Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giống thuốc lá c9 1 nhằm tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh khảm lá

Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giống thuốc C9-1 nhằm tạo thuốc chuyển gen kháng bệnh khảm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Quỳnh Liên, Phịng Cơng Nghệ Tế Bào Thực Vật, Viên Công Nghệ Sinh Học tận tình hướng dẫn, bảo, giúp đỡ tơi suốt q trình thực khóa luận Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới PGS.TS Chu Hồng Hà, ThS Phạm Thị Vân tập thể cán bộ, học viên, sinh viên Phịng Cơng Nghệ Tế Bào Thực Vật, Viện Công Nghệ Sinh Học tạo điều kiện làm việc, giúp đỡ truyền đạt nhiều kinh nghiệm làm việc q báu st q trình hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo khoa Công Nghệ Sinh Học, Viện Đại Học Mở Hà Nội nhiệt tình giảng dạy tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè nhứng người ln bên tơi, động viên góp ý cho tơi suốt q trình học tập thực khóa luận Hà Nội, tháng 05 năm 2011 Sinh viên Nguyễn Thị Thu Hiền LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Deoxyribonucleic Acid ARN Ribonucleic Acid Bp Base pair dNTPs Deoxy Nucleoside Triphosphate LB Luria and Bertani PCR Polymerase Chain Reaction Taq Thermus aquaticus IAA Indolaxetic Acid NAA α- naphthalenneacetic Acid PVY Ptato virus TMV Tobacco Mosaic virus CMV Cucumber Mosaic virus MS Môi trƣờng theo Murashige Skoog BAP 6- benzenladenine Gus Gen mã hóa enzyme β-glucuronidase RM Môi trƣờng rễ RNAi RNA interfence X-gluc 5-bromo-4- chloro-3- indolyl glucuronide EDTA Ethylene Diamine tetra- acetate Acid LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỞ ĐẦU Thuốc trồng vừa có giá trị kinh tế vừa mơ hình quan trọng nghiên cứu công nghệ sinh học trồng Vì vậy, thuốc đối tƣợng đƣợc sử dụng nhiều nghiên cứu ứng dụng đặc biệt làm đối tƣợng chuyển gen Khảm bệnh phổ biến thuốc lá, bệnh khảm gây thiệt hại nghiêm trọng đến suất chất lƣợng thuốc lá, thuốc sợi vàng Bệnh khảm thuốc hai loại virus TMV (Tobacco mosaic virus) CMV (Cucumber mosaic virus) gây Trong đó, TMV loại virus có phổ ký chủ rộng có tới 230 lồi thuộc 32 họ virus gây hại thực vật đƣợc mô tả sớm nƣớc ta Những phƣơng pháp thông dụng để khắc phục bệnh khảm nhƣ sử dụng giống kháng bệnh, giống bệnh biện pháp canh tác( trồng luận canh thuốc với lúa, vệ sinh đồng ruộng ) Tuy nhiên, biện pháp có tác dụng làm giảm bớt lây lan phát triển bệnh, chủ yếu manh tính chất phịng trừ khơng thể chống lại bệnh mà cịn địi hỏi nhiều thời gian, cơng sức ảnh hƣởng xấu tới môi trƣờng Hiện nay, nhờ tiến kỹ thuật di truyền mà ngƣời ta tạo giống trồng có khả kháng lại bệnh virus gây cách đƣa gen mã hóa protein vỏ (coat protein gene) virus vào genome thực vật Xuất phát từ sở thực tiễn trên, giống thuốc C9-1 đƣợc lựa chọn cho nghiên cứu “ Nghiên cứu qui trình chuyển gen vào giống thuốc C9-1 nhằm tạo thuốc chuyển gen kháng bệnh khảm lá” với nội dung mục đích nghiên cứu: (1) Chuẩn hóa phƣơng pháp chuyển gen vào giống thuốc C9-1 thông qua cấu trúc mang thị gus; (2) Tạo thuốc chuyển gen mang cấu trúc TMV-RNAi; (3) Bƣớc đầu phân tích chuyển gen phƣơng pháp PCR LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY THUỐC LÁ 1.1.1 Phân loại Cây thuốc có tên khoa học là: Nicotinana.sp thuộc ngành hạt kín Angiosper, lớp mầm Dicotylndones, phân lớp Asteridae, hoa mõm sói Scrophulariales, họ cà Solanaceae, chi Nicotiana Trong chi Nicotiana có 5070 lồi, đa số dạng cỏ, số dạng thân đứng, hầu hết dạng dại phụ Căn cƣ́ vào hì nh thái, màu sắc hoa ngƣời ta phân chia thành loại chính: - Lồi Nicotiana tabacum L.: có hoa màu hồng hay đỏ tƣơi Đây là loại phổ biến nhất chiếm 90% diện tí ch th́c lá thế giới - Lồi Nicotiana rustica L.: có hoa màu vàng, chiếm 10% diện tí ch th́c giới - Lồi Nicotiana petunioide L.: có hoa màu trắng , phớt hờng hay tí m Thƣờng chỉ có vƣờn thƣ̣c vật phục vụ ng̀ n dƣ̣ trƣ̃ gen cho lai tạo, đƣợc dùng sản xuất - Loài Nicotiana polidiede L : có hoa màu trắng Lồi cũng đƣợc dùng sản xuất, chủ yếu có vƣờn thực vật học số quốc gia LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình 1.1: Cây thuốc (Nicotiana tabacum L.) Trên giới thuốc đƣợc trồng chủ yếu Châu Á với diện tích canh tác khoảng 2.500.000ha, Châu Mĩ 1.600.000ha Châu Phi khoảng 326.000ha với nhiều loại thuốc khác giống thuốc sợi vàng phổ biến nhất.Vùng trồng thuốc cho chất lƣợng cao tập trung chủ yếu số bang nƣớc Mĩ, Cu Ba, Ấn Độ.Tại Việt Namcây thuốc đƣợc canh tác từ Bắc chí Nam, chủ yếu tỉnh sau: Cao Bằng Lạng Sơn (khu vực phía Bắc), Đà Nẵng, Gia Lai Dak Lak (khu vực miền Trung), Ninh Thuận (khu vực Tây nguyên) Tây Ninh (khu vực phía Nam) 1.1.2 Giá trị thuốc Thuốc (Nicotiana tabacum L.) loại công nghiệp ngắn ngày có tầm quan trọng bậc kinh tế thị trƣờng giới không 33 triệu nông dân 120 quốc gia, mà cịn cho tồn cơng nghiệp - từ nhà máy chế biến, điếu, sản xuất phụ gia, phụ liệu đến hệ thống phân phối tiêu thụ, chí phần ngành sản xuất vật tƣ LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com nông nghiệp phục vụ cho thuốc nhƣ phân bón, thuốc bảo vệ thực vật [10], [15].Trồng thuốc có hiệu cao nhiều so với loại trồng khác (1000- 1200 USD/ khô) [8] Các hãng sản xuất thuốc nƣớc tƣ nhận đƣợc nguồn lợi nhuận khổng lồ từ thuốc Ở nƣớc ta, thuốc cũng mang lại giá trị kinh tế cao, sử dụng hiệu đất đai, góp phần tạo cơng ăn việc làm, tận dụng đƣợc nguồn lao động địa phƣơng, tăng thu nhập cho ngƣời lao động Lợi nhuận cao từ sản xuất thuốc quan tâm nhiều cấp quyền nƣớc, số tỉnh miền núi phía Bắc nhƣ Cao Bằng, Lạng Sơn, thuốc nằm cấu trồng truyền thống, thực mang lại hiệu kinh tế cao Tại An Giang nhờ vào thuốc nên giải đƣợc khoảng 200 lao động với thu nhập trung bình 30.000- 40.000 đồng/ ngày [49] Năm 2010, Tổng công ty thuốc Việt Nam đạt kim ngạch xuất 175 triệu USD, tăng 17% so với năm 2009 Xuất siêu gần 54 triệu USD, nộp ngân sách vƣợt mốc 5.000 tỉ đồng, tăng 6% so với năm 2009 [47] Đời sống, việc làm thu nhập ngƣời lao động đƣợc bảo đảm ổn định Đối với ngành công nghệ sinh học thuốc đƣợc sử dụng nhƣ thực vật mơ hình cho nghiên cứu cũng nhƣ ứng dụng nhờ khả dễ dàng tiến hành nuôi cấy in vitro chuyển gen [26] 1.1.3 Thực trạng phát triển vùng thuốc nguyên liệu Việt Nam Là loại cơng nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao thuốc đƣợc trồng nhiều địa phƣơng nƣớc Diện tích trồng thuốc năm 2008 khoảng 25.000 Theo định hƣớng phủ, dự kiến diện tích trồng thuốc năm 2010 39.200 phát triển ổn định tới năm 2020 40.300 [50] Theo đánh giá chuyên gia, nguyên liệu thuốc vàng sấy LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com nƣớc ta có chất lƣợng tƣơng đối tốt, thay đƣợc nguyên liệu Trung Quốc Công ty TNHH Một Thành viên Viện KTKT thuốc đơn vị đầu nghiên cứu chọn tạo giống thuốc phát triển sản xuất đại trà giống thuốc K326, C9-1, K176 đồng thời sản xuất thử nghiệm thành công số giống lai nhƣ VTL1H, VTL5H vùng núi phía Bắc (theo báo cáo Văn phịng chƣơng trình KC06) hay khảo nghiệm số giống nhƣ RGH04, PVH09, PVH51 khu vực đất cát Gia Lai Những nghiên cứu Công ty TNHH Một Thành viên Viện KTKT thuốc cho thấy quan tâm Tổng công ty thuốc Việt Nam công tác phát triển giống nhằm thúc đẩy phát triển vùng thuốc nguyên liệu nƣớc ta Đặc thù sản xuất thuốc điếu phải có phối trộn nhiều loại nguyên liệu thuốc từ vùng khác để tạo nên tính phong phú sản phẩm Hàng năm, ngành thuốc phải nhập lƣợng đáng kể nguyên liệu từ nƣớc giới nguyên liệu nƣớc cũng đƣợc xuất với số lƣợng đến chục ngàn Sản xuất thuốc lĩnh vực kinh tế cần thiết ngành thuốc Việt Nam đóng góp cho ngân sách Nhà nƣớc bảy ngàn tỷ đồng năm Hút thuốc có ảnh hƣởng xấu đến sức khỏe ngƣời tiêu dùng nên nhà nƣớc có chủ trƣơng hạn chế sản xuất thuốc điếu cho tiêu thụ nội địa Hiện thuốc nguyên liệu sản xuất nƣớc chƣa đáp ứng đủ nhu cầu cho nhà máy thuốc điếu, mặt khác nhu cầu nguyên liệu cho xuất lớn nên Chính phủ khuyến khích phát triển sản xuất nguyên liệu nƣớc Chiến lƣợc phát triển Ngành thuốc Việt nam đến năm 2020 đƣợc Chính phủ phê duyệt, nhấn mạnh chủ chƣơng phát triển thuốc nguyên liệu để hạn chế nhập khẩu, tăng cƣờng xuất khẩu, tạo công ăn việc làm nâng cao hiệu kinh tế cho nhà nông [50] Vùng trồng thuốc Việt Nam tập trung chủ yếu tỉnh miền núi, nên việc phát triển trồng thuốc thực hoá chủ trƣơng Đảng Nhà nƣớc “Xóa đói, giảm nghèo” cho đồng bào dân tộc miền núi Chín tỉnh trồng thuốc tập trung Việt Nam (gồm Cao Bằng, Lạng Sơn, Thái LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nguyên, Bắc Giang, Gia Lai, Đắc Lắc, Ninh Thuận Bình Thuận Tây Ninh) tổng cơng ty hỗ trợ phát triển chiếm 90% diện tích vùng trồng thuốc nguyên liệu Việt Nam Trong năm qua, Tổng công ty cũng không ngừng mở rộng thị trƣờng xuất thuốc nguyên liệu thuốc điếu với giá trị kim ngạch xuất năm 2008 đạt 80 triệu USD 1.2 MỘT SỐ BỆNH THƢỜNG GẶP Ở CÂY THUỐC LÁ 1.2.1 Bệnh virus thuốc Trong sản xuất nông nghiệp thiệt hại bệnh virus gây lớn Đối với hàng năm, thiệt hại thể qua việc giảm suất gây mùa toàn vụ Đối với lâu năm, thân gỗ bệnh virus làm giảm chất lƣợng suất bị nhiễm bệnh mà, mà cịn có nguy lây lan cho khỏe mạnh năm sau [1] Hiện nay, có khoảng 2000 loại virus thực vật đƣợc phát nghiên cứu, số khoảng mợt nƣ̉a nh ững lồi gây hại cho trồng Mức độ thiệt hại bệnh virus gây cho trồng nghiêm trọng, lên tới 95 - 100% Sự thiệt hại dừng mức độ suy giảm suất mà ảnh hƣởng đến chất lƣợng sản phẩm thu hoạch [2] Riêng thuốc thiệt hại kinh tế virus gây thuốc lớn lên tới hàng chục tỷ đồng [40] Bệnh virus làm giảm suất, chất lƣợng thuốc lá, mà nguy truyền bệnh cho khỏe năm sau Mặt khác,virus tiêu diệt, phòng trừ nhƣ bệnh vi khuẩn, nấm, mà chúng tiềm tàng tích lũy làm thoái hoá giống [3] Một số loại bệnh virus thuốc LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bảng 1.1: Bệnh virus thuốc [52] Tên bệnh Tên virus gây bệnh Khảm linh lăng Alfalfa mosaic virus( virus khảm linh lăng) Quăn cúc tần Beet curty top virus ( virus gây bệnh quăn cúc tần) Ngọn bụi Tái tổ hợp Tobacco vein distorting virus (virus gây biến nạp gân thuốc lá) tobacco bushy top virus (virus bụi thuốc lá) Cucumber mosaic virus (virus gây bệnh khảm dƣa chuột) Khảm cà chua Vàng hoại tử rau Vàng hoại tử rau diếp(trong Nicotiana glutinosa) diếp Cịi cọc lạc Bệnh hình Peanut stunt virus hoa Tái tổ hợp Tobacco vein distorting virus ( virus gây bệnh biến dạng hồng gân thuốc lá) tobacco mottle virus( virus gây đốm thuốc lá) Kỵ axit thuốc Tobacco etch virus (virus gây bệnh kỵ axit thuốc lá) Xoăn thuốc Tobacco leaf curl virus (Virus gây xoăn thuốc lá) Khảm thuốc Tobacco mosaic virus( virus gây bệnh khảm thuốc lá) Satellite tobacco mosaic virus (virus gây bệnh khảm thuốc vệ tinh) Hoại tử thuốc Tobacco necrosis virus (virus gây hoại tử thuốc lá) Bung hạt thuốc Tobacco rattele virus (virus gây bung hạt thuốc lá) Đốm vòng thuốc Tobacco ring spot virus (virus gây bệnh đốm vòng thuốc lá) Sọc thuốc Tobacco streak virus (virus gây bệnh sọc thuốc lá) Còi cọc thuốc Tobacco stunt virus (virus gây bệnh còi cọc thuốc lá) Vằn gân thuốc Tobacco vein mottling virus (virus gây bệnh vằn gân thuốc lá) Héo đốm cà chua Tomato spotted wilt virus (virus gây bệnh héo đốm cà chua) Viền gân Potato virus ( virus Y khoai tây) U vết thƣơng Wound tumor virus (virus gây bệnh khối u vết thƣơng) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bảng 3.6 Tỷ lệ sống sót thuốc bầu cát, trấu ngồi nhà lưới Lơ thí Số Số Tỷ lệ Số Số Tỷ lệ nghiệm bầu sống sót sống sót ngồi sống sót bầu (%) nhà lƣới ngồi sống sót nhà lƣới (%) TMV 70 64 91,4 64 58 90,6 WT 75 3 100 Ghi chú: WT đối chứng không chuyển gen 3.2.2 Phân tích chuyển gen TMV_RNAi kháng virus 3.2.2.1 Phân tích khả kháng virus TMV phương pháp lây nhiễm nhân tạo Các dòng thuốc chuyển gen sau 2-3 tuần phát triển khoẻ mạnh nhà lƣới đạt có 5-6 thật với kích thƣớc khoảng 10cm đƣợc thử nghiệm khả kháng virus TMV theo phƣơng pháp lây nhiễm nhân tạo (Herber et al., 1996)[20] Kết sau lần lây nhiễm thu đƣợc 20 không nhiễm bệnh Với mẫu thuốc không nhiễm bệnh tiến hành thu maauc chuẩn bị tách ADN tổng số sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR 37 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com a b Hình 2.4 Cây thu sau lây nhiễm a Cây không bị nhiễm bệnh b Cây biểu bệnh sau lây nhiễm 3.2.2.2 Xác định có mặt gen chuyển ADN tổng số từ mẫu thuốc đƣợc tách chiết sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhằm xác định có mặt gen chuyển mẫu thuốc Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra gel agarose 0,8 % 3.2.2.2.1 Kết tách ADN tổng số Để thực phản ứng PCR trƣớc tiên phải tiến hành tách ADN tổng số có chất lƣợng tốt Bƣớc trình tách chiết ADN nghiền mẫu nitơ lỏng Sau nghiền thành dạng bột mịn bổ sung dung dịch đệm, dung dịch có tác dụng tách pha tốt q trình ly tâm 38 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình 3.3 Kết điện di ADN tổng số gel agarose 0,8% Kết điện di cho thấy băng rõ nét, kết luận tách chiết thành công ADN tổng số phục vụ cho phản ứng PCR 3.2.2.2.2 Kết phản ứng PCR Các không nhiễm bệnh đƣợc thu mẫu để khẳng định có mặt cấu trúc chuyển gen phƣơng pháp PCR Kết phân tích cho thấy, có 18 cây/ 20 cho kết dƣơng tính với phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu TMV/Fi- TMV-Ri (hình 3.4) Đối chứng dƣơng plasmid TMV-RNAi làm khn mẫu Đối chứng âm sản phẩm PCR sử dụng khuôn mẫu ADN tổng số tách chiết từ thuốc không chuyển gen (2 mẫu) cho kết âm tính Điều đảm bảo đoạn gen chuyển khơng có sẵn khơng chuyển gen Nhƣ vậy, kết dƣơng tính với phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu TMV-Fi/TMV-Ri 20 thuốc chuyển gen chứng tỏ thuốc có mang cấu trúc gen cần chuyển 39 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình 3.4 Kết PCR kiểm tra có mặt gen chuyển 20 mẫu thuốc C9-1 M: Thang ADN chuẩn kb, (-) Đối chứng âm sản phẩm PCR sử dụng khuôn ADN tách từ thuốc không chuyển gen; 1- 20: 20 thuốc chuyển gen; (+) Đối chứng dƣơng plasmid TMV-RNAi 40 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã tái sinh thành công thuốc C9-1 từ áp dụng đƣợc quy trình quy trình chuyển gen cho thuốc C9-1sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumerfacien, thuốc chuyển gen biểu hoạt tính GUS Quy trình ứng dụng việc chuyển gen đích mong muốn Biến nạp thành công cấu trúc RNAi mang đoạn gen mã hóa vỏ virus TMV vào thuốc thu đƣợc 58 thuốc chuyển gen Lây nhiễm thành công vào thuốc C9-1 chuyển gen nhằm thử tính kháng virus TMV, kết thu đƣợc có 20/ 58 kháng tốt Kết kiểm tra 20 thuốc chuyển gen cho thấy, có 18 mẫu cho kết dƣơng tính với phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu TMVFi/TMV-Ri, chứng tỏ thuốc có mang cấu trúc chuyển gen Kiến nghị Cần tiếp tục tiến hành đánh giá tính kháng dịng thuốc chuyển gen phƣơng pháp lây nhiễm nhân tạo vơi virus TMV Sau lây nhiễm nhân tạo, kiểm tra có mặt virus TMV phản ứng PCR Tiếp tục theo dõi đánh giá tính kháng mẫu thuốc chuyển gen hệ nhằm tạo đƣợc dòng thuốc có khả kháng TMV ổn định qua nhiều hệ 41 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1]: TS Lê Trần Bình Cơng nghệ sinh học thực vật rong cải tiến trồng, Viện khoa học kỹ thuật Nông Nghiệp Việt Nam, 1997, NXB Nơng Nghiệp [2]: Chu Hồng Hà (2010): Nghiên cứu tạo trồng kháng bệnh virus gây công nghệ ức chế RNA (RNAi) [3]: Trần Văn Hai, Giáo trình Hóa bảo vệ thực vật- Khoa Nông Nghiệp, Đại học Cần Thơ [4]: Vũ Triệu Mân (2007), Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội, giáo trinh Bệnh chuyên khoa, chuyên ngành Bảo vệ thực vật [5]:Đỗ Tiến Phát (2009), Xây dựng quy trình tái sinh thử nghiện khả chuyển gen gus vào thông nhựa ( Pinus merkussi Jungh & De Vries), Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, Đại học Nông Nghiệp Hà Nội [6]: Nguyễn Đức Thành (2003), Chuyển gen thực vật NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội [7]: Phạm Thị Vân , Nguyễn M inh Hùng, Hà Viết Cƣờng , Lê Văn Sơn , Lê Trần Bì nh và Chu Hoàng Hà (2009) Tạo thuốc kháng virus TMV kỹ thuật RNAi Hội thảo Quốc gia Bệnh hại Thực vật Việt Nam , 25-26/7 Viện Nghiên cƣ́u Bông và phát triển NN Nha Hố - Ninh Thuận Tr 32-40 [8]: Phạm Thị Vân, Nguyễn Văn Bắc, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình(2008) Tạo thuốc kháng bệnh virus khảm dƣa chuột kỹ thuật RNAi Tạp chí Cơng nghệ sinh học 6(4A): 679-687 [9]: Phạm Thị Vân (2009), Nghiên cứu tạo thuốc kháng bệnh khảm virus kỹ thuật RNAi, Luận văn thạc sĩ khoa học, Viện sinh thái Tài nguyên sinh vật [10]: Nguyễn Văn Chín, Nguyễn Ngọc Bích (2008) Theo dõi tình hình sâu bệnh hại thuốc làm sở dự báo nghiên cứu biện pháp phòng trừ phục vụ sản xuất thuốc nguyên liệu” Báo cáo khoa học Công ty TNHH 42 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Một thành viên Viện kinh tế kỹ thuật thuốc lá, Tổng công ty thuốc Việt Nam: http://ww.vinataba.com.vn Tài liệu tiếng Anh [11]: Akehurt B.C 1981: Tobacco.longman group Ltd, New York 764pp [12]: Banerjee A.K, Part S, Hannapel D.J (2006), “ Eficient production of transgenic potato ( S.tuberosum L.ssp.andigena) plants via Agrobacterium tumerfaciens- mediated transformation.” Plant Science, 170, pp.732-738 [13]: 32Baulcombe D (2004) RNA silencing in plants Nature 431(7006) : 356-63 [14]: RN (1999) Coat-protein-mediated resistance to tobacco mosaic virus: discovery mechanisms and exploitation Phil Trans R Soc Lond B 354: 659-664 [15]: Bonfim K, Faria JC, Nogueira EO, Mendes EA, Aragão FJ (2007) RNAi-mediated resistance to Bean golden mosaic virus in genetically engineered common bean (Phaseolus vulgaris) Mol Plant Microbe Interact 20(6) : 717-26 [16]: Chicas and Macino, 2001 Charateristics of post- transcriptionnal gene silencing EMBO (11): 992-6 [17]: Colliins W.K; Hawks S.N.Jr: Principles of the flue cured Tobacco production N.C Stale Univercity nd E.d.1993.300 [18]di Nicola-Negri E, Brunetti A, Tavazza M, Ilardi V (2005) Hairpin RNA-mediated silencing of Plum pox virus P1 and HC-Pro genes for efficient and predictable resistance to the virus.Transgenic Res 14(6): 98994 [19]Gottula J, Fuchs M (2009) Toward a quarter century of pathogenderived resistance and practical approaches to plant virus disease control Adv Virus Res 75:161-83 43 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com [20]: Hersbers, K, Meuwly P, Frommer WB, Metraux JP, Sonnewald U (1996a), Systemic Acquired Resistance Mediated by the Ectopic Expression of Invertase Posible Hexose sensing in the secretory Pathway Plant Cell 8: 793- 803 [21]: Hull R, Davies JW (1992) Approaches to nonconventional control of plant virus diseases Crit Rev Plant Sci 11: 17-33 [22]: Ilardi V., Mazzei M., Loreti S., Tomassoli L., barba M., 1995 Biomoleccular and serological methods to identify strains of cucumber mosaic cucumovirus on tomato EPPO Bulletin 25: 321- 327 [23]: Jefferson RA, Burgess SM, Hirsh D (1986) β-Glucuronidase from Escherichia coli as a gene-fusion marker Proc Natl Acad Sci USA 83: 8447– 8451 [24: Jefferson R.A (1987), “ Asaying chimeric gens in plants: The gus gen fussiuon system”, Plant Molecculer Biology Reporter, (5), pp 387- 405 [25: Juliana D, Annika P, Jurith M and Iris S ( 2006), “ The use of the phosphomanose isomerase/ mannose seclection system to recover transgenic apple plants” Plant Cell Rep (25), pp 1149- 1156 [26] Kamachi S, Mochizuki A, Nishiguchi M, Tabei Y (2007) Transgenic Nicotiana benthamiana plants resistant to cucumber green mottle mosaic virus based on RNA silencing Plant Cell Rep 26(8): 1283-8 [27: Owen A.M., Downes, J.D., Sahakian, B.J., Polkey, C.E and Robbins T.W (1990) Planning and spatial working memory following frontal lobe lesions in Man Neuropsychologia, 28 (10), 10211034 [28: Owen & Palukaitis, Virology 166: 495, 1988 [29: Palukaitis, P., Roossinck, M J., Dietzgen, R G., and Francki, R i B 1992 Cucumber mosaic virus Adv Virus Res 41: 281-348 [30: Palukaitis, P., and Zaitlin, M 1997 Replicase – mediated resistance to plant virus disease Adv Virus Res 48: 349-377 44 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com [31: Roossinck MJ (2002): Evolutionnary history of cucumber mosaic virus as deduced by phylogentic analyses J Virol 76: 3382- 3387 [32]Scholthof K-BG, Scholthof HB, Jackson AO (1993) Control of Plant virus diseases by Pathogen-derived resistance in transgenic plants Plant Physiol 102: 7-12 [33]Smith NA, Singh SP, Wang MB, Stoutjesdijl PA, Green AG, Waterhouse PM (2000) Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs Nature 407: 319-20 [34] Stryer Lubert (1988) Third Edition W H Freeman and Company Biochemstry ISBN 0-7167- 1843 [35]Sun ZN, Yin GH, Song YZ, An HL, Zhu CX, Wen FJ (2010) Bacterially Expressed Double-Stranded RNAs against Hot-Spot Sequences of Tobacco Mosaic Virus or Potato Virus Y Genome Have Different Ability to Protect Tobacco from Viral Infection Appl Biochem Biotechnol Epub ahead of print [36]: Smith NA, Singh SP, Wang MB, Stoutjesdijl PA, Green AG, Waterhouse PM (2000) Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs Nature 407: 319-20 [37]: Sun ZN, Yin GH, Song YZ, An HL, Zhu CX, Wen FJ (2010) Bacterially Expressed Double-Stranded RNAs against Hot-Spot Sequences of Tobacco Mosaic Virus or Potato Virus Y Genome Have Different Ability to Protect Tobacco from Viral Infection Appl Biochem Biotechnol Epub ahead of print [38]: Tenllado F, Llave C, Díaz-Ruíz J (2004) RNA interference as a new biotechnological tool for the control of virus diseases in plants.Virus Res 102(1): 85-96 [39] Topping JF(1988), Tobacco tranformation Methods ò Molecular Biology, 81: 365 45 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com [40]Tyagi H, Rajasubramaniam S, Rajam MV, Dasgupta I (2008) RNAinterference in rice against Rice tungro bacilliform virus results in its decreased accumulation in inoculated rice plants Transgenic Res 17(5): 897-904 [41]Vanderschuren H, Alder A, Zhang P, Gruissem W (2009) Dosedependent RNAi-mediated geminivirus resistance in the tropical root crop cassava Plant Mol Biol 70(3):265-72 [42]: Wahyuni, W.S., Dietzegen, R G., Hanada, K., and Francki, R.I.B 1992 Seorological and biological variatinon bwtwwen and within subgroup I and II strains of cucumber mosaic virus Plant Pathol 41: 282- 297 [43]:Waterhouse PM, Graham MW, Wang MB (1998) Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA Proc Natl Acad Sci USA 95(23):13959-64 [44] 42Wesley SV, Helliwell CA, Smith NA, Wang MB, Rouse DT, Liu Q, Gooding PS, Singh SP, Abbott D, Stoutjesdijk PA, Robinson SP, Gleave AP, Green AG, Waterhouse PM (2001) Construct design for efficient, effective and high-throughput gene silencing in plants Plant J 27(6): 581-90 [45]: Wesley SV et al (2001) Constructs for efficient, effective and high throughput gene silencing in plants Plant J 27: 581–590 [46]: Zrachya A, Kumar PP, Ramakrishnan U, Levy Y, Loyter A, Arazi T, Lapidot M, Gafni Y (2007) Production of siRNA targeted against TYLCV coat protein transcripts leads to silencing of its expression and resistance to the virus Transgenic Res 16(3): 385-98 Trang web: [47]: http://www.vinataba.com.vn/?module=viewnews&id=316 [48]: http://www.vinataba.com.vn/?module=viewnews&id=316 [49]: http://dantri.com.vn/kinhdoanh/An-Giang-Thoat-ngheo-nho-cay-thuocla/2008/4/226146.vip 46 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com [50]: Quyết định 88/2007/QĐ-TTg, http://www.vinataba.com.vn/toanvan.htm [51]:http://www.hanghoaviet.com/vietnamproducts/vi/news/Trong-caygi/DV2962-giong-ca-chua-chiu-nhiet-va-khang-benh-xoan-la-virus-4637/ [52]: http://www.apsnet.org/online/comcom/names/tobacco.asp 47 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phụ lục Phụ lục Thành phần mơi trƣờng MS THÀNH PHẦN MUỐI KHỐNG CƠ BẢN CỦA MÔI TRƢỜNG MS (Murashige Skoog, 1962) SKOOG I SKOOG II SKOOG III NH4NO3: 1650mg/l FeSO4.7H2O: 27,8mg/l KI: O,83 mg/l KON3: 1900 mg/l MnSO4.4H2O: 22,3mg/l Na2MoO4.2H2O: 0,25mg/l KH2PO4: 170mg/l H3BO4: 6,2mg/l CuSO4.5H2O: 0,0025mg/l MgSO4.7H2O: 370mg/l ZNSO4.7H2O: 8,6mg/l CoCl2 6H2O : 0,025 mg/L CaCl2.2H2 : 440 mg/L Na2EDTA : 37,3 mg/L Và nguyên tố đa lƣợng N P K Ca Mg S, vi l ƣ ợng Fe Zn B Co N Mn Cu Al Mo I 48 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phụ lục 2: Thành phần môi trƣờng nuôi cấy Môi trƣờng Thành phần Nuôi cấy MS(I-V) +30g/l glucose, 8g/l agar, pH5,8 Lây nhiễm ½ MS(I-V) , pH 5,8 Tạo mô sẹo MS (I-V) +1mg/l BAP+ 30g/l glucose+ 8g/l agar, pH5,8 Tạo chồi MS (I-V) +250mg/l cefotaxime + 50mg/l kanamycine + 30g/l glucose +8g/l agar, pH5,8 Ra rễ MS (I-V) + 0,1mg/l NAA + 30g/l glucose+ 8g/l agar, pH5,8 LB lỏng Bacto pepton 10g/l + NaCl 10g/l + Yeast extract 5g/l pH LB aga LB lỏng + 16 g/l aga Dung dịch X-Gluc 50 mM Na2HPO4 NaH2PO4; pH7; 10mM[K3(Fe(CN)6]; 10mM K4[(Fe(CN)6]; 10 mM Na2EDTA; 0,1% Triton-100; 1,5mM X-glucuronide Phụ lục 49 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY THUỐC LÁ 1.1.1.Phân loại 1.1.2 Giá trị thuốc 1.1.3 Thực trạng phát triển vùng thuốc nguyên liệu Việt Nam 1.2 MỘT SỐ BỆNH THƢỜNG GẶP Ở CÂY THUỐC LÁ 1.2.1 Bệnh virus thuốc 1.2.2 Bệnh khảm virus 10 1.3 BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC 14 1.3.1 Sử dụng giống kháng bệnh: 14 1.3.2.Sử dụng giống bệnh 15 1.3.3 Các biện pháp canh tác 15 1.3.4 Sử dụng biện pháp công nghệ sinh học 15 1.3.4.1 Giới thiệu chung công nghệ RNAi tạo trồng kháng virus 18 1.3.4.2 Cơ chế hoạt động RNAi 18 1.4 MỘT SỐ THÀNH TỰU TẠO CÂY CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS Ở VIỆT NAM 19 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 21 2.1 VẬT LIỆU 21 2.1.1.Vật liệu thực vật 21 2.1.2.Chủng vi khuẩn vector chuyển gen: 21 2.1.3.Hóa chất thiết bị sử dụng 22 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.2.1.Tạo nguyên liệu thí nghiệm: 22 2.2.1.1.Khử trùng hạt khí Clo 22 2.2.1.2 Gieo hạt 22 2.2.2.Chuyển gen vào thuốc thông qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumafaciens 23 2.2.2.1.Tạo dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium 23 50 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.2.2.2 Tạo nguyên liệu chuyển gen 23 2.2.2.3.Nhiễm khuẩn đồng nuôi cấy 23 2.2.2.4.Tái sinh chọn lọc chuyển gen 24 2.2.2.5.Tạo rễ hoàn chỉnh 24 2.2.3.Phân tích chuyển gen phƣơng pháp nhuộm mơ hóa tế bào 24 2.2.4 Phân tích có mặt cấu trúc chuyển gen TMV_RNAi phƣơng pháp PCR 25 2.2.4.1 Tách chiết ADN tổng số 25 2.2.4.2 Thực phản ứng PCR 25 2.2.5 Phân tích khả kháng virus chuyển gen phƣơng pháp lây nhiễm nhân tạo 26 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ CHUYỂN GENVÀO GIỐNG THUỐC LÁ C9-1 THÔNG QUA AGROBACTERIUM TUMAFACIENS 28 3.1.1 Tạo nguyên liệu thực vật cho thí nghiệm chuyển gen 29 3.1.2 Chuyển gen tái sinh 29 3.1.2.1 Đồng nuôi cấy với dung dịch Agrobacterium cảm ứng tạo cụm chồi 29 3.1.2.2 Tạo rễ phát triển hoàn chỉnh 32 3.1.3 Phân tích sơ chuyển gen gus nhuộm hóa mô tế bào 35 3.2 CÁC KẾT QUẢ BƢỚC ĐẦU TRONG TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC TMV-RNAi 35 3.2.1 Tái sinh chuyển gen mang cấu trúc TMV-RNAi 35 3.2.2 Phân tích chuyển gen TMV_RNAi kháng virus 37 3.2.2.1 Phân tích khả kháng virus TMV phương pháp lây nhiễm nhân tạo 37 3.2.2.2 Xác định có mặt gen chuyển 38 3.2.2.2.1 Kết tách ADN tổng số 38 3.2.2.2.2 Kết phản ứng PCR 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 51 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... protein gene) virus vào genome thực vật Xuất phát từ sở thực tiễn trên, giống thuốc C9- 1 đƣợc lựa chọn cho nghiên cứu “ Nghiên cứu qui trình chuyển gen vào giống thuốc C9- 1 nhằm tạo thuốc chuyển gen. .. Ở CÂY THUỐC LÁ 1. 2 .1 Bệnh virus thuốc 1. 2.2 Bệnh khảm virus 10 1. 3 BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC 14 1. 3 .1 Sử dụng giống kháng bệnh: 14 1. 3.2.Sử dụng giống. .. công thuốc C9- 1 từ áp dụng đƣợc quy trình quy trình chuyển gen cho thuốc C9- 1sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumerfacien, thuốc chuyển gen biểu hoạt tính GUS Quy trình ứng dụng việc chuyển gen