Nghiên cứu tạo chủng pseudomonas fluorescens chuyển gen crylac từ vi khuẩn bacillus thuringiensis kháng sâu khoang trên cây cải xanh

SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN TP HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG PSEUDOMONAS FLUORESCENS CHUYỂN GEN Cry1Ac TỪ VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS KHÁNG SÂU KHOANG TRÊN CÂY CẢI XANH Mã số: TP01/13-15 Chủ nhiệm đề tài: ThS Phạm Văn Hiểu Cán thực hiện: ThS Phạm Văn Hiểu ThS Đinh Thị Sáu Thành phố Hồ Chí Minh, tháng năm 2016 MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iii DANH SÁCH BẢNG iv DANH SÁCH HÌNH v TÓM TẮT I THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI II ĐẶT VẤN ĐỀ Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài III TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3.1 Tổng quan tài liệu 3.1.1 Tình hình sản xuất rau màu nước ta 3.1.2 Các phương pháp phòng trừ sâu rau 3.1.3 Tổng quan Bacillus thuringiensis 3.1.3.1 Lịch sử phát triển 3.1.4 Giới thiệu vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 13 3.1.5 Sâu khoang 15 IV VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 4.1 Vật liệu nghiên cứu 16 4.1.1 Vector chủng vi khuẩn 16 4.2.3 Các đoạn mồi sử dụng trình nghiên cứu 16 4.2 Phương pháp nghiên cứu 17 4.2.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens dùng làm vật chủ biểu gene Cry 17 4.2.2 Chọn lọc gene Cry thích hợp cho chế phẩm 18 4.2.3 Tạo dịng plasmid mang gen mã hóa cho promoter tac, ter Kanmycin 18 4.2.4 Biểu protein Bt tái tổ hợp 22 4.3 Phân tích hoạt lực diệt sâu quy mơ phịng thí nghiệm 28 V KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29 5.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens dùng làm vật chủ chuyển gen Cry1Ac 29 5.2 Thiết kế vector pUCBtAc mang gen mục tiêu Bt 30 5.2.1.Tổng hợp tạo dòng promoter Tac 30 5.2.2 Cloning gen kháng Kanmycine (Kan) vào pJet-Tac 33 5.2.3 Cloning đoạn gen Terminator (Ter) vào pUCBt 35 i 5.2.4 Cloning đoạn gen tổ hợp Kan-Tac vào pUDBt-Ter 38 5.3 Sự biểu protein Bt từ dòng vi khuẩn E.coli BL21-DE3 Pseudomonas fluorescens 39 5.3.1 Kiểm tra diện pUDBtAc E.coli BL21-DE3 Pseudomonas fluorescens sau biến nạp 39 5.3.2 Kiểm tra biểu protein Bt SDS-PAGE Pseudomonas fluorescens 41 5.3.3 Kiểm tra biểu protein Bt phương pháp DAS-ELISA 42 5.4 Đánh giá hoạt lực diệt sâu quy mơ phịng thí nghiệm 42 VI KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 6.1 Kết luận 46 6.2 Đề nghị 46 VII TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 8.1 Tiếng việt 47 8.2 Tiếng Anh 48 VIII PHỤ LỤC 51 ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay BVTV Bảo vệ thực vật ĐBSH Đồng sông Hồng ĐBSCL Đồng sông Cửu Long Bt Bacillus thuringiensis P fluorescens Pseudomonas fluorescens Ǻ Angstron 10-10m ( 0.1 nm) Amp Ampicillin Tac Promoter Tac Kan Kanamycin Ter Terminator kDa Kilodalton PCR Polymerase Chain Reaction Đối chứng (-) Đối chứng âm Đối chứng (+) Đối chứng dương iii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Hệ thống phân loại Bt Trang 10 Bảng 4.1 Trình tự đoạn mồi thiết kế sử dụng trình nghiên cứu Trang 17 Bảng 4.2 Các chất dùng phản ứng DAS-ELISA Trang 27 Bảng 4.3 Bảng thống kê thí nghiệm hiệu lực diệt sâu độc tố Bt (Cry1Ac) Trang 28 Bảng 5.4 Kết thử nghiệm hiệu lực diệt sâu prorein Bt Trang 44 iv DANH MỤC HÌNH Ảnh chụp kính hiển vi điện tử bào tử (S) tinh thể chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis-125 HD Trang 10 Hình 3.2 Cấu trúc tinh thể 3-D Cry8Ea 2.20 Ǻ Trang 11 Hình 3.3 Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens Trang 13 Hình 3.4 Vịng đời sâu khoang (Spodoptera litura) Trang 15 Hình 4.1 Quá trình extension từ hai phía tiến hành PCR Trang 19 Hình 5.1 Kết cấy ria Pseudomonas fluorescens môi trường King’B Trang 29 Hình 5.2 Kết nhuộm vi khuẩn Pseudomonas fluorescens chụp qua kính hiển vi Trang 29 Hình 5.3 Kiểm tra xác định chủng Pseudomonas fluorescens PCR Trang 30 Hình 5.4 Kết điện di kiểm tra sản phẩm promoter Tac tổng hợp Hình 3.1 phương pháp PCR Trang 31 Hình 5.5 Kết điện di kiểm tra sản phẩm kết tủa promoter Tac sau kết tủa Trang 31 Hình 5.6 Sản phẩm PCR khuyếch đại promoter Tac cặp mồi Jet1.2F/pJet1.2R sau nhân dòng với pJet1.2/blunt Trang 32 Hình 5.7 Kết điện di sản phẩm cắt vector pJet-Tac cặp enzyme KpnI BamHI Hình 5.8 Kết diện di kiểm tra sản phẩm PCR khuyếch đại đoạn gen kháng kanamycin từ pK7GWIWG2(II)/CP-CyMV cặp mồi Fkd/Rkd Trang 32 Trang 33 Kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen Kan từ khuẩn lạc giả định dương tính mang plasmid tái tổ hợp pJet-TK Trang 34 Kết diện di sản phẩm cắt vector pJet-KT có chứa đoạn gen Kan+Tac Trang 34 Hình 5.11 Kết điện di sản phẩm PCR kiểm tra chiều nối gen Kan vào pJet-Tac Trang 35 Hình 5.12 Kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen Ter từ vector pUCIDT cặp mồi Fter/Rter sản phẩm Ter tinh cắt với PstI Hind III Trang 36 Hình 5.9 Hình 5.10 v Hình 5.13 Hình 5.14 Kết điện di sản phẩm sàng lọc dòng tế bào mang vector tái tổ hợp pUDBt-Ter phương pháp PCR với cặp mồi Fter/Rte Trang 37 Kết điện di sản phẩm cắt đoạn gen terminator từ vector Trang 37 pUCIDT enzyme HindIII PstI Hình 5.15 Kết điện di sản phẩm PCR sàng lọc gen Kan khuẩn lạc giả định dương tính mang vector tái tổ hợp pUDBtAc cặp mồi Trang 38 Fkd/Rkd Hình 5.16 Kết điện di PCR sản phẩm cắt vector pUDBtAc Trang 39 Hình 5.17 Sơ đồ thiết kế vector biểu pUDBtAc mang gen Bt Trang 39 Hình 5.18 Kết điện di sản phẩm PCR sàng lọc dòng tế bào E.coli BL21-DE3 Pseudomonas fluorescens mang vector pUDBtAc cặp mồi Fkd/ Rkd Trang 30 Kết điện di sản phẩm PCR sàng lọc dòng tế bào E.coli BL21-DE3 Pseudomonas fluorescens mang vector pUDBtAc cặp mồi Fbt1/ Rbt1 Trang 30 Hình 5.20 Kết điện di sản phẩm cắt vector pUDBtAc tách từ E.coli BL21 DE3 Pseudomonas fluorescens Trang 41 Hình 5.21 Kết chạy điện di SDS-PAGE kiểm tra biểu protein Bt- Trang 41 Hình 5.19 Cry1Ac chủng Pseudomonas fluorescens Hình 5.22 Kiểm tra biểu protein Bt phương pháp ELISA Trang 42 Hình 5.23 Kiểm tra hiệu lực diệt sâu protein Bt Trang 43 Hình 5.24 Hiệu lực diệt sâu protein Bt Trang 44 Hình 5.25 Kiểm tra ảnh hưởng protein Bt lên cải xanh Trang 46 vi TÓM TẮT Độc tố Delta-endotoxin từ Bacillus thuringiensis (Bt) thương mại hóa từ năm 1958 để sản xuất chế phẩm vi sinh có hoạt tính kháng sâu Đề tài thiết kế thành cơng vector biểu pUDBtAc mang gen mã hóa protein Cry1Ac(65 kDa); độc tố biểu thông qua hệ thống biểu vi khuẩn Pseudomonas fluorescens với nồng độ chất cảm ứng IAA 200µM- 400 µM bước đầu xác định hiệu lực diệt sâu khoang (Spodoptera litura) 44 % quy mơ phịng thí nghiệm Việc tạo vector pUDBtAc biểu thành công protein Cry1Ac làm sở khoa học cho nghiên cứu phát triển chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học I THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI Tên đề tài: “Nghiên cứu tạo chủng Pseudomonas fluorescens chuyển gen Cry1Ac từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis kháng sâu khoang cải xanh” Mã số MT-TP01/ 13-15 Cơ quan quản lý: Trung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM Địa chỉ: 2374, Quốc lộ 1, Phường Trung Mỹ Tây, Quận 12, TP HCM Điện thoại: 08-38225202 Cơ quan chủ trì: Phịng CNSH Thực Vật, Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Tp HCM Địa chỉ: 2374, Quốc lộ 1, Phường Trung Mỹ Tây, Quận 12, TP HCM Điện thoại: 08-371596852 Cơ quan phối hợp chính: Chủ nhiệm đề tài: Ths.Phạm Văn Hiểu Cán bộ/ Nhóm thực hiện: ThS Phạm Văn Hiểu, ThS Đinh Thị Sáu Thời gian thực hiện: năm (từ 6/2013- 6/2016) Kinh phí duyệt: 450 triệu đồng Kinh phí sử dụng: 450 triệu đồng 10 Mục tiêu đề tài: Mục tiêu tổng quát: - Xây dựng quy trình chuyển gen kháng sâu Cry1A(c) vi khuẩn Bacillus thurigiensis vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens Đánh giá hoạt lực trừ sâu quy mơ phịng thí nghiệm nhằm tạo tiền đề cho việc phát triển thuốc trừ sâu sinh học Bt phòng trừ sâu ăn rau Mục tiêu cụ thể: - Tạo dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens mang gen kháng sâu Cry1A(c) vi khuẩn Bacillus thurigiensis - Tối ưu hóa khả biểu thử nghiệm hoạt lực sâu quy mơ phịng thí nghiệm nhằm tạo chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học Bt phòng trừ sâu ăn rau 11 Các nội dung nghiên cứu thực so với đề cương đăng ký Thời gian (bắt Kết thực đầu – kết thúc) Tuyển chọn chủng vi 7/2013-8/2013 Đã tuyển chọn thành công khuẩn Pseudomonas fluorescen khuẩn Pseudomonas dùng làm vật chủ chuyển gen fluorescens dùng làm vật chủ chuyển gen Bt (Cry1Ac) Bt (Cry1Ac) Nhân dòng gene Bt 9/2013-3/2014 Cấu tạo thành công vector biểu (Cry1Ac) tạo pUDBtAc mang gen Bt (Cry1Ac) vector biểu mang gen Bt (Cry1Ac) Biến nạp vector biểu 4/2014-12/2014 Biến nạp thành công vector mang gen mục tiêu vào đạt vào P fluorescens P.fluorescens tiến hành chọn lọc thu nhận chủng có hoạt tính tốt Biểu đạt độc tố Bt 1/2015-10/2015 Đã biểu đạt thành công protein vi khuẩn Cry1Ac vi khuẩn f.luorescens P.fluorescens Phân tích hoạt lực 11/2015Đã thử nghiệm hoạt lực diệt diệt sâu quy mô 06/2016 sâu quy mơ phịng thí phịng thí nghiệm nghiệm STT Nội dung đăng ký Đánh giá Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đồ thị 5.4.1: Thử nghiệm hoạt lực sâu khoang protein Bt 100.00 90.00 80.00 70.00 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 Tỉ lệ sâu chết trung bình % Chứng âm Tỉ lệ Tỉ lệ 1:10 Tỉ lệ 1:100 Tỉ lệ 1: 1000 Vi-BT 32000 Bacilus 18000 Nước cất Nghiệm thức Mẫu protein tái tổ hợp cho vào thức ăn, sau cho sâu ăn theo dõi sâu chết sau tuần Nồng độ khơng pha lỗng tỉ lệ sâu chết cao 44.44%, hiệu lực diệt sâu 43,82% nồng độ pha loãng cao tỉ lệ chết giảm dần, tỉ lệ sâu chết, hiệu lực diệt sâu tỉ lệ thuận với nồng độ protein, nồng độ pha loãng thấp 1:1000, tỉ lệ sâu chết, hiệu lực diệt sâu thấp so với mẫu mẫu chứng âm (mẫu khuẩn Pseudomonas fluorescens không mang gen Bt) mẫu nước cất Mẫu chứng dương thuốc trừ sâu thương mại, Thuốc trừ sâu sinh học Vi-BT 32000WP Thành phần: Bacillus thurigiensis Var Kurstaki 32000IU/mg Công ty cổ phần thuốc sát trùng Việt Nam, nồng độ sử dụng 11520 IU Thuốc trừ sâu sinh học BICILUS 18WP Thành phần: Bacillus thurigiensis Var Kurstaki 18000IU/mg Đăng ký phân phối bởi: KING ELONG Co.,Ltd nồng độ sử dụng 6480 IU Trong đó, thuốc trừ sâu Vi-BT tỉ lệ chết 94,44%, mẫu Bicilus cho tỉ lệ chết 51,11% hiệu lực diệt sâu chế phẩm Vi-BT 94,38 % Bicilus 50,56% Theo cách hướng dẫn sử dụng pha loãng theo tỉ lệ 30g/ 25 lít Như vậy, nồng độ Vi-BT cao nồng độ Bicilus 1.78 lần nên tỉ lệ sâu chết Vi-BT cao so với Bicilus 1.85 lần, hiệu lực diệt sâu Vi-BT cao so với Bicilus 1.87 lần Kết phù hợp tỉ lệ sâu chết nồng độ protein Bt hai chế phẩm (Bảng 5.4.1 Đồ thị 5.4.1) Kết thử nghiệm hoạt lực sản phẩm sâu cho thấy sản phẩm có hiệu lực diệt sâu; nồng độ protein Cry1Ac pha loãng 1000 lần, hoạt lực giảm từ 44% xuống 18% 45 A B C Hình 5.25 Kiểm tra ảnh hưởng protein Bt lên cải xanh (Brassica juncea) Mẫu: A chứng âm, B, C: chế phẩm Bt 100 , 10-1 Bên cạnh đó, thử nghiệm chế phẩm protein Bt ảnh hưởng lên cải xanh Mẫu protein tái tổ hợp sử dụng nồng độ pha loãng 1:10, mẫu nước cất phun lên cải xanh theo dõi sau tuần Kết mẫu có chế phẩm protein Bt phát triển bình thường khơng có khác biệt so với mẫu đối chứng (Hình 5.24) Vậy chế phẩm có chứa protein tái tổ hợp khơng ảnh hưởng cải xanh VI KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 6.1 Kết luận - Đã tuyển chọn thành công chủng Pseudomonas fluorescens làm vật chủ phục vụ cho trình nghiên cứu - Tạo dịng thành cơng đoạn gen promoter Tac, Kan, Cry1Ac Ter vào vector tạo dòng pJet1.2/blunt lưu trữ làm nguồn vật liệu quan cho nghiên cứu sau Xây dựng thành công vector biểu pUDBtAc mang gen mã hóa protein Cry1Ac - Biến nạp thành công vector biểu pUDBtAc vào chủng E.coli BL21-DE3 Pseudomonas fluorescens Biểu thành công protein mục tiêu Bt-Cry1Ac chất cảm ứng IAA 200 µM -400µM thể qua kết kiểm tra phương pháp SDS-PAGE kiểm tra ELISA với kháng thể đặc hiệu kháng cry1Ac - Thử nghiệm protein Bt –Cry1Ac sâu khoan cho hiệu lực diệt sâu 44%, không ảnh hưởng đến cải xanh - Tuy đề tài chưa tạo chế phẩm có quy trình thu chế phẩm từ chủng P fluorescens mang gen Cry1Ac từ vi khuẩn B thuringensis; mang ý nghĩa khoa học phục vụ đề tài khác Chẳng hạn vector biểu dùng biểu cho gen khác cần thao tác nhỏ cắt bỏ gen cry1Ac thay vào gen khác Cry1, Sản phẩm tạo có triển vọng để phát triển thành chế phẩm 6.2 Đề nghị Đề tài thiết kế thành công vector biểu pUDBtAc mang gen kháng sâu Cry1Ac, biến nạp thành công vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens, biểu thành công protein Cry1Ac, kiểm tra phương pháp ELISA với kháng thể kháng Cry1Ac thử nghiệm quy mơ phịng thí nghiệm sâu khoang với hiệu lực diệt sâu khoảng 44% Tuy nhiên, nội dung thử nghiệm hoạt lực quy mơ phịng thí nghiệm sâu tiến hành 46 thời gian ngắn, tháng, nên việc thử nghiệm tiến hành loại sâu khoang, chưa thử nghiệm loại sâu khác, protein Cry1Ac chưa đặc hiệu sâu khoang mà đặc sâu khác Cũng lý thời gian thực đề tài ngắn nên chưa nghiên cứu chất cho vào protein Cry1Ac để làm nâng cao hoạt lực diệt sâu Từ hạn chế khó khăn mà đề tài chưa tạo chế phẩm trừ sâu đăng ký sản phẩm đề tài Chúng tơi đề nghị cần có nghiên cứu nhiều loại sâu tinh protein Cry1Ac nghiên cứu chất để tạo sản phẩm Đề tài thu quy trình tạo chủng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens thu nhận chế phẩm protein Cry1Ac VII TÀI LIỆU THAM KHẢO 8.1 Tiếng việt Phạm Văn Lầm Biện pháp canh tác, phòng chống sâu bệnh cỏ dại nông Nghiệp, nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội, 1995 Mai Văn Quyền Những cây rau gia vị ph ổ biến ở Vi ệt Nam, Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội, 1999 Trần Khắc Thi, Phạm Mỹ Linh Rau ăn an toàn - sở khoa học kỹ thuật canh tác, Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội, 2010 Hồ Khắc Tín Giáo trình trùng nơng nghiệp, Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội, 47 1981 Nguyễn Công Thuật Phòng trừ tổng hợp sâu bệnh hại trồng, nghiên cứu ứng dụng, Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội, 1996 8.2 Tiếng Anh Abbott, W S 1925 A method of computing the effectiveness of an insecticides Journal of Economic Entomology, 18: 265-267 Ahmedani MS, Haque MI, Afzal SN, Iqbal U, Naz S (2008) Scope of commercial formulations of Bacillus thuringiensis berliner as an alternative to methyl bromide against Tribolium casta-neum adults Pak J Bot 40(5): 2149–2156 Allan R Shatzman (1998) Recombinant DNA, Principal and Methodologies Approaches to the expression of Forcing Genes SmithKlin Beccham Pharmaceuticals, Kings of Prussia, Pennsulvania, ISBN 0-8247-9989-5: 551-563 Ali S, Zafar Y, Ali GM, Nazir F (2010) Bacillus thuringiensis and its application in agriculture Afr J Biotechnol 9(14): 2022–203 Aronson A, Beckman W, Dunn P (1986) Bacillus thuringiensis and related insect pathogens Microbiol Rev 50: 1–24 Ayyadurai N, Ravindra Naik P, Sakthivel N (2007) Functional characterization of antagonistic fluorescent pseudomonads associated with rhizospheric soil of rice (Oryza sativa L) Journal of Microbiology and Biotechnology 17: 919-927 Bakker, AW and Schippers B (1987) Microbial cyanide productton in the rhizosphere in relation to potato yield reduction and Pseudomonas spp- mediated plant growth stimulation Soil Biol Biochem 19:451–457 Bangera MG., Thomashow LS (1999) Identification and characterization of a gene cluster for synthesis of the polyketide antibiotic 2,4-diacetylphloroglucinol from pseudomonas fluorescens q2-87 Journal of Bacteriology 181: 3155–3163 Barton KA, Whiteley HR, Yang NS (1987) Bacillus thuringiensis delta-endotoxin expressed in transgenic Nicotiana tabacum provides resistance to lepidopteran insects Plant Physiol 85(4): 1103–1109 10 Berbert-Molina MA, Prata AMR, Pessanha LG, Silveira MM (2008) Kinetics of Bacillus thuringiensis var israelensis growth on high glucose concentrations J Ind Microbiol Biotechnol 35(11): 1397–1404 Boonserm P, Davis P, Ellar DJ, Li J (2005) Crystal structure of the mosquitoiarvicidal toxin Cry4Ba and its biological implications J Mol Biol 348(2): 363–382 Chen M, Shelton A, Ye GY (2011) Insect-resistant genetically modified rice in china: from research to commercialization Annu Rev Entomol 56:81–101 Donegan KK, Palmb CJ, Fielanda VJ, et al (1995) Changes in levels, species and DNA fingerprints of soil microorganisms associated with cotton expressing 48 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 the Bacillus thuringiensis var kurstaki endotoxin Applied Soil Ecology 2(2): 111–124 Dulmage HT (1970) Insecticidal activity of HD-1, a new isolate of Bacillus thuringiensis var alesti J Invertebr Pathol 15: 232–239 Federici BA (1999) Bacillus thuringiensis In: Bellows TS, Gordh G, Fisher TW (eds) Handbook of biological control Academic Press, San Diego, pp 517–548 Guo S, Ye S, Liu Y, et al (2009) Crystal structure of Bacillus thuringiensis Cry8Ea1: an insecticidal toxin toxic to underground pests, the larvae of Holotrichia parallela J Struct Biol 168(2):259–266 Haas D, Defago G (2005) Biological control of soil-borne pathogens by fluorescent pseudomonads Nature Reviews in Microbiology 3(4):307-19 Hofte H, Whiteley HR (1989) Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis Microbiol Rev 53(2): 242–255 Husz B (1928) Bacillus thuringiensis Berl A bacterium pathogenic to corn borer larvae Int Corn Borer Invest Sci Rep 1:191–193 Knowles BH, Ellar DJ (1987) Colloid-osmotic lysis is a general feature of the mechanism of action of Bacillus thuringiensis δ-endotoxins with different insect specificity Biochim Biophys Acta Gen Subj 924(3): 509–518 Li JD, Carroll J, Ellar DJ (1991) Crystal-structure of insecticidal delta-endotoxin from Bacillus thuringiensis at 2.5-A resolution Nature 353(6347): 815–821 Nelson KL, Brodsky RA, Buckley JT (1999) Channels formed by subnanomolar concentrations of the toxin aerolysin trigger apoptosis of T lymphomas Cell Microbiol 1(1): 69–74 Peng R, Xiong A, Li X, Fuan H, Yao Q (2003) A d-endotoxin encoded in Pseudomonas fluorescens displays a high degree of insecticidal activity Appl Microbiol Biotechnol 63:300–306 Pérez-García G, Basurto-Ríos R, Ibarra JE (2010) Potential effect of a putative σHdriven promoter on the over expression of the Cry1Ac toxin of Bacillus thuringiensis J Invertebr Pathol 104(2): 140–146 Pigott CR, Ellar DJ (2007) Role of receptors in Bacillus thuringiensis crystal toxin activity Microbiol Mol Biol Rev 71(2): 255–281 Porta H, Cancino-Rodezno A, Soberón M, Bravo A (2011) Role of MAPK p38 in the cellular responses to pore-forming toxins Peptides 32(3): 601–606 Rausell C, Pardo-López L, Sánchez J, Moz-Garay C, Morera C, Soberón M, Bravo A (2004) Unfolding events in the water-soluble monomeric Cry1Ab toxin during transition to oligomeric pre-pore and membrane -inserted pore channel J Biol Chem 279(53): 55168–55175 Rosas-García NM (2009) Biopesticide production from Bacillus thuringiensis: an 49 24 25 26 27 28 29 30 environmentally friendly alternative Recent Pat Biotechnol 3: 28–36 Salisbury FB (1994) The Role of Plant Hormones In: Plant-Environment Interactions, Wilkinson, R.E (Ed.) Marcel Dekker, New York, USA pp: 39-81 Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd edn Cold Spring Harbor, New York Soberón M, Gill SS, Bravo A (2009) Signaling versus punching hole: how Bacillus thuringiensis toxins kill insect midgut cells? Cell Mol Life Sci 66(8): 1337– 1349 Walter C, Fladung M, Boerjan W (2010) The 20-year environmental safety record of GM trees Nat Biotechnol 28(7): 656–658 Xia L, Sun Y, Ding X, Fu Z, Mo X, Zhang H, Yuan Z (2005) Identification of crytype genes on 20-kb DNA associated with Cry1 crystal proteins from Bacillus thuringiensis Curr Microbiol 51(1): 53–58 Xin Deng, Haihua Liang, ,…(2014)Steady­State Hydrogen Peroxide Induces Glycolysis in Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa J Bacteriol ; 196(14): 2499–2513 PMCID: PMC4097596, doi : 10.1128/JB.01538­14 Zhang XB, Candas M, Griko NB, Taussig R, Bulla LA (2006) A mechanism of cell death involving an adenylyl cyclase/PKA signaling pathway is induced by the Cry1Ab toxin of Bacillus thuringiensis Proc Natl Acad Sci USA 103(26): 9897–9902 PHÓ GIÁM ĐỐC CHUYÊN ĐỀ TS Hà Thị Loan Tp Hồ Chí Minh, ngày… tháng… năm 20… TRƯỞNG PHỊNG CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI ThS Nguyễn Xuân Dũng ThS Phạm Văn Hiểu GIÁM ĐỐC TS Dương Hoa Xô 50 PHỤ LỤC THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC Vi-BT 32000WP Thành phần: Bacillus thurigiensis Var Kurstaki 32000IU/mg CÔNG TY CỔ PHẦN THUỐC SÁT TRÙNG VIỆT NAM THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC BICILUS 18WP Thành phần: Bacillus thurigiensis Var Kurstaki 18000IU/mg Đăng ký phân phối bởi: KING ELONG Co.,Ltd 51 PHỤ LỤC I Hóa chất sử dụng thí nghiệm - Mơi trường LB (Luria Bertami) (1 lít): Cân trypton 10 g, yeast extract g, NaCl 10 g, hòa tan 950 ml nước cất, 13 g agar, thêm nước cất để đạt 1000 ml, điều chỉnh pH7.0 Hấp khử trùng điều kiện 121℃, 15 phút - 3M NaAc (100 ml, pH5.2) cân NaAc 24.61 g, hòa tan vào 60 ml dd H2O, thêm nước để đạt 100 ml, điều chỉnh để đạt pH 5.2 - 0.15 M NaCl (200 ml): cân 1.755 g NaCl cho vào 180 ml dd H2O, sau thêm nước để đạt 200 ml Hấp diệt khuẩn 121℃, 15 phút - Chuẩn bị kháng sinh: + Kanamicin: 100 mg/ml, dùng nước cất vô trùng để pha chế, lọc diệt khuẩn đầu lọc 0.2 µ𝑚𝑚 Bảo quản -20 ℃, điều kiện tối + Ampicillin (50 mg/ml): 1g ampicillin hòa tan 20 ml nước cất vơ trùng, dùng đầu lọc 0.2 µm lọc diệt khuẩn - Dung dịch 0.1 M CaCl2 : Cân 11.099 g CaCl2 hịa tan lít dd H2O Hấp khử trùng 121℃, 15 phút - Dung dịch SDS 10%: Cân 10g SDS hòa tan 80 ml dd H2O, thêm nước để đạt thể tích 100 ml - 40 % polyacrylamide gel (500 ml): Acrylamide : N, N'-Methylenebisacrylamide = 19:1 Gồm: 190 g Acrylamide 10 g N, N'-Methylenebisacrylamide dùng dd H2O hòa tan để đạt 500 ml dung dịch; lọc giấy lọc bảo quản bình tối nhiệt độ 4℃ - 10% AP (Amonium Persulfate) TEMED, bảo quản 4℃ Đối với 10% AP bảo quản 4℃ bảo quản 14 ngày - Cồn 96% - Cồn 70% (100 ml) 70 ml cồn pha với 30 ml dd H2O, -20℃ bảo quản 52 Sơ đồ vector pJet1.2/Blunt Trình tự gen Cry1Ac ATG GAC AAC AAC CCG AAC ATC AAC GAA TGG ATT CCG TAC AAC TGC CTG AGC AAC CCG GAA GTG GAA GTG CTG GGC GGC GAA CGC ATC GAA ACC GGC TAC ACC CCG ATT GAC ATC AGC CTG AGC CTG ACC CAG TTC CTG CTG AGC GAG TTC GTG CCG GGC GCC GGC TTC GTG CTG GGC CTG GTG GAC ATC ATC TGG GGC ATC TTC GGC CCG AGC CAG TGG GAC GCC TTC CTG GTG CAG ATC GAA CAG CTG ATC AAC CAG CGC ATC GAA GAG TTC GCC CGC AAC CAG GCC ATC AGC CGC CTG GAA GGC CTC AGC AAC CTG TAC CAG ATT TAC GCC GAG TCC TTC CGC GAG TGG GAA GCC GAC CCG ACC AAC CCG GCC CTG CGC GAA GAA ATG CGC ATC CAG TTC AAC GAC ATG AAC AGC GCC CTG ACC ACC GCC ATC CCG CTG TTC GCC GTG CAG AAC TAC CAG TTC CCG CTG CTG AGC GTG TAC GTG CAG GCC GCC AAC CTG CAC CTG AGC GTG CTG CGC GAC GTG AGC GTG TTC GGC CAG CGC TGG GGC TTC GAC GCC GCC ACC ATC AAC AGC CGC TAC AAC GAC CTG ACC CGC CTG ATC GGC AAC TAC ACC GAC CAC GCC GTG CGC TGG TAC AAC ACC GGC CTG GAA CGC GTG TGG GGT CCG GAC AGC CGC GAC TGG ATT CGC TAC AAC CAG TTC CGC CGC GAA CTG ACC CTG ACC GTG CTG GAC ATC GTG AGC CTG TTC CCG AAC TAC GAC AGC CGC ACC TAC CCG ATC CGC ACC GTG AGC CAG CTG ACC CGC GAA ATC TAC ACC AAC CCG GTG CTG GAG AAC TTC GAC GGC AGC TTC CGC GGC AGC GCC CAG GGC ATC GAA GGC AGC ATT CGC AGC CCG CAC CTG 53 ATG GAC ATC GTG AAC AGC ATC ACC ATC TAC ACC GAC GCC CAC CGC GGC GAA TAC TAC TGG AGC GGC CAC CAG ATC ATG GCC AGC CCG GTG GGC TTC AGC GGC CCG GAG TTC ACC TTC CCG CTG TAC GGC ACG ATG GGC AAC GCC GCC CCG CAG CAG CGC ATC GTG GCC CAG CTG GGC CAG GGC GTG TAC CGC ACC CTG AGC AGC ACC CTG TAC CGC CGC CCG TTC AAC ATC GGC ATC AAC AAC CAG CAG CTC AGC GTG CTG GAC GGC ACC GAG TTC GCC TAC GGC ACC AGC AGC AAC CTG CCG AGC GCC GTG TAC CGC AAG AGC GGC ACC CTG GAC AGC CTG GAC GAA ATC CCG CCG CAG AAC AAC AAC GTG CCG CCG CGC CAG GGC TTC AGC CAC CGC CTG AGC CAC GTG AGC ATG TTC CGC AGC GGC TTC AGC AAC ACC AGC GTG AGC ATC ATC CGC GCC CCG ATG TTC AGC TGG ATT CAC CGC AGC GCC GAG TTC AAC AAC ATC ATC GCC AGC GAC AGC ATT ACC CAG ATC CCG GCA GTG AAA GGC AAC TTC CTG TTC AAC GGC AGC GTG ATC AGC GGT CCG GGC TTC ACC GGC GGC GAC CTG GTG CGC CTG AAC AGC AGC GGC AAC AAC ATC CAG AAC CGC GGC TAC ATC GAA GTG CCG ATC CAC TTC CCG AGC ACC AGC ACC CGC TAC CGC CTG CGC GTG CGC TAC GCC AGC GTG ACC CCG ATC CAC CTG AAC GTG AAC TGG GGC AAC AGC AGC ATC TTC AGC AAC ACC GTG CCG GCC ACC GCC ACC AGC CTG GAC AAC CTC CAG AGC AGC GAC TTC GGC TAC TTC GAA AGC GCC AAC GCC TTC ACC AGC AGC CTG GGC AAC ATC GTG GGC GTG CGC AAC TTC AGC GGC ACC GCC GGC GTG ATC ATC GAC CGC TTC GAG TTC ATC CCG GTG ACG GCC ACC CTG GAA GCC GAA TGA Trình tự đoạn gen kháng kanamycin ATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGA TGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGC GACAATCTATCGCTTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACA TGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACT GGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGA TGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGAAAAACAGCATTCCAGGTATT AGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTCCCT GCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTA TTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGT GATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAAT GCATAAACTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCA CTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGAC GAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTC GGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATA ATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAA Trình tự đoạn gen kháng ampicillin ATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCC TTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGAT CAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGAT CCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGT TCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCG GTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAG AAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATGCAGTGCTGCCATAACC 54 ATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAA GGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCG TTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACG ATGCCTGCANCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACT TACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGC AGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATC TGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATG GTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGG ATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGT AA Trình tự đoạn gen Terminator AAG GCC CAG TCT TTC GAC TGA GCC TTT CGT TTT ATT TGA TGC CTG GCA GTT CCC TAC TCT CGC ATG GGG AGA CCC CAC ACT ACC ATC GGC GCT ACG GCG TTT CAC TTC TGA GTT CGG CAT GGG GTC AGG TGG GAC CAC CGC GCT ACT GCC GCC AGG CAA PHỤ LỤC TI LE SAU CHET 14:43 Thursday, February 24, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Rep T Levels Values 123 V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 Number of Observations Read Number of Observations Used 24 24 55 TI LE SAU CHET 14:43 Thursday, February 24, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Model Error Sum of Squares 19314.26209 14 Corrected Total Mean Square F Value Pr > F 85.23161 23 2146.02912 19399.49370 Coeff Var Root MSE 0.995607 7.251229 2.467382 DF Rep T F 25.87966 19288.38243 12.93983 2755.48320 2.13 452.61 0.0463