Luận án Tiến sĩ Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen RNAi để tạo dòng lan Dendrobium có khả năng kháng virus khảm vàng (Cymbidium mosaic virus CyMV)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN XUÂN DŨNG ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT CHUYỂN GEN RNAi ĐỂ TẠO D NG VI U HẢ N Dendrobium CÓ KHẢ N NG HÁNG VÀNG Cymbidium mosaic virus) LUẬN ÁN TIẾN Ĩ NÔNG NGHIỆP TP HỒ CHÍ MINH- 2017 i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN XUÂN DŨNG ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT CHUYỂN GEN RNAi ĐỂ TẠO D NG VI U N Dendrobium CÓ KHẢ N NG HẢ HÁNG VÀNG Cymbidium mosaic virus) Chuyên ngành: D Mã số: 62.62.01.11 LUẬN ÁN TIẾN Ĩ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: TS Dươ PGS TS C Hoa Xơ H H TP HỒ CHÍ MINH- 2017 ii LỜI C ĐO N Tôi cam đoan công trình nghiên cứu tơi Kết nghiên cứu hồn tồn trung thực, khách quan Các số liệu trình bày cơng trình phần cơng bố Tạp chí Khoa học-cơng nghệ đồng tác giả, phần cịn lại chưa cơng bố cơng trình TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận án Nguyễn Xuân Dũng i LỜI CẢ ƠN Để hồn thành q trình học tập nghiên cứu mình, tơi nhận nhiều giúp đỡ từ gia đình, thầy cơ, đồng nghiệp, bạn bè ủng hộ, tạo điều kiện quan tổ chức Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Dương Hoa Xô - Giám đốc Trung tâm Cơng nghệ Sinh học TP Hồ Chí Minh, người hướng dẫn cho cơng trình nghiên cứu Thầy truyền đạt ý tưởng, định hướng nghiên cứu, kiến thức kinh nghiệm cho tơi suốt q trình học tập, làm việc thực luận án Ngoài ra, với tư cách thủ trưởng đơn vị, thầy chấp thuận tạo điều kiện thuận lợi để tham gia chương trình đào tạo nghiên cứu sinh Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến PGS TS Chu Hồng Hà - Viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, người hướng dẫn thứ hai cho cơng trình nghiên cứu Thầy hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, tạo điều kiện hỗ trợ mặt kỹ thuật đóng góp nhiều ý kiến quý báu suốt trình học tập thực luận án Tơi xin trân trọng gởi lời cảm ơn đến: - Ban lãnh đạo Trung tâm Cơng nghệ Sinh học TP Hồ Chí Minh chấp thuận, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập - Ban lãnh đạo Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho trình học tập - Ban lãnh đạo Sở Khoa học Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh hỗ trợ phần kinh phí cho tơi để thực cơng trình nghiên cứu - PGS.TS Phạm Văn Toản tất cán thuộc Ban Đào tạo sau đại học Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Phòng Quản lý Khoa học Hợp tác Quốc tế- Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam, tận tình giúp đỡ, động viên tơi q trình học tập ii - GS TS Bùi Chí Bửu tất quý thầy cô (đã giảng dạy tham gia Hội đồng đánh giá đề cương, chuyên đề nghiên cứu nghiên cứu sinh) truyền đạt kiến thức, đóng góp nhiều ý kiến q báu tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu Những lời cảm ơn chân thành xin gởi đến: - Các cán bộ, sinh viên làm việc nhóm nghiên cứu chuyển gen thực vật thuộc Phịng Cơng nghệ Sinh học Thực vật, Trung tâm Cơng nghệ Sinh học TP Hồ Chí Minh, nhiệt tình tham gia, giúp đỡ ủng hộ tơi suốt q trình làm việc thực luận án - Các cán nghiên cứu thuộc phịng Cơng nghệ Tế bào Thực vật, Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình giúp đỡ hỗ trợ mặt kỹ thuật trình thực luận án - Quý thầy cô giáo giảng dạy truyền đạt kiến thức cho qua giai đoạn học tập, anh chị em đồng nghiệp bạn bè thân hữu cộng tác hỗ trợ tơi suốt q trình học tập, làm việc nghiên cứu Cuối cùng, xin gởi lời tri ân sâu sắc tình cảm ấm áp đến Ba, Mạ (người mẹ khuất) tất người thân u gia đình hết lịng động viên, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình trưởng thành, học tập nghiên cứu TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận án Nguyễn Xuân Dũng iii MỤC LỤC Trang LỜI C ĐO N i LỜI CẢ ƠN ii MỤC LỤC iv DANH SÁCH BẢNG xi DANH SÁCH HÌNH xiii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết Mục tiêu yêu cầu 3 Đối tượng phạm vi nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn Đóng góp luận án CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược hoa lan 1.1.1 Giới thiệu họ hoa lan 1.1.2 Giống lan Dendrobium 1.1.3 Sơ lược PLBs (Protocorm like bodies) 1.2 Sơ lược Cymbidium mosaic virus 1.2.1 Phân loại, hình dạng phân tử cấu trúc gen 1.2.2 Sự lây nhiễm di chuyển virus CyMV 1.2.3 Triệu chứng bệnh virus CyMV gây 1.2.4 Tình hình bệnh virus CyMV gây giống lan Việt Nam 10 1.3 Phương pháp chọn giống hoa lan 11 1.3.1 Chọn giống phương pháp cổ điển 11 1.3.2 Chọn giống phương pháp chuyển gen 11 1.3.3 Phương pháp chuyển gen qua trung gian Agrobacterium tumefaciens 11 1.3.3.1 Sơ lược phương pháp 11 1.3.3.2 Các dạng Agrobacterium tumefaciens dùng cho chuyển gen 13 iv 1.3.3.3 Cơ chế chuyển gen qua trung gian Agrobacterium tumefaciens 13 1.3.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến chuyển gen qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens hoa lan 14 1.4 Sự can thiệp RNA (RNAi) vai trị chọn giống trồng 19 1.4.1 Lịch sử phát RNAi 20 1.4.2 Cơ chế RNAi 23 1.4.3 Sự khởi đầu khuếch đại tín hiệu RNAi 25 1.4.4 Sự di chuyển tín hiệu RNAi .27 1.4.5 Mối liên hệ virus gây bệnh trồng RNAi 29 1.4.6 Vai trò RNAi chọn giống trồng kháng virus 30 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .36 2.1 Nội dung nghiên cứu 36 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 36 2.1.2 Nội dung nghiên cứu .39 2.2 Phương pháp nghiên cứu 40 2.2.1 Xây dựng quy trình chuyển gen vào lan Dendrobium Sonia 40 2.2.1.1 Xác định điều kiện thích hợp để tạo PLBs phục vụ cho chuyển gen 40 2.2.1.2 Xác định nồng độ chất cảm ứng acetosyringone (AS), thời gian đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn thích hợp cho việc chuyển gen vào PLBs 41 2.2.1.3 Xác định điều kiện thích hợp để loại vi khuẩn sàng lọc PLBs chuyển gen 42 2.2.2 Phân lập xác định trình tự gen CP virus CyMV 43 2.2.2.1 Thu thập mẫu lan nhiễm virus 43 2.2.2.2 Phân lập gen CP 44 2.2.2.3 Nhân dòng gen CP .44 2.2.2.4 Giải trình tự gen CP phân tích tương đồng trình tự .46 2.2.3 Thiết kế vector chuyển gen RNAi biến nạp vào A tumefaciens 46 2.2.3.1 Tạo vector pENTRTM/D-TOPO® có gắn gen CP ORF2-4+CP 46 2.2.3.2 Thiết kế vector chuyển gen RNAi mang đoạn gen CP ORF2-4+CP hệ thống Gateway 47 v 2.2.3.3 Tạo chủng A tumefaciens mang vector chuyển gen RNAi pK7GWIWG2(II)/CP pK7GWIWG2(II)/ORF2-4+CP 48 2.2.4 Tạo lan chuyển gen mang cấu trúc RNAi gen CP ORF2-4+CP .48 2.2.4.1 Nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn 48 2.2.4.2 Chuyển cấu trúc RNAi đoạn gen CP ORF2-4+CP vào PLBs qua trung gian vi khuẩn A tumefaciens .49 2.2.4.3 Sàng lọc PLBs mang cấu trúc gen chuyển 49 2.2.4.4 Kiểm tra diện gen chuyển PLBs giả định chuyển gen 50 2.2.4.5 Thu nhận lan hoàn chỉnh từ PLBs mang gen chuyển kiểm tra diện gen mục tiêu 50 2.2.5 Đánh giá khả kháng virus CyMV lan chuyển gen lây nhiễm virus nhân tạo điều kiện in vitro 51 2.2.5.1 Lây nhiễm virus CyMV vào lan chuyển gen điều kiện in vitro 51 2.2.5.2 Đánh giá khả kháng virus CyMV lan chuyển gen 52 2.2.6 Phân tích xử lý số liệu 52 2.2.7 Điều kiện nuôi cấy 53 2.2.8 Thời gian địa điểm nghiên cứu 53 CHƯƠNG ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54 3.1 Xây dựng quy trình chuyển gen vào PLBs 54 3.1.1 Các điều kiện thích hợp để tạo PLBs phục vụ cho chuyển gen 54 3.1.1.1 Nồng độ chất khử trùng thích hợp để tạo mẫu cấy in vitro 54 3.1.1.2 Mơi trường thích hợp để tạo PLBs từ mô cấy in vitro 55 3.1.1.3 Mơi trường thích hợp cho tăng sinh phát triển PLBs 57 3.1.2 Nồng độ chất cảm ứng AS, thời gian đồng ni cấy chủng vi khuẩn thích hợp cho việc chuyển gen vào PLBs .58 3.1.2.1 Trường hợp chủng C58 58 3.1.2.2 Trường hợp chủng EHA105 .59 3.1.2.3 Trường hợp chủng LBA4404 .60 3.1.2.4 Về mức độ biểu gen GUS 61 vi 3.1.3 Các điều kiện thích hợp để loại vi khuẩn sàng lọc PLBs chuyển gen 62 3.1.3.1 Nồng độ cefotaxime thích hợp để loại vi khuẩn từ PLBs 62 3.1.3.2 Nồng độ hygromycin kanamycin thích hợp để sàng lọc PLBs chuyển gen 63 3.2 Phân lập xác định trình tự gen CP virus CyMV 66 3.2.1 Phân lập gen CP 66 3.2.2 Tạo dòng gen CP .67 3.2.3 Giải trình tự gen CP phân tích tương đồng trình tự 69 3.3 Thiết kế vector chuyển gen RNAi mang đoạn gen CP CP + ORF2-4 71 3.3.1 Tạo vector pENTRTM/D-TOPO® có gắn gen CP ORF2-4+CP .72 3.3.1.1 Khuếch đại gen CP từ vector nhân dòng gen ORF2-4+CP từ vector pBSK/ORF2-4+CP .72 3.3.1.2 Gắn đoạn gen CP ORF2-4+CP vào vector pENTR 72 3.3.1.3 Thiết kế vector chuyển gen RNAi kỹ thuật Gatewway .76 3.3.1.4 Tạo chủng vi khuẩn A tumefaciens mang vector chuyển gen RNAi 78 3.4 Tạo lan chuyển gen mang cấu trúc RNAi gen CP ORF2-4+CP 79 3.4.1 Chuyển cấu trúc RNAi đoạn gen CP ORF2-4+CP vào PLBs qua trung gian vi khuẩn A tumefaciens 79 3.4.1.1 Giai đoạn đồng nuôi cấy 79 3.4.1.2 Giai đoạn khử khuẩn 81 3.4.2 Sàng lọc PLBs mang cấu trúc gen chuyển 82 3.4.3 Kiểm tra diện gen chuyển PLBs giả định chuyển gen 83 3.4.4 Thu nhận lan hoàn chỉnh từ PLBs mang gen chuyển .85 3.5 Khả kháng CyMV lan chuyển gen điều kiện in vitro 90 3.5.1 Về biểu triệu chứng nhiễm virus CyMV 90 3.5.2 Về diện virus lan 92 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .95 Kết luận 95 Đề nghị 96 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CƠNG BỐ 97 vii TÀI LIỆU THAM KHẢO 98 Tài liệu tiếng Việt 98 Tài liệu tiếng Anh 99 PHỤ LỤC Phụ lục Môi trường nuôi cấy thực vật vi khuẩn Phụ lục Một số triệu chứng nghi nhiễm virus mẫu lan thu thập Phụ lục Quy trình chuyển gen vào PLBs lan Dendrobium Sonia qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Phụ lục Kết so sánh trình tự gen CP gen ORF2-4 CyMV Phụ lục Kết xử lý thống kê viii Tỷ lệ mẫ dươ í sa k 4.1 Trường hợp chủng C58 4.1.1 Sau ngày đồng nuôi cấy 4.1.2 Sau ngày đồng nuôi cấy ộm GUS 4.1.3 Sau ngày đồng nuôi cấy 4.1.4 Sau ngày đồng nuôi cấy 4.1.5 Sau ngày đồng nuôi cấy 4.2 Trường hợp chủng EHA105 4.2.1 Sau ngày đồng nuôi cấy 4.2.2 Sau ngày đồng nuôi cấy 4.2.3 Sau ngày đồng nuôi cấy 4.2.4 Sau ngày đồng nuôi cấy 4.2.5 Sau ngày đồng nuôi cấy 4.3 Trường hợp chủng LBA4404 4.3.1 Sau ngày đồng nuôi cấy * Sau ngày đồng nuôi cấy 4.3.2 Sau ngày đồng nuôi cấy 4.3.3 Sau ngày đồng nuôi cấy 4.3.4 Sau ngày đồng nuôi cấy Tỷ lệ mẫu s ê mô ường cefotaxime Số liệu chuyển đổi theo phương thức (X+0,5)1/2, với X số liệu thực 5.1 Sau ngày nuôi cấy 5.2 Sau 14 ngày nuôi cấy Tỷ lệ mẫu chết ê mô ường hygromycin Số liệu chuyển đổi theo phương thức (X+0,5)1/2, với X số liệu thực 6.1 Sau 14 ngày nuôi cấy 6.2 Sau 28 ngày nuôi cấy Tỷ lệ mẫu chế ê mô ường kanamycin Số liệu chuyển đổi theo phương thức (X+0,5)1/2, với X số liệu thực 7.1 Sau 20 ngày nuôi cấy 7.2 Sau 40 ngày nuôi cấy