Nghiên cứu đa dạng di truyền một số giống lan dendrobium bằng chỉ thị issr và sử dụng pcr tiên đóan màu sắc và hương thơm của hoa

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP HCM TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CƠNG NGHỆ CAO TĨM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu) NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ GIỐNG LAN DENDROBIUM BẰNG CHỈ THỊ ISSR VÀ SỬ DỤNG PCR TIÊN ĐOÁN MÀU SẮC VÀ HƯƠNG THƠM CỦA HOA CHỦ NHIỆM NDNC (Ký tên) KS DƯƠNG NGỌC KIỀU THI CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG _/ 20 _ i TÓM TẮT ĐỀ TÀI Trong đề tài, 27 giống lan Dendrobium gồm DL5N2, DL5N3, DL5N1, DLTr04, DL5N4, DLTr01, DNTrLT, DLND, DLT12, DLTr08, DNCK, DNCK1, DNKHM, DLV01, DLX01, DNTr, DNVX, DNVX1, DNVX2, RDKV, RTTTr, RTTV, RTTV1, RTBTr, RGHT, RNDH, RTDT thuộc nhóm Dendrobium hoa lớn, Dendrobium nắng Dendrobium rừng thu thập, ghi nhận số đặc điểm nơng học, ly trích DNA, phân tích đa dạng di truyền dựa kỹ thuật ISSR, khuếch đại vùng gen chalcone synthase (CHS), dihydroflavonol 4-reductase (DFR) tham gia vào đường sinh tổng hợp nên màu sắc sequiterpene synthase (STS) tham gia vào đường sinh tổng hợp nên hương thơm số loài hoa Kết phân tích đa dạng di truyền sử dụng 11 mồi ISSR khuếch tổng số 135 băng DNA với tỷ lệ đa hình 100% Điều chứng tỏ thị ISSR cho tính đa hình cao lan Dendrobium Cây phân lồi tạo từ phân tích UPGMA dựa hệ số Nei Li’s chia 27 giống lan thành nhóm Nhóm bao gồm 25 giống lan: DL5N2, DL5N3, DL5N1, DLTr04, DL5N4, DLTr01, DNTrLT, DLND, DLT12, DLTr08, DNCK, DNCK1, DNKHM, DLV01, DLX01, DNTr, DNVX, DNVX1, DNVX2, RDKV, RTTTr, RTTV, RTTV1, RTBTr, RGHT Nhóm bao gồm giống lại RNDH RTDT Hệ số tương đồng tính 18% nhóm Các giống nhóm tương đồng 27%, hệ số tương đồng giống phân nhóm 1A 30%, giá trị boostrap 20%, giống nhóm có hệ số tương đồng 23% Kết phân nhóm di truyền giống khác giống có kiểu hình giống Kết PCR khuếch đại vùng gen CHS, DFR, STS có cặp mồi CHS F2/R2 DFR F2/R2 cho kết PCR Trình tự vùng CHS giống tương đồng cao (78-100%) với trình tự Chalcone synthase mRNA Dendrobium hybrid cultivar Sonia Earsakul số Query cover lại thấp có khác biệt lớn chiều sản phẩm PCR giống giống với ii MỤC LỤC Trang phụ bìa Tóm tắt đề tài Mục lục Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình Thơng tin đề tài Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài 1.1.1 Sơ lược thị phân tử 1.1.2 Hoa phong lan 1.1.2.1 Đặc điểm hình thái, phân loại giá trị kinh tế hoa lan 1.1.2.2 Sơ lược gen tạo nên màu hoa lan 1.1.2.3 Sơ lược gen tạo nên mùi thơm hoa lan 1.1.3 Những nghiên cứu thực nước 1.1.3.1 Những nghiên cứu nước 1.1.3.2 Những nghiên cứu nước 1.2 Tính cấp thiết nội dung nghiên cứu khoa học 1.3 Ý nghĩa khoa học khả áp dụng thực tiễn 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Khả áp dụng thực tiễn Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thu thập giống lan hệ thống hóa đặc điểm nơng học giống 2.1.1 Mục tiêu 2.1.2 Bố trí – Phương pháp thí nghiệm 2.1.2.1 Thu mẫu 2.1.2.2 Liệt kê đặc điểm nơng học giống 2.2 Ly trích DNA tổng số giống lan Dendrobium 2.2.1 Mục tiêu 2.2.2 Phương pháp thực 2.2.2.1 Phương pháp ly trích DNA 2.2.2.2 Phương pháp định tính định lượng DNA 2.3 Phân tích đa dạng di truyền giống lan kỹ thuật ISSR-PCR 2.3.1 Mục tiêu 2.3.2 Phương pháp thực 2.3.2.1 Thực phản ứng PCR ISSR 2.3.2.2 Phương pháp điện di mã hóa số liệu cho kết ISSR 2.3.2.3 Phương pháp phân tích kết ISSR 2.4 Thực phản ứng khuếch đại trình tự gen CHS, DFR, STS 2.4.1 Mục tiêu 2.4.2 Thực phản ứng PCR iii Trang i ii iii v vi vii viii 1 5 7 9 10 11 11 11 11 11 11 16 16 16 16 16 17 17 17 17 19 20 20 20 21 2.4.2.1 Thực phản ứng PCR khuếch đại gen CHS DFR 2.4.2.2 Thực phản ứng PCR khuếch đại gen STS 2.5 Phân tích trình tự gen CHS DFR Và STS 2.5.1 Mục tiêu 2.5.2 Bố trí – Phương pháp thí nghiệm Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thu thập giống lan hệ thống hóa đặc điểm nơng học giống 3.2 Ly trích DNA tổng số giống lan Dendrobium 3.3 Phân tích đa dạng di truyền sử dụng kỹ thuật ISSR 3.4 Kết PCR gen CHS, DFR STS 3.5 Kết phân tích trình tự gen CHS Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận 4.2 Kiến nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO iv 21 22 23 23 23 24 24 33 34 41 42 47 47 47 49 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Giải thích thuật ngữ Chữ viết tắt DNA Deoxyribonucleic acid PCR Polymerase chain reaction RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RAPD Random Amplified Polymorphism DNA AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism SSR Simple Sequence Repeat ISSR Inter – Simple Sequence Repeat MAS Marker assisted selection MAB Marker-assisted breeding MVA Mevalonate pathway MEP 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate IPP Isopentenyl pyrophosphate DMAPP Dimethylallyl diphosphate STS Serquiterpene synthase gen DFR Dihydroflavonol 4-reductase CHS Chalcone synthase DHK Dihydrokaempferol DHQ Dihydroquercetin DKM Dihydromyricetin PLB Protocm Like Body UV Ultra Violet v DANH SÁCH BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1 Một số tên gọi khác kỹ thuật ISSR-PCR Bảng 2.1 Danh sách tiêu nông học giống lan 12 Dendrobium Bảng 2.2 Danh sách Primer sử dụng phản ứng PCR ISSR 18 Bảng 2.3 Thành phần nồng độ hóa chất phản ứng PCR ISSR 18 Bảng 2.4 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR ISSR 19 Bảng 2.5 Trình tự mồi cho phản ứng PCR phát gen CHS DFR 21 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng PCR phát gen CHS DFR 21 Bảng 2.7 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR phát gen CHS DFR 22 Bảng 2.8 Trình tự mồi khuếch đại gen STS 22 Bảng 2.9 Thành phần phản ứng PCR phát gen STS 22 Bảng 2.10 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR phát gen STS 23 Bảng 3.1 Danh sách giống lan Dendrobium sử dụng đề tài 24 Bảng 3.2 Bảng mô tả đặc điểm nông học giống 25 Bảng 3.3 Kết định lượng DNA tổng số giống lan 34 Bảng 3.4 Danh sách mồi đa hình đoạn DNA 35 Bảng 3.5 Đa dạng di truyền quần thể Dendrobium 40 Bảng 3.6 Kết giải trình tự sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi CHS 43 F2/R2 vi DANH SÁCH HÌNH Tên hình Trang Hình 1.1 Nguyên tắc hoạt động ISSR SSR Hình 1.2 Tóm tắt đường sinh tổng hợp nên anthocyanin tạo nên màu sắc cho hoa Hình 1.3 Con đường sinh tổng hợp isoprene Hình 2.1 Hình minh họa số đặc điểm hình thái lan Dendrobium 14 Hình 2.2 Thang chuẩn DNA 1kb Promega CATALOG#G5711 19 Hình 3.1 Những giống lan Dendrobium sử dụng đề tài 33 Hình 3.2 Kết định tính DNA tổng số giống lan 33 Hình 3.3 Gel điện di sản phẩm khuếch đại DNA giống lan 36 Dendrobium kỹ thuật ISSR Hình 3.4 Cây phân lồi thu từ phân tích UPGMA 39 Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm PCR sử dụng mồi CHS F2/R2 41 Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm PCR sử dụng mồi DFR F2/R2 42 Hình 3.7 Kết giải trình tự giống DNTr01 sử dụng mồi CHS F2, 42 CHS R2 giống DLTr08 sử dụng mồi CHS R2 Bioedit 7.2.5 vii THÔNG TIN ĐỀ TÀI Tên đề tài/ dự án: Nghiên cứu đa dạng di truyền số giống lan Dendrobium thị ISSR sử dụng PCR tiên đóan màu sắc hương thơm hoa Chủ nhiệm đề tài/dự án: Dương Ngọc Kiều Thi Cơ quan chủ trì: Trung tâm Nghiên cứu & Phát triển Nơng nghiệp Công nghệ cao Tp HCM Thời gian thực hiện: Từ tháng 01/2015 đến tháng 12/2015 Kinh phí duyệt: 161.772.000 đồng Mục tiêu: Xây dựng quy trình ISSR-PCR nghiên cứu đa dạng di truyền giống lan, thử nghiệm tiên đoán màu sắc hoa phản ứng PCR khuếch đại gen Chalcon synthase (CHS), Dihydroflavonol 4-reductase (DFR) hương thơm hoa sequiterpene synthase (STS) Sản phẩm đề tài/ dự án: Quy trình phân tích đa dạng di truyền giống lan Dendrobium sử dụng thị phân tử ISSR viii CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài 1.1.1 Sơ lược thị phân tử Có loại thị chủ yếu thị hình thái (morphological marker), thị sinh hóa (biochemical marker) thị DNA (molecular marker hay genetic marker) [2] Trong loại thị thị DNA sử dụng phổ biến chúng sử dụng trực tiếp vật liệu di truyền DNA, vốn không chịu ảnh hưởng môi trường phát triển cá thể, đa dạng kỹ thuật thị DNA Chỉ thị SSR hay gọi với tên khác microsatellites, STR (Short Tandem Repeat), định nghĩa đa hình đoạn lặp lại đơn giản Kỹ thuật SSR dựa khuếch đại trình tự microsatellite primer đặc hiệu có khả bổ sung vào hai đầu locus microsatellite (Flanking region) Các primer thiết kế dựa vào trình tự vùng có chứa microsatellite Sự đa hình băng số lượng độ dài ngắn đoạn lặp lại Điều quan trọng kỹ thuật SSR phải biết trình tự vùng sườn để thiết kế primer phù hợp cho loài Tuy nhiên, với phát triển sinh tin học cà khoa học máy tính việc thiết kế primer cho SSR khơng cịn trở ngại cho việc ứng dụng vào nghiên cứu Sản phẩm cuối phương pháp SSR đoạn DNA có kích thước chênh lệch nhỏ chúng phân tách gel polyacrylamide Cho đến SSR ứng dụng rộng rãi để nghiên cứu đa dạng di truyền, đồ di truyền cho nhiều loài động thực vật khác nhờ có nhiều ưu điểm thị RFLP phát nhiều locus, đa hình cho locus cao, độ lặp lại cao, cần DNA SSR thị đồng trội (codominant) cho phép phân biệt cá thể đồng hợp tử dị hợp tử Tương tự RAPD, AFLP SSR có nhiều tiềm ứng dụng nhiều lĩnh vực khác nghiên cứu đa dạng quan hệ di truyền, phân biệt loài cá thể, lập đồ di truyền xác định QTL, chọn giống nhờ thị phân tử Tuy nhiên, kỹ thuật địi hỏi chi phí cao khơng phù hợp với nhiều phịng thí nghiệm nhỏ [14] ISSR loại thị microsatellite sử dụng nguyên tắc RAPD với primer hình thành từ phần chuỗi microsatellite phần base ngẫu nhiên có độ dài khoảng 16 – 25bp [26] Các primer sử dụng unanchored hay gọi MP – PCR (Microsatellite primer PCR) [14] anchored vị trí 5’ 3’ với – base Về nguyên tắc, PCR khuếch đại đoạn sườn nằm kế cận motif microsatellite Trong điều kiện khuếch đại phù hợp, kỹ thuật ISSR cho phép sản sinh vài chục sản phẩm có chiều dài khoảng 150 – 4.000 bp, đó, chúng điện di gel agarose hay gel acrylamide [26] Sự đa hình phát chủ yếu thuộc dạng xuất hiện/không xuất RAPD tương ứng với khác độ dài đoạn microsatellite Những thị ISSR phát đa hình ISSR có ưu điểm RAPD sử dụng mồi có kích thước dài nên điều kiện giai đoạn bắt cặp có nghiêm ngặt cao, hạn chế tượng mismatch priming dẫn đến khả lặp lại ISSR cho thấy 92 – 95% băng DNA khuếch đại từ mẫu DNA giống Những băng mờ nhạt, khơng rõ khơng có khả lặp lại Hơn nữa, kỹ thuật thực đơn giản, tốn thời gian chi phí khơng cao so với thị phân tử khác [26] Trong hầu hết trường hợp, ISSR thị mang tính trội số trường hợp, thị đồng trội (có thể phân biệt đồng hợp tử dị hợp tử [14] Hiện nay, kỹ thuật ISSR kỹ thuật có nguyên tắc hoạt động tương tự sử dụng rộng rãi nhiều loại trồng nghiên cứu nhận dạng di truyền, đa dạng di truyền, lập đồ genmome, xác định gene chọn giống trồng nghiên cứu tiến hóa sinh học [26] UBC844 UBC827 UBC843 UBC820 Hình 3.3 Gel điện di sản phẩm khuếch đại DNA giống lan Dendrobium kỹ thuật ISSR (tt) 38 Hình 3.4 Cây phân lồi thu từ phân tích UPGMA, sử dụng hệ số tương đồng Nei Li dựa 135 băng ISSR, mối quan hệ di truyền 27giống lan Dendrobium Các giống DL5N2, DL5N3, DL5N1 DLTr04 tương đồng với khoảng 90% với giá trị Boostrap cao 100%, tương đồng 78% so với giống DL5N4 Các giống RTTV RTTV1 tương đồng 99% với (Boostrap 100%) Các giống DNVX, DNVX1, DNVX2 tương đồng 100% (Boostrap 100%) Trong thu thập ký hiệu theo đặc điểm hình thái, nhóm giống (DL5N1, DL5N2, DL5N3, DL5N4), (DNVX, DNVX1, DNVX2), (RTTV, RTTV1) ghi nhận giống Phân tích số đa dạng di truyền giống lan quần thể sử dụng phần mềm POPGENE version 1.32 Mức độ đa dạng di truyền cá thể quần thể tương đối thấp (PPL: 59,9%; Nei’s gene diversity H = 0,2; Shanmon’s information index I = 0,3; Số lượng allen quan sát được: Na = 1,53; Số lượng allen hiệu Ne = 1,37) 39 Bảng 3.5 Đa dạng di truyền quần thể Dendrobium Stt Giống Na Ne H I PPL DLTR01 1,81 (0,40) 1,44 (0,34) 0,27 (0,17) 0,41 (0,24) 81,82% DLTR04 1,81 (0,40) 1,47 (0,32) 0,28 (0,16) 0,43 (0,23) 81,82% DL5N1 1,63 (0,50) 1,34 (0,34) 0,21 (0,19) 0,32 (0,27) 63,64% DL5N2 1,63 (0,50) 2,29 (0,30) 0,19 (0,17) 0,30 (0,25) 63,64% DL5N3 1,63 (0,50) 1,29 (0,30) 0,19 (0,17) 0,30 (0,25) 63,64% DL5N4 1,72 (0,46) 1,35 (0,27) 0,23 (0,16) 0,36 (0,24) 72,73% DLTR08 1,63 (0,50) 1,36 (0,34) 0,22 (0,19) 0,33 (0,28) 63,64% DLT12 1,27 (0,46) 1,12 (0,21) 0,08 (0,14) 0,13 (0,23) 27,27% DLND 1,63 (0,50) 1,29 (0,30) 0,19 (0,17) 0,30 (0,26) 63,64% 10 DLV01 1,63 (0,40) 1,34 (0,32) 0,21 (0,18) 0,33 (0,27) 63,64% 11 DLX01 1,81 (0,54) 1,54 (0,34) 0,32 (0,17) 0,47 (0,24) 81,82% 12 DNVX 1,54 (0,54) 1,31 (0,38) 0,18 (0,20) 0,28 (0,29) 54,55% 13 DNVX1 1,54 (0,54) 1,31 (0,38) 0,18 (0,20) 0,28 (0,29) 54,55% 14 DNVX2 1,54 (0,54) 1,31 (0,38) 0,18 (0,20) 0,28 (0,29) 54,55% 15 DNTR 1,18 (0,40) 1,18 (0,40) 0,19 (0,20) 0,12 (0,28) 18,18% 16 DNTRLT 1,45 (0,52) 1,21 (0,24) 0,14 (0,16) 0,22 (0,26) 45,45% 17 DNKHM 1,9 (0,30) 1,39 (0,24) 0,26 (0,12) 0,41 (0,17) 90,91% 18 DNCK 1,63 (0,50) 1,27 (0,30) 0,17 (0,16) 0,28 (0,24) 63,64% 19 DNCK1 1,63 (0,50) 1,34 (0,34) 0,21 (0,19) 0,32 (0,27) 63,64% 20 RNDH 1,36 (0,50) 1,29 (0,40) 0,16 (0,22) 0,23 (0,32) 36,36% 21 RTTR 1,54 (0,52) 1,32 (0,38) 0,19 (0,20) 0,28 (0,29) 54,55% 22 RKDV 1,54 (0,52) 1,36 (0,36) 0,21 (0,20) 0,31 (0,30) 54,55% 23 RTBTR 1,54 (0,52) 1,33 (0,36) 0,20 (0,20) 0,30 (0,29) 54,55% 24 RTTV 1,63 (0,50) 1,39 (0,35) 0,23 (0,20) 0,35 (0,29) 63,64% 25 RTTV1 1,63 (0,50) 1,39 (0,35) 0,23 (0,20) 0,35 (0,29) 63,64% 26 RTDT 1,72 (0,46) 1,54 (0,39) 0,30 (0,29) 0,44 (0,29) 72,73% 27 RGHT 1,45 (0,50) 1,21 (0,20) 0,15 (0,14) 0,21 (0,22) 45,45% TB 1,53 (0,46) 1,37 (0,33) 0,2 (0,18) 0,3 (0,26) 59,9% 40 Ghi chú: Na: observed number of alleles (số lượng allen quan sát được); Ne: effective number of alleles (Số allen hiệu quả); H: Nei’s gene diversity (hệ số đa dạng gene Nei); I: Shanmon’s information index; PPL: the percentage of polymorphic loci (phần trăm loci đa hình); giá trị ngoặc đơn độ lệch chuẩn TB: Trung bình 3.4 Kết PCR gen chalcone synthase (CHS), dihydroflavol 4-reductase (DFR), Serquiterpene synthase (STS) Dù thử nghiệm nhiều quy trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại khác thay đổi nồng độ thành phần phản ứng PCR, phản ứng PCR sử dụng cặp mồi CHS F1/R1, DFR F1/R1, STS F1/R1, STS F2/R2 không cho sản phẩm khuếch đại Chỉ có cặp mồi CHS F2/F2 DFR F2/R2 cho sản phẩm PCR Có 19 giống có sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi CHS F2/R2 gồm DLTr01, DLTr04, DL5N1, DL5N2, DL5N3, DL5N4, DLTr08, DLT12, DLND, DLV01, DLX01, DNVX, DNVX1, DNVX2, DNTr, DNTrLT, DNKHM, DNCK, DNCK1, Trong đó, 12 giống DLTr01, DLTr08, DLT12, DLND, DLV01, DNVX, DNVX2, DNTr, DNTrLT, DNKHM, DNCK, DNCK1 có băng DNA điện di gel agarose (kích thước khoảng 2,5 kb) giống DNTr04, DL5N1, DL5N2, DL5N3, DL5N4, DLX01, DNVX1 có đến băng DNA (2,5 kb, 0,9 kb, 1,1 kb, 3,0 kb) Các băng có kích thước 2,5 kb cho tín hiệu sáng dùng để giải trình tự phân tích trình tự gen CHS (Hình 3.4) Phản ứng PCR sử dụng mồi DFR F2//R2 cho sản phẩm PCR 24/27 giống lan khảo sát (trừ giống DNVX, DNVX1, DNVX2), giống cho từ đến băng DNA với kích thước 100 bp, 200 bp, 250 bp, 300 bp (Hình 3.5) Khơng có mẫu cho băng có kích thước giống với kích thước dự đốn ban đầu 1152 bp Do đó, có sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi CHS F2/R2 đem giải trình tự phân tích tương đồng Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm PCR sử dụng mồi CHS F2/R2 41 Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm PCR sử dụng mồi DFR F2/R2 3.5 Phân tích trình tự gen CHS, DFR, STS Hình 3.7 Kết giải trình tự giống DNTr01 sử dụng mồi CHS F2, CHS R2 giống DLTr08 sử dụng mồi CHS R2 Bioedit 7.2.5 Kết giải trình tự so sánh với trình tự GenBank cho thấy tương đồng cao (78-100%) với trình tự Chalcone synthase mRNA Dendrobium hybrid cultivar Sonia Earsakul số Query cover lại thấp khác biệt chiều sản phẩm PCR giống giống với (Bảng 3.5) Đa số sắc phổ giống hiển thị phần mềm Bioedit 7.2.5 bị nhiễu (Hình 3.6) Trình tự giải mồi xuôi mồi ngược giống khác khác so với giống khác 42 Bảng 3.6 Kết giải trình tự sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi CHS F2/R2 Tên trình tự Độ dài trình tự Độ tương dồng (bp) Query Vùng tương đồng cover CHS_1_F2 1577 100% (Dendrobium hybird cultivar Sonia Earsakul chalcone synthase, KC345011.1) 3% Chalcone synthase mRNA CHS_1_R2 764 99% (Dendrobium hybird cultivar Sonia Earsakul chalcone synthase, KC345011.1) 96% Chalcone synthase mRNA CHS_2_F2 407 100% (Dendrobium hybird cultivar Sonia Earsakul chalcone synthase, KC345011.1) 13% Chalcone synthase mRNA CHS_2_R2 1349 78% (Dendrobium hybird cultivar Sonia Earsakul chalcone synthase, KC345011.1) 63% Chalcone synthase mRNA CHS_3_F2 361 97% (Dendrobium hybird cultivar Sonia Earsakul chalcone synthase, KC345011.1) 16% Chalcone synthase mRNA CHS_3_R2 1217 90% (Dendrobium hybird cultivar Sonia Earsakul chalcone synthase, KC345011.1) 73% Chalcone synthase mRNA CHS_4_F2 1387 97% (Dendrobium hybird cultivar Sonia Earsakul chalcone synthase, KC345011.1) 4% Chalcone synthase mRNA CHS_4_R2 1397 100% (Cattleya hybird cultivar, KP171693.1) 3% Chalcone synthase mRNA CHS_5_F2 772 98% (Dendrobium hybird cultivar Sonia Earsakul chalcone synthase, KC345011.1) 7% Chalcone synthase mRNA CHS_5_R2 1384 90% (Dendrobium hybird cultivar Sonia Earsakul chalcone synthase, KC345011.1) 64% Chalcone synthase mRNA CHS_6_F2 506 98% (Dendrobium hybird cultivar Sonia Earsakul chalcone synthase, KC345011.1) 4% Chalcone synthase mRNA CHS_6_R2 1104 94% (Dendrobium hybird cultivar Sonia Earsakul chalcone synthase, KC345011.1) 94% Chalcone synthase mRNA CHS_7_F2 417 Khơng có trình tự tương đồng CHS_7_R2 745 Khơng có trình tự tương đồng CHS_8_F2 352 91% (Dendrobium hybird cultivar Sonia Earsakul chalcone synthase, KC345011.1) 15% Chalcone synthase mRNA CHS_8_R2 1748 98% (Dendrobium hybird cultivar Sonia Earsakul chalcone synthase, KC345011.1) 60% Chalcone synthase mRNA CHS_9_F2 1353 95% (Dendrobium hybird cultivar Sonia Earsakul chalcone synthase, KC345011.1) 4% Chalcone synthase mRNA CHS_9_R2 1349 95% (Dendrobium hybird cultivar Sonia Earsakul chalcone synthase, KC345011.1) 4% Chalcone synthase mRNA CHS_10_F2 506 100% (Dendrobium hybird cultivar Sonia Earsakul chalcone synthase, KC345011.1) 11% Chalcone synthase mRNA 43 CHS_10_R2 1355 85% (Dendrobium hybird cultivar Sonia Earsakul chalcone synthase, KC345011.1) 68% Chalcone synthase mRNA CHS_11_F2 1372 98% (Dendrobium hybird cultivar Sonia Earsakul chalcone synthase, KC345011.1) 4% Chalcone synthase mRNA CHS_11_R2 1666 98% (Dendrobium hybird cultivar Sonia Earsakul chalcone synthase, KC345011.1) 63% Chalcone synthase mRNA CHS_12_F2 1367 98% (Dendrobium hybird cultivar Sonia Earsakul chalcone synthase, KC345011.1) 4% Chalcone synthase mRNA CHS_12_R2 397 93% (Dendrobium hybird cultivar Sonia Earsakul chalcone synthase, KC345011.1) 75% Chalcone synthase mRNA CHS_13_F2 1360 98% (Dendrobium hybird cultivar Sonia Earsakul chalcone synthase, KC345011.1) 4% Chalcone synthasemRNA CHS_13_R2 1645 96% (Dendrobium hybird cultivar Sonia Earsakul chalcone synthase, KC345011.1) 64% Chalcone synthase mRNA CHS_14_F2 1056 98% (Dendrobium hybird cultivar Sonia Earsakul chalcone synthase, KC345011.1) 5% Chalcone synthase mRNA CHS_14_R2 598 98% (Dendrobium hybird cultivar Sonia Earsakul chalcone synthase, KC345011.1) 94% Chalcone synthase mRNA CHS_15_F2 608 Khơng có trình tự tương đồng CHS_15_R2 694 Khơng có trình tự tương đồng CHS_16_F2 641 97% (Dendrobium hybird cultivar Sonia Earsakul chalcone synthase, KC345011.1) 6% Chalcone synthase mRNA CHS_16_R2 1354 86% (Dendrobium hybird cultivar Sonia Earsakul chalcone synthase, KC345011.1) 66% Chalcone synthase mRNA CHS_17_F2 759 100% (Dendrobium hybird cultivar Sonia Earsakul chalcone synthase, KC345011.1) 7% Chalcone synthase mRNA CHS_17_R2 574 86% (Dendrobium hybird cultivar Sonia Earsakul chalcone synthase, KC345011.1) 70% Chalcone synthase mRNA CHS_18_F2 348 Khơng có trình tự tương đồng CHS_18_R2 519 Khơng có trình tự tương đồng CHS_19_F2 612 97% (Dendrobium hybird cultivar Sonia Earsakul chalcone synthase, KC345011.1) 9% Chalcone synthase mRNA CHS_19_R2 1110 Khơng có trình tự tương đồng 44 Chalcone synthase enzyme chủ chốt đường sinh tổng hợp flavonoid/ isoflavonoid tạo màu sắc cho hoa Ngồi việc đóng vai trị phát triển lập trình sẵn, biểu CHS gen tăng cường bị tác động tác nhân gây stress tia tử ngoại, công vi khuẩn nấm bệnh Sự biểu CHS giúp tích lũy chất kháng độc tố gốc flavonoid isoflavonoid liên quan đến chế tự bảo vệ salicylic acid Trong thực vật, CHS ln có mặt tế bào chúng kích hoạt điều kiện chuyên biệt Hoạt tính CHS kiểm sốt antisense sense genes Những nghiên cứu biểu antisense genes Petunia, thuốc lá, Gerbera hybrid Arabidopsis cho thấy có mặt antisense CHS làm ức chế biểu CHS thực vật Những hoa Pentunia chuyển gen CHS antisense bị ức chế gen CHS nội sinh mức độ khác biểu kiểu hình hoa bị ức chế sản xuất nên anthocyanin tạo hoa màu xanh trở nên dạng sọc Ở Arabidopsis, parsley, snapdragon tìm thấy gen CHS Trong hầu hết hạt kín, CHS mã hóa họ gen petunia, morning glories, Gerbera, leguminous, Cannasbis sativa [12] Dường có gen CHS họ gen CHS có dạng biểu khác Sinh tổng hợp anthocyanin cần có enzyme gồm chalcone synthase (CHS), chalcone isomerase (CHI), flavanone 3-β-hydroxylase (F3H), dihyfroflavonol-4-reductase (DFR), anthocyanin synthase (ANS) Flovonoid glcosyltransferase Tùy loài mà sản phẩm F3H, dihydroflavonol, thay với nhóm hydroxyl flavonoid 3’-hydroxylase (F3’H) và/hoặc flavonoid 3’,5’-β-hydroxylase (F3’5’H), tạo nên chất trung gian cho nhánh đường sinh tổng hợp dẫn đến hình thành nhóm sắc tố khác hoa [31] Nhiều nghiên cứu chứng minh ảnh hưởng đột biến lên CHS, CHI, F3H, DFR, ANS khóa đường sinh tổng hợp làm cho hoa có màu trắng Các giống hoa Dendrobium lai phân bố nhiều nơi giới với màu sắc, hương thơm hình thái đa dạng Nhiều nghiên cứu thực nhằm tìm hiểu kiểm sốt màu sắc hoa Dendrobium CHS DFR gen phân lập phân tích khác biệt để tìm khác biệt tương quan gen màu hoa Nattaphan cộng 45 năm 2015 phân lập phân tích trình tự cDNA, sử dụng 5’ 3’-RACEs cDNA cloning giải trình tự, định lượng bán định lượng realtime PCR gen CHS, CHI1, CHI2, F3H, DFR, ANS, F3’5’H, FLS phân lập từ giống Dendrobium lai có màu tím, đào, trắng trắng xanh Các phân tích trình tự amino acid mức độ biểu gen tám gen mở tiềm biến thiên màu sắc giống lai Các giống hoa lai có màu đào thay đổi việc sản xuất anthocyanin từ cyanidin thành pelargonidin thông qua đột biến F3’H, cường độ màu sắc mức độ biểu thấp CHI1 CHI2 Thêm vào đó, giống hoa lai có màu trắng đột biến F3H và/hoặc mức độ biểu cao FLS, enzym chuyển đổi màu sắc chất trung gian flavonoid thành chất không màu Sự không biểu đồng thời F3H, DFR ANS giống hoa lai có màu trắng khác cho thấy biến đổi điều hòa anthocyanin làm cho hoa có màu trắng Thêm vào đó, phân tích đột biến lai hoa có màu vàng sẫm chứng minh ảnh hưởng biểu gen anthocyanin lên cường độ màu sắc hoa Hieber cộng năm 2005 phân lập phân tích biểu tính ổn định gen DFR, PSY, phytioene desaturase, carotenoid isomerase 9-cis epoxycaroteinoid dioxygenase từ Oncidium Gover Ramsey Sự biểu gen chúng diễn tra suốt trình phát triển hoa khơng giống Dendrobium Broheadia biểu giai đoạn khác kích hoạt 46 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Sử dụng kỹ thuật ISSR sử dụng 11 primers cho tổng số 135 băng DNA với tỷ lệ đa hình 100% Số lượng băng DNA thu mồi từ đến 16 băng, trung bình 12,5 băng Kích thước sản phẩm khuếch đại từ 100 bp đếm 3000 bp Cây phân lồi tạo từ phân tích UPGMA dựa hệ số Nei Li’s chia 27 giống lan thành nhóm Nhóm bao gồm giống RNDH RTDT nhóm gồm giống cịn lại Nhóm chia thành nhóm phụ (1A 1B) Nhóm 1B gồm giống RTTV, RTTV1, RTBTr, RGHT, nhóm 1A gồm giống cịn lại Giá trị Bootstrap cho nhóm 51% 37% Hệ số tương đồng tính 18% nhóm Các giống nhóm tương đồng 27%, hệ số tương đồng giống phân nhóm 1A 30%, giá trị boostrap 20%, giống nhóm có hệ số tương đồng 23% ISSR chứng tỏ hiệu phân biệt giống có kiểu hình khác biệt kiểu gen Điều quan trọng việc nhận diện phân biệt giống có kiểu gen khác kiểu hình gần giống làm sở cho tạo chọn giống Các phản ứng PCR sử dụng cặp mồi CHS F1/R1, DFR F1/R1, STS F1/R1, STS F2/R2 khơng cho sản phẩm khuếch đại Chỉ có cặp mồi CHS F2/F2 DFR F2/R2 cho sản phẩm PCR 19 giống cho sản phẩm khuếch đại từ mồi CHS F2/R2 giải trình tự so sánh với trình tự GenBank cho thấy tương đồng cao với trình tự (78-100%) với trình tự Chalcone synthase mRNA Dendrobium hybrid cultivar Sonia Earsakul số Query cover lại thấp khác biệt chiều sản phẩm PCR giống giống với 4.2 Kiến nghị Sử dụng ISSR cho việc sàng lọc phân biệt giống để đánh giá đa dạng hay khác biệt mặt di truyền làm sở cho việc lai tạo bảo tồn giống Thực phản ứng PCR thông thường chưa đủ để thu sản phẩm PCR phân tích khác biệt gen tạo nên màu sắc mùi hương hoa Có thể có nhiều gen CHS Dendrobium Do đó, để phân tích khác biệt 47 gen từ dự đốn hình thành nên màu sắc hoa cần thực phương pháp RT-PCR và/ realtime PCR để vừa xác định cường độ biểu hiện, vừa xác định gen biểu hoa Hạn chế nhiễu phân tích trình tự Đồng thời, nên chọn hoa có màu sắc trơn (đơn) hồn tồn có tính ổn định thời gian dài 48 Tài liệu tham khảo Tiếng Việt [1] Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang 2008 Di truyền phân tử Nhà xuất Nơng nghiệp, Tp Hồ Chí Minh [2] Hồ Huỳnh Thùy Dương (1997) Sinh học phân tử Nhà xuất Giáo dục [3] Trần Lê Lưu Ly, Nguyễn Hữu Hoàng, Bùi Lan Anh, Trần Nguyên Vũ, Bùi Văn Lệ (2008) Thử nghiệm chuyển gen lan Hồ Điệp (Phalaenopsis amabilis L.) phương pháp bắn gen Aagrobacterium tumefaciens Tạp chí phát triển KH&CN, tập 11, số 10 – 2008, pp 109-113 [4] Lâm Văn Thông (2009) Xác định biến dị di truyền lan Dendrobium udomsri kỹ thuật Rapd phương pháp flow cytometry Chuyên ngành trồng trọt, Trường Đại học Cần Thơ, 61 tr [5] Trần Thanh Tuyến (2010) Ảnh hưởng phân bón liều lượng chiếu xạ tia gamma sinh trưởng lan Dendrobium udomsri Luận văn thạc sĩ Khoa học Nông Nghiệp chuyên ngành Trồng Trọt, Trường Đại học Cần Thơ, 63 tr Tiếng Anh [6] Akagi, H., Yokozeki, Y., Inagaki, A., Nakamura, A., and Fujimura, T.(1996) A co-dominant DNA marker closely linked to the rice nuclear restorer gene, Rf-1, identified with inter-SSR fingerprinting Genome 39, pp 1205-1209 [7] Arcade, A., Anselin, F., Rampant P.F., Lesage M.C., Pagues L.E., and Prat, D (2000) Amplication of AFLP, RAPD, and ISSR markers to genetic mapping of European and Japanese larch Theor Appl Genet 100, pp 299-307 [8] Becker, J., and Heun M., (1995) Mapping of digested and undigested rando amplified microsetallite polymorphisms in barley Genome 38, pp 991-998 [9] Bisht, S., Adhikari, B.S (2014) Dendrobium longicornu: an addition to the orchid flora of Western Himalaya Tropicalia ISSN 1626-3596, pp 157-168 [10] Chan, W., Abdullah, J.O., and Namasivayam, P (2011) Isolation, cloning and characterization of fragrance-related transcripts from Vanda Mini Palmer Sci Hort 127, pp 388-397 49 [11] Charters, Y.M., Wilkinson, M.J (2000) The use of self-pollinated progenies as ‘in groups’ for the genetic characterizaation of cocoa germplasm Theor Appl Genet 100, pp 160-166 [12] Dao, T.T.H., Linthorst, H.J.M., Verpoorte, R (2011) Chalcone synthase and its functions in plant resistance Phytochem Rev, 10: 397-412 [13] Fajardo, C.G., Vieira, F.A., Molina, W.F.(2014) Interspecific genetic analysis of orchids in Brazil using molecular markers Plant Syst Evol 300, pp 18351832 [14] Gupta, M., Chyi, Y.S., Severson, J.R., and Owen, J.L (1994) Application of inter simple sequence repeat (ISSR) markers to plant genetics Electrophoresis 18, pp 1524-1528 [15] Hantula, J., Dusabenyagasani, M., and Hamelin, R.C.(1996) Random amplified microsatellites (RAMS) - a novel method for characterizing genetic variation within fungi Eur J for Path 26, pp 159-166 [16] Hussain, A.J., Gupta, V., Ali, J., Ranjekar, P.K., Siddiq, E.A (2000) Physiological characterization, genetics and molecular mapping of a new source of temperature sensitive genetic male sterility in rice Fourth International Rice Genetics Symposium, October, IRRI, Philipines Abstracts, pp 95 [17] Keb, L M, Gonzalez, G., Chi-manzanero, B., Infante, D (2002) A rapid and simple method for small scale DNA extraction in Agavaceae and other tropical plants Plant Mol Biol Rep 20: 299a-299e [18] Nei, M., Li, W.H (1979) Genetics Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases (molecular evolution /mitochondrial DNA/ nucleotide diversity) Proc Natl Acad Sct USA 76 (10):5269-5273 [19] Page RDM 1996 TREEVIEW: an application to display phylogenetic trees on personal computers Computer Applications in the Biosciences 12:357–358 [20] Pavlíček A, Hrdá Š, Flegr J 1999 FreeTree - freeware program for construction of phylogenetic trees on the basis of distance data and for bootstrap/jackknife analysis of the trees robustness Application in the RAPD analysis of genus Frenkelia Folia Biologica 45:97–99 50 [21] Pinheiro, L.R., Rabbani, A.R.C., Silva, A.V.C., Lédo, A.S., Pereira, K.L.G., and Diniz, L.E.C (2012) Genetic diversity and population structure in the Brazilian Cattleya labiata (Orchidaceae) using RAPD and ISSR markers Plant Syst Evol 298, 1815-1825 [22] Qian, W., Ge, S., Hong, D.Y., 2001 Genetic variation within and among populations of a wide rice Oryza granulata from China detected by RAPD and ISSR markers Theor Appl Genet 102, pp 440-449 [23] Qian, X., Li, Q-J., Liu, F., Gong, M-J., Wang, C-X., and Tian, M (2014) Conservation genetics of an Endangered Lady’s Slipper orchid: Cypripedium japonicum in China Int J Mol Sci 15, 11578-11596 [24] Rasika, G.M-J, Champagne, M.M., Hieber, A.D., and Kuehnle, A.R (2005) Cloning and characterization of two anthocyanin biosynthetisc genes from Dendrobium orchid J Amer Soc Hort Sci 130 (4), pp 611-618 [25] Ratnaparkhe, M.B., Tekeoglu, M., and Muehlbauer, F.J.(1998) Inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism are useful for finding markers associated with disease resistance gene clusters Theor Appl Genet 97, pp 515-519 [26] Reddy, M.P., Sarla, N., and Siddig, E.A (2002) Inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism and its application in plant breeding Euphytica 128, pp 917 [27] Rodrigues, J.F., Berg, C., Abreu, A.G., Novello, M., Veasey, E.A., Oliveira, G.C.X., and Koehler, S (2014) Species delimitation of Cattleya coccinea and C mantiqueirae (Orchidaceae): insights from phylogenetic and population genetics analyses Plant Syst Evol, DOI 10.1007/s00606-014-1156-z [28] Rodríguez-Concepción, M., Boranat, A (2002) Elucidation of the methyleryththritol phosphate pathway for isoprenoid biosynthesis in bacteria an plastids A metabolic milestone achieved through genomics Plant Physiol 130, pp 1079-1089 [29] Sankar, A.A., Moore G.A (2001) Evaluation of inter-simple sequence repeat analysis for mapping in Citrus and extension of genetic linkage map Theor Appl Genet 102, pp 206-214 51 [30] Song, A.A.L., Abdullah, J.O., Abdullah, M.P., Shafee, N., and Rahim, R.A (2012) Functional expression of an orchid fragrance gene in Lactococcus lactis Int J Mol Sci 13, 1582-1597 [31] Tanaka, Y., Sasaki, N., Ohmiya, A (2008) Biosynthesis of plant pigments: anthocyanins, betalains, and carotenoid Plant J 54: 733-749 [32] Wang, G., Mahaligan, R., Knap, H.T (1998) (C-A) and (G-A) anchored simple sequence repeats (ASSRs) generated polymorphism in soybean, Glycine max (L.) Merr Theor Appl Genet 96, pp 1086-1096 [33] Wolff, K., Zietkiewicz, E., and Hofstra, H (1995) Identification of chrysanthemum cultivars and stability of DNA fingerprint patterns.Theor Appl Genet 91, pp 439-477 [34] Yannis, M., Lament E (1996) A Generic Estimation of Population Subdivision Using Distances Between Alleles With Special Reference for Microsatellite Loci Genetics 142 1061-1064 52