Nghiên cứu tác dụng ức chế virus ev 71 kháng viêm kháng khuẩn và độc tính của thuốc chứa tinh chất lá trầu trên thực nghiệm

SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CÔNG TY CỔ PHẦN DƯỢC PHẨM OPC BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ VIRUS EV71, KHÁNG VIÊM, KHÁNG KHUẨN VÀ ĐỘC TÍNH CỦA THUỐC NƯỚC CHỨA TINH CHẤT LÁ TRẦU (Piper betle L., họ Hồ tiêu – Piperaceae) TRÊN THỰC NGHIỆM CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI : PGS.TS NGUYỄN PHƯƠNG DUNG CƠ QUAN QUẢN LÝ : SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TP.HỒ CHÍ MINH CƠ QUAN CHỦ TRÌ : CƠNG TY CP DƯỢC PHẨM OPC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 8/ 2015 BÁO CÁO NGHIỆM THU Tên đề tài: Nghiên cứu tác dụng ức chế virus EV71, kháng viêm, kháng khuẩn độc tính thuốc nước chứa tinh chất Lá Trầu (Piper betle L., họ Hồ tiêu – Piperaceae) thực nghiệm Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Nguyễn Phương Dung Cơ quan chủ trì: Cơng ty Cổ phần Dược phẩm OPC Thời gian thực đề tài: 6/2014-6/2015 Kinh phí duyệt: 410.000.000 đ Kinh phí cấp: 205.000.000 đ theo TB số: 55TB-SKHCN ngày 03/6/2014 Mục tiêu: (Theo đề cương duyệt) Mục tiêu tổng quát: Nghiên cứu chế phẩm chống lây lan điều trị bệnh Tay Chân Miệng từ Lá Trầu Mục tiêu cụ thể: - Khảo sát khả ức chế virus EV71 in vitro chế phẩm thuốc nước chứa tinh chất Lá Trầu - Ðánh giá tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn chế phẩm thuốc nước chứa tinh chất Lá Trầu thực nghiệm - Khảo sát độc tính cấp bán trường diễn chế phẩm thuốc nước chứa tinh chất Lá Trầu chuột nhắt trắng i Nội dung: (Theo đề cương duyệt) TT Các nội dung, công việc Kết chủ yếu cần thực Khảo sát khả ức chế virus EV71 Ở nồng độ pha loãng 1/512 (tương đương 0,59 mg/100 mL chế phẩm), thuốc nước chứa tinh chất Lá Trầu thuốc nước TK thể tác dụng ức chế EV71 in vitro từ đến 10 lần (75 – 90%) sau 1h, 2h, 3h, 4h dùng thuốc Ðánh giá tác dụng kháng viêm cấp Thuốc thử nghiệm làm giảm phù chân thuốc nước chứa tinh chất Lá Trầu chuột liều uống 60, 120 180 mơ hình gây viêm carragenin mg/kg Liều 120 mg/kg 180 mg/kg có tác dụng kháng viêm cấp nhanh so với liều 60 mg/kg, tương đương aspirin (240 mg/kg) Ðánh giá tác dụng kháng viêm mạn Trọng lượng u hạt tươi, u hạt khô thuốc nước chứa tinh chất Lá Trầu 24,94% 69,27% so với chứng mơ hình tạo u hạt thực nghiệm Thuốc thử nghiệm có tác dụng kháng viêm mạn liều uống 120 mg/kg, tương đương aspirin 240 mg/kg Ðánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro MIC(%, v/v) thuốc thử nghiệm thuốc nước chứa tinh chất Lá Trầu 1,56 với Staphylococcus aureus S aureus đề kháng methicillin; 6,25 với Pseudomonas aeruginosa 12,50 với Escherichia coli Khảo sát độc tính cấp đường uống LD50 đường uống thuốc thử nghiệm thuốc nước chứa tinh chất Lá Trầu 3907,69 mg/kg chuột nhắt trắng Khảo sát độc tính bán trường diễn Ở liều uống 120 mg/kg 180 mg/kg thuốc nước chứa tinh chất Lá Trầu (60 ngày), thuốc thử nghiệm không làm chuột nhắt trắng thay đổi tốc độ tăng trọng, số huyết học, sinh hóa bản, hình thái vi thể gan thận chuột nhắt trắng Thống kê, xử lý số liệu thực nghiệm Ðạt yêu cầu báo cáo khoa học Báo cáo tổng kết đề tài ii Những nội dung thực (đối chiếu với hợp đồng ký) TT Nội dung thực Sản hẩm cần đ t Tiến độ hoàn thành Nghiên cứu tác dụng ức chế Bảng số liệu phân tích, EV71 in vitro nhận xét 100% Nghiên cứu tác dụng chế EV71 in Bảng số liệu phân tích, vivo nhận xét 0% Nghiên cứu tác dụng kháng viêm Bảng số liệu phân tích, cấp nhận xét 100% Nghiên cứu tác dụng kháng viêm Bảng số liệu phân tích, mạn nhận xét 100% Nghiên cứu tác dụng kháng Bảng số liệu phân tích, khuẩn nhận xét 100% Nghiên cứu độc tính cấp Bảng số liệu phân tích, nhận xét 100% Nghiên cứu độc bán trường diễn Bảng số liệu phân tích, nhận xét 100% Thống kê, xử lý số liệu thực Báo cáo khoa học nghiệm Báo cáo tổng kết đề tài iii 100% Nghiên cứu tác dụng ức chế virus EV71, kháng viêm, kháng khuẩn độc tính thuốc nước chứa tinh chất Lá Trầu thực nghiệm TÓM TẮT Tình hình mục tiêu nghiên cứu Trầu (Piper betle L., họ Hồ tiêu - Piperaceae) phân bố rộng rãi Việt Nam, Ấn độ, Trung quốc, Srilanka, Thái lan nhiều quốc gia Đông Nam Á khác Lá Trầu sử dụng y học cổ truyền Việt Nam để ngăn ngừa bệnh lý miệng Với mục đích tìm kiếm chế phẩm thảo dược giúp ngăn ngừa lây lan bệnh Tay Chân Miệng (TCM), Nghiên cứu đánh giá tác dụng ức chế EV71, kháng viêm, kháng khuẩn độc tính chế phẩm thuốc nước chứa tinh chất Lá Trầu (TK) chuột nhắt trắng Phương tiện hương há nghiên cứu: Động vật: Chuột nhắt trắng trưởng thành phái, chủng Swiss albino, thể trọng 18-22 g, 6-8 tuần tuổi, khoẻ mạnh, viện Vaccin sinh phẩm Nha trang cung cấp Thuốc thử nghiệm chứa tinh chất Lá Trầu (TK) cung cấp Công ty CP Dược phẩm OPC Sử dụng mẫu trắng dung môi dùng pha chế mẫu thử (khơng có tinh chất Lá Trầu ) thử nghiệm kháng khuẩn kháng virus Khảo sát khả trung hịa virus theo quy trình ni cấy tế bào kháng thể trung hòa Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) Viện Pasteur Tp Hồ Chí Minh Áp dụng phương pháp pha lỗng, phân tán thạch để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Thực vi khuẩn Gram dương (Staphylococcus aureus ATCC 29213 - MSSA, S aureus đề kháng methicillin ATCC 43300 - MRSA) vi khuẩn Gram âm (Pseudomonas aeruginosa ATCC 2785, Escherichia coli ATCC 2592) Bộ môn Vi ký sinh - Khoa Dược, Đại học Y Dược Tp.HCM Áp dụng mơ hình gây viêm cấp carragenin, gây viêm mạn tạo u hạt thực nghiệm chuột nhắt trắng Chỉ tiêu theo dõi: thể tích chân chuột sau tiêm carragenin 1, 2, ngày, ngày; Trọng lượng u hạt, tươi khơ ngày thứ thí nghiệm gây viêm mạn Đánh giá độc tính cấp theo hướng dẫn OECD 423 áp dụng dịch chiết thảo dược Ghi nhận thay đổi hành vi, tỷ suất tử vong sau cho chuột uống liều thuốc thử nghiệm Thử nghiệm độc tính bán trường diễn: chia chuột nhắt thành lô (1 chứng, thử), lô 10 chuột, dùng thuốc nghiên cứu liên tục 60 ngày, liều thử nghiệm 120 180 mg/kg Cân thể trọng hàng tuần Xét nghiệm huyết học, sinh hóa, vi thể gan, thận vào cuối thử nghiệm, 60 ngày sau uống thuốc iv Kết Tác dụng dược lý Ở nồng độ pha loãng 1/512 (tương đương 0,59 mg tinh chất Lá Trầu /100 mL chế phẩm), thuốc nước chứa tinh chất Lá Trầu (TK) thể tác dụng ức chế enterovirus 71 (EV71) Thuốc nước chứa tinh chất Lá Trầu (TK) có nồng độ ức chế tối thiểu 50% (MIC) với Staphylococcus aureus, S aureus đề kháng methicillin, Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli 1,56; 1,56; 6,25 12,50 (%, v/v) so với mẫu trắng Trên mô hình gây phù chân chuột carragenin, thuốc nước chứa tinh chất Lá Trầu (TK) thể tác dụng kháng viêm cấp liều uống 60 mg/kg, 120 mg/kg 180 mg/kg Trên mơ hình gây u hạt, thuốc nước TK thể tác dụng kháng viêm mạn liều uống 120 mg/kg Độc tính Đã xác định LD50 đường uống thuốc nước TK 3907,69 mg/kg So với lô chứng, liều uống 120 mg/kg 180 mg/kg, thuốc nước TK không ảnh hưởng đến thể trọng, số huyết học, sinh hóa bản, hình thái vi thể gan thận chuột nhắt trắng Kết luận Ở nồng độ pha loãng 1/512 (tương đương 0,59 mg tinh chất Lá Trầu /100 mL chế phẩm), thuốc nước chứa tinh chất Lá Trầu (TK) giảm số lượng EV71 3,98 - 10 lần so với mẫu chứng Đồng thời, mẫu nghiên cứu ức chế Staphylococcus aureus, S aureus resistance methicillin, Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli Thuốc nước chứa tinh chất Lá Trầu (TK) thể tác dụng kháng viêm cấp mạn nhanh mạnh chuột nhắt trắng LD50 đường uống thuốc nước TK 3907,69 mg/kg Thuốc nước TK tương đối an toàn với chuột nhắt trắng liều 120 mg/kg 180 mg/kg, uống liên tục 60 ngày Có thể triển khai thử nghiệm người v ABTRACT Background and Aims: Piper betle L belongs to the family Piperaceae and is distributed in Vietnam, India, China, Srilanka, Thailand and other Southeast Asian countries The Betel leaves from Piper betle L have long been used in traditonal medicine of Vietnam for prevention of oral diseases In the present study, we investigated the antiviral activities of a preparation from Betel leaves extract (TK) against enterovirus 71 (EV71) The antibacterial activity against Staphylococcus aureus (MSSA and MRSA), Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli was studied by agar disk diffusion method This study was designed also to evaluate the anti-inflammatory activities and the oral toxicity of the preparation from Betel leaves extract (TK) Materials and Methods: Animals: Swiss albino mice weight body 18–22g, 6-8 weeks age, purchased from the Institute of Vaccines and Medical Biological - Nhatrang Studying sample (TK) was supplied by OPC Pharmaceutical Joint Stock Company Solvent for preparing study sample (without Betel leaves extract) was used as control (C group) for antiviral and antibacterial activity assay Assays of antiviral activity were evaluated by the WHO protocol in Pasteur Institute at HCMC - VN The TK were evaluated for antibacterial activity against Gram positive (Staphylococcus aureus ATCC 29213 - MSSA, S aureus methicillin resistance ATCC 43300 - MRSA) and Gram negative bacteria (Pseudomonas aeruginosa ATCC 2785, Escherichia coli ATCC 2592) The anti-inflammatory effects of the preparation from Betel leaves extract on acute (carragenin-induced) and chronic (cotton pellet granule) phases of inflammation were investigated The mouse paw edema was measured Plethysmometrically from 1, 2, hours and day, days after injection carragenin Pellet granule was weighed on fresh and dried at the end of 8th day Study sample was followed OECD guidelines OECD 423 for assessing the acute oral toxicity of the plant extracts The behavior and mortality were examined for up to 14 days Sub-chronic toxicity test: groups of 10 animals were used Mice were treated daily for 60 consecutive days test groups received orally at the dose 120 and 180 mg/kg Body weight was measured weekly Hematological and biochemical parameters, relative organ weight were determined at the end of the 60 days administration vi Results: The antiviral assays demonstrated that TK preparation possessed significant antiviral activity against EV71 at a concentration of 1/512 (equivalent 0,59 mg extract of Betel leave/100 mL preparation) (v/v) The bacterial activity was observed toward Staphylococcus aureus, S aureus methicillin resistance, Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli with Minimum Inhibitory Concentration 50% (MIC) are 1.56, 1.56, 6.25 and 12.50 (%, v/v) compared without Betel leaves exctract The preparation from Betel leaves extract at the dose of 60, 120 and 180 mg/kg was capable of reducing carragenin-induced inflammation The TK preparation was showed a potent antiproliferative effect (69.27%) in the chronic inflammation model (120 mg/kg, p.o) In acute toxicity study, LD50 of TK preparation was determined 3907.69 mg/kg (p.o) Sub-chronic toxicity study: oral administration of the TK preparation at the dose 120 and 180 mg/kg did not induce death or significant changes in body weight, relative weight of vital organs, hematological parameters and was not associated with liver and kidney toxicity Conclusion: The TK preparation has the potential to be effective in the treatment of infection with Staphylococcus aureus, S aureus methicillin resistance, Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli The activity against virus EV71 at a concentration of 1/512 (equivalent 0,59 mg extract of Betel leave/100 mL preparation) was low, about 3.98 - 10 times comparied the control sample The TK preparation has anti-inflammatory effects, confirming the traditional use of this plant for inflammatory pain Preparation from Betel leaves extract (TK) showed anti-inflammatory activity on mice Our study provided data for futher investigations on detailed toxic effects of this preparation TK may be safe when it's used in human vii MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU Chương 1-TỔNG QUAN 1.1 Sơ lược bệnh Tay Chân Miệng EV71 1.2 Dược liệu nghiên cứu -Trầu Chương 2-NỘI DUNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 Nội dung 1: Khảo sát khả ức chế virus EV71 chế phẩm thuốc nước chứa tinh chất Lá Trầu 11 Nội dung 2: Khảo sát độc tính cấp đường uống chế phẩm thuốc nước chứa tinh chất Lá Trầu chuột nhắt trắng 14 Nội dung 3: Ðánh giá tác dụng kháng viêm cấp chế phẩm thuốc nước chứa tinh chất Lá Trầu mô hình gây viêm carragenin 16 Nội dung 4: Ðánh giá tác dụng kháng viêm mạn chế phẩm thuốc nước chứa tinh chất Lá Trầu mơ hình tạo u hạt thực nghiệm 18 Nội dung 5: Ðánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro chế phẩm thuốc nước chứa tinh chất Lá Trầu 20 Nội dung 6: Khảo sát độc tính bán trường diễn chế phẩm thuốc nước chứa tinh chất Lá Trầu chuột nhắt trắng 22 Chương 3-KẾT QUẢ 24 Nội dung 1: Tác dụng ức chế virus EV71 in vitro chế phẩm thuốc nước chứa tinh chất Lá Trầu 24 Nội dung 2: Độc tính cấp 26 Nội dung 3: Đánh giá tác dụng kháng viêm cấp chế phẩm thuốc nước chứa tinh chất Lá Trầu mơ hình gây viêm carragenin 27 Nội dung 4: Kết đánh giá tác dụng kháng viêm mạn chế phẩm thuốc nước chứa tinh chất Lá Trầu mơ hình tạo u hạt thực nghiệm 31 Nội dung 5: Tác dụng kháng khuẩn 32 Nội dung Kết khảo sát độc bán trường diễn 34 BÀN LUẬN 38 Chương 4-KẾT LUẬN & ĐỀ NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Tiếng Anh Tiếng Việt APC Allypyrocatechol BHA Butylated Hydroxyanisole EMEM Eagles Minimal Essential Medium EV71 Enterovirus 71 CCID50 Cell Culture Infective Dose 50 CPE Cytopathic Effect Tác dụng làm thay đổi cấu trúc tế bào chủ gây virus DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl Hoạt tính chống oxy hóa HTCO LPO Lipid peroxyl oxidase MHA Mueller-Hinton Agar MIC Minimum Inhibitory Concentration 50% Nồng độ ức chế tối thiểu 50% MSSA Methicillin-sensitive Staphylococcus Staphylococcus aureus nhạy với aureus methicillin Methicillin-resistant Staphylococcus Staphylococcus aureus kháng aureus methicillin MRSA TCM Tay Chân Miệng TK Trầu không TSB Tryptic Soy Broth RD-A Rhabdomyosarcoma-A Tế bào sarcoma vân Y học cổ truyền YHCT ix TÀI LIỆU THAM KHẢO Abrahim NN, Kanthimathi MS, Abdul-Aziz A (2012), Piper betle show antioxidanr activities, inhibits MCF-7 cell proliferation and increases activities of catalase and superoxidase dismutase, BMC Complementary and Alternative Medicine 12-220http://biomedcentral.com/1472-6882/12/220, 11 p Chen Duo-Zhi, Xiong Hua-Bin (2013), Two new Sphingolipid from the leaves of Piper betle L., Molecules, 18, 11241-11249 Deshpandes SN, Kadam DG (2013), GCMS analysis and antibacterial activity of Piper betle (Linn) leaves against Streptococcus mutans, Asian J Pharm Cli Res, 6(5), 99-101 Diwidvedi V, Tripathi S (2014), Review study on potential acivity of Piper betle, J Pharm and Phyto 3(4), 93-98 Đỗ Tất Lợi (2014), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, trang 118-119 Frydenberg, A; Starr, M (2003), Hand, foot and mouth disease, Australian family physician 32 (8): 594–5 Gerhard Vogel H et al (2008), Drug Discovery and Evaluation Pharmacological Assays, 3rd Edition, Springer, 1113 Goldstein SA, Shemano L, Daweo R, Betler J, (1996), Cotton pellet ganuloma pou method for evaluation of anti-inflammatory activity, Arch Pharmacodynamic Ther, 165, 294-3, Vogel H, Anti-inflammatory Activity Drug Discovery and Evaluation 725-771 Hagiwara A, Tagaya I, Yoneyama T (1978) Epidemic of hand, foot and mouth disease associated with enterovirus 71 infection Intervirology 9: 60– 63 doi: 10.1159/000148922 45 10.Jahir AK et al, 2011, Evaluation of antibacterial properties of extract of Piper betle leaf, J Pharm Biol Sci, 11(11), 1-3 11.Kaminska, K; Martinetti, G; Lucchini, R; Kaya, G; Mainetti, C (2013), Coxsackievirus A6 and Hand, Foot, and Mouth Disease: Three Case Reports of Familial Child-to-Immunocompetent Adult Transmission and a Literature Review, Case Reports in Dermatology (2): 203–209 12.Khong Wei Xin, Yeo Huimin, Sylvie Alonso, (2012), Enterovirus 71: pathogenesis, control and models of disease, Future Virology, Vol 7, No 10 , 989-1004 13.Lê Thị Lan Phương, Nguyễn Phương Dung (2012), Đánh giá tác dụng kháng viêm, giảm đau viên nang PT5 chuột nhắt, Tạp chí Y học Tp Hồ Chí Minh, tập 19, phụ số 1, trang 135-139 14.Nalina TZ, Rahim HA (2007), The crude aqueous extract of Piper betle L and its antibacterial effect towards Streptococcus mutans, A J Biol Biotech, 3(1)10-15 15.Nguyễn Văn Thanh, Trần Cát Đơng (2002), Xây dựng mơ hình đánh giá chất có tiềm kháng khuẩn, Nghiên cứu y học, (1), tr 309 – 313 16.OECD (2002), Guidelines for the testing of chemicals/ Section Health Effects Test N0423/ Acute oral toxicity acute toxic class method Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris, Fancer 17.Ooi, MH; Wong, SC; Lewthwaite, P; Cardosa, MJ; Solomon, T (2010), Clinical features, diagnosis, and management of enterovirus 71, Lancet Neurology (11): 1097–1105 18.Rathee JS, Patro BS, Mula S, Gamre S, Chattopadhyay S (2006), Antioxidant activity of Piper betle leaf extract and its constituents, J Agric Food Chem, Nov2;54(24) p.9046-9054 46 19.Razak FA, Rahim H (2003), The anti-adherence effect of Piper betle and Psidium guajava extracts on the adhesion of early settlers in dental plaque to saliva-coated glass surfaces, J Oral Sci, 45(4), 201-206 20.Repass GL, Palmer WC, Stancampiano FF (2014), Hand, foot, and mouth disease: Identifying and managing an acute viral syndrome, Cleve Clin J Med 81 (9): 537–43 21.Rukayadi Y, Hwang K (2006), In vitro activity of xanthorrhizol against Streptococcus mutans biofilms, Lett in App Micro, 42(4), 400-404 22.Sickles GM, Mutterer M, Feorino P, Plager H (1955) Recently classified types of Coxsackie virus, group A; behavior in tissue culture Proc Soc Exp Biol Med 90: 529–531 doi: 10.3181/00379727-90-22088 23.Subashkumar R, Sureshkumar M (2013), Antibacterial effect of crude aqueous of Piper betle L against pathogenic bacteria, Inter J Res Pharm Biol Sci, 4(1), 42-46 24.Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam tập II, NXB Khoa học Kỹ thuật, trang 1007-1009 25.Viện Dược liệu (2004), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý thuốc từ dược thảo, NXB Khoa học Kỹ thuật, trang 140-149 26.WHO (2004), Polio laboratory manual, 4th edition, WHO/IVB/04.10, 73-78 27.Widowati W, Wijaya L, Wargasetia TL, Bachtiar I, Yellianty Y, Laksmitawati DR (2013), Antioxidant, anticancer, and appoptosis-inducing effects of Piper betle extracts in Hela cells, J Exp Integr Med 3(3):225-230 28.Winter CA, Risley E, Nuss G, (1962), Carragenin-induced edema in hind paw of the rat as an assay for anti-inflammatoty drugs, Proc Soc Exp Biol Med 111, 544-547 47 PHỤ LỤC Hướng dẫn sử dụng SẢN PHẨM CHỨA TINH CHẤT LÁ TRẦU CÔNG THỨC: Cho chai 90ml Tinh dầu chuẩn hóa Lá Trầu 0,27 g Chất nhũ hóa X 4,50 g Đường trắng 63,00 g Natri benzoat 0,09 g Caramen 0,90 g Nước tinh khiết vđ 90 ml CHỈ ĐỊNH: Hỗ trợ điều trị bệnh Tay Chân Miệng DẠNG THUỐC VÀ TRÌNH BÀY: Siro thuốc Hộp chai 90ml BẢO QUẢN: Nơi khô mát, nhiệt độ 300C TIÊU CHUẨN ÁP DỤNG: TCCS Để xa tầm tay trẻ em Đọc kỹ hướng dẫn sử dụng trước dùng Nếu cần thêm thông tin, xin hỏi ý kiến bác sĩ Sản xuất Nhà Máy Dược Phẩm OPC Ấp Tân Hóa - Xã Tân Vĩnh Hiệp - Huyện Tân Un - Bình Dương Email: info@opcpharma.com Website: www.opcpharma.com CƠNG TY CỔ PHẦN DƯỢC PHẨM OPC 1017 Hồng Bàng - Q.6 - TP.Hồ Chí Minh ĐT: 08.37517111- 08.38778899 Fax: 08.38752048 48 Thử nghiệm tác dụng trung hòa virus Vật liệu - Virus EV71 phân lập, định danh nuôi cấy khoa Vi sinh miễn dịch – Viện Pasteur TP HCM - Tế bào sarcoma vân (Rhabdomyosarcoma-A, RD-A) - Môi trường nuôi cấy tế bào RD-A: Môi trường tăng trưởng EMEM (Eagles Minimal Essential Medium) 10%; Môi trường trì E’MEM 2% - Dụng cụ: Tủ ấm CO2, kính hiển vi đảo ngược, bảng nhựa 96 giếng, tube pha loãng micro pipet Phương pháp- kết Chuẩn bị tế bào RD-A virus EV71 sử dụng thử nghiệm KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO VÀ XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ TẾ BÀO RD-A o Kỹ thuật nuôi cấy tế bào  Nguồn gốc tế bào: Tổ chức Y tế giới (WHO) cung cấp  Lấy tế bào chứa nitơ lỏng tạo ngân hàng tế bào làm việc (working cell bank)  Tế bào sau lấy từ nitơ lỏng chuyển vào chai cấy, cho môi trường tăng sinh vào chai đủ cho tế bào mọc lớp Cho ml dịch treo tế bào vào chai 25 cm2 với thể tích có 10 ml nồng độ tế bào x 106 tế bào / ml Ủ qua đêm 36oC, thay môi trường tăng sinh vào chai, theo dõi ngày kính hiển vi soi ngược đến tế bào mọc kín lớp bề mặt chai  Tế bào, sau phục hồi quan sát ngày đến tế bào mọc thành1 lớp phủ kín bề mặt chai tiến hành cấy chuyền tế bào 2-3 chai để sử dụng cho lần thực xét nghiệm Sau 2-3 ngày ủ 36oC khí CO2, tế bào phát triển gần kín chai, đổ bỏ môi trường MEM tăng sinh, thay môi trường MEM trì cho chai Mỗi đời tế bào sử dụng tuần sau tuần tế bào nhân thêm để dùng thời gian    Dịng tế bào có sẵn cho lần thực thực nghiệm KỸ THUẬT PHỤC HÔI VIRUS, CHUẨN ĐỘ VIRUS EV71 o Xác định hiệu giá virus (CCID50 – Cell Culture Infective Dose 50)  Virus EV71 phân lập từ bệnh phẩm bệnh nhân Tay Chân Miệng , chủng giải trình tự gen vùng VP1 xác định chủng EV71 , chủng lưu giữ tủ âm sâu  Lấy chủng virus từ tủ âm chờ tan hoàn toàn sử dụng để pha loãng  Pha loãng hỗn dịch chứa virus EV71 ống nghiệm theo mức nồng độ giảm dần theo cấp số nhân (từ nồng độ 10-1 đến nồng độ 10-8)  Lần lượt cho vào giếng: 50 µL virus pha lỗng + 50 µL mơi trường E’MEM 2% + 100 µL hỗn dịch tế bào RD-A  Ủ tủ ấm nhiệt độ 360C, 5% CO2 Quan sát hiệu ứng gây độc tế bào CPE kính hiển vi đảo ngược sau ngày, ngày sau ngày 49  Đếm số giếng có tượng CPE Tính nồng độ EV71 gây chết 50% tế bào theo công thức Karber: logCCID50 = L – d (S – 0,5) Trong đó: L: logarit nồng độ pha loãng thấp dùng thử nghiệm d: tỷ lệ khác biệt nồng độ pha lỗng S: tổng tỷ lệ giếng dương tính giếng gây nhiễm nồng độ virus Lập lại lần, tính trị số logCCID50 trung bình Lần 1: - 7,4 Lần 2: - 7,5 Lần : - 7,3 Hiệu giá virus trung bình : 10 7,4 CCID50 /0.05 ml Chuẩn bị nguồn tế bào RD-A có nồng độ cố định độ pha loãng virus EV71 sử dụng thử nghiệm KỸ THUẬT CHUẨN BỊ NGUỒN TẾ BÀO RD-A o Tiến hành cấy chuyền theo bước sau:        Bỏ hết môi trường MEM tăng sinh, rửa nhẹ lớp tế bào PBS(-) Cho 0,5 ml dung dịch Trypsin+Versene (1 phần Trypsin 0,25% + phần Versene 1:5000) để tách rời tế bào Làm dịch treo tế bào cách cho thêm 4,5 ml môi trường MEM tăng sinh Hút nhẹ dịch treo tế bào vài lần pipette Pasteur để làm tách rời tế bào cịn dính theo cụm Đếm mật độ tế bào có chai Làm lại hỗn dịch tế bào cho chai 25 cm2 với thể tích có 10 ml nồng độ tế bào x 106 tế bào / ml cho xét nghiệm trung hịa có nồng độ tế bào 1,5 x 105 tế bào / ml cách cho thêm mơi trường MEM tăng sinh với thể tích phù hợp dựa kết đếm mật độ tế bào Dịng tế bào có sẵn cho lần thực thực nghiệm KỸ THUẬT CHUẨN BỊ NGUỒN VIRUS EV71 SỬ DUNG TRONG THỬ NGHIỆM - Chuẩn bị chai tế bào 10 mL theo quy trình ni cấy tế bào - Gây nhiễm virus EV71 vào chai tế bào theo quy trình phân lập virus - Xác định nồng độ virus EV71 theo quy trình chuẩn độ virus - Chia nhỏ 50 ống, 100uL/ống, lưu trữ tủ âm sâu -700C, sử dụng thử nghiệm, - Các ống virus biết trước hiệu giá KỸ THUẬT CHUẨN BỊ CÁC ĐỘ PHA LOÃNG VIRUS EV71 o Dùng bút lơng ghi nồng độ pha lỗng từ 10-1 -10-8 (từ ống 1-8) ghi mã số virus cần pha lõang lên thành ống 50 o Cho 900µl môi trường E’MEM 2% vào ống pha lỗng o Sau cho 100 µl hỗn dịch vi-rút vào ống số o Dùng pipette khác trộn hỗn hợp nhẹ nhàng, tránh tạo bọt hút 100µl chuyển sang ống thứ ống nồng độ pha lỗng phải thay đầu cone Xác định nồng độ chất thử nghiệm không độc với tế bào RD-A - Pha loãng chất thử nồng độ 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128 cho vào giếng chứa hỗn dịch (2,0 x 105 tế bào / 0,1 ml) tế bào RD-A - Ủ tủ ấm nhiệt độ 360C, 5% CO2 - Quan sát hiệu ứng gây độc tế bào CPE kính hiển vi đảo ngược sau ngày, ngày sau ngày để xác định nồng độ chất thử nghiệm không độc với tế bào RD-A Chọn nồng độ không gây hiệu ứng CPE tế bào RD-A để khảo sát tác dụng ức chế virus EV71 bước Lập lại lần , lấy giá trị trung bình Kết : Dị nồng độ pha lỗng bậc (1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256, 1/512, 1/1024, 1/2048), nồng độ pha lỗng 1/512 khơng gây hiệu ứng CPE tế bào RD-A lần khác Xác định nồng độ chất thử nghiệm có tác dụng trung hòa virus - Tiến hành thử nghiệm với thời gian ủ khác nhau: giờ, giờ, giờ, - Phương pháp: Cho vào giếng: 50 µL virus pha lỗng + 50 µL dung dịch chất thử (ở nồng độ không gây hiệu ứng CPE) Ủ tủ ấm nhiệt độ 360C, 5% CO2 để chất thử trung hòa virus Thêm vào giếng 100 µL hỗn dịch tế bào RD-A (từ 10-1 đến 10-8) Ủ tủ ấm nhiệt độ 360C, 5% CO2 Quan sát hiệu ứng gây độc tế bào CPE kính hiển vi đảo ngược sau ngày, ngày sau ngày Đếm số giếng có tượng CPE tính nồng độ EV71 gây chết 50% tế bào theo công thức Karber Lặp lại thí nghiệm lần, tính trị số logCCID50 trung bình Hiệu giá virus có trung hồ với thuốc thử sau 1h lần : 10 6,8 CCID50 /0.05 ml 10 6,9 CCID50 /0.05 ml 10 6,8 CCID50 /0.05 ml Hiệu giá virus lần tương ứng : 10 7,4 CCID50 /0.05 ml 10 7,5 CCID50 /0.05 ml ,10 7,4 CCID50 /0.05 ml Hiệu giá virus có trung hồ với thuốc thử sau 2h lần : 10 6,9 CCID50 /0.05 ml 51 10 6,8 CCID50 /0.05 ml 10 6,8 CCID50 /0.05 ml Hiệu giá virus lần tương ứng : 10 7,5 CCID50 /0.05 ml 10 7,4 CCID50 /0.05 ml ,10 7,4 CCID50 /0.05 ml Hiệu giá virus có trung hồ với thuốc thử sau 3h lần : 10 6,3 CCID50 /0.05 ml 10 6,3 CCID50 /0.05 ml 10 6,2 CCID50 /0.05 ml Hiệu giá virus lần tương ứng : 10 7,3 CCID50 /0.05 ml 10 7,3 CCID50 /0.05 ml ,10 7,2 CCID50 /0.05 ml Hiệu giá virus có trung hồ với thuốc thử sau 4h lần : 10 6,2 CCID50 /0.05 ml 10 6,3 CCID50 /0.05 ml 10 6,3 CCID50 /0.05 ml Hiệu giá virus lần tương ứng : 10 7,2 CCID50 /0.05 ml 10 7,3 CCID50 /0.05 ml 10 7,3 CCID50 /0.05 ml Với hiệu giá virus EV71 sử dụng phản ứng trung hịa xác định, ghi nhận thuốc thử ( Lá Trầu) pha loãng 1/512 tiếp xúc với virus sau 1h, 2h, 3h 4h làm cho nồng độ gây độc virus giảm đi, tức thuốc thử có khả trung hịa virus 52 Thể tích chân chuột (mL) - mơ hình gây viêm carragenin Lô 1: Mẫu trắng STT Vo (ml) sau viêm sau thuốc Sau thuốc Sau thuốc Sau thuốc Sau thuốc sau thuốc ngày Sau thuốc ngày 0.51 0.85 0.91 0.83 0.75 0.68 0.65 0.6 0.59 0.5 0.8 0.87 0.82 0.82 0.8 0.75 0.61 0.58 0.56 0.85 0.9 0.87 0.9 0.85 0.72 0.66 0.61 0.52 0.86 0.95 0.8 0.83 0.8 0.79 0.71 0.7 0.52 0.84 0.8 0.77 0.71 0.7 0.68 0.64 0.62 0.55 1.01 0.97 1.06 0.96 0.84 0.86 0.63 0.53 0.53 0.96 0.94 0.89 0.89 0.85 0.82 0.66 0.54 0.58 1.12 1.05 1.13 1.02 0.99 0.64 0.61 0.54 0.99 0.91 0.87 0.86 0.95 0.9 0.68 0.58 10 0.57 1.23 1.2 1.16 1.05 0.8 0.8 0.59 0.55 Sau thuốc Sau thuốc Sau thuốc Sau thuốc sau thuốc ngày Lô 2: TK1 (60 mg/kg) STT Vo (ml) sau viêm sau thuốc Sau thuốc ngày 0.56 0.94 0.89 0.88 0.86 0.76 0.6 0.58 0.62 0.58 1.18 1.11 1.06 0.91 0.81 0.74 0.69 0.63 0.53 1.02 0.9 0.8 0.8 0.73 0.68 0.62 0.64 0.54 0.95 0.92 0.87 0.79 0.74 0.69 0.62 0.64 0.52 1.05 0.85 0.81 0.78 0.74 0.63 0.66 0.61 0.58 1.01 0.89 0.81 0.74 0.7 0.69 0.68 0.68 0.54 0.82 0.79 0.68 0.62 0.62 0.6 0.6 0.6 0.55 0.96 0.81 0.8 0.72 0.61 0.64 0.58 0.59 0.53 1.02 0.99 0.91 0.89 0.81 0.7 0.63 0.55 10 0.51 0.83 0.8 0.79 0.64 0.72 0.62 0.54 0.51 Lô 3: TK2 (120 mg/kg) STT Vo (ml) sau viêm Điều trị sau Điều trị sau Điều trị sau Điều trị sau Điều trị sau Điều trị sau ngày Điều trị sau ngày 0.54 0.78 0.72 0.7 0.65 0.6 0.57 0.54 0.56 0.54 0.78 0.71 0.63 0.59 0.58 0.55 0.55 0.53 0.6 1.2 0.85 0.85 0.85 0.82 0.75 0.63 0.62 0.53 0.81 0.67 0.63 0.61 0.64 0.61 0.58 0.54 0.62 0.83 0.64 0.61 0.6 0.59 0.57 0.57 0.57 0.51 0.9 0.61 0.59 0.53 0.54 0.52 0.51 0.51 0.5 0.9 0.7 0.61 0.54 0.58 0.5 0.51 0.5 0.53 0.87 0.7 0.63 0.55 0.56 0.55 0.62 0.56 0.55 1.05 0.8 0.72 0.65 0.61 0.53 0.54 0.53 10 0.55 0.88 0.72 0.61 0.58 0.59 0.51 0.51 0.51 53 Lô TK3 (180 mg/kg) STT Vo (ml) sau viêm Điều trị sau Điều trị sau Điều trị sau Điều trị sau Điều trị sau Điều trị sau ngày Điều trị sau ngày 0.54 0.84 0.76 0.6 0.57 0.55 0.55 0.61 0.59 0.56 0.9 0.75 0.69 0.57 0.55 0.54 0.53 0.55 0.52 0.86 0.77 0.69 0.62 0.6 0.53 0.55 0.54 0.48 0.83 0.72 0.66 0.54 0.51 0.49 0.54 0.54 0.54 0.95 0.82 0.73 0.65 0.58 0.56 0.54 0.53 0.54 0.97 0.69 0.62 0.6 0.58 0.55 0.55 0.54 0.5 0.82 0.8 0.8 0.7 0.68 0.56 0.57 0.55 0.57 0.87 0.76 0.62 0.6 0.58 0.58 0.58 0.54 0.54 1.04 0.96 0.83 0.78 0.74 0.69 0.57 0.55 10 0.55 1.12 0.79 0.7 0.62 0.6 0.57 0.53 0.51 Điều trị sau Điều trị sau Điều trị sau Lô 5: Aspirin (240 mg/kg) STT Vo (ml) sau viêm Điều trị sau Điều trị sau Điều trị sau ngày Điều trị sau ngày 0.52 0.75 0.58 0.55 0.54 0.57 0.52 0.51 0.5 0.54 0.74 0.64 0.56 0.56 0.54 0.52 0.54 0.53 0.59 0.83 0.65 0.61 0.6 0.61 0.58 0.56 0.58 0.53 0.83 0.67 0.61 0.6 0.62 0.6 0.57 0.55 0.5 1.02 0.82 0.82 0.75 0.71 0.67 0.64 0.55 0.52 0.86 0.72 0.61 0.55 0.54 0.52 0.52 0.52 0.54 1.15 0.9 0.83 0.72 0.69 0.65 0.57 0.55 0.55 0.93 0.75 0.66 0.6 0.59 0.57 0.55 0.56 54 Khối lượng u h t tươi, khơ (mg) - mơ hình gây u h t cotton Lô Nước cất STT 10 Trọng lượng (g) 26 25 25 25 24 26 25 25 25 24 Khối lượng u hạt tươi (mg) 71.2 69.9 67.5 69.5 57.9 77.7 60.5 70.5 54.8 54.9 Khối lượng u hạt khô (mg) 28.7 27.6 32.7 30.2 29.8 28.7 27.7 29.4 27.1 26.6 Lô 2: Aspirin (240 mg/kg) STT 10 Trọng lượng (g) Khối lượng u hạt tươi (mg) 25 27 26 27 25 27 27 28 28 25 48.9 49.1 46.8 52.6 47.1 45.6 53.3 49.6 54.3 46.2 Khối lượng u hạt khô (mg) 27.6 21.8 22.3 21.4 23.3 21.7 25.1 23.2 23.5 21.2 Lô 3: TK2 (120 mg/kg) STT 10 Trọng lượng (g) 26 25 24 26 28 27 29 28 28 27 Khối lượng u hạt tươi (mg) 46.4 47.1 51.6 51.3 46.1 45.5 48.4 45.2 54.4 55.2 55 Khối lượng u hạt khô (mg) 20.6 23.1 23 23.3 23.1 21.7 22.5 22.3 23.8 23.8 ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN Thê trọng chuột trước, cuối thử nghiệm Lô chứng TT Trước 30 ngày 60 ngày 20 22.5 19 24.5 20.5 23.0 19 25.5 22 23.0 18 24.5 19.5 24.0 21.5 25.0 22 23.5 10 18.5 22.0 11 18 22.5 24.5 12 18.5 24.5 32.0 13 20 23.0 28.5 14 18.5 25.5 27.5 15 22 23.0 26.5 16 18.5 24.5 28.0 17 19 24.0 27.5 18 22 25.0 28.0 19 20 23.5 29.5 20 20 22.0 25.0 X 19.83 1.42 23.75 1.11 27.70 2.15 SD Lô TK2 (120 mg/kg) TT Trước 30 ngày 60 ngày 18 21.5 21 24.5 20 22.0 19 25.5 20 23.0 18.5 24.5 22 23.5 20.5 23.0 19.5 21.0 10 19 22.5 11 18 22.0 23.0 12 21 25.5 29.0 13 20 21.5 24.0 14 19 23.0 26.0 15 20 22.0 24.5 16 18.5 23.5 28.0 17 22 25.0 23.0 18 20.5 24.5 32.0 19 19.5 22.0 21.0 20 19 22.5 27.5 X 19.75 1.18 23.13 1.38 25.80 3.33 SE 56 Lô TK3 (180 mg/kg) TT 10 Trước 18 21 20 19.5 22 18.5 19.5 20.5 20 18 30 ngày 22.5 24.5 22.0 23.0 23.0 21.5 24.0 25.0 23.5 22.0 60 ngày TT 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 X SD Trước 30 ngày 19 22 21.5 18.5 21 18 18.5 22 21.5 18 22.5 24.5 22.0 23.0 23.0 21.5 24.0 25.0 23.5 22.0 60 ngày 27.0 25.0 27.0 23.0 32.0 23.0 25.5 28.0 30.0 24.5 19.85 1.50 23.10 1.12 26.50 2.92 Chỉ số huyết học, sinh hóa trước thử nghiệm STT WBC RBC HGB HCT 10.5 8.74 15.9 8.1 8.55 16.5 9.3 9.31 17.4 10.6 8.55 16.1 10.8 9.71 17.3 7.8 9.01 16.2 10.1 9.29 17.4 14.2 10.3 17.3 9.2 7.54 14.3 10 8.9 8.3 16.7 11 7.8 9.01 16.2 12 10.1 9.29 17.4 13 14.2 10.3 17.3 14 9.2 7.54 14.3 15 8.9 8.3 16.7 48.50% 49.80% 52.50% 48.20% 51.60% 48.30% 52.30% 51.70% 42.40% 48.60% 48.30% 52.30% 51.70% 42.40% 48.60% X 9.98 8.92 16.47 49.15% PLT 914 923 808 894 903 920 897 931 852 934 920 897 931 852 934 SGOT 117.1 96 115.1 109.6 98.6 103.2 106.8 98.3 116.2 97.8 103.2 106.8 98.3 116.2 97.8 SGPT 73.3 65 60.8 67.6 58.3 63.2 61.3 65.8 59.3 60.1 63.2 61.3 65.8 59.3 60.1 900.67 105.40 62.96 57 Protein Cre 1.07 6.51 1.33 6.2 1.31 6.84 1.3 6.85 1.23 6.25 1.17 6.1 1.01 0.88 6.15 1.54 1.15 6.5 1.17 6.1 1.01 6.3 0.88 6.15 1.54 7.36 1.15 5.89 1.18 6.41 Chỉ số huyết học, sinh hóa sau 30 ngày Lô chứng: nước cất 10 10 11.6 11 10 10.8 12.5 11 10 9.3 8.58 10 9.2 9.2 8.8 9.3 17.2 16.7 16.1 14.4 16 15.8 17.2 16.5 16.8 18 52.30% 45.00% 48.30% 52.30% 48.30% 51.40% 63.20% 51.40% 52.10% 54.40% PLT 834 918 904 918 888 817 923 967 923 812 X 10.49 8.94 16.47 52.00% 890.4 STT WBC RBC HGB HCT SGOT 101.2 95.9 142 95.9 120 80 76 97.2 97.5 143 SGPT 65.9 69 83.2 69 90 48 65 64 65 49 104.87 66.81 Protein Cre 1.4 0.8 0.92 5.8 1.01 6.3 0.8 1.5 1.15 1.12 5.5 1.03 1.23 6.5 1.1 6.51 Lô TK2 (120 mg/kg) 10 8.1 9.3 10 9.5 9.3 11.5 11.6 11 11.5 7.69 9.5 8.9 9.5 10 8.55 9.8 15.9 14 17.4 15.5 16.5 14 16.1 17.3 15 17.5 53.20% 49.80% 52.50% 48.50% 49.80% 52.50% 48.20% 45.00% 48.20% 51.60% PLT 930 890 845 914 923 769 894 950 934 912 X 10.08 8.89 15.92 50.00% 896.1 STT WBC RBC HGB HCT SGOT 120 90 114 120 89.5 115 109.6 98.6 120 89.5 SGPT 56 79 61 76.5 71 60.8 67.6 58.3 59 69 106.62 65.82 Protein Cre 1.3 1.5 1.4 4.8 0.8 6.4 0.9 6.2 0.7 6.8 1.2 6.4 1.1 6.3 1.3 1.23 5.6 1.14 6.05 Lô TK3 (180 mg/kg) 10 10.1 8.9 8.5 10.1 12.5 12 9.2 9.5 9.01 9.29 8.3 9.01 11 10.3 8.9 8.5 16.2 17.4 16.7 16.2 17 17.9 15 16 15 16 48.30% 52.30% 48.60% 50.40% 52.30% 58.00% 45.60% 49.00% 53.20% 48.60% PLT 920 800 934 909 897 789 931 876 996 934 X 9.68 9.13 16.34 51.00% 898.6 STT WBC RBC HGB HCT 58 SGOT 103.2 123 97.8 120 106.8 98.3 98.3 89.7 134 80.7 SGPT 67 54 63 65 67 56 70 59 59 43 105.18 60.3 Protein Cre 1.2 6.1 5.6 1.2 1.05 7.5 1.1 0.7 6.2 0.8 6.5 1.3 1.3 1.3 6.5 1.1 6.34 Chỉ số huyết học, sinh hóa sau 60 ngày Lô chứng: nước cất STT WBC RBC 10 10 11.6 10.2 10.8 12.1 10.8 12.1 10 11.6 9.3 8.58 8.91 9.2 8.8 8.91 9.2 8.8 9.3 8.58 X 10.72 8.96 HGB HCT 17.2 16.7 16.1 17.1 16.8 16.1 17.1 16.8 17.2 16.7 48.90% 49.20% 48.30% 51.40% 52.10% 48.30% 51.40% 52.10% 48.90% 49.20% 16.78 50.00% PLT 834 918 904 817 923 904 817 923 834 918 SGOT 101.2 95.9 142 97.2 97.5 142 97.2 97.5 101.2 95.9 SGPT 65.9 69 83.2 54.3 70 83.2 64 65 53.8 59.5 879.2 106.76 66.79 Protein Cre 0.89 0.95 6.6 0.88 1.54 1.15 7.5 0.92 1.12 1.03 1.17 6.5 1.01 6.5 1.07 6.61 Lô TK2 (120 mg/kg) 10 10.5 8.1 9.3 10.6 10.8 10.6 10.8 10.5 8.1 9.3 8.74 8.55 9.31 8.55 9.71 8.55 9.71 8.74 8.55 9.31 15.9 16.5 17.4 16.1 17.3 16.1 17.3 15.9 16.5 17.4 48.50% 49.80% 52.50% 48.20% 51.60% 48.20% 51.60% 48.50% 49.80% 52.50% PLT 914 923 808 894 903 894 903 914 923 808 X 9.86 8.97 16.64 50.00% 888.4 STT WBC RBC HGB HCT SGOT 117.1 96 115.1 109.6 98.6 109.6 98.6 117.1 96 115.1 SGPT 73.3 65 60.8 67.6 58.3 67.6 58.3 73.3 71 60.8 107.28 65.6 Protein Cre 1.07 6.51 1.33 6.2 1.31 6.84 1.12 6.9 1.03 6.3 1.3 6.85 1.23 6.25 0.89 6.51 0.95 6.2 0.92 6.8 1.12 6.54 Lô TK3 (180 mg/kg) 10 14.2 9.2 8.9 9.2 8.9 7.8 10.1 7.8 10.1 14.2 10.3 7.54 8.3 7.54 8.3 9.01 9.29 9.01 9.29 10.3 17.3 14.3 16.7 14.3 16.7 16.2 17.4 16.2 17.4 17.3 51.70% 42.40% 48.60% 42.40% 48.60% 48.30% 52.30% 48.30% 52.30% 51.70% PLT 931 852 934 852 934 920 897 920 897 931 X 8.89 8.89 16.38 49.00% 906.8 STT WBC RBC HGB HCT 59 SGOT 98.3 116.2 97.8 116.2 97.8 103.2 106.8 103.2 106.8 98.3 SGPT 65.8 59.3 60.1 59.3 60.1 63.2 61.3 63.2 61.3 65.8 104.46 61.94 Protein Cre 0.88 6.15 1.54 1.15 6.5 1.54 1.15 1.17 6.1 1.01 1.17 6.1 1.01 6.3 0.88 6.5 1.15 6.37