩm 3,2 gam/lần điều chế ii - 7-ADCA với độ tinh khiết 99,90%, hiệu suất tổng hợp 31%, hiệu suất tinh chế chế 80% khối lượng sản phẩm 3,5 gam/lần điều chế - D-phenylglycin với độ tinh khiết 99,94%, hiệu suất tổng hợp 29%, hiệu suất tinh chế 40% khối lượng sản phẩm 1,2 gam/lần điều chế - Tạp D amlodipin với độ tinh khiết 99,92%, hiệu suất tổng hợp 42% , hiệu suất tinh chế 63,2% khối lượng sản phẩm gam/lần điều chế - Tạp A nifedipin với độ tinh khiết 99,56%, hiệu suất tổng hợp 89,92%, hiệu suất tinh chế 34,83% khối lượng sản phẩm 1,04 gam/lần điều chế - Tạp B nifedipin với độ tinh khiết 99,71%, hiệu suất tổng hợp 95,52%, hiệu suất tinh chế 76,79% khối lượng sản phẩm 1,74 gam/lần điều chế Đã xây dựng thẩm định đạt yêu cầu quy trình xác định độ tinh khiết captopril disulfid, 7-ADCA, D-phenylglycin, tạp D amlodipin, tạp A tạp B nifedipin phương pháp HPLC Đã xây dựng tiêu chuẩn sở tạp 7-ADCA, D-phenylglycin, captopril disulfid, tạp D amlodipin, tạp A tạp B nifedipin bao gồm tiêu tính chất, định tính, hàm ẩm, độ tinh khiết, mức chất lượng tiêu phương pháp thử Tất tạp thiết lập chất đối chiếu, đủ điều kiện để đăng ký chuẩn Dược điển Đã xây dựng thẩm định đạt yêu cầu quy trình định lượng captopril disulfid nguyên liệu thành phẩm captopril phương pháp HPLC Tất quy trình kiểm nghiệm tạp chất liên quan khảo sát tính phù hợp hệ thống đạt yêu cầu theo qui định theo Dược điển Việt Nam IV Bốn quy trình có giới hạn phát thấp mức chất lượng cho phép tạp chất liên quan theo Dược điển Việt Nam IV Đã ứng dụng quy trình để kiểm tra tạp chất captopril disulfid, 7-ADCA D-phenylglycin, tạp D amlodipin, tạp A tạp B nifedipin số nguyên liệu thành phẩm tương ứng thị trường iii SUMMARY INTRODUCTION Related compounds are unwanted chemicals present in the active pharmaceutical ingredients or finished pharmaceutical products These compounds arise from normal manufacture and during storage that has no therapeutic value and are potentially harmful Impurity profiling in drugs is a key challenge today and regulation requirements is tightening around this topic The use of modern analytical technologies has helped many pharmaceuticals address their challenges However, in Vietnam the impurities reference standards are costly with limited accessibility OBJECTIVES The aim of this study was to synthesize six related compounds that their presence have to be tested in several common drugs, including cephalexin, amlodipine, captopril, and nifedipine, then to establish these related compounds as reference standards, and finally to apply or develop HPLC methods for quantitative determination of these related impurities in pharmaceutical substances and products MATERIALS AND METHODS Six related compounds were chemically synthesized or prepared by using immobilized enzyme on calcium stearate The crude products were purified by column chromatography and recrystallization The synthetic or enzymatic-prepared products were elucidated by their IR, MS and NMR spectroscopic data Their purity was determined by HPLC using peak area normalization method and established as reference standards, based on ISO guide Finally, the assay of the related impurities in pharmaceutical substances and finished products were determined by HPLC methods, using the established reference standards RESULTS Six closely related compounds were successfully synthesized or prepared Their assigned value reached the purity over 99% With this, they were valuable for quality control of the related impurities In addition, the HPLC methods for assay of these impurities were applied or developed and validated according to International Conference on Harmonization (ICH) guidelines, providing application to quantitative determination of the related impurities in the active pharmaceutical ingredients and finished pharmaceutical products CONCLUSION Our results contribute to increase national list of impurities reference standards that helps the local pharmaceutical manufacturers to control related impurities in drugs iv MỤC LỤC Trang TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU i MỤC LỤC iv Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt vi Danh sách bảng viii Danh sách hình xvi Danh sách sơ đồ xix BÁO CÁO NGHIỆM THU xx CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1 Tổng quan vấn đề nghiên cứu Tính cần thiết đề tài 12 Đối tượng nghiên cứu 14 Ý nghĩa khoa học khả áp dụng thực tiễn đề tài 14 CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 15 Nội dung 1: Xây dựng qui trình điều chế số tạp chất qui mơ phịng thí nghiệm 15 Nội dung 2: Tiêu chuẩn hóa tạp điều chế 27 Nội dung 3: Kiểm tra tạp chất liên quan nguyên liệu thành phẩm 31 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 Nội dung 1: Xây dựng qui trình điều chế số tạp chất qui mơ phịng thí nghiệm 38 1.1 Xây dựng qui trình điều chế tạp acid (2S,2’S)-1,1’-[disulphanediylbis[(2S)-2-methyl-1-oxopropane -3,1-diyl]-bis[pyrrolidine-2-carboxylic] (captopril disulfid) 38 1.2 Xây dựng qui trình điều chế tạp acid 7- aminodesacetoxycephalosporanic (7-ADCA) tạp acid (2R)-2-amino-2-phenylacetic (D-phenylglycin) phương pháp thủy phân cephalexin sử dụng enzym PGA 45 v 1.3 Xây dựng qui trình điều chế tạp 3-ethyl 5-methyl 2-[(2-(amino)ethoxy)]-4-(2-chlorophenyl)-6-methylpyridine -3,5-dicarboxylate (tạp D amlodipin) 55 1.4 Xây dựng qui trình điều chế tạp A tạp B nifedipin 66 1.5 Hiệu suất khối lượng điều chế tạp 81 Nội dung 2: Tiêu chuẩn hóa tạp điều chế 81 2.1 Tiêu chuẩn hóa tạp captopril disulfid 82 2.2 Tiêu chuẩn hóa tạp 7-ADCA D-phenylglycin 85 2.3 Tiêu chuẩn hóa tạp D amlodipin 90 2.4 Tiêu chuẩn hóa tạp A tạp B nifedipin 93 Nội dung 3: Kiểm tra tạp chất liên quan nguyên liệu thành phẩm 100 3.1 Kiểm tra tạp chất liên quan captopril disulfid nguyên liệu thành phẩm chứa captopril 100 3.2 Kiểm tra tạp chất liên quan 7-ADCA D-phenylglycin nguyên liệu thành phẩm chứa cephalexin 107 3.3 Kiểm tra tạp chất liên quan D amlodipin nguyên liệu thành phẩm chứa amlodipin 111 3.4 Kiểm tra tạp A tạp B nifedipin nguyên liệu thành phẩm chứa nifedipin theo dược điển Việt Nam IV 115 3.5 Thảo luận 119 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 126 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC BÀI BÁO, LUẬN VĂN, HỌC PHẦN VÀ HỢP ĐỒNG CHUYỂN GIAO LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI PHỤ LỤC vi Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt ACN Acetonitril 7-ADCA 7-amino-3-desacetoxycephalosporanic acid As Asymmetric factor (Hệ số bất đối) BP British Pharmacopoeia (Dược điển Anh) CP Captopril CPDS Captopril disulfid d Đỉnh đôi DCM Diclorometan dd doublet of doublets (đỉnh đôi-đôi) DĐVN Dược điển Việt Nam DSC Differential Scanning Calorimetry (Nhiệt vi sai) dt doublet of triplets (đỉnh đôi-ba) EtOAc Ethyl acetat EP European Pharmacopeia (Dược điển Châu Âu) ) HPLC Năng suất quay cực đo 25 oC (hoặc 20 oC) High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) Hz Hertz IR Infrared (Hồng ngoại) LOD Limit of detection (Giới hạn phát hiện) LOQ Limit of quantitation (Giới hạn định lượng) M Phân tử lượng m Đỉnh bội MeOH Methanol MS Mass spectrum (Phổ khối) N Number of theoretical plates (Số đĩa lý thuyết) NMR Nuclear magnetic resonance (Cộng hưởng từ hạt nhân) PDA Photo Diode Array (Dãy diod quang) vii PGA Penicillin G acylase Phổ 1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Phổ 13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 ppm Part per million (phần triệu) PTN Phòng thí nghiệm q quadruplet (đỉnh bốn) Rs Resolution (Độ phân giải) RSD Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) S Peak area (Diện tích pic) s singlet (đỉnh đơn) SD Standard deviation (Độ lệch chuẩn) SKLM Sắc ký lớp mỏng S/N Signal/Noise (Tỷ số tín hiệu/nhiễu) t triplet (đỉnh ba) TB Trung bình TGA Thermo Gravimetric Analysis (Phân tích nhiệt trọng lượng) tR Retention time (Thời gian lưu) Ubb Độ không đảm bảo đo từ độ đồng lọ USP United States Pharmacopeia (Dược điển Mỹ) UV Ultraviolet (Tử ngoại) UV-Vis Ultraviolet-Visible (Tử ngoại – khả kiến) δC (δH) Độ dịch chuyển hóa học carbon (proton) viii Danh sách bảng Trang Bảng 1.1 Giá công bố số tạp chất số nhà sản xuất thị trường Bảng 2.1 Điều kiện sắc ký xác định độ tinh khiết tạp A tạp B nifedipin Bảng 3.1 Kết xác định nhiệt độ nóng chảy sản phẩm kết tinh captopril disulfid Bảng 3.2 Các đỉnh đặc trưng phổ IR sản phẩm tổng hợp captopril disulfid Bảng 3.3 Dữ liệu phổ NMR sản phẩm tổng hợp captopril disulfid theo Alan F Casy Bảng 3.4 Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống phương pháp xác định độ tinh khiết captopril disulfid Bảng 3.5 Kết khảo sát tính tuyến tính phương pháp xác định độ tinh khiết captopril disulfid giá trị thống kê Bảng 3.6 Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp xác định độ tinh khiết captopril disulfid Bảng 3.7 Kết khảo sát độ xác trung gian phương pháp xác định độ tinh khiết captopril disulfid Bảng 3.8 Khối lượng sản phẩm thô thu sau phản ứng thủy phân cephalexin với enzym Bảng 3.9 Dữ liệu phổ 1H NMR (500 MHz), 13 13 25 40 40 41 42 44 44 45 46 C NMR (125 MHz) chất A D2O & CF3COOD so với liệu phổ 1H NMR (500 MHz, D2O), 13C 48 NMR (125 MHz, D2O) D-phenylglycin Bảng 3.10 Dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO) 13 C-NMR (125 MHz, DMSO) chất B so với liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, D2O) 13C- 49 NMR (125 MHz, D2O) 7-ADCA Bảng 3.11 Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống phương pháp xác định độ tinh khiết D-phenylglycin 50 119 Hình 3.30 Sắc ký đồ mẫu thử kiểm tra tạp A tạp B nifedipin nguyên liệu nifedipin (lô 249) 3.5 Thảo luận 3.5.1 Điều chế tạp chất Tạp captopril disulfid Phương pháp tổng hợp captopril disulfid với H2O2 thực thành công khả oxy hóa oxy nguyên tử sinh từ H2O2 mạnh so với oxy khơng khí Phản ứng xảy tương đối chậm khơng có xúc tác kim loại Do sản phẩm phản ứng sinh nước nên captopril disulfid tủa dễ dàng sau tinh chế đạt độ tinh khiết cao, phù hợp với mục tiêu tạo sản phẩm làm chuẩn đồng thời hạn chế ô nhiễm môi trường Captopril disulfid chất tan nước dung môi hữu cloroform, diethyl ether, diclormethan tan methanol ethanol Vì methanol lựa chọn để hòa tan sản phẩm kết tinh lại mơi trường nước Ngồi methanol có nhiệt độ sơi thấp ethanol nên q trình kết tinh thuận lợi nhanh chóng Q trình tinh chế captopril disulfid phương pháp kết tinh nóng kết tinh nguội cho hiệu không khác biệt thời gian thực kết tinh nóng nhanh Tạp 7-ADCA D-phenylglycin Enzym penicillin G acylase xúc tác phản ứng tổng hợp cephalexin từ Dphenylglycin 7-ADCA Enzym tham gia q trình thủy giải nhóm Nacyl lại sản phẩm ban đầu Tuy nhiên, PGA có giá thành cao (4,1 triệu đồng/100mg) , khó bảo quản, vận chuyển tái sử dụng Một sản phẩm từ công nghệ enzym việc cố định hóa enzym phức hợp 120 polymer giúp giải trở ngại Do vậy, nhóm nghiên cứu sử dụng enzym penicillin G acylase cố định hóa chất polymer Kết cho thấy sản phẩm dễ tinh chế, có độ tinh khiết cao đáp ứng yêu cầu làm chất chuẩn Điểm quan trọng sau xúc tác phản ứng, tách loại enzym dễ dàng cách lọc thu hồi tái sử dụng nhiều lần không làm ảnh hưởng đến môi trường giá thành rẻ (1,5 triệu đồng/ 1kg) Đây điểm trội so với việc tổng hợp đường hóa học, đồng thời làm giảm giá thành sản phẩm tổng hợp Khi tiến hành kết tinh phân đoạn để thu sản phẩm, 7-ADCA có độ tan nước thấp nhiều so với D-phenylglycin nên pH môi trường điều chỉnh pH đẳng điện 7-ADCA trước (pH 4) để kết tủa 7-ADCA sau điều chỉnh pH đẳng điện D-phenylglycin (pH 6,5) để thu sản phẩm Dphenylglycin Kết cho thấy sản phẩm 7-ADCA có lẫn D-phenylglycin phần tạp loại bỏ dễ dàng thông qua kết tinh lại tiến hành HPLC điều chế Lượng sản phẩm D-phenylglycin thô thu thấp độ tinh khiết cao (98,3% tính theo phương pháp phần trăm diện tích pic) Nếu tiến hành điều chỉnh pH dịch phản ứng từ 6,5 để thu Dphenylglycin trước sản phẩm bị lẫn nhiều tạp 7-ADCA việc tinh chế gặp nhiều khó khăn, hiệu suất tinh chế thấp Cơ sở để chọn pH pha mẫu (7-ADCA pha đệm pH trước bổ sung vừa đủ đệm phosphat pH 5, D-phenylglycin pha đệm pH 5) dựa tài liệu tham khảo DĐVN IV Điều kiện phù hợp theo lí thuyết pH nồng độ dạng ion hóa mẫu cao Thực tế cho thấy mẫu tan tốt điều kiện chọn Tạp D amlodipin Tổng hợp 3-ethyl 5-methyl 2-[(2-(phthalimido)ethoxy)]-4-(2-clorophenyl)-6methylpyridin-3,5-dicarboxylat: phương pháp oxy hóa vịng 1,4-pyridin tạo vịng pyridin với tác nhân oxy hóa hỡn hợp SiO2-HNO3 phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, thời gian phản ứng ngắn, hiệu suất cao dễ tinh chế Hiệu suất phản ứng thay đổi tăng giảm lượng tác nhân oxy hóa thời gian phản ứng, nhiên thay đổi không nhiều Qua khảo sát, tỉ lệ phthaloyl amlodipin SiO2- 121 HNO3 thích hợp 3,58 : (tính theo khối lượng), thời gian phản ứng thích hợp 20 - 30 phút Tổng hợp tạp D amlodipin 3-ethyl 5-methyl 2-[(2-(amino)ethoxy)]-4-(2clorophenyl)-6-methylpyridin-3,5-dicarboxylat: quy trình tổng hợp với xúc tác methylamin đạt hiệu suất cao (49%) Quy trình có cách bố trí phản ứng đơn giản, dễ thực Tạp A tạp B nifedipin Phương pháp tổng hợp tạp A nifedipin (dehydronifedipin) đề tài chưa có cơng trình cơng bố nước giới, có cơng trình nghiên cứu việc oxy hóa vịng 1,4 – dihydropyridin chất có khung tương tự Phương pháp tổng hợp tạp B nifedipin (dehydronitroso nifedipin) công bố số báo giới, nhiên Việt Nam chưa có thực đề tài Các hóa chất sử dụng để tổng hợp tạp A tạp B nifedipin từ nguyên liệu nifedipin dễ tìm rẻ tiền, riêng để tổng hợp tạp B nifedipin sử dụng đèn UVA cơng suất lớn để có thời gian phản ứng rút ngắn Trong trình tổng hợp tạp A nifedipin cần ý tới lượng HNO3 cho vào phản ứng thời gian phản ứng, nên dừng phản ứng sớm để tránh việc tạo q nhiều tạp gây khó khăn cho q trình tinh chế Sau tổng hợp tạp A nifedipin, việc loại bỏ HNO3 nên rửa nước cất, không nên rửa nước có tính base gây biến đổi cấu trúc tạp A, tạo chất có màu đỏ Quá trình tinh chế tạp A nifedipin sử dụng hệ dung môi n-hexan – ethyl acetat (2:8) Tuy thời gian tiến hành sắc ký cột dài khả tách để loại tạp tốt, sản phẩm kết tinh lại hỡn hợp aceton – nước tinh khiết Phản ứng tạo tạp B nifedipin dễ dàng xảy hoàn toàn, nhiên việc tinh chế tạp B cần thận trọng cơng thức có nhóm nitroso gắn vào vịng thơm, nhóm có đặc điểm dễ bị oxy hóa, cần hạn chế tối đa việc tiếp xúc với oxy khơng khí chất có tính oxy hóa khác Chỉ tiến hành sắc ký cột mà không cần tiến hành kết tinh lại, việc kết tinh lại lọc phễu có nguy cao phân hủy tạp B 122 3.5.2 Tiêu chuẩn hóa tạp Quy trình xác định độ tinh khiết captopril disulfid HPLC: điều kiện nhiệt độ ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu cột Khi tăng nhiệt độ lên 50 oC, hệ số đối xứng pic captopril disulfic cải thiện đạt yêu cầu (0,8 ≤ As ≤ 1,5) Khi nhiệt độ tăng, độ nhớt pha động giảm nên giảm thời gian rửa giải, dẫn đến chiều rộng pic hẹp Ngoài nhiệt độ cao làm giảm tượng chuyển khối, dẫn đến hiệu cột tăng theo phương trình Van Deemter Tuy nhiên nhiệt độ sắc ký không nên cao (> 60 0C) làm bay dung mơi pha động có khả làm phân hủy mẫu Trong nghiên cứu này, nhiệt độ cột 50 0C lựa chọn phù hợp Pha động sử dụng acetonitril nước acid phosphoric với pH 2, không cần phải sử dụng dung dịch đệm nên thời gian rửa cột hệ thống HPLC nhanh, không gây ăn mòn hệ thống tượng kết tinh muối Ngoài pH này, hiệu cột sắc ký khơng bị ảnh hưởng khả thích hợp với pH từ – 13 cột Phenomenex Gemini NX C18 Thời gian lưu pic captopril captopril disulfid phút, pic tạp X trình tổng hợp khoảng phút, có khả sản phẩm phụ xuất trình tổng hợp captopril disulfid Khi tiến hành sắc ký với thời gian đến 60 phút không thấy xuất pic lạ khác xem sắc ký đồ không gian chiều với bước sóng từ 200 – 800 nm không phát pic tạp khác Sử dụng chức kiểm tra độ tinh khiết pic cách so sánh phổ UV-Vis thời gian lưu pic captopril disulfic với phổ UV-Vis điểm bất kỳ pic cho thấy có tương hợp phổ đến 99% Tất đánh giá chứng tỏ tất thành phần sản phẩm tổng hợp sau tinh chế rửa giải tiến hành sắc ký nên độ tinh khiết sản phẩm tính theo phương pháp phần trăm diện tích pic đạt 99% tin cậy Sau việc chọn thời gian sắc ký để xác định độ tinh khiết sản phẩm sau tinh chế 10 phút giúp làm giảm thời gian phân tích, tiết kiệm dung mơi acetonitril Tiêu chuẩn hóa captopril disulfid: kết đánh giá thiết lập chất đối chiếu captopril disulfid cho thấy chất đủ điều kiều để đăng ký chuẩn quốc gia với hàm lượng xác định 99,45% tính theo trạng Với hiệu suất tồn qui trình (tổng hợp tinh chế) khoảng 60%, khối lượng captopril disulfid thu 123 khoảng 3,15 g cho mỗi lần tổng hợp thời gian tổng hợp tinh chế không 24 nên chất đối chiếu captopril disulfid cung cấp đủ cho xí nghiệp dược nước có nhu cầu, góp phần làm tăng nguồn tạp chuẩn cơng tác kiểm tra chất lượng tạp chất liên quan Qui trình xác định độ tinh khiết tạp A tạp B nifedipin HPLC: qui trình xác định độ tinh khiết hai tạp A tạp B nifedipin HPLC - PDA đơn giản, thời gian lưu pic tạp A từ 5,9 tới 6,2 phút thời gian lưu pic tạp B từ 7,2 phút, sử dụng hệ dung môi thông dụng acetonitril – nước, không cần thêm đệm hay phải điều chỉnh pH giúp rửa hệ thống sắc ký nhanh an toàn cho hệ thống, cột sắc ký Đối với tạp B nifedipin, sắc ký đồ thường xuất pic tạp tạp B bị oxy hóa tạo tạp A dạng dung dịch, mẫu để định lượng tạp B phải pha trước định lượng Trong trình thử nghiệm, tiến hành sắc ký tạp A tạp B mỗi tạp 60 phút, nhiên sắc ký đồ pic tạp A, tạp B tạp khác có thời gian lưu khoảng 10 phút, thời gian từ 10 phút tới 60 phút không phát pic lạ sắc ký đồ chiều chiều, việc tiến hành sắc ký với thời gian 15 phút phù hợp, tiết kiệm thời gian dung môi Thiết lập chất đối chiếu tạp A tạp B nifedipin: dược điển Việt Nam IV có quy định phải kiểm tạp A tạp B nifedipin nguyên liệu thành phẩm nifedipin, qui định giới hạn cho phép nguyên liệu cao (không 0,5% tạp A, 0,1% tạp B) thành phẩm là hai tạp phân hủy tạo thành bảo quản thành phẩm không tốt, tiếp xúc với ánh sáng tác nhân oxy hóa Tuy nhiên việc đặt mua tạp thường đắt tiền thiếu tính chủ động gây khó khăn nhiều cho cơng tác kiểm nghiệm thành phẩm Hiện hệ thống kiểm nghiệm quốc gia chưa cung cấp tạp A tạp B nifedipin, công ty nước sản xuất thành phẩm nifedipin nhiều, việc thiết lập chất đối chiếu tạp A tạp B nifedipin cho thấy quy trình tổng hợp tinh chế đủ khả tạo tạp chuẩn để đăng ký chuẩn quốc gia với hàm lượng xác định so với chuẩn USP 99,560% tạp A 99,708% tạp B tính chế phẩm khan Hiệu suất tồn quy trình tạp A 31%, tạp B 73% Thời gian tổng hợp tinh chế tương đối ngắn 124 cung cấp đủ cho xí nghiệp dược nước có nhu cầu, góp phần tăng nguồn tạp chuẩn công tác kiểm tra tạp chất liên quan 3.5.3 Kiểm tra tạp chất nguyên liệu thành phẩm Quy trình định lượng captopril disulfid nguyên liệu chế phẩm captopril: điều kiện sắc ký để xác định độ tinh khiết captopril disulfid điều kiện sắc ký để định lượng tạp chất captopril disulfid nguyên liệu chế phẩm captopril Ngoài điều kiện hoàn toàn phù hợp định lượng đồng thời hoạt chất captopril tạp chất captopril disulfid nguyên liệu thành phẩm Điều thuận lợi công tác kiểm tra chất lượng chế phẩm Một khó khăn cơng tác kiểm nghiệm tạp chất liên quan giới hạn cho phép thường nhỏ so với dược chất nên để phát tạp chất liên quan phải chuẩn bị mẫu thử có nồng độ dược chất cao (thường từ 1000 ppm trở lên) Điều đòi hỏi điều kiện sắc ký phải lựa chọn cho độ phân giải pic dược chất pic tạp chất phải lớn nhiều so với giá trị qui định 1,5 Ngoài tải lượng cột sắc ký thông số cần lưu ý Nếu nồng độ chất phân tích cao làm cột phân tích bị tải, dẫn đến hiệu cột giảm nhanh chóng sau vài lần sắc ký Trong nghiên cứu với hỗn hợp chuẩn captopril 1000 ppm captopril disulfid 10 ppm không ảnh hưởng đến tải lượng hiệu cột sau lần sắc ký liên tục Kết thẩm định cho thấy qui trình định lượng tạp chất captopril disulfid đáp ứng đầy đủ yêu cầu qui trình kiểm nghiệm tạp chất liên quan nguyên liệu thành phẩm nên ứng dụng để kiểm tra tạp chất số nguyên liệu chế phẩm chứa captopril thị trường Kết định lượng captopril disulfid số nguyên liệu chế phẩm captopril thị trường cho thấy nhiều chế phẩm có hàm lượng tạp captopril disulfid vượt giới hạn cho phép 2% theo qui định DĐVN IV 3% theo qui định USP 36 BP 2013 Mặc dù kết ban đầu, thông tin cảnh báo cho nhà bào chế, sản xuất phân phối lưu ý q trình nghiên cứu xây dựng cơng thức bào chế, lựa chọn bao bì điều kiện bảo quản thuốc trình khảo sát tác nhân oxy hoá captopril, chất dễ bị phân hủy tạo tạp captopril disulfid 125 Kiểm tra tạp chất A B chế phẩm nifedipin: kết kiểm tra tính phù hợp hệ thống cho thấy qui trình kiểm tra tạp A tạp B nifedipin theo Dược Điển Việt Nam IV đáp ứng đầy đủ yêu cầu qui trình kiểm nghiệm tạp chất liên quan thành phẩm Kết kiểm tra hai tạp A tạp B số chế phẩm chứa nifedipin thị trường cho thấy chế phẩm thường xuất tạp B (tạp tạo tác động ánh sáng) Hàm lượng tạp nằm giới hạn cho phép không 2% tạp A 0,5% tạp B theo qui định Dược Điển Việt Nam IV Trong trình kiểm nghiệm thành phẩm chứa nifedipin, cần lưu ý pha dung dịch thử trước kiểm nghiệm để lâu kết khơng xác nifedipin dạng dung dịch dễ tạo thành tạp A tạp B nifedipin 126 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Đề tài hoàn thành nội dung, cụ thể sau: Đã điều chế thành công xác định điều kiện tổng hợp cho hiệu suất cao tạp chất captopril disulfid, 7-ADCA, D-phenylglycin, tạp D amlodipin, tạp A tạp B nifedipin với độ tinh khiết cao dùng làm chất đối chiếu kiểm nghiệm: - Captopril disulfid với độ tinh khiết 99,45%, hiệu suất tổng hợp 60,24%, hiệu suất tinh chế 57,08% khối lượng sản phẩm 3,2 gam/lần điều chế - 7-ADCA với độ tinh khiết 99,90%, hiệu suất tổng hợp 31%, hiệu suất tinh chế chế 80% khối lượng sản phẩm 3,5 gam/lần điều chế - D-phenylglycin với độ tinh khiết 99,94%, hiệu suất tổng hợp 29%, hiệu suất tinh chế 40% khối lượng sản phẩm 1,2 gam/lần điều chế - Tạp D amlodipin với độ tinh khiết 99,92%, hiệu suất tổng hợp 42% , hiệu suất tinh chế 63,2% khối lượng sản phẩm gam/lần điều chế - Tạp A nifedipin với độ tinh khiết 99,56%, hiệu suất tổng hợp 89,92%, hiệu suất tinh chế 34,83% khối lượng sản phẩm 1,04 gam/lần điều chế - Tạp B nifedipin với độ tinh khiết 99,71%, hiệu suất tổng hợp 95,92%, hiệu suất tinh chế 76,79% khối lượng sản phẩm 1,74 gam/lần điều chế Đã xây dựng thẩm định đạt yêu cầu quy trình xác định độ tinh khiết captopril disulfid, 7-ADCA, D-phenylglycin, tạp D amlodipin, tạp A tạp B nifedipin phương pháp HPLC Đã xây dựng tiêu chuẩn sở tạp 7-ADCA, D-phenylglycin, captopril disulfid, tạp D amlodipin, tạp A tạp B nifedipin bao gồm tiêu tính chất, định tính, hàm ẩm, độ tinh khiết, mức chất lượng tiêu phương pháp thử Tất tạp thiết lập chất đối chiếu, đủ điều kiện để đăng ký chuẩn Dược điển Đã xây dựng thẩm định đạt yêu cầu quy trình định lượng captopril disulfid nguyên liệu thành phẩm captopril phương pháp HPLC Tất quy trình kiểm nghiệm tạp chất liên quan khảo sát tính phù hợp hệ thống đạt yêu cầu theo qui định theo Dược điển Việt Nam IV Bốn quy trình 127 có giới hạn phát thấp mức chất lượng cho phép tạp chất liên quan theo Dược điển Việt Nam IV Đã ứng dụng quy trình để kiểm tra tạp chất captopril disulfid, 7-ADCA D-phenylglycin, tạp D amlodipin, tạp A tạp B nifedipin số nguyên liệu thành phẩm tương ứng thị trường Sáu tạp chất chuẩn nói đủ điều kiện để đăng ký chất chuẩn quốc gia, phục vụ cho công tác kiểm nghiệm nước, phù hợp với yêu cầu, điều kiện tình hình kinh tế Việt Nam Đề nghị Từ kết thu được, đưa số đề nghị sau: - Sáu tạp chất chuẩn captopril disulfid, 7-ADCA D-phenylglycin, tạp D amlodipin, tạp A tạp B nifedipin đăng ký chất chuẩn quốc gia - Ứng dụng qui trình kiểm tra tạp captopril disulfid, 7-ADCA, D-phenylglycin, tạp D amlodipin, tạp A tạp B nifedipin tất mẫu nguyên liệu thành phẩm tương ứng khác lưu hành thị trường - Tăng cường kiểm tra, kiểm soát chất lượng thuốc, nguyên liệu lưu hành thị trường tiêu giới hạn tạp chất để đảm bảo chất lượng thuốc theo tiêu chuẩn đăng ký - Tiếp tục đầu tư trang thiết bị, sở vật chất phục vụ cho công tác điều chế, chuẩn hóa chất dùng làm chất chuẩn, đặc biệt tạp chuẩn để phục vụ nhu cầu sử dụng nước, hạn chế nhập từ nước TÀI LIỆU THAM KHẢO Hellen Karine Stulzer, Marcos Antonio Segatto Silva (2006), “Stability Studies of coated Granules and Tablets contained Captopril”, Acta Farm Bonaerense, 25(4), 497-504 Julia Aparecida L.Souza (2012), “Quantification of captopril disulfide as a degradation product in captopril tablets using near infrared spectroscopy and chemometrics”, Vibrational Spectroscopy, 62, 35– 41 Waleed M.M Mahmoud, Klaus Kümmerer (2012), “Captopril and its dimer captopril disulfide: Photodegradation, aerobic biodegradation and identification of transformation products by HPLC–UV and LC–ion trap-MS”, Chemosphere, 88, 1170-1177 Tak Yee Lee, Robert E Notari (1987), “Kinetics and mechanism of captopril oxidation in aqueous solution under controlled oxy partial pressure”, Pharmaceutical Research, 4(2), 98 – 103 Armida Torreggiania, Paola Taddeia, M Raffaella Tosib (2001), “A spectroscopic investigation of captopril and the Cu(II) - captopril system”, Journal of Molecular Structure, 565 – 566, 347 – 352 Antonio Luiz Braga, Oscar E Dorneles Rodrigues, Devender Singh (2010), “Metal Free Air Oxidation of Thiols in Recyclable Ionic Liquid: A Simple and Efficient Method for the Synthesis of Disulfides”, European Journal of Organic Chemistry, 2010(14), 2661 – 2665 Seema S Badi, Suresh M Tuwar (2013), “Kinetics and Mechanism of Oxidation of Captopril by Hexacyanoferrate (III) in Aqueous Acidic Medium”, Journal of Solution Chemistry, 42, 1518 – 1531 Schaefer J P., Tam Y (1998), “Ferrous sulphate interacts with captopril”, British Journal of Clinical Pharmacology, 46, 377 – 381 Alan F Casy, George H Dewar (1994), “Captopril and its probable contaminants: NMR and MS features of analytical value”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 12(7), 855 – 861 10 Schaefer J P., Tam Y (1998), “Ferrous sulphate interacts with captopril”, British Journal of Clinical Pharmacology, 46, 377 – 381 11 Takashi Nishikawa, Reiko Abe (2004), “HPLC profile of captopril disulfide that undergoes reversible cis – trans conversion among three isomers”, Analytical sciences, 20, 1395 – 1398 12 Raquel Nogueira, Wagner Wollinger, Thaís Elias da Silva, Leonardo Mesquita de Oliveira, Eliane Cristina Pires Rego, Gabriela Fernandes Moreira, Juliano Smanioto Barin, Luciane Varini Laporta, Márcia Foster Mesko, Celso Figueiredo Bittencourt, Janaína Marques Rodrigues, Valnei Smarỗaro da Cunha (2011), Validation of a liquid chromatographic method for determination of related substances in a candidate certified reference material of captopril”, Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, 47, 351-362 13 Verweij Jan, Tan Hong Sheng, Kooreman Hermanus Jacobus (1977), “Preparation of 7-substituted amino-desacetoxycephalosporanic acid compounds”, United States Patent, 4(3), 894 14 Jinun B Yeh, Lain-Tze Lee (1994), “Method for the preparation of delta3-7substituted amino deacetoxy cephalosporanic acid”, United States patent (5), 302-713 15 Bovenberg Roelof Ary Lans, Koekman Bertus Pieter (1998), “Process for the production of 7-ADCA via expandase activity on Penicillin G”, United States patent, (5), 1-4 16 Alonso F O M., Oestreicher E G., Antunes O A C (2008), “Production of enantiomer pure D-Phenylglycine using Pseudomonas aeruginosa 10145 as biocatalyst”, Brazilian journal of chemical engineering, 25(1), 1-8 17 Jingang Wang, Quing Zhang, He Huang, Zhongyi Yuan, Dafu Ding, Sheng Yang, Weihong Jiang (2008), “Increasing synthetic performance of penicillin G acylse from Bacillus megaterium by site-dirtected mutagenesis”, Applied Microbiology and Biotechnology, 74(5), 1023-1030 18 Janssen H A Michiel Sheldon R A (2006), “Properties of immobilised penicillin G acylase in lactam antibiotic synthesis”, Rotterdam Europrt, Nertherlands, 18-19, 31-32 19 Arash Ghorbani-Choghamarani, Mohsen Nikoorazm, Hamid Goudarziafshar, Lotfi Shiri, and Zahra Chenani (2009), “Oxidation of Hantzsch 1,4Dihydropyridins Using Supported Nitric Acid on Silica Gel and Poly Vinyl Pyrrolidone (PVP)under Mild and Heterogeneous Conditions”, Bull Korean Chem Soc, Vol 30, No 4, 972-974 20 Sudhakar P., Nirmala M., Moses Babu J., Vyas K., Ganta Madhusudan Reddy, Vijaya Bhaskar B., Pratap Reddy P., Mukkanti K (2006), “Identification and characterization of potential impurities of amlodipine maleate”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, vol 40, 605-613 21 EOS Eczacibasi Ozgun Kimyasal Urunler Sanazyi Ve Ticaret (2002), “Isolation of dihydropyridin derivative anf preparation salts thereof”, International aplication published under the patent cooperation treaty, WO 2004/058711, July 2004 22 Walid A Al-Turk, Ibraheem A Majeed, Wallace J Murray, David W Newton, Sadeq Othman (1988), “Some factors affecting the photodecomposition of nifedipine”, International Journal of Pharmaceutics, 41, 227-230 23 Syed Laik Ali (1989), Analytical profiles of drug substances, Academic Press, volume 18, 221-268 24 Henkde Vries, Gerard M J Beijersbergen Van Henegouwen (1995), “Photodegradation of nifedipine under in vivo related circumstances”, Photochemistry and Photobiology, 62(6), 959-963 25 Henk de Vries, Gerard M J Beijersbergen van Henegouwen (1998) “Photoreactivity of nifedipine in vitro and in vivo”, Journal of photochemistry and photobiology B, 43, 217-221 26 Syed Laik Ali (1989), Analytical profiles of drug substances, Academic Press, volume 18, 221-268 27 Perumal, R Nagarajan, Anthonyraj, Muralidharan, Saikumar (2006), “A convenient method for the oxidation of Hantzsch 1,4 – dihydropyridines with N-bromosuccinimide”, Indian Journal of Chemistry, 45B, 826-828 28 Satya Paul, Shivani Sharma, Monika Gupta, Deepak Choudhary, Rajive Gupta (2007), “Oxidative Aromatization of Hantzsch 1,4-Dihydropyridines by SiO2/P2O5-SeO2 under Mild and Heterogeneous Conditions”, Bull Korean Chem Soc, 28(2), 336-338 29 Arash Ghorbani-Choghamarani, Mohsen Nikoorazm, Hamid Goudarz iafshar, Lotfi Shi ri, Zahra Chenan (2009), “Oxidation of Hantzsch 1,4- Dihydropyridines Using Supported Nitric Acid on Silica Gel and Poly Vinyl Pyrrolidone (PVP) under Mild and Heterogeneous Conditions”, Bull Korean Chem Soc, 30(4), 972-974 30 Smita Patra, et al (2012), “Synthetic studies towards nifedipine and estimation of nifedipine by HPTLC method”, IJPCBS, 2(4), 482-487 31 Nguyễn Thị Kim Thanh, Cao Ngọc Anh, Mai Thanh Hà, Lê Quang Thảo (2007), “Nghiên cứu tạo tạp chất nifedipin nitrophenylpyridin analog (tạp A) nifedipin nitrosophenylpyridin analog (tạp B) để kiểm tra phù hợp hệ thống sắc ký xác định tạp chất nguyên liệu nifedipin phương pháp HPLC”, Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc, số 3, 13-18 32 Yuya Horinouchi, Koichiro Tsuchiya, Chiaki Taoka, Soichiro Tajima, Yoshitaka Kihira, Yuko Matsuda, Kozo Shishido, Masahiro Yoshida, Shuichi Hamano, Kazuyoshi Kawazoe, Yasumasa Ikeda, Keisuke Ishizawa, Shuhei Tomita, Toshiaki Tamaki (2011), “Antioxidant Effects of Photodegradation Product of Nifedipine”, Chem Pharm Bull, 59(2), 208-214 33 Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 124125; PL-105, 114-116, 122, 127-129, 138-143, 149-151 34 ISO Guide 35:2006 (2006), Reference materials – General and statistical principles for certification, p 48 35 ISO 13528:2005 (2005), Statistical methods for use in proficiency testing by inter-laboratory comparisons, p 64 36 I.C.H (2005), Harmonized tripartite guideline, Validation of analytical procedures: test and methodology, pp -13 37 Sigma Aldrich (2010), D-phenylglycin safety data sheet, pp 1-4 38 Alvin Singer, S M McElvain (1943), “2,6-dimethylpyridin”, Organic Syntheses, Coll Vol 2, p 214 39 Machado George D C., Marlito Gomes Jr., O A C Antunes, Enrique G Oestreicher (2005), “Enzymic resolution of DL-phenylglycine”, Process Biochemistry, 40, 3186-3189 40 Schroën C G P H., Mohy Eldin M S., Janssen A E M., Mita G D., Tramper J (2001), “Cephalexin synthesis by immobilised penicillin G acylase under non-thermal conditions”, Jounal of Molecular Catalysis B, 15, 163-172 41 BP (2013), CD-ROM 42 Browne D (2009), "Reference-Standard Material Qualification" Pharm Tech., 33(4), 66-73 43 David Browne (2009), “Reference-Standard Material Qualification”, Pharmaceutical Technology, 33(4), 66-73 44 Douglas S Johnson, Jie Jack Li (2007), The art of drugs synthesis, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, pp 162-163 45 European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare (2008), Safety data sheet N0750015, No.5, pp 1-3 46 European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare (2009), Safety data sheet N0750010, No.6, pp 1-4 47 European Pharmacopoeia (2014), CD-ROM 48 Friedrich Bossert, Wnppertal-Elberfeld, Wolf Vater (1969), US3485847, 4aryl-1,4-dihydropyridine, pp 1-10 49 García M.A., Solans C., Aramayona J J., Fraile L J., Bregante M.A (1998), “A common method for the determination of several calcium channel blockers using an HPLC system with ultraviolet detection”, Talanta, 47, 1245–1254 50 Gill P., Moghadam T T., Ranjbar B (2010), "Differential scanning calorimetry techniques: applications in biology and nanoscience" J Biomol Tech, 21(4), 167-193 51 Jerry R Mohrig, Christina Noring Hammod, Paul F Shcatz (2010), Techniques in Organic, W.H Freeman and Company, New York, pp 113-125, 183-193 52 Kestens V., Zeleny R., Auclair G., Held A., Roebben G., Linsinger T P J (2011), "Differential scanning calorimetry method for purity determination: A case study on polycyclic aromatic hydrocarbons and chloramphenicol" Thermochim Acta, 524(1-2), 1-6 53 Mirela Filipan-Litvic, Mladen Litvic, Ivica Cepanec, Vladimir Vinkovic (2007), “Hantzsch Synthesis of 2,6-Dimethyl-3,5-dimethoxycarbonyl-4-(omethoxyphenyl)-1,4-dihydropyridine; a novel cyclisation leading to an unusual formation of 1-Amino-2-methoxycarbonyl-3,5-bis(o-methoxyphenyl)-4-oxacyclohexan-1-ene”, Molecules, 12, 2546-2558 54 Mojtaba Shamsipur, Bahram Hemmateenejad, Morteza Akhond, Katayoun Javidnia, Ramin Miri (2013), “A study of the photo-degradation kinetics of nifedipine by multivariate curve resolution analysis”, J Pharm Biomed, 31, 1013-1019 55 O'Neill M J (1966), "Measurement of Specific Heat Functions by Differential Scanning Calorimetry", Anal Chem., 38(10), 1331-1336 56 Potter H., Hulm M (1988), “Assay of nifedipine and its by- and degradation products in the drugs substance and dragees by liquid chromatography on formamide-saturated silica gel columns”, Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis, 6(1), 115 – 119 57 Prabu S L., Suriyaprakash T N K (2010), "Impurities and its importance in pharmacy", Int J Pharm Sci Rev Res., 3(2), 66-71 58 Smita Patra, et al (2012), “Synthetic studies towards nifedipine and estimation of nifedipine by HPTLC method”, IJPCBS, 2(4), 482-487 59 USP 38 (2015), Electronic Edition 60 Walid A Al-Turk, Ibraheem A Majeed, Wallace J Murray, David W Newton, Sadeq Othman (1988), “Some factors affecting the photodecomposition of nifedipine”, International Journal of Pharmaceutics, 41, 227-230