Nghiên cứu tạo một số dòng lan dendrobium kháng virus khảm vàng cymbidium mosaic virus cymv gây hại trên lan bằng kỹ thuật chuyển gen rnai

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu ngày 29 tháng năm 2015) NGHIÊN CỨU TẠO MỘT SỐ DÒNG LAN Dendrobium KHÁNG VIRUS KHẢM VÀNG (Cymbidium mosaic virus - CyMV) GÂY HẠI TRÊN LAN BẰNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN RNAi ThS NGUYỄN XUÂN DŨNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 10 / 2015 ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ SỞ NƠNG NGHIỆP VÀ PTNT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu ngày 29 tháng năm 2015) NGHIÊN CỨU TẠO MỘT SỐ DÒNG LAN Dendrobium KHÁNG VIRUS KHẢM VÀNG (Cymbidium mosaic virus - CyMV) GÂY HẠI TRÊN LAN BẰNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN RNAi ThS NGUYỄN XUÂN DŨNG Cơ quan chủ trì Chủ nhiệm đề tài TS Dương Hoa Xơ ThS Nguyễn Xuân Dũng Cơ quan quản lý THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 10 / 2015 TĨM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Virus khảm vàng (Cymbidium mosaic virus - CyMV) gây hại nghiêm trọng giống lan Dendrobium Việt Nam Bệnh virus gây đến chưa có thuốc đặc trị, vậy, việc tạo giống lan có khả kháng virus vấn đề quan trọng Trong nghiên cứu này, chuyển gen RNAi qua trung gian Agrobacterium tumefaciens sử dụng để tạo dòng lan Dendrobium kháng CyMV Đoạn thân mang chồi ngủ lan Dendrobium Sonia ex vitro sử dụng làm vật liệu cho việc tạo lan in vitro PLBs tái sinh từ lát cắt mô thân lan in vitro sử dụng làm vật liệu chuyển gen Vector chuyển gen RNAi thiết kế từ trình tự gen CP (được phân lập Việt Nam) ORF2-4+CP (chọn lọc từ ngân hàng gen NCBI) CyMV Các yếu tố ảnh hưởng đến chuyển nạp gen nồng độ acetosyringone, thời gian đồng nuôi cấy, chủng Agrobacterium tumefaciens, nồng độ kháng sinh (cho diệt khuẩn sàng lọc mô chuyển gen) môi trường thích hợp cho tái sinh phát triển PLBs khảo sát PLBs chuyển gen sàng lọc môi trường chọn lọc trước kiểm tra diện gen mục tiêu PCR Các lan tăng trưởng từ PLBs chuyển gen đánh giá khả kháng virus qua việc lây nhiễm nhân tạo điều kiện nuôi cấy in vitro Kết cho thấy dung dich Ca(OCl)2 25% thời gian 20 phút thích hợp để khử trùng tạo mẫu cấy vơ trùng từ đoạn thân mang chồi ngủ Môi trường MS bổ sung mg/l NAA kết hợp với 0,5 mg/l hay 0,3 mg/l BA thích hợp cho tái sinh PLBs từ lát cắt mô thân hay tăng trưởng PLBs Trình tự gen CP CyMV phân lập khu vực khác Việt Nam có tương đồng cao Các trình tự tương đồng gen CP ORF2-4 sử dụng để thiết kế vector chuyển gen RNAi Vector hoàn chỉnh biến nạp thành công vào Agrobacterium tumefaciens Hiệu chuyển gen (tỷ lệ PLBs biểu gen GUS) cao đạt PLBs lây nhiễm với Agrobacterium tumefaciens đồng ni cấy mơi trường chứa 100 µM AS thời gian ngày (với chủng C58 EHA105) hay ngày (với chủng LBA4404) Cefotaxime 300 mg/l kanamycin 500 mg/l hygromycin 7-15 mg/l thích hợp cho việc loại khuẩn sàng lọc PLBs chuyển gen Kết chuyển gen thu PLBs chuyển gen có diện gen mục tiêu gen Các lan in vitro thu từ PLBs chuyển gen có khả kháng CyMV I SUMMARY OF RESEARCH CONTENT Cymbidium mosaic virus (CyMV) causes severely damage to Dendrobium orchids in VietNam So far there is no cure for viral disease so creating varieties of orchid resistant to virus is the important issue In this study, Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of RNAi was used to create Dendrobium lines resistant to CyMV Stem segments with dormant buds of Dendrobium Sonia ex vitro were used as material to obtaining in vitro orchid plant PLBs were regenerated from stem tissue slices of in vitro orchid plants and using as transformed material RNAi vectors were designed from the gene sequences of CP (isolated in Viet Nam) or ORF2-4+CP (selected from NCBI genebank) of CyMV The main factors influencing the transformation including acetosyringone concentration, the co-cultivation time, Agrobacterium tumefaciens strain, antibiotic concentration (for the disinfection and screening transformed PLBs) and medium for regeneration and growth of PLBs were surveyed The transformed PLBs were screened on selective medium before testing for presence of target gene by PCR The transformed orchid plants (growth from transformed PLBs) were tested resistant to virus via artificial infection in vitro The results show that solution of Ca(OCl)2 25% and time of 20 minute was suitable for disinfecting from the stem segments with dormant buds MS medium supplemented with mg/l NAA in combination with 0.5 mg/l or 0.3 mg/l BA was suitable for PLBs regeneration from stem tissue slices or growth of PLBs The CP sequences of isolates of CyMV in different areas of Viet Nam showed high degree of similarity The homologous gene sequences of CP or ORF2-4+CP were used to design RNAi vector The complete vector was successful transformed into Agrobacterium tumefaciens The highest transformation efficiency (percentage of PLBs with GUS gene expression) was obtained when PLBs were infected and cocultivated with Agrobacterium tumefaciens on the medium containing 100µM AS for day (with strain EHA 105 and C58) or day (with strain LBA4404) Medium containing 300 mg/l cefotaxime and 500 mg/l kanamycin or 7-15 mg/l hygromycin was suitable for the disinfection and screening of transformed PLBs Results of transformation obtained transformed PLBs with presence of target gene in genome The in vitro orchid plants that are derived from transformed PLBs showed resistant to CyMV II MỤC LỤC Trang TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU I SUMMARY OR RESEARCH CONTENT II I THÔNG TIN CHUNG ĐỀ TÀI XII II GIỚI THIỆU .3 III TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3.1 Sơ lược hoa lan 3.1.1 Giới thiệu họ hoa lan 3.1.2.Giới thiệu lan Dendrobium Sonia 3.1.3 Sơ lược PLBs (protocorm like bodies) Sơ lược Cymbidium mosaic virus 2.1 Phân loại, hình dạng phân tử cấu trúc gen 3.2.2 Sự lây nhiễm di chuyển CyMV ký chủ 3.2.3 Triệu chứng bệnh 3.2.4 Tình hình bệnh CyMV gây Việt Nam 3.3 Sự chuyển gen qua trung gian Agrobacterium tumefaciens 10 3.3.1 Giới thiệu chung 10 3.3.2 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 10 3.3.3 Cơ chế chuyển gen qua trung gian Agrobacterium tumefaciens 11 3.3.4 Các nhân tố ảnh hưởng đến chuyển gen qua trung gian Agrobacterium tumefaciens 12 3.3.4.1 Chủng vi khuẩn .12 3.3.4.2 Nồng độ chất cảm ứng 12 3.3.4.3 Mô cấy 12 3.3.4.4 Nhiệt độ 14 3.3.4.5 Các chất có hoạt tính bề mặt 14 3.4 Giới thiệu kỹ thuật RNAi ứng dụng nghiên cứu tạo chuyển gen kháng virus 15 3.4.1 Giới thiệu chung 15 3.4.2 Sơ lược lịch sử phát can thiệp RNA 15 3.4.3 Các thành phần can thiệp RNA 19 3.4.3.1 Các RNA can thiệp nhỏ 20 III 3.4.3.2 Enzym Polymerase phụ thuộc RNA 21 3.4.3.3 Các protein dạng Dicer protein liên kết với RNA mạch kép 22 3.4.3.4 Protein Argonaute 22 3.4.4 Các đường can thiệp RNA 22 3.4.5 Cơ chế can thiệp RNA thực vật 23 3.4.5.1 Sự can thiệp qua siRNA 23 3.4.5.2 Sự can thiệp qua miRNA 23 3.4.6 Sự khởi đầu khuếch đại tín hiệu can thiệp RNA 25 3.4.7 Sự di chuyển tín hiệu can thiệp RNA 27 3.4.8 Mối liên hệ virus gây bệnh trồng can thiệp RNA 28 3.4.9 Ứng dụng can thiệp RNA chọn giống trồng 29 IV VẬT LIỆU .31 4.1 Thực vật 31 4.2 Vi khuẩn 31 4.3 Các vector đoạn gen 31 V PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 5.1 Xây dựng quy trình chuyển gen vào lan Dendrobium Sonia 35 5.1.1 Xác định điều kiện thích hợp để tạo PLBs (Protocorm like bodies) phục vụ cho chuyển gen 35 5.1.1.1 Xác định nồng độ chất khử trùng thích hợp để tạo mẫu cấy in vitro .35 5.1.1.2 Xác định mơi trường thích hợp để tạo PLBs từ mô cấy (lát cắt thân) in vitro 35 5.1.1.3 Xác định mơi trường thích hợp cho tăng sinh phát triển PLBs 36 5.1.2 Xác định nồng độ chất cảm ứng acetosyringone (AS), thời gian đồng ni cấy chủng vi khuẩn thích hợp cho việc chuyển gen vào PLBs .36 5.1.2.1 Chuẩn bị vi khuẩn cho chuyển gen 36 5.1.2.2 Chuẩn bị PLBs thực đồng nuôi cấy 36 5.1.2.3 Đánh giá hiệu chuyển gen thông qua nhuộm GUS 37 5.1.3 Xác định điều kiện thích hợp để loại vi khuẩn sàng lọc PLBs chuyển gen .37 5.1.3.1 Xác định nồng độ cefotaxime thích hợp để loại vi khuẩn từ PLBs 37 5.1.3.2 Xác định nồng độ hygromycin thích hợp để sàng lọc PLBs chuyển gen 37 5.1.3.3 Xác định nồng độ kanamycin thích hợp để sàng lọc PLBs chuyển gen 37 5.2 Khảo sát tình hình nhiễm, phân lập xác định trình tự gen CP virus khảm vàng (CyMV) 38 IV 5.2.1 Khảo sát tình hình nhiễm CyMV lan Dendrobium TP Hồ Chí Minh 38 5.2.2 Thu thập mẫu, phân lập xác định trình tự gen CP virus CyMV 38 5.2.2.1 Thu thập mẫu nhiễm virus 38 5.2.2.2 Phân lập gen CP 38 5.2.2.3 Nhân dòng gen CP 39 5.2.2.4 Giải trình tự gen CP phân tích tương đồng trình tự thu 40 5.3 Thiết kế vector chuyển gen RNAi biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 40 5.3.1 Tạo vector pENTRTM/D-TOPO® có gắn gen đa đoạn CP ORF2-4 40 5.3.2 Thiết kế vector chuyển gen RNAi pK7GWIWG2(II) mang đoạn gen CP CP+ORF2-4 hệ thống Gateway 41 5.3.3 Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang vector chuyển gen RNAi pK7GWIWG2(II)/CP pK7GWIWG2(II)/ORF2-4+CP 42 5.4 Tạo lan chuyển gen mang cấu trúc RNAi gen CP ORF2-4 + CP 42 5.4.1 Nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn 42 5.4.2 Chuyển cấu trúc RNAi đoạn gen CP ORF2-4+CP vào PLBs qua trung gian Agrobacterium tumefaciens 42 5.4.2.1 Chuẩn bị vi khuẩn cho chuyển gen 42 5.4.2.2 Chuẩn bị PLBs thực đồng nuôi cấy 42 5.4.2.3 Loại vi khuẩn từ PLBs cefotaxime 43 5.4.3 Sàng lọc PLBs mang cấu trúc gen chuyển 43 5.4.4 Kiểm tra diện gen chuyển PLBs giả định chuyển gen .43 5.4.5 Thu nhận lan hoàn chỉnh từ PLBs mang gen chuyển 43 5.5 Đánh giá khả kháng virus CyMV chuyển gen lây nhiễm virus nhân tạo điều kiện in vitro 43 5.5.1 Lây nhiễm virus CyMV vào lan chuyển gen điều kiện in vitro 44 5.5.1.1 Chuẩn bị dịch virus CyMV vô trùng 44 5.5.1.2 Lây nhiễm virus CyMV vào lan chuyển gen .44 5.5.2 Đánh giá khả kháng virus CyMV lan chuyển gen sau lây nhiễm 44 5.6 Xử lý thống kê 44 VI KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46 6.1 Xây dựng quy trình chuyển gen vào lan Dendrobium Sonia 46 6.1.1 Các điều kiện thích hợp để tạo PLBs phục vụ cho chuyển gen 46 6.1.1.1 Nồng độ chất khử trùng thích hợp để tạo mẫu cấy in vitro 46 V 6.1.1.2 Mơi trường thích hợp để tạo PLBs từ mô cấy (lát cắt thân) in vitro 47 6.1.1.3 Mơi trường thích hợp cho tăng sinh phát triển PLBs 48 6.1.2 Nồng độ chất cảm ứng acetosyringone (AS), thời gian đồng ni cấy chủng vi khuẩn thích hợp cho việc chuyển gen vào PLBs .49 6.1.2.1 Trường hợp chủng C58 49 6.1.2.2 Trường hợp chủng EHA105 .50 6.1.2.3 Trường hợp chủng LBA4404 50 6.1.2.4 Về mức độ biểu gen GUS 51 6.1.3 Các điều kiện thích hợp để loại vi khuẩn sàng lọc PLBs chuyển gen 52 6.1.3.1 Nồng độ kháng sinh cefotaxime thích hợp để loại vi khuẩn từ PLBs 52 6.1.3.2 Nồng độ hygromycin thích hợp để sàng lọc PLBs chuyển gen 53 6.1.3.3 Nồng độ kanamycin thích hợp để sàng lọc PLBs chuyển gen 54 6.2 Kết đánh giá tình hình nhiễm, thu thập mẫu, phân lập xác định trình tự gen CP CyMV 55 6.2.1 Tình hình nhiễm CyMV lan Dendrobium TP Hồ Chí Minh 55 6.2.2 Kết thu thập mẫu, phân lập xác định trình tự gen virus CyMV 55 6.2.2.1 Thu thập mẫu nhiễm virus 55 6.2.2.2 Phân lập gen CP 56 6.2.2.3 Tạo dòng gen CP 57 6.2.2.4 Giải trình tự gen CP phân tích tương đồng trình tự thu 58 6.3 Thiết kế vector chuyển gen 60 6.3.1 Tạo vector pENTRTM/D-TOPO® có gắn gen đa đoạn CP ORF2-4 61 VI.3.1.1 Khuếch đại gen CP từ vector nhân dòng gen ORF2-4+CP từ vector pBSK/ORF2-4+CP phản ứng PCR .61 6.3.1.2 Gắn đoạn gen CP ORF2-4+CP vào vector pENTR TOPO nhờ phản ứng TOPO cloning 61 6.3.2 Thiết kế vector chuyển gen RNAi pK7GWIWG2(II) kỹ thuật Gatewway 63 6.3.3 Tạo chủng Agrobacterium tumefaciens mang vector chuyển gen RNAi pK7GWIWG2(II)/CP pK7GWIWG2(II)/ORF2-4+CP 65 6.4 Tạo lan chuyển gen mang cấu trúc RNAi gen CP ORF2-4+CP 66 6.4.1 Chuyển cấu trúc RNAi đoạn gen CP ORF2-4+CP vào PLBs qua trung gian Agrobacterium tumefaciens 66 6.4.1.1 Giai đoạn đồng nuôi cấy 66 6.4.1.2 Giai đoạn khử khuẩn 67 VI 6.4.2 Sàng lọc PLBs mang cấu trúc gen chuyển 68 6.4.3 Kiểm tra diện gen chuyển PLBs giả định chuyển gen .68 6.4.4 Thu nhận lan hoàn chỉnh từ PLBs mang gen chuyển 70 6.5 Khả kháng CyMV lan chuyển gen điều kiện in vitro 71 6.5.1 Về triệu chứng biểu 71 6.5.2 Về diện virus lan 73 VII KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 75 7.1 KẾT LUẬN 75 ĐỀ NGHỊ 76 PHỤ LỤC 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO 91 TIẾNG VIỆT 91 TIẾNG ANH 91 VII CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ RNA: DNA: RNAi: CPMR: mRNA: miRNA: sRNA siRNA: hpRNA: ihpRNA: RISC: RDR: dsRBD: GFP: HCPro: HYL1: CP: ORF: TGB: RdRp: NCR: CBP: CyMV: ORSV: PAMV: WC1MV: SMYEaV: Ribonucleic acid Deoxyribonucleic acid RNA interference Coat protein-mediated resistance Messenger RNA MicroRNA Small RNA Small interfering RNA Hairpin RNA Intron hairpin RNA RNA-induced silencing complex RNA-dependent RNA polymerase Double-stranded RNA binding domain Green fluorescent protein Helper component-proteinase Hyponastic leaves Coat protein Open reading frame Triple-gene-block RNA-dependent RNA polymerase Noncoding region Cap binding protein Cymbidium mosaic virus Odontoglossum ringspot virus Potato aucuba mosaic virus White clover mosaic virus Strawberry mild yellow edge-associated potexvirus Cucumber mosaic virus Tobacco mosaic virus Bean golden mosaic virus Cucumber green mottle mosaic virus Benzyladenine Naphthaleneacetic acid CMV: TMV: BGMV: CGMMV: BA: NAA: VIII Phụ lục Sơ đồ cấu trúc vector kích thước sản phẩm tương ứng Sự tạo thành vector tái tổ hợp pENTR/CP pENTR/ORF2-4+CP TOPO cloning reaction CP (460 bp) ORF2-4+CP (496 bp) 83 Vector pENTR/CP pENTR/ORF2-4+CP với vị trí enzyme NotI SalI pUC ori pUC ori M13_F attL1 M13_F Not I,673 pENTR/CP_CyMV attL1 Not I, 673 pENTR/ORF2-4+CP_CyMV 3040 bps 3076 bps CP_CyMV Kanamycin Sal I,874 ORF2-4+CP_CyMV Kanamycin attL2 attL2 Sal I,1175 M13_R M13_R Vector pK7GWIWG2(II)/, pK7GWIWG2(II)/CP, pK7GWIWG2(II)/ORF2-4+CP với vị trí enzyme XbaI HindIII phân đoạn thu cắt vector XbaI HindIII Sm/SpR LB Kan Xba I,1759 attR1 T35S ccdB pK7 pK7/CP Phân đoạn 8116 8116 8116 Phân đoạn 3310 2850 2886 Phân đoạn 1463 1003 1039 attR2 pK7GWIWG2(II) Xba I,3222 ,3222 12889 bps pK7/2 Mẫu -4+CP CmR attR2 ccdB RB p35S attR1 6532 Hin, dIII Sm/SpR Sm/SpR LB Xba I,1759 XbaI,1759 T35S attB1 T35S attB1 ORF2-4+CP-CyMV CP-CyMV attB2 Xba I, pK7GWIWG2(II)/CP_CyMV 11969 bps LB Kan Kan pK7GWIWG2(II)/ORF2-4+CP_CyMV 2762 CmR 12041 bps attB2 Xba I,2798 CmR attB2 attB2 CP-CyMV RB p35S attB1 Hin dIII,5612 ORF2-4+CP-CyMV RB p35S attB1 Hin dIII, 5648 84 Phụ lục Một số lan chuyển gen thu từ đề tài 85 Phụ lục Quy trình chuyển gen vào PLBs lan Dendrobium Sonia vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Vật liệu - PLBs (Protocorm like bodies) tái sinh từ lan Dendrobium Sonia in vitro - Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen mục tiêu (chùng C58, mang vector (pK7GWIWG2(II)/CP pK7GWIWG2(II)/ORF2-4+CP) Thiết bị dụng cụ - Tủ cấy vô trùng - Nồi hấp tiệt trùng - Máy lắc - Tủ ủ nhiệt - Máy ly tâm - Máy PCR khuếch đại gen - Pipetman (micropipet) - Bình tam giác, đĩa Petri thủy tinh - Một số thiết bị dụng cụ khác công nghệ sinh học Các bước thực 3.1 Chuẩn bị vi khuẩn cho lây nhiễm Tăng sinh vi khuẩn môi trường LB bổ sung 50 mg/l ampicilin, 100 mg/l spectinomicin 50 mg/l rifampicin, 28°C, tốc độ lắc 200 vòng/ phút OD dịch nuôi cấy đạt giá trị từ 0,6-1 Ly tâm (8000 vòng/phút) thu sinh khối vi khuẩn pha loảng với môi trường MS lỏng (cùng thể tích tăng sinh) có bổ sung 100 M AS để sử dụng cho lây nhiễm 3.2 Lây nhiễm vi khuẩn vào PLBs thực đồng nuôi cấy a Tách riêng BLBs đơn lẻ từ cụm PLBs (quá trình tách thực mơi trường MS lỏng) b Ngâm PLBs sau tách vào môi trường MS lỏng bổ sung 100M AS thời gian 15 phút nhiệt độ 25oC c Ngâm PLBs với dịch vi khuẩn chuẩn bị bước thời gian 30 phút, nhiệt độ 25oC 86 d Làm khô nhẹ PLBs giấy thấm, cấy vào môi trường MS rắn có bổ sung 100 M AS, đặt ni tối nhiệt độ 25  2oC, ẩm độ 55  5% ngày 3.3 Loại vi khuẩn khỏi PLBs sau lây nhiễm e Cấy PLBs (sau lây nhiễm với vi khuẩn) vào môi trường khử khuẩn (MS + 0,3 mg/l BA + mg/l NAA + 300 mg/l cefotaxime) 21 ngày (thực cấy chuyền sang môi trường sau ngày) 3.4 Sàng lọc PLBs mang gen thu nhận lan chuyển gen f Cấy PLBs vào môi trường sàng lọc (MS + 0,3 mg/l BA + mg/l NAA + 500 mg/l kanamycin) thời gian 60 ngày g Sau sàng lọc, cô lập phần mẫu từ cụm PLBs, tiến hành ly trích DNA thực phản ứng PCR với cặp mồi đoạn gen mục tiêu (cặp mồi F-CCP1/R-CCP1 cho trường hợp gen CP hay cặp mồi Fi-CORF2-4/Ri-CCP cho trường hợp gen ORF2-4+CP) để kiểm tra diện gen mục tiêu f Chuyển cụm PLBs mang gen mục tiêu nuôi cấy môi trường sàng lọc tuần, sau chuyển sang ni cấy mơi trường tăng trưởng (½MS) vịng tháng để thu nhận hoàn chỉnh 87 Phụ lục Bảng phân chia nội dung cơng việc quan chủ trì đề tài (TT CNSH TP Hồ Chí Minh) quan phối hợp thực (Viện CNSH) TT Nội dung Đơn vị thực Thu thập mẫu, phân lập, xác đinh trình tự gen CP CyMV khu vực: - Thành phố Hồ Chí Minh, Đà Lạt - Hà Nội, Bắc Giang, Thái Nguyên - Trung tâm CNSH TP Hồ Chí Minh - Viện CNSH Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi Viện CNSH Xây dựng quy trình chuyển gen cho lan Dendrobium Trung tâm CNSH TP Hồ Chí Minh Tạo lan Dendrobium chuyển gen mang cấu trúc RNAi Trung tâm CNSH TP Hồ Chí Minh Đánh giá dịng lan Dendrobium chuyển gen Trung tâm CNSH TP Hồ Chí Minh 88 Phụ lục Các báo khoa học liên quan đến đề tài công bố Nguyễn Xn Dũng, Dương Hoa Xơ, Chu Hồng Hà, 2014 Tối ưu hóa chuyển nạp gen lan Dendrobium sonia qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Tạp chí sinh học, Số 36(1se), trang 257-265 Hồ Thị Thương, Lê Thu Ngọc, Phạm Bích Ngọc, Lâm Đại Nhân, Nguyễn Xuân Dũng, Chu Hoàng Hà, 2014 Thiết kế đánh giá hoạt động cấu trúc chuyển gen kháng virus khảm vàng (Cymbidium mosaic virus) hại ho lan công nghệ RNAi Tạp chí Cơng nghệ sinh học Số 12 (1), tr 95-101 Hồ Thị Thương, Lê Thu Ngọc, Phạm Bích Ngọc, Lâm Đại Nhân, Nguyễn Xuân Dũng, Chu Hồng Hà, 2014 Đánh giá tính kháng Cymbidium mosaic virus hại hoa lan mơ hình thuốc chuyển gen đa đoạn sử dụng công nghệ RNAi Hội thảo Quốc gia Bệnh hại thực vật Việt Nam, tr 27-33 Nguyễn Xuân Dũng, Phạm Văn Hiểu, Dương Hoa Xô, 2014 Tạo dịng biểu gen mã hóa protein vỏ (CP) virus khảm vàng (cymbidium mosaic virus - CyMV) gây bệnh hoa lan Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam Số 7(53), tr 124-132 Nguyễn Xuân Dũng, Nguyễn Thị Thanh Thảo, Dương Hoa Xơ, Chu Hồng Hà, 2014 Nghiên cứu chuyển gen RNAi qua trung gian Agrobacterium tumefaciens vào Dendrobium Sonia để tạo giống kháng virus khảm vàng Hội nghị khoa học lần thứ Hội Sinh lý thực vật Việt Nam 89 Phụ lục Các sinh viên nghiên cứu sinh đào tạo từ đề tài TT Năm tốt nghiệp Cơ sở đào tạo 2015 (dự kiến) Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Bước đầu thiết lập quy trình gen vào lan Phương chuyển Dendrobium Sonia vi khuẩn Agrobacterium 2011 Đại học Tôn Đức Thắng Khảo sát tạo chồi PLBs từ chồi cô lập, thân lan Dendrobium Sonia 2011 Đại học Tôn Đức Thắng Họ tên Tên đề tài tốt nghiệp Trình độ tiến sĩ Nguyễn Xuân Dũng Đánh giá hiệu kỹ thuật chuyển gen RNAi để tạo dịng lan Dendrobium có khả kháng virus khảm vàng (Cymbidium mosaic virus) Trình độ Cử nhân/ kỹ sư Lê Thị Loan Lê Thị Hải Châu Nghiên cứu chuyển gen mã hóa cho protein vỏ (CP) khảm vàng Nguyễn Thị Thanh virus (Cymbidyum mosaic virus) Thảo vào PLBs lan Dendrobium Sonia 2012 Đại học Nông Lâm TP HCM Nghiên cứu chuyển cấu trúc gen có khả kháng virus khảm vàng (Cymbidium mosaic virus) vào PLBs lan Dendrobium Sonia vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 2013 Đại học Tôn Đức Thắng Phạm Thị Điểm 90 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Click B.R Pasternak J.J., 2007 Công nghệ sinh học phân tử Nguyên lý ứng dụng ADN tái tổ hợp Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, 856 tr Chu Hoàng Hà, Phạm Thị Vân, Lê Trần Bình, 2009 Tạo trồng chuyển gen kháng bệnh virus kỹ thuật RNAi Báo cáo Hội nghị quốc gia sinh vật biến đổi gen quản lý an toàn sinh học, Hà Nội 2009, tr 19-28 Lê Thị Ánh Hồng, Phan Tố Phượng, Trần Duy Quý, Nguyễn Mai Chi, Nguyễn Thúy An, Nguyễn Hằng Phương, Mai Thu Hà, Lương Thị Hải, Đàm Quốc Trụ, Nguyễn Văn Đồng, 1999 Ứng dụng kỹ thuật phân tử phát xác định bệnh hại thực vật Việt Nam Báo cáo Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc năm 1999, p 301-313 Nguyễn Ngọc Quỳnh, Nguyễn Duy, Hồng Ngọc Trâm, Phạm Thị Mỹ Hạnh, Lý Phương Loan, Bùi Thị Thu Ngân, 2007 Ứng dụng phương pháp RT-PCR chuẩn đoán virus gây bệnh khảm vàng CyMV bệnh đốm vòng ORSV hoa lan Dendrobium Phalaenopsis Hội thảo ứng dụng kỹ thuật nhân giống nuôi trồng hoa lan TP Hồ Chí Minh năm 2007, tr 47-51 Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 2012 Cơng Nghệ Gen Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp, 201 tr Nguyễn Thiện Tịch, Đoàn Thị Hoa, Trần Sĩ Dũng, Huỳnh Thị Ngọc Nhân, 2004 Kỹ Thuật Nuôi Trồng Hoa Lan Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp, 271 tr Nguyễn Xuân Dũng, Nguyễn Quốc Tồn, Đặng Quỳnh Chi, Nguyễn Quốc Bình, 2009 Phát Cymbidium mosaic virus Odontoglossum ringspot virus Multiplex RT-PCR Real-time RT-PCR Tuyển tập Hội nghị Công nghệ sinh học tồn quốc-khu vực phía Nam năm 2009, tr 584-589 Phạm Thị Vân, Nguyễn Văn Bắc, Lê Văn Sơn, Chu Hồng Hà, Lê Trần Bình, 2008 Tạo thuốc kháng bệnh virus khảm dưa chuột kỹ thuật RNAi Tạp chí Cơng nghệ Sinh học (4A), tr 679-687 TIẾNG ANH Abel P P , Nelson R S., De B., Hoffmann N., Rogers S G., Fraley R T., and Beachy, R N., 1986 Delay of disease development in transgenic plants that express the tobacco mosaic virus coat protein gene Science 232, p 738-743 Alimohammadi M and Bagherieh-Najjar, 2009 Agrobacterium-mediated transformation of plants: Basic principles and influencing factors African Journal of Biotechnology Vol (20), p 5142-5148 91 Atichart P., Bunnag S., Piyada T., 2007 Agrobacterium - mediated transformation of Dendrobium secundum (B L.) Lindl with antisense ACC oxidase Asian J Plant Sci., 6(7): 1065-1071 Banyne E H., Rakitina D V., Morozov S Y., Baulcombe D C., 2005 Cell-to-cell movement of Potato Potexvirus X is dependent on suppression of RNA silencing Plant J 44, p 471-482 Bartel B and Bartel D P., 2003 MicroRNAs: At the root of plant development Plant Physiol 132, p 709-717 Bartel D P., 2004 MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism and function Cell 116, p 281–297 Batygina T B., Bragina E A and Vasilyeva V E., 2003 The reproductive system and germination in orchids Actabiologica cracoviensia Series Botanica 45(2), p 21-34 Baulcombe D., 2004 RNA silencing in plants Nature, 431, p 356-363 Baumberger N and Baulcombe D C., 2005 Arabidopsis ARGONAUTE1 is an RNA slicer that selectively recruits microRNAs and short interfering RNAs Proc Natl Acad Sci USA 102, p 11928-11933 10 Bunnag S and Pilahome W., 2012 Agrobacterium-mediated transformation of Dendrobium chrysotoxum Lindl Afr J Biotechnol., 11(10), p 2472-2476 11 Covey, S N., Al-Kaff, N S., Langara, A & Turner, D S., 1997 Plants combat infection by gene silencing Nature 385, p 781-782 12 Chang C., Chen Y C., Hsu Y H., Wu J T., Hu C C., Chang W C., Lin N S., 2005 Transgenic resistance to Cymbidiummosaic virus in Dendrobium expressing the viral capsid protein gene Transgenic Res 14, p 41-46 13 Chapman, E J., Prokhnevsky A I., Gopinath K., Dolja, V & Carrington J C., 2004 Viral RNA silencing suppressors inhibit the microRNA pathway at an intermediate step Genes Dev 18, p 1179-1186 14 Deeken R., Engelmann J C., Efetova M., Czirjak T., Muller T., Kaiser W M., Tietz, Krischke M O., Mueller M J., Palme K., Dandekar T., Hedricha R., 2006 An Integrated View of Gene Expression and Solute Profiles of Arabidopsis Tumors: A Genome-Wide Approach Plant Cell 18, p 3617-3634 15 Dunoyer P., Lecellier C H., Parizotto E A., Himber C & Voinnet O., 2004 Probing the microRNA and small interfering RNA pathways with virus-encoded suppressors of RNA silencing Plant Cell 16, p 1235-1250 16 Dunoyer, P., Himber, C., and Voinnet, O., 2005 DICER-LIKE is required for RNA interference and produces the 21-nucleotide small interfering RNA component of the plant cell-to-cell silencing signal Nat Genet 37, p 1356-1360 17 Feinberg E H & Hunter C P., 2003 Transport of dsRNA into cells by the transmembrane protein SID-1 Science 301, p 1545-1547 92 18 Fire A., Xu S., Montgomery M K., Kostas S A., Driver S E and Mello C C., 1998 Potent enzym specific genetic interference by double-strenzymed RNA in Caenorhabditis elegans Nature 391, p 706-811 19 Gasciolli V., Mallory, A C., Bartel D P., and Vaucheret H., 2005 Partially redundant functions of Arabidopsis DICER-like enzymes and a role for DCL4 in producing trans-acting siRNAs Curr Biol 15, p 1494-1500 20 Gottula J and Fuchs M., 2009 Toward a Quarter Century of Pathogen-Derived Resistance and Practical Approaches to Plant Virus Disease Control Advances in Virus Research 75, p 161-183 21 Hamilton A J and Baulcombe D C., 1999 A species of small antisense RNA in post-transcriptional gene silencing in plants Science 286, p 950-952 22 Hamilton A J., Voinnet, O., Chappell, L and Baulcombe D C., 2002 Two classes of short interfering RNA in RNA silencing EMBO J 21, p 4671-4679 23 Han M H., Goud S., Song L and Fedoroff, N., 2004 The Arabidopsis doublestranded RNA-binding protein HYL1 plays a role in microRNA-mediated gene regulation Proc Natl Acad Sci USA 101, p 1093-1098 24 Hannon G J., 2002 RNA interference Nature 418, p 244-51 25 Haywood V., Kragler F and Lucas W J., 2002 Plasmodesmata: pathways for protein and ribonucleoprotein signaling Plant Cell 14, p 303-325 26 Hellens, 2000 Technical Focus: A guide to Agrobacterium binary Ti vectors Trends in plant science (10), p 446-451 27 Himber C., Dunoyer P., Moissiard G., Ritzenthaler C and Voinnet O., 2003 Transitivity-dependent and -independent cell-to-cell movement of RNA silencing EMBO J 22, p 4523-4533 28 Hu J S., Ferreira s, Xu M Q., Lu M., Iha M., Pflum E and Wang M (1994), “Transmission, movement, and inactivation of Cymbidium mosaic and Odontoglossum ringspot viruses”, Plant Disease, 78(6), p 633-636 29 Jefferson R A., 1978 Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system Experimental protocols Plant molecular biology reporter 5(4), p 387-405 30 Jones-Rhoades M W and Bartel D P., 2004 Computational identification of plant microRNAs and their targets, including a stress-induced miRNA Mol Cell 14, p 787-799 31 Juarez M T., Kul, J S., Thomas J., Heller B A and Timmermans M C., 2004 microRNA-mediated repression of rolled leaf1 specifies maize leaf polarity Nature 428, p 84-88 32 Karpova O V., Zayakina O V., Arkhipenko M V., Sheval E V., Kiselyova O I., Poljakov V Y., Yaminsky I V., Rodionova N P and Atabekov J G., 2006 Potato virus X RNA-mediated assembly of single-tailed ternary coatprotein-RNAmovement protein complexes J Gen Virol 87, p 2731-2740 93 33 Kidner C A and Martienssen R., 2004 Spatially restricted microRNA directs leaf polarity through ARGONAUTE1 Nature 428, p 81-84 34 Kim J D., Koo Y B and Chang M U., 1998 Genome characterization of a Korean isolate of Cymbidium mosaic virus Mol Cells 30, p 181–188 35 Kurihara Y., Yuasa T., and Watanabe Y 2006 The interaction between DCL1 and HYL1 is important for efficient and precise processing of pri-miRNA in plant microRNA biogenesis RNA 12, p 206-212 36 Lakatos L., Szittya G., Silhavy D and Burgyan J., 2004 Molecular mechanism of RNA silencing suppression mediated by p19 protein of tombusviruses EMBO J 23, p 876-884 37 Lee Y I., Hsu S T and Yeung E C., 2013 Orchid protocorm like bodies aer somatic embryos American Journal of Botany 100 (11), p 2121-2131 38 Llave C., Kasschau K D., Rector M A and Carrington J C, 2002 Endogenous and silencing-associated small RNAs in plants Plant Cell 14, p 1605–1619 39 Makeyev, E V and Bamford, D H., 2002 Cellular RNA-dependent RNA polymerase involved in posttranscriptional gene silencing has two distinct activity modes Mol Cell 10, 1417-1427 40 Mallory A C., Reinhart B J., Bartel D., Vance V B and Bowman, L H., 2002 A viral suppressor of RNA silencing differentially regulates the accumulation of short interfering RNAs and microRNAs in tobacco Proc Natl Acad Sci USA 99, p 15228–15233 41 Mallory, A C., Eli L., Smith T H., Marathe R., Anandalakshmi R., Fagard M., Vaucheret H., Pruss G., Bowman L., Vance V B., 2001 HC-Pro suppression of transgene silencing eliminates the small RNAs but not transgene methylation or the mobile signal Plant Cell 13, p 571–583 42 Marais F., 2000 Virus Diseases Orchid Society of Northern Transvaal Http://www.ont.co.za/virus_diseases.htm 43 Men S., Ming X., Liu R., Wei C., Li Y., 2003 Agrobacterium - mediated genetic transformation of a Dendrobium orchid Plant Cell Tiss Org., 75, p 63-71 44 Mi S., Cai T., Hu Y., Chen Y., Hodges E., Ni F., Wu L., Li S., Zhou H., Long C., Chen S., Hannon G.J., and Qi Y., 2008 Sorting of small RNAs into Arabidopsis Argonaute complexes is directed by the 5' terminal nucleotide Cell 133, p 116-127 45 Moissiard G and Voinnet O., 2004 Viral suppression of RNA silencing in plants Mol Plant Pathol 5, p 71–82 46 Moran J and Knoxfield, 1999 Virus diseases of orchids Http://www.dpi.vic.gov.au/DPI/nreninf.nsf/childdocs/ 47 Mourrain, P , Beclin C., Elmayan T., Feuerbach F., Godon C., Morel J B., Jouette D., Lacombe A M., Nikic S., Picault N., Re´moue´ K., Sanial M., Anh Vo T., 94 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 Vaucheret H., 2000 Arabidopsis SGS2 and SGS3 genes are required for posttranscriptional gene silencing and natural virus resistance Cell 101, p 533-542 Napoli C., Lemieux C and Jorgensen R., 1990 Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans Plant Cell 2, p 279-289 Navalinskiene, Raugalas J., Samuitiene M., 2005 Viral diseases of flower plants 16 Identification of viruses affecting orchids (Cymbidium Sw.) Biologija, Nr p 29-34 Palauqui J C., Elmayan T., Pollien J M and Vaucheret H., 1997 Systemic acquired silencing: transgenespecific post-transcriptional silencing is transmitted by grafting from silenced stocks to non-silenced scions EMBO J 16, p 4738-4745 Papp I., Mette M F., Aufsatz W., Daxinger L., Schauer S E., Ray A., Van der Winden J., Matzke M., and Matzke A J M., 2003 Evidence for nuclear processing of plant microRNA and short interfering RNA precursors Plant Physiol 132, p 1382–1390 Ratcliff F., Harrison B D and Baulcombe D C., 1997 A similarity between viral defense and gene silencing in plants Science 276, p 1558-1560 Reddy D V R., Sudarshana M R., Fuchs M., Rao N C and Thottappilly G., 2009 Genetically Engineered Virus-Resistant Plants in Developing Countries: Current Status and Future Prospects Advances in Virus Research 75, p 185-220 Reinhart B J., Weinstein E G., Rhoades M W., Bartel B and Bartel D P., 2002 MicroRNAs in plants Genes Dev 16, p 1616–1626 Schiebel W., Haas B., Marinkovic S., Klanner A and Sanger, H L., 1993 RNAdirected RNA polymerase from tomato leaves II Catalytic in vitro properties J Biol Chem 268, p 11858-11867 Schwarz D S., Hutvágner G., Du T., Xu Z., Aronin N., Zamore P D., 2003 Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex Cell 115 (2), p 199-208 Shrestha B.R., Chin D.P., Tokuhara K., Mii M., 2010 Agrobacterium-mediate transformation of Vanda using protocorm-like bodies Aspac J Mol Biol Biotechnol., 18 (1), p 225-228 Sijen, T., Fleenor J., Simmer F., Thijssen K L., Parrish S., Timmons L., Plasterk R H A., and Fire A., 2001 On the role of RNA amplification in dsRNA-triggered gene silencing Cell 107, p 465–476 Sudarshana M R, Gourgopal R., and Bryce W F ,2007 Methods for Engineering Resistance to Plant Viruses Plant-Pathogen Interactions PC Ronald, Humana Press 354, p 183-195 Takeda A., Iwasaki S., Watanabe T., Utsumi M., Watanabe Y., 2008 The mechanism selecting the guide strand from small RNA duplexes is different among Argonaute proteins Plant Cell Physiol 49, p 493-500 Tennant P., Fermin G., Fitch M M., Manshardt R.M., Slightom J L., Gonsalves 95 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 D., 2001 Papaya ringspot virus resistance of transgenic rainbow and sunup is affected by gene dosage, plant development, and coat protein homology European Journal of Plant Pathology 107, p 645-653 Truniger V and Aranda M A., 2009 Recessive resistance to plant viruses Adv.Virus Res 75, p 119-159 University of Illinois Extention, 1990 Common virus diseases of orchids Report on plant diseases Department of crop sciences University of Illinois at Urbana Champaign Http://www.aces.uiuc.edu/vista/pdf_pubs/614.pdf Vaistij F E., Jones L and Baulcombe D C., 2002 Spreading of RNA targeting and DNA methylation in RNA silencing requires transcription of the target gene and a putative RNA-dependent RNA polymerase Plant Cell 14, p 857–867 Van Blokland R., Van der Geest N., Mol J N M., Kooter J M., 1994 Transgenemediated suppression of chalcone synthase expression in Petunia hybrida results from an increase in RNA turnover Plant J 6, p 861–77 Van der Krol A R., Mur L A., Beld M., Mol J N and Stuitje A R, 1990 Flavonoid genes in petunia: addition of a limited number of gene copies may lead to a suppression of gene expression Plant Cell 2, p 291-299 Vargason J M., Szittya G., Burgyan J and Tanaka Hall, T M., 2003 Size selective recognition of siRNA by an RNA silencing suppressor Cell 115, p 799-811 Vazquez F., Gasciolli V., Crete P and Vaucheret, H, 2004 The nuclear dsRNA binding protein HYL1 is required for microRNA accumulation and plant development, but not posttranscriptional transgene silencing Curr Biol 14, p 346-351 Verchot-Lubicz J., 2005 A new cell to cell transport model for potexviruses Mol Plant Microbe Interact 18, p 283–290 Verdel A., Jia S., Gerber S., Sugiyama T., Gygi S., Grewal S., Moazed D., 2004 RNAi-mediated targeting of heterochromatin by the RITS complex Science 303 (5658), p 672-676 Voinnet O and Baulcombe D C., 1997 Systemic signalling in gene silencing Nature 389, p 553 Voinnet O., Lederer C and Baulcombe D C., 2000 A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana Cell 103, p 157-167 Watanabe Y., 2011 Overview of plant RNAi Methods In Molecular Biology 744, p 1-11 Winston W M., Molodowitch C and Hunter C P., 2002 Systemic RNAi in C elegans requires the putative transmembrane protein SID-1 Science 295, p 2456-2459 Wisler G C., 1989 How to Control Orchid Viruses: The Complete Guidebook Maupin House Pub, 119 p 96 76 Wong S M., Mahtani P H., Lee K C., Yu H H., Tan Y., Neo K K., Chan Y., Wu M and Chng C G., 1997 Cymbidium mosaic potexvirus RNA: complete nucleotide sequence and phylogenetic analysis Arch Virol, 142, p 383-391 77 Xie Z., Fan, B., Chen C H and Chen Z., 2001 An important role of an inducible RNA-dependent RNA polymerase in plant antiviral defense Proc Natl Acad Sci USA 98, 6516-6521 78 Xie Z., Johansen L K., Gustafson A M., Kasschau K D., Lellis A D., Zilberman D., Jacobsen S E., and Carrington J.C., 2004 Genetic and functional diversification of small RNA pathways in plants PLoS Biol 2, E104 79 Yamada O., Ikeda R., Ohkita I., Hayashi R., Sakamoto K., and Akita O., 2007 Gene silencing by RNA interference in the Koji Mold Aspergillus oryzae Biosci Biotechnol Biochem 71(1), p 138-144 80 Yang S H., Yu H., Goh C J., 2003 Functional characterisation of a cytokinin oxidase gene DSCKX1 in Dendrobium orchid Plant Molecular Biology 51, p 237-248 81 Ye K., Malinina L and Patel, D J., 2003 Recognition of small interfering RNA by a viral suppressor of RNA silencing Nature 426, p 874-878 82 Yoo B.C., Kragler F., Gasic E V., Haywood V., Evans S A., Lee E M., Lough T J., Lucas W., 2004 A systemic small RNA signaling system in plants Plant Cell, p 1979-2000 83 Zamore P D., Tuschl T., Sharp P A., and Bartel D P., 2000 RNAi: doublestranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals Cell 101, p 25-33 84 Zettler F W., Ko N J., Wisler G C., Elliott M.S, Wong S M., 1990 Viruses of orchid and their control Plant Disease, 74(9), p 621-626 85 Zettler F W., Ko N J., Wisler G C., Elliott M S, Wong S M., 1990 Viruses of orchid and their control Plant Disease, 74(9), p 621-626 97