Nghiên cứu tạo chuột chuyển gen phát sáng huỳnh quang

SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN TP HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGHIÊN CỨU TẠO CHUỘT CHUYỂN GEN PHÁT SÁNG HUỲNH QUANG Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm Cơng nghệ Sinh học TP HCM Chủ nhiệm nhiệm vụ: CN Phan Ngọc Uyên Phương Thành phố Hồ Chí Minh – 2020 SỞ NƠNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NƠNG THƠN TP HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CỞ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGHIÊN CỨU TẠO CHUỘT CHUYỂN GEN PHÁT SÁNG HUỲNH QUANG (Đã chỉnh sửa theo kết luận Hội đồng nghiệm thu ngày 16/03/2020) Chủ nhiệm nhiệm vụ (ký tên) Phan Ngọc Uyên Phương Cơ quan chủ trì nhiệm vụ (ký tên đóng dấu) TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Thành phố Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2020 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KH&CN I THÔNG TIN CHUNG Tên nhiệm vụ: Nghiên cứu tạo chuột chuyển gen phát sáng huỳnh quang Thuộc: Chương trình/lĩnh vực (tên chương trình/lĩnh vực): Đề tài cấp sở Chủ nhiệm nhiệm vụ: Họ tên: Phan Ngọc Uyên Phương Ngày, tháng, năm sinh: 26/03/1991 Nam/ Nữ: Nữ Học hàm, học vị: Cử nhân Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên Chức vụ: Nhân viên Điện thoại: Tổ chức: Nhà riêng: Mobile: 0933540491 Fax: … E-mail: Phuong.pnu@gmail.com Tên tổ chức công tác: Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh Địa tổ chức: 2374 Quốc lộ 1, Phường Trung Mỹ Tây, Quận 12, TP Hồ Chí Minh Địa nhà riêng: 2374 Quốc lộ 1, Phường Trung Mỹ Tây, Quận 12, TP Hồ Chí Minh Tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm Cơng nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh Điện thoại: 028 37153792 Fax: (84-28) 38 91 69 97 E-mail: ttcnsh.snn@tphcm.gov.vn Website: www.hcmbiotech.com.vn Địa chỉ: 2374 Quốc lộ 1, Phường Trung Mỹ Tây, Quận 12, TP Hồ Chí Minh Họ tên thủ trưởng tổ chức: Dương Hoa Xô Số tài khoản: 3713.0.1007645 Kho bạc: Nhà nước TP HCM Tên quan chủ quản đề tài: Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Thời gian thực nhiệm vụ: - Theo Hợp đồng ký kết: từ tháng 01 năm 2017 đến tháng 03 năm 2019 - Thực tế thực hiện: từ tháng 01 năm 2017 đến tháng 06 năm 2020 - Được gia hạn (nếu có): - Lần từ tháng 03 năm 2019 đến tháng 06 năm 2020 Kinh phí sử dụng kinh phí: a) Tổng số kinh phí thực hiện: 700 tr.đ, đó: + Kính phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học: 700 tr.đ + Kinh phí từ nguồn khác: tr.đ b) Tình hình cấp sử dụng kinh phí từ nguồn ngân sách khoa học: Số TT Theo kế hoạch Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) 273 Năm 2017 Năm 2018 350 Năm 2019 77 Thực tế đạt Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) 266,33 Năm 2017 343,80 Năm 2018 76,95 Năm 2019 Ghi (Số đề nghị toán) c) Kết sử dụng kinh phí theo khoản chi: Đơn vị tính: Triệu đồng Số TT Nội dung khoản chi Trả công lao động (khoa học, phổ thơng) Ngun, vật liệu, lượng Thiết bị, máy móc Xây dựng, sửa chữa nhỏ Chi khác Tổng cộng Theo kế hoạch Tổng NSKH 183,95 Nguồn khác Thực tế đạt Tổng NSKH 183,95 183,95 183,95 489,32 489,32 475,86 475,86 26,73 26,73 700 700 27,27 687,08 27,27 687,08 Nguồn khác - Lý thay đổi (nếu có): Các văn hành q trình thực đề tài/dự án: (Liệt kê định, văn quan quản lý từ công đoạn xét duyệt, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực có); văn tổ chức chủ trì nhiệm vụ (đơn, kiến nghị điều chỉnh có) Số TT Số, thời gian ban hành văn 325/QĐ-CNSH, 20/12/2016 86/HĐGV-CNSH, 03/05/2017 11/QĐ-CNSH, 18/05/2018 86/QĐ-CNSH, 25/06/2019 43/2019/HĐ-SNN, 09/12/2019 Tên văn Quyết định thành lập Hội đồng xét duyệt đề cương Hợp đồng giao việc thực đề tài cấp sở năm 2017 Quyết định việc thành lập Hội đồng Khoa học đánh giá tiến độ đề tài nghiên cứu cấp Trung tâm Quyết định việc thành lập Hội đồng Khoa học đánh giá tiến độ nghiệm thu nhiệm vụ khoa học công nghệ năm 2018 Hợp đồng thực nhiệm vụ khoa học Cơng nghệ cấp sở “Nghiên cứu tạo dịng tế bào gốc Ghi 476/QĐ-SNN 53/QĐ-CNSH, 11/03/2020 trung mơ bệnh lí để thử nghiệm thước điều trị bệnh tiểu đường tuýp (nhiệm vụ chuyển tiếp từ năm 2017) Quyết định việc gia hạn thời gian thực nhiệm vụ Khoa học Công nghệ cấp sở Quyết định việc thành lập Hội đồng Khoa học nghiệm thu nhiệm vụ khoa học công nghệ cấp Trung tâm Tổ chức phối hợp thực nhiệm vụ: Số TT Tên tổ chức đăng ký theo Thuyết minh Tên tổ chức tham gia thực Nội dung tham gia chủ yếu Sản phẩm chủ yếu đạt Ghi chú* … - Lý thay đổi (nếu có): Cá nhân tham gia thực nhiệm vụ: (Người tham gia thực đề tài thuộc tổ chức chủ trì quan phối hợp, khơng q 10 người kể chủ nhiệm) Số TT Tên cá nhân đăng ký theo Thuyết minh Tên cá nhân tham gia thực Nội dung tham gia Chủ trì - Hồn thiện đề cương chi tiết - Hồn thiện báo cáo tiến độ - Chủ trì việc CN Phan Ngọc Uyên Phương CN Phan Ngọc Uyên Phương Tổng hợp viết báo cáo kết quả: Chủ trì nhân dịng gen mục tiêu gfp - Chủ trì vi tiêm gen vào trứng hai tiền nhân, nuôi dưỡng sàng lọc phơi giai đoạn morula, blastocyst Chủ trì tạo chuột đực thắt ống dẫn tinh, Sản phẩm chủ yếu đạt -Có dịng tế bào E.Coli mang plasmid PCX-EGFP -Vi tiêm DNA vào phôi giai đoạn tiền nhân ohát triển đến giai đoạn tế bào, nuôi phôi phát triển khỏe mạnh đến giai đoạn blastocyst cho q trình chuyển phơi -xác định giai đoạn động dục chu kì động dục gồm giai đoạn với biểu sưng, nhăn, Ghi chú* cho phối với chuột cho chuột mang thai giả - Chủ trì chuyển phơi giai đoạn morula blastocyst mang gen không mang gen vào chuột mẹ mang thai giả - Chủ trì theo dõi Chuột phát sáng kính hiển vi huỳnh quang Kiểm tra DNA chuột mang gen gfp - Tổng hợp viết báo cáo nghiệm thu đề tài TS Nguyễn Trọng Bình TS Nguyễn Trọng Bình CN Mai Hữu Phương ThS Nguyễn CN Phan Ngọc Thị Thanh Giang Uyên Phương TS Nguyễn Trọng Bình Chủ trì nhân dòng gen mục tiêu gfp - Gây siêu noãn chuột việc tiêm PMSG hCG - Sàng lọc hợp tử giai đoạn hai tiền nhân Nuôi phôi đến giai đoạn morula blastocyst âm hộ mở rộng, tế bào đại diện tế bào biểu mô sừng hóa khơng nhân -Chuột sinh phát sáng huỳnh quang xanh ánh sáng kích thích - Escherichia coli DH5α mang vector nhân dòng chứa gfp -Ống dẫn trứng có diện ampulla -Hợp tử thu có diện tiền nhân cho q trình vi tiêm Phơi giai đoạn morula blastocyst khỏe mạnh chuẩn bị cho q trình chuyển phơi - Khảo sát thời gian gây mê chuột đực cho trình gây bất thụ cắt ống dẫn tinh ThS Bùi Quốc Thắng CN Phan Ngọc Uyên Phương TS Trịnh Như Thùy ThS Bùi Quốc Thắng ThS Nguyễn Thị Nhật Uyên CN Phan Ngọc Uyên Phương TS Nguyễn Trọng Bình CN Mai Hữu Phương -Vi tiêm DNA vào tiền nhân hợp tử giai đoạn hai tiền nhân CN Phan Ngọc Uyên Phương TS Nguyễn Trọng Bình CN Mai Hữu Phương - Chuyển phơi mang gen vào chuột mang thai hộ theo dõi chuột sinh Kiểm tra DNA chuột TS Trịnh Như Thùy vào tử cung chuột -Chuột đực bất thụ hoàn tồn hồi phục sau 10-14 ngày, khơng có dấu hiệu nhiễm trùng Khơng có khả sinh sản giao phối với chuột -tiền nhân có xáo trộn hạch nhân vi tiêm DNA, đồng thời có phát triển khỏe mạnh sau vi tiêm Chuột mang thai hộ có dấu hiệu mang thai sau – 19 ngày chuyển phôi Chuột sinh phát sáng ánh sáng kích thích khơng cịn cơng tác TTCNS H khơng cịn cơng tác TTCNS H - Lý thay đổi (nếu có): Tình hình hợp tác quốc tế: Số TT Theo kế hoạch (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị: Theo kế hoạch Số (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa TT điểm ) Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm ) Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Tóm tắt nội dung, công việc chủ yếu: (Nêu mục 15 thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát nước nước ngồi) Số TT Các nội dung, cơng việc chủ yếu (Các mốc đánh giá chủ yếu) Hoàn thiện đề cương chi tiết Nhân dòng gen mục tiêu gfp - Thời gian (Bắt đầu, kết thúc - tháng … năm) Theo kế Thực tế đạt hoạch 1/2017 – 1/2017 – 2/2017 2/2017 Chủ trì nhân dịng gen mục tiêu gfp tháng (23/2017) tháng (23/2017) vi tiêm gen vào trứng hai tiền nhân, nuôi dưỡng sàng lọc phôi giai đoạn morula, blastocyst tháng (49/2017) tháng (49/2017) Người, quan thực CN Phan Ngọc Uyên Phương CN Mai Hữu Phương TS Nguyễn Trọng Bình CN Phan Ngọc Uyên Phương TS Nguyễn Trọng Bình CN Phan Ngọc Uyên Phương TS Trịnh Như Thùy ThS Nguyễn Thị Thanh Giang ThS Bùi Quốc Thắng CN Mai Hữu Phương tạo chuột đực thắt ống dẫn tinh, cho phối với chuột cho chuột mang thai giả tháng (10/20171/2018) tháng (10/20171/2018) CN Phan Ngọc Uyên Phương TS Nguyễn Trọng Bình chuyển phơi giai đoạn morula blastocyst mang gen không mang gen vào chuột mẹ mang thai giả tháng (29/2018) 2/2018 – 9/2019 TS Trịnh Như Thùy CN Mai Hữu Phương CN Phan Ngọc Uyên Phương TS Nguyễn Trọng Bình theo dõi Chuột phát sáng kính hiển vi huỳnh quang Kiểm tra DNA chuột mang gen gfp tháng (10/20183/2018) 9/2019 – 12/2019 TS Trịnh Như Thùy CN Mai Hữu Phương CN Phan Ngọc Uyên Phương TS Nguyễn Trọng Bình TS Trịnh Như Thùy CN Mai Hữu Phương Viết báo cáo nghiệm thu đề tài tháng (3/2019) 12/2019 CN Phan Ngọc Uyên Phương - Lý thay đổi (nếu có): III SẢN PHẨM KH&CN CỦA NHIỆM VỤ Sản phẩm KH&CN tạo ra: a) Sản phẩm Dạng I: Số TT Tên sản phẩm tiêu chất lượng chủ yếu Đơn vị đo Số lượng Theo kế hoạch Thực tế đạt Quy trình tạo chuột phát sáng huỳnh quang 1 Tạo chuột phát sáng huỳnh quang yêu cầu cần đạt - Lý thay đổi (nếu có): b) Sản phẩm Dạng II: Số TT Tên sản phẩm Yêu cầu khoa học cần đạt Theo kế hoạch Thực tế đạt Ghi - Lý thay đổi (nếu có): c) Sản phẩm Dạng III: Số TT Yêu cầu khoa học cần đạt Theo Thực tế kế hoạch đạt Tên sản phẩm Phan Ngọc Uyên Phương*, Lê Bảo Thơ, Nguyễn Thị Huỳnh Như, Nguyễn Trọng Bình, Nguyễn Đăng Quân XÁC ĐỊNH CHU KÌ ĐỘNG DỤC TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG TRÊN CÁC NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN CHUỘT THÍ NGHIỆM Poster Poster Số lượng, nơi cơng bố (Tạp chí, nhà xuất bản) Hội nghị CNSH Tồn quốc, 2019, Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Tp Hồ Chí Minh - Lý thay đổi (nếu có): d) Kết đào tạo: Số TT Cấp đào tạo, Chuyên ngành đào tạo Thạc sỹ Cử nhân Số lượng Theo kế hoạch Thực tế đạt Ghi (Thời gian kết thúc) 1 2020 2018 Thực tế đạt Ghi (Thời gian kết thúc) - Lý thay đổi (nếu có): đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp: Số TT Tên sản phẩm đăng ký Kết Theo kế hoạch Số phôi Số phôi chuyển vi vào ống dẫn trứng sau tiêm vi tiêm 132 110 79 227 224 204 Số chuột sử Số phôi thu dụng nhận Lô TN Kết bảng cho thấy với liều tiêm hormone PMSG, hCG IU nhóm nghiên cứu chúng tơi nhu nhận trung bình 32,64 hợp tử giai đoạn hai tiền nhân (359/11) nhiều so với số lượng hợp tử thu đợt 16,16% Điều cho thấy điều kiện ni dưỡng chuột có ảnh hưởng lớn đến chất lượng số lượng hợp tử Đối với chuột độ tuổi sinh sản bình thường cho 8-12 chuột con/ lần sinh sản Như kết thu nhận hợp tử hoàn tồn đáng ghi nhận cho việc tối thiểu hóa số động vật sử dụng Nghiên cứu Seiya Mizuno cộng năm 2014 [10] cho thấy tổng số 224 phơi vi tiêm có 204 phơi sử dụng để chuyển vào ống dẫn trứng chuột mang thai hộ, đạt tỉ lệ vi tiêm 91,52% Kết bảng đợt vi tiêm thứ đạt tỉ lệ vi tiêm 66,4%, đợt 74,9% bảng đợt vi tiêm lần đạt tỉ lệ vi tiêm thành công lên đến 90,14% Các kết vi tiêm mà nhóm nghiên cứu đạt nhìn chung chưa cao so với giới, nhiên thấy tiến rõ rệt trình vi tiêm DNA vào hợp tử giai đoạn hai tiền nhân Điều cho thấy tiềm lớn việc làm chủ kỹ thuật vi tiêm nhằm phục vụ cho nghiên cứu liên quan đến việc tạo chuột biến đổi di truyền phương pháp vi tiêm DNA Các phôi sau vi tiêm đánh giá sinh trưởng phát triển, lựa chọn phơi Các phơi có hình dạng bất thường phát triển không (mũi tên xanh)… loại bỏ, phôi khỏe mạnh (mũi tên màu cam) chuyển vào ống dẫn trứng chuột mẹ mang thai hộ 45 Hình 32 Phơi giai đoạn tế bào phát triển sau trình vi tiêm DNA vào tiền nhân đực (thang đo: 50 µm) (Mũi tên xanh: đại diện phơi bất thường hình dạng phơi bào Mũi tên cam: đại diện phơi bình thường với chất lượng tốt, có phơi bào đầy đủ mặt kích thước hình dạng) Tạo chuột mang thai hộ Chuột mang thai hộ 0,5 dpc (days postcoitum) sử dụng cho chuyển phôi vào ống dẫn trứng; 2,5 dpc sử dụng cho chuyển phôi vào tử cung Chuột mang thai hộ cho thành cơng có dấu hiệu giao phối với diện lớp màu trắng đục vàng nhạt nút nhầy âm đạo (hình 4.8 B) diện đoạn bóng (ampulla) ống dẫn trứng chuẩn bị cho q trình nhận phơi hình 4.9 B Sau q trình chuyển phơi, chuột nhận phơi có dấu hiệu mang thai Bảng Tỉ lệ thành công việc tạo chuột mang thai giả Số chuột sử dụng Số chuột có diện ampulla (%) Số chuột sử dụng chuyển phôi 12 10 (83,33) 10 (80,00) Trung bình 81,67% Kết bảng cho thấy tổng số 17 chuột kiểm tra dấu hiệu giao phối thành cơng (hình 36) để tạo chuột mang thai giả, có 14 số 17 (81,67%) chuột nhận phơi (pseudopregnant recipient females) sử dụng để chuyển phôi số 17 (18,33%) chuột không sử dụng để chuyển 46 phơi trước có diện giao phối thành cơng (hình 36 B) Điều cho thấy việc kiểm tra vị trí nhận phơi ống dẫn trứng khơng có đoạn bóng (hình 37 A) có đoạn bóng (37 B) sau trình giao phối thành cơng với chuột đực bất thụ quan trọng, yếu tố định việc chuyển phôi vào ống dẫn trứng chuột mẹ mang thai hộ Hình 33 Âm hộ chuột A: Chưa giao phối giao phối không thành công B: Giao phối thành công (một lớp màu vàng nhạt trắng đục) Một điều đặc biệt ý tất chuột sau xác định giai đoạn động dục phối với chuột đực bất thụ theo tỉ lệ 1:2 tiến hành ghi nhận dấu hiệu giao phối thành cơng Tất chuột có dấu hiệu giao phối thành công tiến hành phẫu thuật mở lưng kiểm tra sưng lên vị trí nhận phơi chuẩn bị cho q trình chuyển phơi giai đoạn 1-2 tế bào vào ampulla Đối với chuột có dấu hiệu giao phối thành cơng khơng có sưng lên ampulla khơng chuyển phôi mà đưa trở lại buồng nuôi Từ kết trên, tiến hành chuyển phôi giai đoạn - tế bào vào đoạn ống dẫn trứng Hình 33 cho thấy diện bong bóng khí nhằm đảm bảo phơi bên kim chuyển phơi (hình 37D) đẩy vào ống dẫn trứng để đảm bảo thêm lần nữa, kim chuyển phôi sau chuyển phôi kiểm tra kính hiển vi soi để chắn khơng cịn phơi cịn sót lại kim, đồng thời bong bóng khí giúp cho mơi trường lỏng chứa phơi không bị trào khỏi ống dẫn trứng, làm sở cho việc theo dõi dấu hiệu mang thai chuột sau đưa chuột mang thai hộ trở lại buồng ni (hình 38) 47 Bảng 10 Tỉ lệ thành cơng hình thành chuột mẹ mang thai hộ qua q trình chuyển phơi Số phơi sử dụng Số chuột mẹ mang Số phôi thai /chuột mang chuyển vào ống thai hộ sử dụng dẫn trứng (%) Số chuột sinh biểu huỳnh quang /chuột sinh 79 283 (204+79) (đối chứng – không vi tiêm egfp) 204 (vi tiêm egfp) 4/4 (100) 0/69 10/10 (100) 2/134 Theo dõi mang thai chuột mẹ từ ngày 19 ngày sau chuyển phôi Dựa vào kết bảng 10, ghi nhận 4/4 chuột mang thai hộ mang thai nhóm đối chứng 10/10 chuột mang thai sau q trình chuyển phơi nhóm vi tiêm egfp Điều cho thấy nhóm nghiên cứu tạo mơ hình chuột mẹ mang thai hộ với tỉ lệ thành cơng cao Làm chủ quy trình nghiên cứu nhằm ứng dụng cho nghiên cứu Chuột sinh sau 19±3 ngày đồng thời kiểm tra huyết thống với chuột mẹ mang thai hộ Theo dõi mang thai chuột mẹ từ ngày 19 ngày sau chuyển phơi Hình 39 cho thấy trình mang thai chuột sau chuyển phơi Cụ thể hình 39B cho thấy có hồi phục vết thương lưng, có tăng kích thước vú tăng nhẹ trọng lượng Hình 39C cho thấy tăng trọng lượng cách rõ rệt, điều chứng minh trình tạo chuột mẹ mang thai hộ chuyển phôi thành công Chuột sinh sau 19±3 ngày đồng thời kiểm tra huyết thống chuột sinh chuột mẹ nhận phơi 48 Hình 34 Theo dõi trình mang thai chuột mang thai hộ sau chuyển phôi A: Chuột vừa chuyển phơi ngày 0,5 B: Chuột nhận phơi có dấu hiệu mang thai sau 7,5 ngày C: Chuột nhận phôi mang thai sau 18,5 ngày Kiểm tra biểu huỳnh quang chuột sinh Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu sử dụng chuột khỏe mạnh giao phối với chuột đực bất thụ, điều dẫn đến ống dẫn trứng chuột nhận phôi tinh trùng, khơng có hình thành phơi thai thân chuột nhận phơi Từ nhóm nghiên cứu dễ dàng kết luận tồn chuột sinh chuột sinh từ phôi chuyển vào ống dẫn trứng, khác mặt huyết thống với chuột nhận phơi Bên cạnh đó, chúng tơi sử dụng phơi vi tiêm plasmid mang gen egfp để chuyển phôi chuột mẹ nhận phôi chuột không mang gen egfp, chuột sinh phát sáng huỳnh quang ánh sáng kích thích (hình 4.12 bảng 4.4) xem thành cơng q trình tạo chuột mẹ mang thai hộ, chuyển phơi Tồn chuột sinh nhóm nghiên cứu kiểm tra biểu huỳnh quang kính hiển vi soi có gắn huỳnh quang (hình 40) với bước sóng 530550 nm [2] ghi nhận thấy phát sáng màu xanh lục với biểu protein egfp hình bên Hình 35 Hệ thống kính hiển vi soi có gắn huỳnh quang sử dụng cho việc kiểm tra biểu phát sáng huỳnh quang chuột 49 Hình 36 Chuột phát sáng huỳnh quang protein egfp A1, B1, C1: ánh sáng trắng A2, B2, C2: ánh sáng kích thích có bước sóng 530 – 550 nm Trong cặp đơi A1, A2 chuột bên trái chuột không mang gen, chuột bên phải mang gen biểu huỳnh quang egfp B1, B2: Chuột không mang gen biểu huỳnh quang egfp C1, C2: Chuột mang gen biểu huỳnh quang egfp Nghiên cứu Joel Marh cộng năm 2018 sử dụng trung bình 15 phơi chuột mẹ mang thai hộ (106 phôi chuột mẹ mang thai hộ) [44] Fumiaki Itoi cộng năm 2012 [7] sử dụng chuột mang thai hộ để chuyển 74 phơi, trung bình 18,5 phơi/ chuột mang thai hộ Yi Wu cộng năm 2019 [8] sử dụng trung bình 25,11 (904/36) phơi cho chuột mẹ mang thai hộ Trong nghiên cứu này, thực chuyển phơi vào ống dẫn trứng trung bình 20 phôi vào chuột mẹ mang thai hộ cho kết đáng ghi nhận kết tỉ lệ mang thai bên Nghiên cứu Thomas Kolbe cộng năm 2012 [35] việc chuyển phôi vào chuột mang thai hộ đạt tỉ lệ mang thai cao 95,7% Pablo cộng năm 2017 [11] báo cáo tổng số 391 chuột sử dụng để chuyển phơi, có 333 chuột mang thai, đạt tỉ lệ mang thai 85,2% Dựa vào bảng 10 nghiên cứu cho thấy 14 lần chuyển phôi cho 14 chuột mẹ 50 mang thai hộ thành công với tỉ lệ mang thai 100% Cũng nghiên cứu này, Pablo cộng báo cáo tổng số 5029 phơi chuyển có 1824 chuột sinh chiếm tỉ lệ 36,26% Trong nghiên cứu chúng tôi, lô đối chứng phôi không vi tiêm, thu nhận tỉ lệ chuyển phơi 71,83% thí nghiệm sử dụng phôi vi tiêm DNA thu nhận tỉ lệ chuyển phôi 65,69% Mặc dù nhiều nghiên cứu chứng minh egfp không gây hại cho tế bào xem dấu hiệu nhận biết việc chuyển gen vào phôi hay tế bào, nhiên Mohamed S Hassanane cộng năm 2017 [29] chứng minh việc chuyển gen ngoại lại vào tế bào làm giảm khả phân chia thành tế bào, điều lí giải kết chuyển phôi lô đối chứng không vi tiêm egfp vào hợp tử giai đoạn hai tiền nhân lại có kết chuyển phơi mang thai cao lơ thí nghiệm Về việc chuyển phơi Masahito Ikawa cộng nghiên cứu họ sử dụng 12 chuột mang thai hộ, ghi nhận chuột mang thai chiếm tỉ lệ 75% Pablo Gonza´lez-Jara năm 2017 chuyển phôi giai đoạn tế bào vào ống dẫn trứng tổng số 391 chuột chuyển phơi có 333 chuột mang thai đạt tỉ lệ thành công 85,2% tổng số 5029 phôi chuyển có 1824 phơi chuyển thành cơng chiếm tỉ lệ thành công 36,26% [11] Như kết cho thấy tiềm việc chuyển phơi từ vị trí ống dẫn trứng mang lại kết khả quan mặt chuyển phôi tỉ lệ chuột mẹ mang thai Nakatashi T cộng năm 2002 [45] báo cáo đạt tỉ lệ 3,2% (150/4739) Masahito Ikawa cộng năm 1995 [3] thực vi tiêm gfp vào hợp tử giai đoạn hai tiền nhân, số 166 hợp tử vi tiêm chuyển phơi, có 16 chuột sinh đạt tỉ lệ 9,6% có chuột có biểu phát sáng huỳnh quang đạt tỉ lệ 3% Cũng sử dụng phương pháp vi tiêm DNA vào tiền nhân, Minoru Kato cộng Đại học Tokyo [31] báo cáo, số phơi biểu egfp có 38% phơi chuyển gen egfp (chiếm tỉ lệ 13% phôi vi tiêm), có tới 62% phơi dạng khảm (chiếm 24% phôi vi tiêm) Seiya Mizuno cộng năm 2014 [10] báo cáo trình vi tiêm hỗn hợp DNA vào hợp tử giai đoạn hai tiền nhân sinh chuột 51 dạng khảm (chiếm 23,3%) Nghiên cứu ghi nhận 2/134 chuột sinh phát sáng huỳnh quang (hình 41) ánh sáng kích thích, đạt tỉ lệ 1,49% kết khiêm tốn so với nghiên cứu giới Như đề cập trên, để tạo động vật biến đổi di truyền, tùy theo mục đích sử dụng mà chuột chọn lựa phù hợp Các nghiên cứu liên quan đến việc tạo chuột biến đổi gen sử dụng chuột chủng, điều kiện khơng cho phép, Việt Nam chưa có chuột chủng để nghiên cứu mà chủ yếu chuột nhắt trắng có biến đổi gen (chuột khơng chủng), điều lí giải tỉ lệ tạo chuột phát sáng huỳnh quang có kết thấp Tuy nhiên, kết nghiên cứu góp phần cho thấy tiềm lớn việc thực nghiên cứu liên quan đến việc tạo chuột chuyển gen phương pháp Crispr/cas mà giới đẩy mạnh nghiên cứu nhằm đưa nghiên cứu Việt Nam tiến đến gần với nghiên cứu giới 52 V KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ Kết luận Nghiên cứu thực tiến độ mục tiêu đề ban đầu như: - Thu mơ hình chuột đực bất thụ với tỉ lệ thành công 80% - Tạo thành công chuột mang thai giả đạt tỉ lệ 81,67%, ghi nhận 100% chuột chuyển phôi thông qua ống dẫn trứng có dấu hiệu mang thai, tỉ lệ chuyển phôi tự nhiên 71,83%, phôi vi tiêm DNA ngoại lai 65,69% - Chọn phương pháp Chuyển phôi sau vi tiêm DNA vào ống dẫn trứng nhằm tạo chuột biến đổi di truyền - Tạo thành công chuột mẹ mang thai hộ với tỉ lệ thành công cao (100%), tất 14 chuột sử dụng làm chuột mẹ mang thai hộ có dấu hiệu mang thai ổn định qua lần chuyển phôi - Tạo thành công chuột phát sáng huỳnh quang egfp với tỉ lệ 1,49% Đề nghị - Tiếp tục nghiên cứu việc tạo chuột biến đổi di truyền 53 VI TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] F A Ran, P D Hsu, J Wright, V Agarwala, D A Scott, and F Zhang, “Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system,” Nat Protoc., vol 8, no 11, pp 2281–2308, 2013 [2] S Kawamoto et al., “A novel reporter mouse strain that expresses enhanced green fluorescent protein upon Cre-mediated recombination,” FEBS Lett., vol 470, no 3, pp 263–268, 2000 [3] M Ikawa, K Kominami, Y Yoshimura, K Tanaka, Y Nishimune, and M Okabe, “Green fluorescent protein as a marker in transgenic mice,” Development, Growth & Differentiation, vol 37, no pp 455–459, 1995 [4] A J Modzelewski, S Chen, B J Willis, K C K Lloyd, J A Wood, and L He, “Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology,” Nat Protoc., vol 13, no 6, pp 1253–1274, 2018 [5] L Cui et al., “Transcervical Embryo Transfer in Mice,” vol 53, no 3, 2014 [6] L M Ittner, “Pronuclear injection for the production of transgenic mice,” 2007 [7] F Itoi et al., “Offspring from Mouse Embryos Developed Using a Simple Incubator-Free Culture System with a Deoxidizing Agent,” PLoS One, vol 7, no 10, 2012 [8] Y Wu et al., “Generating viable mice with heritable embryonically lethal mutations using the CRISPR-Cas9 system in two-cell embryos,” Nat Commun., vol 10, no 1, 2019 [9] A Sarvari, M M Naderi, and M R Sadeghi, “A Technique for Facile and Precise Transfer of Mouse Embryos,” vol 5, no 1, pp 3–6, 2013 [10] S Mizuno et al., “Simple generation of albino C57BL/6J mice with G291T mutation in the tyrosinase gene by the CRISPR/Cas9 system,” Mamm Genome, vol 25, no 7–8, pp 327–334, 2014 [11] P González-Jara, T Fontela, E López-Mimbela, M Cereceda, D Del Olmo, and M Moreno, “Optimization of the balance between effort and yield in unilateral surgical transfer of mouse embryos,” Lab Anim., vol 51, no 6, pp 622–628, 2017 54 [12] A Cho, N Haruyama, and A B Kulkarni, “Generation of transgenic mice,” Curr Protoc Cell Biol., no SUPPL 42, pp 1–22, 2009 [13] R Carballada, T Degefa, P Esponda, and C D I Biolo, “Transfection of Mouse Eggs and Embryos Using DNA Combined to Cationic Liposomes,” vol 365, no January, pp 360–365, 2000 [14] N V T Pham Hoang Anh, Pham Truong Duy, Cao Thùy Khanh, Bui Hong Thuy, “ESTABLISHMENT OF GFP MOUSE EMBRYOS USING INTRACYTOPLASMIC INJECTION OF PRESERVED GFP SPERMATOZOA AT -80 DEGREE C.pdf.” [15] S D Ramos, J M Lee, and J D Peuler, “An inexpensive meter to measure differences in electrical resistance in the rat vagina during the ovarian cycle,” pp 667–670, 2001 [16] S Achiraman et al., “Biochemical Analysis of Female Mice Urine with Reference to Endocrine Function : A Key Tool for Estrus Detection Biochemical Analysis of Female Mice Urine with Reference to Endocrine Function : A Key Tool for Estrus Detection,” 2011 [17] A K Champlin, D L Dorr, and A H Gates, “Determining the Mouse the Stage by the of the Estrous Cycle in Appearance of the Vagina mice,” Biol Reprod., vol 8, pp 191–194, 1973 [18] S L Byers, M V Wiles, S L Dunn, and R A Taft, “Mouse Estrous Cycle Identification Tool and Images,” vol 7, no 4, pp 1–5, 2012 [19] I T Performance, “Visual Guide to the Mouse Estrous Cycle JAX ® Mice Pup Appearance by Age,” vol 7, no 4, 2012 [20] T Yener, A T Tunc, H Aslan, H Aytan, and A C Caliskan, “Determination of Oestrous Cycle of the Rats by Direct Examination : How Reliable ?,” vol 77, pp 75–77, 2007 [21] A S Aguiar, A E Speck, I M Amaral, P M Canas, and R A Cunha, “The exercise sex gap and the impact of the estrous cycle on exercise performance in mice,” Sci Rep., vol 8, no 1, pp 1–8, 2018 [22] C Fu, K Begum, and P A Overbeek, “Primary ovarian insufficiency induced by fanconi anemia e mutation in a mouse model,” PLoS One, vol 11, no 3, pp 1– 55 13, 2016 [23] J D Vidal and A J Filgo, “Evaluation of the Estrous Cycle, Reproductive Tract, and Mammary Gland in Female Mice,” Curr Protoc Mouse Biol., vol 7, no 4, pp 306–325, 2017 [24] C Caligioni, “NIH Public Access,” pp 1–11, 2010 [25] F A La et al., “Mouse sperm begin to undergo acrosomal exocytosis in the upper isthmus of the oviduct,” Dev Biol., vol 411, no 2, pp 172–182, 2016 [26] Y Li, Q Wei, J Feng, M Xu, R Huang, and F Shi, “Expression of bone morphogenetic protein , , and related components of the BMP signaling pathway in the mouse uterus during the estrous cycle *,” vol 15, no 7, pp 601– 610, 2014 [27] H Jang, “Regulation of Cyclic AMP-Response Element Binding Protein Zhangfei ( CREBZF ) Expression by Estrogen in Mouse Uterus,” vol 22, no 1, pp 95– 104, 2018 [28] J M Walker, Transgenic mouse metholds and protocols [29] M S Hassanane et al., “First study of sperm mediated gene transfer in Egyptian river buffalo,” J Genet Eng Biotechnol., 2017 [30] M Ikawa, K Kominami, Y Yoshimura, K Tanaka, Y Nishimune, and M Okabe, “A rapid and non-invasive selection of transgenic embryos before implantation using green fluorescent protein (GFP),” FEBS Lett., vol 375, no 1– 2, pp 125–128, 1995 [31] M Kato, K Yamanouchi, M Ikawa, M Okabe, K Naito, and H Tojo, “Efficient selection of transgenic mouse embryos using EGFP as a marker gene,” Mol Reprod Dev., vol 54, no 1, pp 43–48, 1999 [32] B Ghassemi, M Shamsara, M Soleimani, J Kiani, and M Rassoulzadegan, “Pipeline for the generation of gene knockout mice using dual sgRNA CRISPR/Cas9-mediated gene editing,” Anal Biochem., 2018 [33] M Okabe, M Ikawa, K Kominami, T Nakanishi, and Y Nishimune, “‘Green mice’ as a source of ubiquitous green cells,” FEBS Lett., vol 407, no 3, pp 313– 319, 1997 56 [34] M B & T W Satoshi Hishigami, Sayaka Wakayama, Nguyen Van Thuan, Hiroshi Ohta, EiJi Mizutani, Takafusa Hikichi, Hong-Thuy Bui, Sebastian Balbach, Atsuo Ogura, “Production of cloned mice by somatic cell nuclear transfer,” Nat Protoc., vol 1, no 1, pp 125–138, 2006 [35] T Kolbe, R Palme, C Touma, and T Ru, “Repeated Use of Surrogate Mothers for Embryo Transfer in the Mouse Parameters of Reproduction,” vol 86, no June 2011, pp 1–6, 2012 [36] H Chin and C L Wang, “Utero-Tubal Transfer of Mouse Embryos,” vol 81, pp 77–81, 2001 [37] E G Lavoie, I Go, D Aranda, and J Se, “Changes in expression and activity levels of ecto- ¢ -nucleotidase / CD73 along the mouse female estrous cycle,” pp 191–197, 2010 [38] C C Paccola, C G Resende, T Stumpp, S M Miraglia, and I Cipriano, “The rat estrous cycle revisited : a quantitative and qualitative analysis,” pp 677–683, 2013 [39] S Mahjabeen, M K Hatipoglu, D M Benbrook, S D Kosanke, D GarciaContreras, and L Garcia-Contreras, “Influence of the estrus cycle of the mouse on the disposition of SHetA2 after vaginal administration,” Eur J Pharm Biopharm., vol 130, no July, pp 272–280, 2018 [40] G Manzano Nieves et al., “Early life stress delays sexual maturation in female mice,” Front Mol Neurosci., vol 12, no February, pp 1–12, 2019 [41] M Aly, “Pathological and Hormonal Effects of Aflatoxins on Reproduction of Female Albino Rats,” no October, 2015 [42] N Bagheripour, S Zavareh, M T Ghorbanian, S H Paylakhi, and S R Mohebbi, “Changes in the expression of OCT4 in mouse ovary during estrous cycle,” vol 8, no 1, pp 43–48, 2017 [43] C a Pinkert, M H Irwin, L W Johnson, and R J Moffatt, “Mitochondria transfer into mouse ova by microinjection.,” Transgenic Res., vol 6, no 6, pp 379–83, 1997 [44] J Marh et al., “Hyperactive self-inactivating piggyBac for transposase-enhanced pronuclear microinjection transgenesis,” Proc Natl Acad Sci., vol 109, no 47, 57 pp 19184–19189, 2012 [45] T Nakanishi et al., “Fish analysis of 142 EGFP transgene integration sites into the mouse genome,” Genomics, vol 80, no 6, pp 564–574, 2002 58 59