Nghiên cứu tạo một số dòng lan mokara kháng virus khảm vàng cymv cymbidium mosaic virus bằng kỹ thuật chuyển gen rnai thông qua khuẩn agrobacterium tumefaciens

SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU NHIỆM VỤ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ Tên nhiệm vụ: NGHIÊN CỨU TẠO MỘT SỐ DÒNG LAN Mokara KHÁNG VIRUS KHẢM VÀNG CyMV (Cymbidium mosaic virus) BẰNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN RNAi THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Đơn vị chủ trì nhiệm vụ: Phịng Cơng nghệ Sinh học Thực vật Chủ nhiệm đề tài: KS Nguyễn Thị Thanh Thảo Cán tham gia: TS Nguyễn Xuân Dũng ThS Phan Thủy Quyên KS Phan Lê Trâm Anh Hình thức thực hiện: Nghiên cứu ứng dụng TP Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2019 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH vii TÓM TẮT ix PHẦN THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI PHẦN NỘI DUNG KHOA HỌC I ĐẶT VẤN ĐỀ II TỔNG QUAN TÀI LIỆU Sơ lược lan Mokara .4 Giới thiệu Cymbidium mosaic virus (CyMV) 2.1 Sơ lược CyMV 2.2 Khả lây nhiễm triệu chứng bệnh 2.3 Biện pháp kiểm soát bệnh khảm vàng lan CyMV .8 Công nghệ chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ứng dụng lan .8 Công nghệ RNA interference (RNAi) .10 4.1 Lịch sử phát 10 4.2 Cơ chế RNAi thực vật 12 4.3 Tiềm ứng dụng chế RNAi 13 Nghiên cứu ứng dụng công nghệ RNAi chọn giống trồng kháng virus 14 Thiết kế vector chuyển gen kỹ thuật Gateway 18 III NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 Nội dung nghiên cứu 20 Vật liệu nghiên cứu 20 3.1 Khảo sát môi trường thích hợp cho tái sinh tăng sinh PLBs 21 3.1.1 Khảo sát mơi trường thích hợp cho tái sinh PLBs 21 3.1.2 Khảo sát mơi trường thích hợp cho tăng sinh PLBs 22 3.2 Tạo chủng vi khuẩn mang vector chuyển gen 23 3.2.1 Tạo tế bào A tumefaciens dòng LBA4404 khả nạp 23 3.2.2 Tạo chủng A tumefaciens chứa vector mang cấu trúc RNAi .23 3.3 Xây dựng quy trình chuyển gen .25 3.3.1 Khảo sát nồng độ chất cảm ứng thời gian đồng ni cấy thích hợp cho q trình chuyển gen .25 3.3.2 Khảo sát nồng độ kháng sinh cefotaxime thích hợp để loại bỏ vi khuẩn sau thời gian đồng nuôi cấy 26 3.3.3 Khảo sát nồng độ kháng sinh kanamycin thích hợp để sàng lọc mẫu sau chuyển gen .26 3.4 Tạo dịng lan mang gen cp (CyMV) có cấu trúc RNAi 27 3.4.1 Nuôi cấy, tăng sinh vi khuẩn 27 3.4.2 Lây nhiễm, khử khuẩn sàng lọc mẫu giả định chuyển gen 27 3.4.3 Chuyển gen với thay đổi thời gian làm khô mẫu sau ủ với vi khuẩn .28 3.4.4 Chuyển gen với thay đổi nhiệt độ đồng nuôi cấy 28 3.4.5 Chuyền cấu trúc RNAi gen cp vào lan Mokara in vitro 28 3.4.6 Kiểm tra diện gen mục tiêu dòng giả định chuyển gen 29 3.5 Đánh giá khả kháng CyMV dòng giả định chuyển gen 30 3.5.1 Lây nhiễm CyMV vào lan chuyển gen điều kiện in vitro 30 3.5.2 Đánh giá khả kháng virus CyMV lan chuyển gen 30 3.6 Xử lý thống kê 32 IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 Mơi trường thích hợp cho tái sinh tăng sinh PLBs 32 1.1 Mơi trường thích hợp cho tái sinh PLBs 32 1.1.1 Nồng độ BA NAA thích hợp cho tái sinh PLBs 32 1.1.2 Nồng độ Kinetin thích hợp cho tái sinh PLBs 34 1.2 Mơi trường thích hợp cho tăng sinh PLBs .35 1.2.1 Nền mơi trường thích hợp cho tăng sinh PLBs 35 1.2.2 Nồng độ BA NAA thích hợp cho tăng sinh PLBs 36 Quy trình chuyển gen vào lan Mokara 39 3.1 Ảnh hưởng chất cảm ứng AS thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu chuyển gen 39 3.2 Hiệu khử khuẩn kháng sinh cefotaxime 42 ii 3.3 Hiệu sàng lọc mẫu giả định chuyển gen kanamycin 44 Tạo dịng lan mang gen cp (CyMV) có cấu trúc RNAi .47 4.1 Chuyển cấu trúc RNAi gen CP vào mô .47 4.2 Chuyển cấu trúc RNAi gen cp vào PLBs 49 4.1.1 Chuyển gen với thay đổi nhiệt độ đồng nuôi cấy .51 4.1.2 Chuyển gen với thay đổi thời gian làm khô mẫu sau ủ với vi khuẩn A.tumefaciens .51 4.1.3 Kiểm tra diện gen mục tiêu dòng giả định chuyển gen 52 4.1.4 Thu nhận lan hoàn chỉnh từ mẫu PLBs mang cấu trúc gen mục tiêu .53 4.3 Chuyển cấu trúc RNAi gen cp vào in vitro .54 Đánh giá khả kháng CyMV lan chuyển gen 56 V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 58 Kết luận 58 Đề nghị 59 PHẦN SẢN PHẨM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ .60 PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO .62 Tiếng Việt 62 Tiếng Anh 63 PHỤ LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens AS acetosyringone BA benzyl adenine cDNA complementary DNA cp coat protein Ct chu kỳ ngưỡng CyMV Cymbidium mosaic virus DNA deoxyribonucleic acid dsRNA double stranded RNA GUS β-glucuronidase LB Luria-Bertani miRNA micro RNA mRNA messenger RNA MS Murashige & Skoog NAA 1-naphthaleneacetic acid OD optical density PCR polymerase chain reaction PLB protocorm-like body PLBs protocorm-like bodies RISC RNA – incluced silencing complex RNA ribonucleic acid RNAi RNA inteference siRNA small interfering RNA sRNA short RNA RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction CMV Cucumber mosaic virus TMV Tomato mosaic virus TYLCV Tomato yellow leaf curl virus PRSV Papaya ringspot virus SMV Soybean mosaic virus BYMV Bean yellow mosaic virus iv DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1: Một số nghiên cứu chuyển gen vào lan thông qua vi khuẩn A.bacterium Bảng 2: Kết ứng dụng RNAi loại virus thực vật khác 15 Bảng 3: Các loại mồi sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 4: Thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc 24 Bảng 5: Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuẩn lạc 24 Bảng 6: Thành phần phản ứng Realtime RT-PCR trực tiếp mẫu .31 Bảng 7: Chu trình nhiệt phản ứng Realtime RT-PCR trực tiếp mẫu 31 Bảng 8: Tỷ lệ tái sinh PLBs từ mẫu nuôi cấy môi trường MS bổ sung BA nồng độ khác sau 15 tuần nuôi cấy .32 Bảng 9: Tỷ lệ tái sinh PLBs từ mẫu nuôi cấy môi trường KC lỏng bổ sung Ki nồng độ khác sau tuần nuôi cấy 34 Bảng 10: Khối lượng cụm PLBs môi trường MS bổ sung BA NAA nồng độ khác sau 60 ngày nuôi cấy .37 Bảng 11: Tỷ lệ mẫu dương tính GUS nồng độ AS thời gian đồng nuôi cấy khác 40 Bảng 12: Tỷ lệ mẫu PLBs dương tính GUS nồng độ AS khác sau sau ngày đồng nuôi cấy .41 Bảng 13: Hiệu diệt khuẩn kháng sinh cefotaxime mẫu nồng độ khác 42 Bảng 14: Hiệu diệt khuẩn kháng sinh cefotaxime mẫu PLBs nồng độ khác 43 Bảng 15: Tỷ lệ mẫu PLBs sống tái nhiễm nuôi cấy môi trường không bổ sung kháng sinh cefotaxime 43 Bảng 16: Hiệu gây chết kanamycin mẫu không chuyển gen sau 3, tuần nuôi cấy 45 Bảng 17: Hiệu gây chết kanamycin mẫu PLB không chuyển gen sau 3, tuần nuôi cấy 46 v Bảng 18: Hiệu gây chết kanamycin mẫu PLB không chuyển gen sau 9, 11 13 tuần nuôi cấy 46 Bảng 19: Tỷ lệ mẫu sống sau giai đoạn khử khuẩn 48 Bảng 20: Tỷ lệ mẫu PLBs sống sau giai đoạn khử khuẩn 49 Bảng 21: Tỷ lệ mẫu PLBs sống sau giai đoạn sàng lọc 50 Bảng 22: Số PLBs sống sót qua giai đoạn chuyển gen sau thay đổi nhiệt độ đồng nuôi cấy .51 Bảng 23: Số PLBs sống sót qua giai đoạn chuyển gen sau thay đổi thời gian làm khô mẫu sau lây nhiễm 51 Bảng 24: Số mẫu tạo chồi non PLBs từ phương pháp tạo vết thương .54 Bảng 25: Kết chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime RT-PCR phát CyMV Mokara sau đến tuần lây nhiễm 57 vi DANH SÁCH HÌNH Trang Hình Hoa lan Mokara Fullmoon Hình Hình dạng CyMV kính hiển vi Hình Cấu trúc gen CyMV .7 Hình Triệu chứng vàng lan CyMV Hình Triệu chứng khảm màu hoại tử hoa lan CyMV Hình Ví dụ bất hoạt gen chuyển gen 11 Hình Cơ chế hoạt động RNAi 13 Hình Kỹ thuật Gateway 19 Hình Cấu trúc vector pCAMBIA1301 20 Hình 10 Cấu trúc vector pK7GWIWG2(II)/CP 21 Hình 11 Các mẫu sau 15 tuần ni cấy mơi trường có bổ sung BA NAA với nồng độ khác 33 Hình 12 Sự đáp ứng môi trường KC bổ sung Kinetin nồng độ khác sau tuần nuôi cấy 34 Hình 13 Sự tái sinh PLBs từ môi trường KC bổ sung 0,5 mg/l Ki 34 Hình 14 Các PLBs ni cấy khống khác sau tuần ni cấy 35 Hình 15 Các PLBs ni cấy khống khác sau 12 tuần ni cấy .36 Hình 16 Sự tăng sinh PLBs môi trường khác 38 Hình 17 Kết PCR khuẩn lạc số dòng vi khuẩn sau biến nạp 39 Hình 18 Sự biểu gen GUS mẫu chuyển gen 40 Hình 19 Các mức độ biểu gen GUS mãu chuyển gen .40 Hình 20 Hiện tượng mẫu diệp lục hóa nâu mơi trường có bổ sung kháng sinh kanamycin 45 Hình 21 Hiện tượng mẫu hoại tử thời điểm tuần sau lây nhiễm 48 Hình 22 PLBs mơi trường khử khuẩn sau 30 ngày nuôi cấy 49 Hình 23 Mẫu hố nâu diệp lục sau tuần ni cấy mơi trường có bổ sung 500 mg/l kanamycin 50 Hình 24 Kết Kiểm tra gen cp số PLB giả định chuyển gen 52 vii Hình 25 Mẫu diệp lục hóa nâu q trình ni cấy phục hồi sau giai đoạn sàng lọc 53 Hình 26 Mẫu diệp lục hóa nâu q trình ni cấy phục hồi 54 Hình 27 Sự phát sinh chồi PLBs .55 Hình 28 Kết kiểm tra gen mục tiêu từ mẫu giả định chuyển gen có nguồn gốc từ phương pháp tiêm gốc 55 Hình 29 Cây lan Mokara sau tuần lây nhiễm virus 56 viii TÓM TẮT Mokara nhóm lan thương mại ưa chuộng Việc trồng lan Mokara mang lại nguồn thu nhập ổn định cho người trồng lan Tuy nhiên, tương tự giống lan khác, Mokara dễ bị xâm nhiễm virus gây bệnh Trong đó, nguy hiểm virus gây bệnh khảm vàng Cymbidium mosaic virus (CyMV) Trong nghiên cứu này, công nghệ chuyển gen RNAi áp dụng để tạo dịng lan Mokara có khả kháng virus phục vụ cho sản xuất Theo đó, mẫu lan Mokara Fullmoon in vitro sử dụng làm nguồn vật liệu cho nghiên cứu Mô nuôi cấy môi trường MS bổ sung BA NAA hay Knudson C bổ sung Kinetin cho tái sinh PLBs Quy trình chuyển gen thiết lập cách lây nhiễm vi khuẩn A tumefaciens (dịng LBA4404) với mơ in vitro, PLBs in vitro Mẫu giả định chuyển gen khử khuẩn với cefotaxime sàng lọc với kanamycin Sự diện gen mục tiêu mô lan chuyển gen xác nhận kỹ thuật PCR Khả kháng virus chuyển gen đánh giá phương pháp lây nhiễm virus nhân tạo điều kiện nuôi cấy in vitro Kết nghiên cứu cho thấy PLBs tái sinh từ mô lan Mokara Fullmoon in vitro môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BA kết hợp với mg/l NAA hay môi trường Knudson C bổ sung 0,5 mg/l Kinetin PLBs tăng sinh tốt môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BA kết hợp mg/l NAA Quy trình chuyển gen thiết lập thành cơng với PLBs in vitro Trong đó, PLBs lây nhiễm đồng nuôi cấy với A tumefaciens LBA4404 thời gian ngày 22oC, sau đó, khử khuẩn với 300 mg/l cefotaxime 14 ngày sàng lọc với 500 mg/l kanamycin 11 tuần; in vitro lây nhiễm cách tiêm vi khuẩn vào gốc đồng nuôi cấy thời gian ngày, sau khử khuẩn với 300 mg/l cefotaxime Hiệu chuyển gen đạt mức 0,035% 27,03 tương ứng cho hai trường hợp chuyển gen vào PLBs chuyển gen với in vitro M c d , việc chuyển gen thực với PLBs in vitro, nhiên lan hoàn chỉnh thu nhận với trường hợp chuyển gen vào in vitro Kết đánh giá tính kháng virus cho thấy lan chuyển gen có biểu khả kháng với virus CyMV điều kiện nuôi ix 43 Park S.M., Lee J.S., Jegal S., Jeon B.Y., Jung M., Park Y.S., Han S.L., Shin Y.S., Her N.H., Lee J.H., Lee M.Y., Ryu K.H., Yang S.G., Harn C.H (2005), Transgenic watermelon rootstock resistant to CGMMV (cucumber green mottle mosaic virus) infection Plant Cell Reports, 24(6): 350-356 44 Raja N.I., Bano A., Rashid H., Chaudhry Z and Ilyas N (2010), Imrpoving Agrobacterium mediated transformation protocol for integration of xa21 gene in wheat (Triticum aestivum L.) Pakistan Journal of Botany, 42(5):3613-3631 45 Reddy D.V.R., Sudarshana M.R., Fuchs M., Rao N.C and Thottappilly G (2009), Genetically engineered virus-resistant plants in developing countries: Current status and future prospects Advances in Virus Research, 75: 185-220 46 Reddy J (2008), Biotechnology of Orchids I.K International: New Delhi 47 Sebastinraj J., Britto S.J., Kumar D.V., Robinson J.P and Thangavel P (2014), Rapid propagation of Vanda testacea (Lindl.) Rchb.F – A highly medicinal value epophytic orchid of India World Journal of Agricultural Sciences, 10(5): 223-230 48 Semiarti E., Indrianto A., Purwantoro A., Isminingsih S., Suseno N., Ishikawa T., Yoshioka Y., Machida Y and Machida C (2007), Agrobacterium-mediated transformation of the wild orchid species Phalaenopsis amabilis Plant Biotechnology, 24: 265-272 49 Semiarti E., Indrianto A., Purwantoro A., Martiwi I.N A., Feroniasanti Y.M.L., Nadifah F., Mercuriani I.S., Dwiyani R., Kojima S., Machida Y and Machida C.(2011), Establishment of high-frequency genetic transformation method of Indonesian orchid species mediated by Agrobacterium tumefaciens Proceedings of Nagoya International Orchid Congress, Japan, 32-39 50 Shackelford N.J and Chlan C.A (1996), Identification of antibiotics that are effective in eliminating Agrobacterium tumefaciens Plant Molecular Biology Reporter, 14(1):50-57 51 Sharma N., Sahu P.P., Puranik S and Prasad M (2013), Recent advances in plant-virus interaction with emphasis on small interfering RNAs (siRNAs) Molecular Biotechnology, 55: 63-77 52 Sherpa A.R., Hallan V., Pathak P and Zaidi A.A (2007), Complete nucleotide sequence analysis of Cymbidium mosaic virus Indian isolate: further evidence for natural recombination among potexviruses.Journal of Biosciences, 32(4): 663669 53 Shrestha B.R., Chin D.P., Tokuhara K., and Mii M (2007), Efficient production of transgenic plants of Vanda through sonication-assisted Agrobacterium- 67 mediated transformation of protocorm-like bodies Plant Biotechnology, 24, 429434 54 Shrestha B.R., Chin D.P., Tokuhara K and Mii M (2010), Agrobacteriummediated transformation of Vanda using protocorm-like bodies Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology, 18(1):225-228 55 Smith E.F and Townsend C.O (1907), A plant-tumor of bacterial origin Science, 26(643): 671-673 56 Smith N.A., Singh S.P., Wang M.B., Stoutjesdijk P.A., Green A.G and Waterhouse P.M (2000), Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs Nature, 407(6802): 319-320 57 Teixeira da Silva J.A.and Fukai S (2001), The impact of carbenicillin, cefotaxime and vancomycin on chrysanthemum and tabacco TCL morphogenesis and Agrobacterium growth Journal of Applied Horticulture, 3(1):3-12 58 Uddain J., Zakaria L., Lynn C.B and Subramaniam S (2015), Preliminary assessment on Agrobacterium-mediated transformation of Dendrobium Broga Giant orchid’s PLBs Emirates Journal of Food and Agriculture, 27(9):669-677 59 University of Illinois (1990), Common virus disease of orchids.Report on Plant Disease, 614 60 Van der Krol A.R., Mur L.A., Beld M., Mol J.N and Stuitje A.R (1990), Flavonoid genes in petunia: addition of a limited number of gene copies may lead to a suppression of gene expression Plant Cell, 2: 291-299 61 Vij S.P., Jaspreet K.S., Jagdeep V., Pathak P (2004), In vitro rapid mass multiplication of Aerides multiflora roxb., a floriculturally significant species J.orchid India, 17(1-2 ): 63-68 62 Wang M.B., Abbott D.C and Waterhouse P.M (2000), A single copy of a virusderived transgene encoding hairpin RNA gives immunity to barley yellow dwarf virus Molecular Plant Pathology, 1(6): 347-356 63 Wong S.M., Mahtani P.H., Lee K.C., Yu H.H., Tan Y., Neo K.K., Chan Y., Wu M and Chng C.G (1997), Cymbidium mosaic potexvirus RNA: complete nucleotide sequence and phylogenetic analysis Archives of Virology, 142: 383391 64 Yu H., Yang S.H and Goh C.J (2001), Agrobacterium-mediated transformation of a Dendrobium orchid with the class knox gene DOH1 Plant Cell Reports, 20:301-305 65 Zettler F.W., Ko N.J., Wisler G.C., Elliott M.S and Wong S.M (1990), Viruses of orchids and their control Plant Diseases, 74(9): 621-626 68 66 Zhang L., Chin D.P., Fukami M., Ichikawa H., Nakamura I and Mii M (2010), Agrobacterium-mediated genetic transformation of Cattleya with an Odontoglossum ringspot virus replicase gene sequence Plant Biotechnology, 27:421-426 67 Zupan J.R and Zambryski (1995), Transfer of T-DNA from Agrobacterium to the plant cell Plant Physiology, 107:1041-1047 TP.HCM, ngày tháng năm 2019 TP.HCM, ngày tháng năm 2019 Đơn vị chủ trì thực Chủ nhiệm đề tài TS Nguyễn Xuân Dũng Nguyễn Thị Thanh Thảo TP.HCM, ngày tháng năm 2019 TP.HCM, ngày tháng năm 2019 Phòng Quản lý Khoa học HTQT Phịng Tài - Kế tốn ThS Lâm Vỹ Nguyên Nguyễn Thị Kim Xoàng TP.HCM, ngày tháng năm 2019 TP.HCM, ngày tháng năm 2019 Phó Giám đốc phụ trách Giám đốc TS Hà Thị Loan PGS.TS Dương Hoa Xơ 69 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Tình hình sử dụng kinh phí Đơn vị: đồng Nội dung khoản chi Tổng kinh phí Nguyên, vật liệu, lượng Thiết bị, máy móc Chi khác Tổng cộng Được giao (1) = (3)+(5)+(7)+(9) 108.000.000 320.059.000 - 71.941.000 500.000.000 Đã sử dụng (2) = (4)+(6)+(8)+(10) 114.088.000 293.104.400 - 78.277.714 485.470.114 Được giao (3) 24.000.000 112.100.000 13.900.000 150.000.000 Đã sử dụng (4) 30.000.000 89.524.000 18.262.700 137.786.700 Được giao (5) 24.000.000 58.400.000 17.600.000 100.000.000 Đã sử dụng (6) 24.000.000 56.857.650 18.618.314 99.475.964 Được giao (7) 24.000.000 58.500.000 17.500.000 100.000.000 Đã sử dụng (8) 24.000.000 58.163.750 17.830.600 99.994.350 Được giao (9) 36.000.000 91.059.000 22.941.000 150.000.000 Đã sử dụng (10) 36.088.000 88.559.000 23.566.100 148.213.100 (11) = (2) / (1) 117 92 94 97 Năm 2014 Kinh phí năm Cơng lao động Năm 2015 Năm 2016 Năm 2017 Tỷ lệ giải ngân ( ) Phụ lục 2: Quy trình chuyển gen cp vào PLBs lan Mokara thông qua Agrobacterium tumefaciens Vật liệu - PLBs tái sinh từ mẫu Mokara Fullmoon in vitro - Chủng vi khuẩn A.tumefaciens LBA4404 mang vector pK7GWIWG2(II)/CP-CyMV Thiết bị dụng cụ - Tủ cấy vô tr ng - Máy ly tâm - Nồi hấp tiệt tr ng - Máy PCR khuếch đại gen - Máy lắc - Pipetman (micropipet) - Tủ ủ nhiệt - Bình tam giác, đĩa petri thủy tinh - Một số thiết bị dụng cụ khác công nghệ sinh học Các bước thực 3.1 Chuẩn bị vi khuẩn cho lây nhiễm Tăng sinh vi khuẩn môi trường LB bổ sung 50 mg/l ampicilin, 100 mg/l spectinomicin 50 mg/l rifampicin, 28°C, tốc độ lắc 200 rpm OD dịch nuôi cấy đạt giá trị từ 0,6-0,8 Ly tâm thu sinh khối vi khuẩn tốc độ 6000 rpm 15 phút huyền ph sinh khối thu với môi trường MS lỏng có c ng thể tích tăng sinh 3.2 Lây nhiễm vi khuẩn vào PLBs thực đồng nuôi cấy a Tách riêng PLBs đơn lẻ từ cụm PLBs (q trình tách thực mơi trường MS lỏng) b Ngâm PLBs với dịch huyền ph vi khuẩn chuẩn bị bước thời gian 30 phút c Làm khô nhẹ PLBs giấy thấm thời gian phút, cấy vào môi trường MS rắn có bổ sung 0,5 mg/l BA kết hợp mg/l NAA, đ t nuôi tối nhiệt độ 22oC, ẩm độ 55 ± 5% ngày 3.3 Loại vi khuẩn khỏi PLBs sau lây nhiễm d Chuyển PLBs (sau thời gian đồng nuôi cấy) vào môi trường khử khuẩn (MS + 0,5 mg/l BA + mg/l NAA + 300 mg/l cefotaxime) 14 ngày (thực cấy chuyền sang môi trường sau ngày) 3.4 Sàng lọc dòng giả định chuyển gen thu nhận lan hoàn chỉnh e Chuyển PLBs khử khuẩn sang môi trường sàng lọc (MS + 0,5 mg/l BA + mg/l NAA + 500 mg/l kanamycin) thời gian 11 tuần (thực cấy chuyền sang môi trường sau ngày) f Chuyển mẫu sống sau trình sàng lọc sang mơi trường MS rắn có bổ sung 2,5 mg/l BA kết hợp 0,5 mg/l NAA để kích thích trình tạo 3.5 Kiểm tra gen mục tiêu giả định chuyển gen g Tách mẫu giả định chuyển gen (5 mm2 ) tử vô tr ng h Nghiền mẫu 50 ml hỗn dịch dilution buffer PVP (1:4), gia nhiệt 98oC phút giữ lạnh 4oC phút i Thực PCR trực tiếp với kit Phire Plant Direct kit c p mồi FCCP1/R-CCP1, thành phần phản ứng (20 µl): bao gồm 10 µl 2X Phire Plant PCR buffer, 0,4 µl Phire Hot Start II DNA Polymerase, 0,5 μl loại mồi xuôi mồi ngược (10 µM) ho c 0,4 µl hỗn hợp mồi kiểm sốt, µl dịch nghiền mẫu, lượng nước đảm bảo cho thể tích đạt 20 µl k Thiết lập chu trình nhiệt: chu kỳ 98ºC/7 phút, 40 chu kỳ 98ºC/15 giây, 55ºC/30 giây, 72ºC/60 giây chu kỳ 72ºC/10 phút n Phân tích điện di gel agarose 1,5 , nhuộm ethidium bromide soi gel máy chụp gel (Geldoc it) Phân đoạn gen mục tiêu có kích thước 450 bp so với thang chuẩn Phụ lục 3: Quy trình chuyển gen cp vào Mokara in vitro thông qua A tumefaciens phương pháp tiêm gốc Vật liệu - CâyMokara Fullmoon in vitro cao - cm - Chủng vi khuẩn A.tumefaciens LBA4404 mang vector pK7GWIWG2(II)/CP-CyMV Thiết bị dụng cụ - Tủ cấy vô tr ng - Máy ly tâm - Nồi hấp tiệt tr ng - Máy PCR khuếch đại gen - Máy lắc - Pipetman (micropipet) - Tủ ủ nhiệt - Bình tam giác - Một số thiết bị dụng cụ khác công nghệ sinh học Các bước thực 3.1 Chuẩn bị vi khuẩn cho lây nhiễm Tăng sinh vi khuẩn môi trường LB bổ sung 50 mg/l ampicilin, 100 mg/l spectinomicin 50 mg/l rifampicin, 28°C, tốc độ lắc 200 rpm OD dịch nuôi cấy đạt giá trị từ 0,6-0,8 Ly tâm thu sinh khối vi khuẩn tốc độ 6000 rpm 15 phút huyền ph sinh khối thu với mơi trường MS lỏng có c ng thể tích tăng sinh 3.2 Lây nhiễm vi khuẩn vào thực đồng nuôi cấy a Cây Mokara in vitro có từ 4-5 lá, 3-4 rễ đưa khỏi bình ni cấy tủ cấy vơ tr ng b D ng kim tiêm có chứa dịch huyền ph vi khuẩn đâm nhẹ tạo đến vết thương quanh gốc cây, bơm dịch vi khuẩn lên bề m t vết thương c Cấy vào môi trường MS bổ sung 2,5 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA 100 µM AS Đ t ni tối nhiệt độ 25 ± 2oC, ẩm độ 55 ± ngày 3.3 Loại vi khuẩn sau lây nhiễm phục hồi sau khử khuẩn d Cấy vào môi trường MS bổ sung 2,5 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA 300 mg/l cefotaxime tháng e Sau trình khử khuẩn, chuyển gen nuôi cấy môi trường MS bổ sung 2,5 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA để kích thức tạo chồi 3.4 Thu nhận lan phát sinh từ vị trí vết thương f Tách riêng chồi (khoảng 1,5 cm) phát sinh từ vết thương tạo gốc cây, nuôi cấy môi trường MS bổ sung 2,5 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA 3.4 Kiểm tra diện gen mục tiêu g Cô lập phần mẫu từ phát sinh, thực phản ứng PCR trực tiếp với c p mồi F-CCP1 R-CCP1 tương tự phụ lục h Các mẫu mang gen mục tiêu nuôi cấy môi trường tăng trưởng (MS + 2,5 mg/l BA + 0,5 mg/l NAA) để thực bước đánh giá Phụ lục 4: Quy trình lây nhiễm virus CyMV điều kiện phịng thí nghiệm Vật liệu - Cây lan Mokara (cây giả định chuyển gen ho c virus) - Cây lan nhiễm virus sử dụng làm nguồn cung cấp virus Thiết bị dụng cụ - Tủ cấy vô tr ng - Máy ly tâm - Nồi hấp tiệt tr ng - Máy PCR khuếch đại gen - Máy lắc - Pipetman (micropipet) - Tủ ủ nhiệt - Bình tam giác, đĩa petri thủy tinh - Một số thiết bị dụng cụ khác công nghệ sinh học Các bước thực 3.1 Chuẩn bị dịch virus CyMV vô tr ng - Nghiền g mẫu lan nhiễm virus ml dung dịch đệm phosphate 100 mM, pH7 thành hỗn hợp đồng - Ly tâm hỗn dịch 200 rpm phút, loại bỏ c n tế bào - Xử lý vô tr ng cách đưa dịch virus qua màng lọc (0,45μm) tủ cấy vô tr ng 3.2 Lây nhiễm virus vào lan Mokara - Cây lan Mokara tăng trưởng bình ni cấy đưa đĩa cấy điều kiện vô tr ng tủ cấy - D ng kim tiêm có chứa dịch virus đâm nhẹ để tạo 5-6 vết thương quanh gốc - Bơm dịch virus lên bề m t vết thương vừa tạo - Đưa trở lại bình ni cấy đ t nuôi điều kiện trước lây nhiễm - Theo dõi ghi nhận nhiễm virus cách quan sát triệu chứng kiểm tra diện virus phương pháp RT-PCR ho c real time RT-PCR phát virus Phụ lục 5: Môi trường nuôi cấy thực vật vi khuẩn Thành phần khống mơi trường ni cấy mơ thực vật Thành phần Đa lượng NH4NO3 CaCl2.2H2O Ca(NO3)2 MgSO4.7H2O KH2PO4 KCl (NH4)2SO4 KNO3 (NH4)2SO4 Vi lượng H3BO3 CoCl2.6H2O CuSO4.5H2O FeSO4.7H2O MnSO4.4H2O KI Na2MoO4.2H2O ZnSO4.7H2O Na2EDTA.2H2O FeNaEDTA Vitamin Myo-Inositol Pyridoxine (B6) Biotin (H) Nicotinic acid (PP) Thiamine -HCl Pantothenate – Ca MS Knudson C (mg/l) Gamborg B5 (mg/l) 1.650 440 500 241,3 122,15 250 250 500 - 113,23 6,2 0,025 0,025 27,8 22,3 0,83 0,25 8,6 37,2 25 5,68 - 0,025 0,025 10 0,75 0,25 36,7 100 0,01 1 - 100 1 10 - 370 170 1.900 - Môi trường nuôi cấy vi sinh Peptone 10g/L Yeast Extract 5g/L Muối NaCl 10g/L 121,56 134 2.500 134 Phụ lục 6: Kết xử lý thống kê Khảo sát nồng độ BA NAA thích hợp cho tái sinh PLBs ANOVA Tylecamung Sum of Squares df Mean Square Between Groups 44323.396 11 4029.400 Within Groups 39375.250 36 1093.757 Total 83698.646 47 Post Hoc Tests Homogeneous Subsets Tylecamung Duncan NT N Subset for alpha = 0.05 0000 0000 10 0000 4 8.3325 25.0000 25.0000 11 33.3325 33.3325 41.6650 41.6650 41.6650 41.6675 41.6675 41.6675 45.8325 45.8325 45.8325 75.0000 75.0000 75.0000 75.0000 12 Sig 91.6675 103 070 067 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 4.000 F 3.684 Sig .001 Khảo sát nồng độ kinetin thích hợp cho tái sinh PLBs ANOVA Tái sinh PLBs Sum of Squares Between Groups Mean Square 4888.000 106.709 12 4994.709 15 Within Groups Total df F Sig 1629.333 183.227 000 8.892 Post Hoc Tests Homogeneous Subsets Tái sinh PLBs a Duncan Subset for alpha = 0.05 Kinetin N 1.00 0400 1.50 0400 2.00 0400 50 40.4050 Sig 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed Khảo sát nồng độ BA NAA thích hợp cho tăng sinh PLBs ANOVA Khối lượng PLBs Between Groups Within Groups Total Sum of Squares 360513.333 2628.000 363141.333 df 45 53 Mean Square F 45064.167 771.647 58.400 Sig .000 Post Hoc Tests Homogeneous Subsets Khối lượng PLBs Duncan Nt N Subset for alpha = 0.05 MS 94.1667 1:1 100.000 0.5:0.5 1:0.5 1.5:0.5 1.5:1 2:0.5 255.833 0.5:1 257.000 2:1 129.000 165.833 176.667 201.833 361.667 Sig .193 1.000 1.000 1.000 1.000 793 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed Hiệu sàng lọc mẫu chuyển gen kanamycin 4.1 sau 30 ngày nuôi cấy ANOVA Ba mươi ngày Sum of Squares Between Groups Within Groups Total Df Mean Square 4924.978 1231.245 532.756 30 17.759 5457.734 34 F Sig 69.333 Post Hoc Tests Homogeneous Subsets Ba mươi ngày Duncan nghiemthuc N Subset for alpha = 0.05 100 11.7686 19.4571 000 300 500 700 28.8386 38.2986 44.1757 Sig 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 F Sig Means for groups in homogeneous subsets are displayed 4.2 Sau 50 ngày nuôi cấy ANOVA Năm mươi ngày Sum of Squares Between Groups Within Groups Total Df Mean Square 17378.671 4344.668 2235.920 30 74.531 19614.591 34 Post Hoc Tests Homogeneous Subsets Năm mươi ngày Duncan nghiemthuc N Subset for alpha = 0.05 100 52.6514 300 54.4257 500 70.5986 700 76.7957 Sig 12.9286 1.000 703 189 Means for groups in homogeneous subsets are displayed 58.294 000 4.3 Sau 60 ngày nuôi cấy ANOVA Sáu mươi ngày Sum of Squares Between Groups Mean Square 23950.384 5987.596 1395.328 30 46.511 25345.711 34 Within Groups Total df Post Hoc Tests Homogeneous Subsets Sáu mươi ngày Duncan nghiemthuc N Subset for alpha = 0.05 100 54.3357 300 61.7500 500 84.1529 700 86.6714 Sig 14.2629 1.000 051 495 Means for groups in homogeneous subsets are displayed F 128.735 Sig .000