Hoàn thiện quy trình nuôi trồng nấm đông trùng hạ thảo bông tuyết isaria tenuipes

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP.HCM TRUNG TÂM ƯƠM TẠO DOANH NGHIỆP NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO NHIỆM VỤ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ HỒN THIỆN QUY TRÌNH NI TRỒNG NẤM ĐƠNG TRÙNG HẠ THẢO BƠNG TUYẾT Isaria tenuipes THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/2016 BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP.HCM TRUNG TÂM ƯƠM TẠO DOANH NGHIỆP NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO NHIỆM VỤ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ HỒN THIỆN QUY TRÌNH NI TRỒNG NẤM ĐƠNG TRÙNG HẠ THẢO BÔNG TUYẾT Isaria tenuipes CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) CHỦ NHIỆM (Ký ghi rõ họ tên) Nguyễn Duy Long Lâm Ngọc Thảo THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/2016 I GIỚI THIỆU Thông tin chung dự án 1.1 Chủ nhiệm 1: Nguyễn Duy Long Học vị: Thạc sĩ Công nghệ Sinh học Chức vụ: Phó trưởng phịng Hỗ trợ cơng nghệ Vi sinh Địa chỉ: Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, Tp.HCM Điện thoại: 0909909776 Email: duylong@abi.com.vn Cơ quan chủ trì: Trung tâm Ươm tạo doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao TP.HCM 1.2 Chủ nhiệm 2: Lâm Ngọc Thảo Học vị: Cử nhân Sinh học Chức vụ: Phó trưởng phịng Hỗ trợ cơng nghệ Vi sinh Địa chỉ: Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, Tp.HCM Điện thoại: 01652594525 Email: ngocthao_1982@yahoo.com Cơ quan chủ trì: Trung tâm Ươm tạo doanh nghiệp Nơng nghiệp Cơng nghệ cao TP.HCM Cán phối hợp chính: Họ tên TT (Học vị chức danh KH) Chuyên Cơ quan ngành công tác KS Nguyễn Tiến Công Duy thực phẩm CN Nguyễn Công Ngọc Duy sinh học CN Thạch Thị Công Hồng Loan sinh học nghệ nghệ Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao TP.HCM Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao TP.HCM nghệ Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao TP.HCM KS Huỳnh Xuân Công Vũ sinh học CN Huỳnh Công Phương Anh sinh học Th.S Nguyễn Thị Công Hồng Tuyền sinh học nghệ Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao TP.HCM nghệ Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao TP.HCM nghệ Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao TP.HCM Tính cấp thiết Trong tự nhiên, mối quan hệ nấm với trùng lồi chân khớp khác cộng sinh đến ký sinh gây hại Nấm côn trùng thiên địch phổ biến loài chân khớp khắp giới xem đối tượng kiểm soát sinh học (Hajek St Leger, 1994; Shah Pell, 2003) [23-45] Nhóm nấm có phân bố rộng, phân bố tính đa dạng lồi nấm trùng tùy thuộc vào điều kiện mơi trường, tính đa dạng lồi trùng tình trạng ký chủ (Hajek and St Leger, 1994) [23] Khu vực có khí hậu nhiệt đới hay ơn đới, đặc biệt nước nhiệt đới có ẩm độ khơng khí cao, có đa dạng phong phú lồi trùng điều kiện lý tưởng cho nấm côn trùng phát triển Việt Nam nước nằm khu vực nhiệt đới có nguồn đa dạng sinh học phong phú, có tiềm nguồn lợi nấm ký sinh côn trùng tự nhiên Nhiều lồi nấm trùng ứng dụng rộng rãi đấu tranh sinh học kiểm soát dịch hại, phổ biến lồi Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae Normurea rileyi Theo Taborsky (1992) [50], ứng dụng sử dụng Metarhizium anisopliae cho đấu tranh sinh học thực vào năm 1888 Krassilstchik Tại Việt Nam, nhiều nghiên cứu thành công việc sử dụng nấm trùng phịng trị loại trùng sâu hại trồng, điển nấm Metarhizium anisopliae Beauveria bassiana ứng dụng phòng trừ mối nhà (Nguyễn Dương Khuê, 2005) [2], sâu khoang hại cải xanh (Võ Thị Thu Oanh cs., 2005) [11], sâu hại đậu tương đậu xanh (Phạm Thị Thùy cs., 2005) [5], rầy mềm loài sâu hại lúa (Trần Văn Hai cs., 2006; Nguyễn Thị Lộc cs., 2002) [4-10] Trong y học cổ truyền, Ophiocordyceps sinensis (tên cũ Cordyceps sinensis, tiếng Việt gọi “Đông Trùng, Hạ Thảo”) sử dụng thuốc trị bệnh bồi bổ thể từ 1.000 năm qua nước châu Á, đặc biệt Trung Quốc Nhật Bản Đây loài nấm sống ký sinh sâu bướm thuộc loài Thitarodes armoricanus, tìm thấy vùng núi có độ cao từ 3.000-5.000 m Trung Quốc, Ấn Độ, Nepal Bhutan Trong y học cổ truyền Trung Quốc, “Đông Trùng, Hạ Thảo” dùng để chữa bệnh phổi hô hấp, thận, gan, tim mạch; trị bệnh yếu sinh lý cao huyết áp; trị rối loạn miễn dịch chống ung thư (Zhu cs., 1998a,b) [56- 57] Nấm Isaria tenuipes (Peck.) Samson gọi Paecilomyces japonica Yasuda Paecilomyces tenuipes, loài nấm dùng y học cổ truyền Trung Quốc với nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps sinensis) Nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris) Cả hai chi Paecilomyces Cordyceps thuộc họ Clavicipitaceae Các kết nghiên cứu sinh học phân tử gần xác định Paecilomyces tenuipes giai đoạn vơ tính Cordyceps takaomontana Yakushiji et Kumazawa (Spatafora J W and M Blackwell, 1993; Shimizu, 1994, Eiji Yokoyama cs., 2003) Theo y học cổ truyền Trung Hoa, thể nấm I tenuipes có giá trị cao mặt dược liệu tác dụng dược lý sinh học chúng Những hợp chất có hoạt tính bao gồm hoạt tính chống khối u tác động đến hệ thống miễn dịch tách chiết từ loài nấm Paecilomyces công bố (Borchers cs., 1999; Liu cs., 1996; Lee cs., 1996) Leucinostatins A, D, Polygalactosamine kháng khối u, Saintopin, Sphingofungins E F, UCE1022, Paeciloquinones A, B, C, D, E F, Ergosterol peroxide, Acetoxyscirpenediol… Theo kết nghiên cứu Haruhisa Kikuchi cs (2004) cho thấy, sinh khối nấm P tenuipes chứa Paecilomycine A, B C hoạt chất có hoạt tính sinh học cao [21] Tuy nhiên, tính chất độc đáo dược liệu tạo nên giá trị hàng hóa cao ngày sử dụng rộng rãi, tăng liều lượng dẫn đến thu hoạch mức làm giảm nguồn tài nguyên hoang dã, mặt khác để phục vụ cho nghiên cứu sâu nấm ký sinh côn trùng nấm dược liệu cần số lượng lớn Để bù đắp cho thiếu hụt nhà khoa học tiến hành mở rộng nghiên cứu nhân nuôi nhân tạo chất loại hạt ngũ cốc, sâu non, tằm, nhộng tằm số nguyên liệu khác việc mô tả đặc điểm tự nhiên chúng Đặc biệt thành công nhân nuôi Cordyceps môi trường rắn nhân tạo, tạo hoạt chất sinh học, thực phẩm chức có giá trị dinh dưỡng cao Đối với Việt Nam, công nghệ nấm ký sinh côn trùng lĩnh vực mới, đặc biệt loài nấm ký sinh trùng có hoạt chất sinh học dùng làm dược liệu, chưa có tài liệu nghiên cứu sản xuất loài Do vậy, cần có nghiên cứu sâu phân tích thận trọng để chứng minh xác Nhưng điều quan trọng số lượng thời gian để nghiên cứu phân tích mà việc thu thập từ tự nhiên khó khăn hoi Mặt khác, lồi vi sinh vật nói chung nấm ký sinh trùng nói riêng có u cầu khác để chúng sinh trưởng phát triển tốt Do vậy, tiến hành nghiên cứu phương pháp nhân ni nhân tạo nhằm tìm quy trình nhân nuôi nhân tạo phục vụ cho nghiên cứu sâu cần thiết Trên sở tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu hình thành synnema Isaria tenuipes (Peck.) Samson phương pháp lên men bề mặt” Kết nghiên cứu đề tài góp phần quan trọng tiến trình nghiên cứu nhân ni nhân tạo nấm ký sinh trùng nói chung nấm dược liệu nói riêng Xuất xứ Dự án thực dựa cơng trình nghiên cứu khoa học sau - Trần Ngọc Lân Trịnh Thị Minh Thành 2011 Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất sinh khối nấm dược liệu “Bơng tuyết Đông trùng Hạ thảo” Isaria tenuipes (Peck) Samson Luận văn tốt nghiệp Trường Đại Học Vinh Theo nghiên cứu này, chủng nấm Isaria tenuipes (Peck) Samson nuôi cấy môi trường lỏng PDB, chất gạo lức có bổ sung bột nhộng tằm Nhóm tác giả khảo sát môi trường khác điều kiện nuôi cấy vật liệu khác Kết cho thấy môi trường lỏng dịch chiết khoai tây, glucose, bột nhộng tằm cho khả hình thành synnema tốt với tổng thời gian thu hoạch trung bình 50 ngày, sản lượng synnema trung bình 2.89 (g/bình 250ml) Tác giả cho thấy môi trường chất gạo lức bổ sung bột nhộng tằm nuôi hộp nhựa thể tích 700ml cho sản lượng cao 19.52g/hộp Tuy nhiên, qua nghiên cứu nhóm tác giả chưa đánh giá khảo sát khối lượng bột nhộng tằm tối ưu điều kiện ánh sáng ảnh hưởng đến suất synnema Isaria tennuipes Do đó, dự án kế thừa kết tiếp tục triển khai khảo sát khối lượng chất bột nhộng tằm bổ sung điều kiện ánh sáng ảnh hưởng đến hình thành synnema Isaria tenuipes Mục tiêu dự án Hồn thiện quy trình nhân ni nhân tạo nhân nuôi trực tiếp nhộng tằm để sản xuất synnema Isaria tenuipes Hỗ trợ kỹ thuật chuyển giao công nghệ cho doanh nghiệp tham gia chương trình ươm tạo doanh nghiệp công nghệ nuôi trồng nấm dược liệu Isaria tenuipes II TỔNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu nấm ký sinh côn trùng 1.1 Khái niệm “Nấm ký sinh công trùng - Entomology phathogenic fungi (EPF) hay nấm côn trùng – Insect fungi” khái niệm nhà khoa học sử dụng thuật ngữ đồng nghĩa, đề cập nhóm sinh vật ký sinh gây bệnh cho côn trùng Nấm ký sinh trùng vừa nhóm nấm có tính đa dạng sinh học cao (trên giới có khoảng 1,5 triệu lồi nấm, Thái Lan có khoảng 70.000 - 150.000 loài nấm 2000 loài nấm ký sinh trùng) vừa có vai trị quan trọng phòng trừ sâu hại trồng y dược Theo Evans (1988), nấm ký sinh côn trùng chia thành nhóm: (1) Ký sinh tức nấm ký sinh nội quan, khoang thể trùng ký chủ; (2) Ký sinh ngồi tức nấm phát triển lớp cuticun vỏ thể côn trùng gây nên bệnh hại cho ký chủ; (3) Nấm mọc côn trùng tức nấm trực tiếp gián tiếp chứng minh chúng ký sinh côn trùng (samson cs., 1988); (4) Cộng sinh có nghĩa nấm trùng mang lại lợi ích cho mối quan hệ chung sống Nấm chia thành ký sinh sơ cấp (primery pathogen) ký sinh thứ cấp (secondery pathogen) (Pu Li, 1996) Nấm ký sinh sơ cấp thường nhiễm vào ký chủ côn trùng khoẻ mạnh, gây bệnh sau giết chết trùng Trong đó, nấm ký sinh thứ cấp ký sinh côn trùng yếu bị thương.Các mầm bệnh ký sinh côn trùng trưởng thành côn trùng bị bệnh gọi ký sinh hội ký sinh khơng chun tính, loại ký sinh nhiễm vào ký chủ thơng qua xâm nhập qua lớp cuticun vỏ thể côn trùng (dẫn theo Trần Ngọc Lân cs., 2008) [8] Như vậy, nấm ký sinh côn trùng (EPF) dùng để mô tả tượng nấm ký sinh ký chủ côn trùng.Theo Tzean cs (1997), khái niệm dùng cho nấm ký sinh nhện nhện trùng nhóm(lớp) nghành Động vật chân khớp chúng có kiểu sinh thái ăn thực vật ăn thịt sinh sống chủ yếu (Dẫn theo Trần Ngọc Lân, 2008) [8] 1.2 Chu trình sống lây nhiễm Nấm ký sinh trùng xâm nhiễm vào thể côn trùng qua đường hô hấp, tiêu hóa qua quan sinh dục, phần lớn qua lớp vỏ cuticun chúng Tức phải có tiếp xúc bào tử nấm bề mặt thể vật chủ Bào tử nấm bám vào bề mặt thể vật chủ, đủ điều kiện ẩm độ bào tủ mọc mần xâm nhiễm vào bên thể côn trùng qua lớp vỏ cuticun Khi nấm xâm nhiễm vào bên trong, nấm mọc khắp thể côn trùng, nhiều loại nấm sản xuất độc tốc để tăng tốc độ giết chế côn trùng ngăn chặn cạnh tranh lồi vi sinh vật khác Hình 1.1 Chu trình xâm nhiễm nấm ký sinh trùng Nấm xâm nhiễm vào thể côn trùng gồm giai đoạn chính: (i) Giai đoạn xâm nhập Tính từ bào tử nấm mọc mầm đến lúc hoàn thành việc xâm nhập vào xoang thể côn trùng Bào tử nấm sau mọc mầm phát sinh mầm bệnh, giải phóng enzyme ngoại bào tương ứng với thành phần lớp vỏ cuticun côn trùng để phân hủy lớp vỏ Protease, chitinase, lipase, aminopeptidase, carboxypeptidase A, esterase, N - axetylglucosaminidase, cenlulase Các enzyme tạo cách nhanh chóng, liên tục với mức độ khác lồi chí lồi Enzyme protease chitinase hình thành thể trùng, tham gia phân hủy lớp da côn trùng (cuticula) lớp biểu bì (thành phần protein) Lipase, cenlulase enzyme khác enzyme có vai trị khơng phần quan trọng Nhưng quan trọng enzyme phân hủy protein (protease) enzyme phân huỷ kitin (chitinase) trùng Hai enzyme có liên quan trực tiếp đến hiệu lực diệt côn trùng nấm ký sinh côn trùng (Tạ Kim Chỉnh cs., 2005) [7] (ii) Giai đoạn phát triển nấm thể côn trùng côn trùng chết Đây giai đoạn sống ký sinh nấm Trong xoang thể côn trùng nấm tiếp tục phát triển, hình thành nhiều sợi nấm ngắn Khi hệ sợi nấm hình thành thể, phân tán khắp thể theo dịch máu, phá hủy tế bào máu làm giảm tốc độ lưu thông máu Toàn phận nội quan bị xâm nhập Nấm thường xâm nhập vào khí quản làm suy yếu hô hấp Hoạt động côn trùng trở nên chậm chạp phản ứng với tác nhân kích thích bên ngồi Kết vật chủ khả kiểm soát hoạt động sống dẫn đến chết (Phạm Văn Lầm, 2000) [6] (iii) Giai đoạn sinh trưởng nấm sau vật chủ chết Đây giai đoạn sống hoại sinh nấm ký sinh Xác trùng chết nguồn dinh dưỡng có giá trị cho vi sinh vật Thông thường, phận bên thể côn trùng bị phân hủy vi khuẩn hoại sinh Trên bề mặt thể côn trùng, nấm hoại sinh Aspergillus spp., Penicillium spp Fusarium spp định cư lớp biểu bì cạnh tranh với vi khuẩn bên thể trùng Do nấm trùng có khả sản xuất chất có hoạt tính thuốc kháng sinh ức chế hoạt động vi khuẩn nấm hoại sinh khác nên chúng cạnh tranh với sinh vật để tồn phát triển, làm cho xác vật chủ không bị phân hủy Sau nấm côn trùng sử dụng cạn kiệt nguồn dinh dưỡng bên thể côn trùng, chuyển sang giai đoạn hình thành bào tử Ở giai đoạn xâm nhiễm vào bên thể côn trùng, nấm sử dụng enzyme ngoại bào để phân hủy lớp vỏ cuticun Khác với giai đoạn này, giai đoạn nấm đâm xuyên, mọc thành sợi bên ngồi sử dụng tồn tác động học Sau bào tử hình thành lớp sợi nấm bề mặt thể vật chủ Nhiều trùng bị bao bọc tồn bên ngồi hệ sợi nấm bào tử, mà khó khơng thể xác định vật chủ (Janet Jennifer cs., 2006) [28] nằm lá, cành hay đất, bị nấm ký sinh sau thời gian synnemata mọc lên có màu trắng đặc trưng Theo nghiên cứu Trần Ngọc Lân, Thái Thị Ngọc Lam, Nguyễn Thị Thành [9] sinh trưởng phát triển Isaria tenuipes môi trường PDA cho thấy Khuẩn lạc môi trường PDA mọc nhanh, hình toả trịn, hướng lên Màu sắc khuẩn lạc thay đổi, màu trắng sau chuyển sang màu vàng vàng nhạt thành thục Bào tử xuất sau nuôi cấy từ - ngày Sau 10 ngày khuẩn lạc bao phủ PDA Kết bảng cho thấy, đường kính khuẩn lạc tăng dần theo thời gian nuôi cấy đạt giá trị lớn 23.66 mm sau 10 ngày (khuẩn lạc phủ kín bề mặt PDA) Sau ngày thứ 4, bề mặt khuẩn lạc bắt đầu xuất đường tròn đồng tâm Ngày thứ tâm khuẩn lạc có xu hướng lõm xuống, mặt sau màu vàng nhạt, màu trắng bắt đầu xuất bào tử màu trắng bao phủ bề mặt nấm, dạng bột Sự xuất bào tử ngày thứ ảnh hưởng đến độ dày khuẩn lạc Độ dày tăng dần từ ngày thứ đến ngày thứ đạt đỉnh ngày thứ sau giảm dần Sau ngày, nấm lõm xuống rõ ràng phân biệt thành đường tròn đồng tâm bề mặt PDA Sợi nấm dạng lông nhu màu vàng nhạt, mềm, có lớp bào tử trắng, dạng bột, mỏng bao phủ khắp bề mặt nấm Sau ngày, tâm khuẩn lạc bào tử nhô dần lên, dày đặc Đái Huy Ban, Trần Đình Toại, Lưu Tham Mưu (2007) công bố nghiên cứu loại Đông trùng Hạ Thảo Isaria sp Tiêu Đông trùng Hạ Thảo phát Tuyên Quang Kết nghiên cứu thành phần sinh hóa nấm “Đơng trùng hạ thảo tằm dâu” (Isaria tenuipes) Nguyễn Mậu Tuấn (2010) cho thấy, hàm lượng protein dao động từ 59.61 đến 70.45%, hàm lượng mannitol dao động từ 1.21 đến 1.78%, tổng acid amin dao động từ 27.75 đến 48.02% với thành phần vi lượng vitamin cao Tuy nhiên, kết nghiên cứu không cho thấy diện hợp chất adenosien N6-(2-hydroxyethyl) adenosine thành phần hóa sinh phân tích từ lồi mà [3] báo cáo Nguồn lợi nấm Isaria tenuipes 3.1 Khả ứng dụng y học Nấm ký sinh côn trùng không ứng dụng kiểm soát sinh học, mà chúng cịn mang lại nguốn lợi khác, có khả cho hợp chất có hoạt tính sinh học cao( bioactive compound) nguồn nguyên liệu cho y- dược Rachada Haritakun cs (2007) [49] nghiên cứu hợp chất loài Isaria tenuipes BCC 7.831, kết qua phân tích cho thấy Isariotins A-D (1-4), có ancaloit sở hữu đơn chất cố định với vòng kép [3.3.1] Các cấu trúc hợp chất làm sáng tỏ chủ yếu NMR phân tích khối lượng kính quan phổ Theo y học truyền thống Trung Hoa, thể nấm P tenuipes có giá trị cao mặt dược liệu tác dụng dược lý sinh học chúng Những hợp chất có hoạt tính bao gồm hoạt tính chống khối u tác động đến hệ thống miễn dịch tách chiết từ loài nấm Paecilomyces công bố (Borchers cs., 1999; Liu cs., 1996; Lee cs., 1996) Leucinostatins A, D, Polygalactosamine kháng khối u, Saintopin, Sphingofungins E F, UCE1022, Paeciloquinones A, B, C, D, E F, Ergosterol peroxide, Acetoxyscirpenediol… Polysaccharides phân lập từ P tenuipes báo cáo có hoạt động chống ưng thư thể (Ban cs., 1998) Báo cáo cho tác dụng chống ưng thư Polysaccharides kích thích hệ thống miễn dịch Các hoạt chất Ergosterol peroxide Acetoxyscirpenediol tách chiết từ nấm P tenuipes ni cấy nhân tạo có khả ức chế dòng tế bào ung thư người tế bào khối u dày, tế bào ung thư gan, tế bào ung thư ruột kết-ruột thẳng Hoạt tính Acetoxyscirpenediol mạnh Cisplatin hoạt chất dùng điều trị cho bệnh nhân ung thư đến 6.6 lần (Nam cs., 2000) Phân tích hóa sinh cho thấy, hợp chất Y dược Adenosine N6-(2hydroxyethyl) adenosine thể Isaria tenuipes, hai hợp chất hợp chất quan trọng điều chỉnh vận chuyển nơron chúng chứng minh có liên quan nhiều đến chức sinh lý điều hòa giấc ngủ, điều hòa lo lắng, nhận thức Các chiết xuất methanol từ P tenuipes cho thấy, khả gây độc đáng kể so với dòng tế bào ung thư HeLa, HeLa S3 A-431 ( Shin cs., 2000) Park cs (2000) nghiên cứu tác dụng gây độc tế bào ung thư P tenuipes môt số tế bào khối u người Nghiên cứu Nilanonta cs (2000) cho thấy lồi P tenuipes có chứa chất kháng khuẩn chống ưng thư trùng rốt rét( plasmodial) lồi có chứa hoạt chất thuộc nhóm cycoldepsipeptides Theo kết nghiên cứu Haruhisa Kikuchi cs (2004) cho thấy, sinh khối nấm I tenuipes chứa Paecilomycine A, B C hoạt chất có hoạt tính sinh học cao[20] Năm 2009, Akira Sakakura, Kazufumi Shioya cs [13] phát hợp chất chống oxy hóa pseudo-di-peptide tiền chất chiết xuất từ Isaria tenuipes.Chất sử dụng loại thuốc dân gian có nguồn gốc từ thiên nhiên Nhật Bản có tên ‘Hanasanagitake’ Cấu trúc pseudo-dipeptide xác định (R)-3,4-diguanidinobutanoyl-(S)-DOPA (R)-3,4diguanidinobutanoyl-(S)-tyrosine phân tích quang phổ, tổng hợp hóa học chuyển đổi enzym T Bunyapaiboonsri cs (2009) [53] Một Hêmiacêtan có vịng kép đơn, isariotins E (1) F (2), với TK-57-164A (3) phân lập từ nấm ký sinh côn trùng Isaria tenuipes BCC 12.625 Cấu hình tuyệt đối (3) ghi địa cách áp dụng phương pháp sửa đổi Mosher Isariotin F (2) trưng bày hoạt động chống lại bệnh sốt rét ký sinh trùng Plasmodium falciparum K1 với IC50 5.1 μm hoạt động độc tế bào chống lại dòng tế bào ung thư (KB, BC, NCI-H187) nonmalignant (Vero) tế bào, tương ứng với giá trị IC50 15.8 , 2.4, 1.6, 2.9 μm Hiện Hàn Quốc nước có quy mô sản xuất P tenuipes lớn giới Sản phẩm P tenuipes đa dạng từ dạng thực phẩm chức đến dạng thuốc viên nang 3.2 Khả ứng dụng phòng trừ sinh học Trên giới chi Isaria xem tác nhân quan trọng phòng trừ sâu hại cậy trồng chúng dể dàng phân lập hình thành bào tử môi trường nuôi cấy (Nigel L., Hywel- Jones, 2005) Trong có lồi Isaria javanica, Isaria fariosa, Isaria fumosorosea Nấm Isaria javanica sử dụng để phòng trừ nhiều loại trồng Năm 2008 Argentina phòng trừ sâu hại trồng đạt hiệu phòng trừ từ 26.6-76.6% với nồng độ 107 sau ngày sau xử lý lại nấm ký sinh côn trùng khác Theo kết nghiên cứu Takeshi Maruyama cs (2009) sử dụng P tenuipes để tạo sản phẩm làm thuốc trừ sâu sinh học phịng trừ rệp trắng hại rau nhà kính với hiệu cao Nghiên cứu Vega-Aquino cs (2010) cho thấy, nấm Nomuraea rileyi Isaria tenuipes (= Paecilomyces tenuipes ) tác nhân gây bệnh phổ biến lepidopterans Các thử nghiệm thực để đánh giá hoạt động dầu làm chất bám dính cho bào tử N rileyi I tenuipes chống lại ấu trùng Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Helicoverpa Zea, Heliothis virescens Cả hai loại nấm đánh giá cao tương thích với loại dầu tỉ lệ chết gây gần 100% tất phương pháp kết hợp với dầu, giá trị LT(50) thấp 4,7 ngày N rileyi 6,0 ngày I tenuipes dầu đậu nành Tỉ lệ chết với I tenuipes chống lại S exigua dao động từ 90% đến 100% (giống ARSEF 2488 4096), N rileyi gây tử vong 95% S frugiperda Kết cho thấy đánh giá toàn diện nấm ký sinh côn trùng nông nghiệp cách sử dụng cơng nghệ ứng dụng dầu khuyến khích, đặc biệt, nông nghiệp hữu bền vững III NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Chủng Isaria tenuipes sử dụng dự án nhâp từ Ngân hàng giống vi sinh Nhật Bản – NBRC Thời gian địa điểm thực hiện: Thời gian thực hiện: Từ tháng 3/2016 - đến tháng 12/2016 Địa điểm thực hiện: Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao TP Hồ Chí Minh Nội dung nghiên cứu 3.1 So sánh môi trường lỏng nhân nuôi Isaria tenuipes -Mục tiêu thí nghiệm: Nhằm đánh giá lựa chọn môi trường lỏng tối ưu cho phát triển Isaria tenuipes -Mơ tả thí nghiệm: + Vật liệu thí nghiệm: Chủng Isaria tenuipes sử dụng dự án nhâp từ Ngân hàng giống vi sinh Nhật Bản – NBRC số dụng cụ máy móc thơng thường phịng thí nghiệm + Địa điểm thí nghiệm: Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh, Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao + Bố trí thí nghiệm: - Bước 1: - Giống Isaria tenuipes cấy đĩa PDA, ủ 250C 10 ngày + Pha môi trường PDA (Potato Dextrose Agar): 250g Khoai tây 20g Dextrose 20g Agar Môi trường hấp khử trùng 1210C/15p + Tiến hành đổ đĩa + Cấy Giống Isaria tenuipes đĩa PDA + Ủ đĩa 250C 10 ngày - Bước 2: Pha môi trường: NT1: SGY (g/l): Glucose 40, pepton 10, yeast extract 10 NT2: GYM (g/l): Glucose 40, yeast extract 10, Malt extract 10 NT3: PDB (g/l): Khoai tây 250, Dextrose 20 + Phân môi trường vào erlen 250 ml ( erlen 150ml) Hấp khử trùng 1210C/15p - Bước 3: Cấy giống Isaria tenuipes đĩa PDA vào bình mơi trường lỏng + Lấy 5mm thạch sợi nấm cấy vào môi trường lỏng PDB bình tam giác Đem ni máy lắc 150v/p 25oC vịng – ngày Thí nghiệm nhân tố bố trí theo kiểu hồn tồn ngâu nhiên Mỗi cơng thức có lần lặp, cơng thức 30 bình cho lần lặp - Bước 4: Tính nồng độ bào tử: Nồng độ bào tử nấm xác định buồng đếm hồng cầu + Cấu tạo buồng đếm hồng cầu Đó lam kính dày (kích thước cm x cm x 0,5 cm), có rãnh ngang rãnh dọc, có 225 vng lớn Trong có 25 ô lớn chia thành ô vuông nhỏ (1 lớn có 16 nhỏ) Kích thước ô nhỏ sau: cạnh 1/20 mm sâu 1/10 mm Thể tích vuông nhỏ là: 1/20 x 1/20 x 1/10 = 1/4000 (mm3) + Phương pháp đếm Đối với môi trường PDA lấy phần khuẩn lạc nấm cho vào cốc đong nhỏ với 10ml nước cất lần Dùng đũa thủy tinh khuấy bào tử hòa tan vào nước Đối với môi trường lên men xốp: Lấy 1g hỗn hợp chất môi trường cho vào cốc đong nhỏ với 10ml nước cất lần Dùng đũa thủy tinh đánh Sau đó, dùng lưới lọc mịn (tấm lưới lọc Nhật Bản) lọc hỗn hợp dung dịch vừa pha chế để đảm bảo có bào tử lọt qua Nhỏ vào dịch lọc - giọt hỗn hợp gồm Tween 80 cồn 960 với tỷ lệ : 1, khuấy Hỗn hợp có tác dụng giúp ổn định bào tử dịch lọc để đễ dàng cho việc đếm - Nhỏ giọt bào tử pha loãng lên buồng đếm, đậy lamen lên, dùng giấy thấm để thấm dịch thừa xung quanh - Đặt buồng đếm lên kính hiển vi điều chỉnh kính hiển vi vật kính 40x - Đếm số lượng bào tử lớn, lớn có 16 ô nhỏ - Chọn ô, góc buồng đếm (phương pháp điểm chéo góc) Đếm lần lấy giá trị trung bình + Cơng thức tính bào tử - Cách tính bào tử trung bình: X = (a + b + c)/3 Trong đó: X : giá trị trung bình ô vuông a, b, c: tổng số bào tử đếm lần ô vuông lớn - Sử dụng µl chất lỏng bào tử cho vào 25 ô vuông, số bào tử tập trung ml là: c = X × ×104 (đơn vị tính bào tử) - Cho n số lần pha loãng C số bào tử tập trung nguồn gốc dung dịch: C=c×n 3.2 Ảnh hưởng khối lượng chất cường độ ánh sáng lên hình thành synnema Isaria tenuipes Mục tiêu: Nhằm đánh giá lựa chọn khối lượng chất cường độ ánh sáng phù hợp cho hình thành synnema Phương pháp tiến hành: + Chuẩn bị mơi trường - Gạo rửa vịi nước chảy để loại bỏ bụi bẩn làm sạch, thật nước phơi bóng tối - Cân đong lượng gạo theo công thức cho vào hộp/lọ - Cân đong lượng nhộng tằm + lượng nước cất theo tỷ lệ cho vào mõi hộp/lọ - Bit miệng hộp/lọ túi bóng vịng chun đậy nắp hộp ngâm gạo 30 phút - Đem hấp khử trùng (1210C, 30 phút) làm nguội buồng cấy (bật đèn tia cực tím để bảo đảm vơ trùng) + Lây nhiễm nhân nuôi Mỗi lọ/hộp cấy vào 10% giống lỏng có nồng độ bào tử 106 bt/ml, đem nuôi chế độ tối 25oC Sau 15 -18 ngày chuyển sang chế độ sáng/tối nhiệt độ 20oC, ẩm độ 75 - 80% Duy trì chế độ thu hoạch synnema + Bố trí thí nghiệm: Nhân tố khối lượng khảo sát mức 30g, 40g, 50g Nhân tố ánh sáng khảo sát mức 100 lux, 200 lux, 300 lux Ánh sáng Khối lượng NT1 100 30 NT2 100 40 NT3 100 50 NT4 200 30 NT5 200 40 NT6 200 50 NT7 300 30 NT8 300 40 NT9 300 50 Thí nghiệm nhân tố bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên Mỗi cơng thức có lần lặp, 30 bình cho lần lặp Các tiêu theo dõi: Tỉ lệ bao phủ bề mặt môi trường Thời gian sinh trưởng synnema Sản lượng synnema Hàm lượng Adenosine Hàm lượng Polysaccharide 3.3 Đánh giá hình thành synnema Isaria tenuipes loại môi trường có nguồn dinh dưỡng bổ sung khác Mục tiêu: Nhằm đánh giá lựa chọn nguồn dinh dưỡng bổ sung tốt cho hình thành synnema Phương pháp tiến hành + Chuẩn bị môi trường - Gạo rửa vòi nước chảy để loại bỏ bụi bẩn làm sạch, thật nước phơi bóng tối - Cân đong lượng gạo theo công thức cho vào hộp/lọ - Cân đong lượng nhộng tằm + lượng nước cất theo tỷ lệ cho vào mõi hộp/lọ - Bit miệng hộp/lọ túi bóng vịng chun đậy nắp hộp ngâm gạo 30 phút - Đem hấp khử trùng (1210C, 30 phút) làm nguội buồng cấy (bật đèn tia cực tím để bảo đảm vô trùng) + Lây nhiễm nhân nuôi Mỗi lọ/hộp cấy vào 10% giống lỏng có nồng độ bào tử 106 bt/ml, đem nuôi chế độ tối 25oC Sau 15 -18 ngày chuyển sang chế độ sáng/tối nhiệt độ 20oC, ẩm độ 75 - 80% Duy trì chế độ thu hoạch synnema Khối lượng gạo cường độ ánh sáng kết tốt thí nghiệm 3.2 + Bố trí thí nghiệm: Cơng thức 1: Nguồn dinh dưỡng bổ sung hóa chất (0,1% CaCl2) Cơng thức 2: Nguồn dinh dưỡng bổ sung nhộng tằm (0,1% bột nhộng tằm) Công thức 3: Nguồn dinh dưỡng bổ sung 0,1% bột nhộng tằm 0,1% CaCl2 Thí nghiệm nhân tố bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên Mỗi cơng thức có lần lặp, 30 bình cho lần lặp Các tiêu theo dõi: Tỉ lệ bao phủ bề mặt môi trường Thời gian sinh trưởng synnema Sản lượng synnema Hàm lượng Adenosine Hàm lượng Polysaccharide 3.4 Hồn thiện quy trình ni trồng nấm Đơng trùng hạ thảo bơng tuyết Isaria tenuipes  Quy trình ni trồng:  Thuyết minh quy trình 3.4 Phương pháp xử lý số liệu Kết xử lý thống kê phần mềm SPSS phiên 11.5 dành cho Windows Sự sai khác giá trị trung bình đánh giá phương pháp phân tích phương sai ANOVA chiều (One way ANOVA) Duncan test với p=0,05 IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN So sánh môi trường lỏng nhân nuôi Isaria tenuipes Ảnh hưởng khối lượng chất cường độ ánh sáng lên hình thành synnema Isaria tenuipes Đánh giá hình thành synnema Isaria tenuipes loại mơi trường có nguồn dinh dưỡng bổ sung khác V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Kiến nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt Hà Thị Quyến, Tạ Kim Chỉnh, Hoa Thị Minh Tú, Lại Khánh Linh Nguyễn Ngọc Quyên, 2002 Ảnh hưởng điều kiện bảo quản giống đến đặc tính sinh học vi nấm diệt trùng, Metarhizium anisopliae Beauveria bassiana, Báo cáo khoa học Hội nghị trùng học tồn quốc lần thứ 4, Hà Nội, 11 - 12 tháng 4, năm 2002, Nxb Nông nghiệp, tr 401 405 Nguyễn Dương Khuê, 2005 Sử dụng nấm Metarhizium anisopliae Sorok phòng trừ mối nhà (Coptotetrmes formosanus Shiraki) theo phương pháp lây nhiễm Hội nghị trùng học tồn quốc lần thứ Hà Nội 1112/04/2005 Trang 409 – 414 Nguyễn Mậu Tuấn, Nguyễn Thái Huy, Trương Phi Hùng, 2011 Kết nghiên cứu thành phần sinh hóa nấm Đơng trùng hạ thảo tằm dâu Paecilomyces tenuipes Báo cáo khoa học Hội nghị côn trùng tồn quốc lần thứ 7, Nxb Nơng Nghiệp, 2011, pp: 905-912 Nguyễn Thị Lộc, Võ Thị Bích Chi, Nguyễn Thị Nhàn, Phạm Quang Hưng, Huỳnh Văn Nghiệp, Vũ Tiến Khang Nguyễn Đức Thành 2002 Nghiên cứu, sản xuất ứng dụng hai chế phẩm sinh học để quản lý loài sâu hại lúa Viện lúa ĐBSCL Trang 274 – 295 Phạm Thị Thùy, Trần Văn Huy, Nguyễn Duy Mạn 2005 Nghiên cứu hồn thiện cơng nghệ sản xuất thuốc trừ sâu vi nấm Beauveria Metarhizium để phòng trừ sâu hại đậu tương đậu xanh Hà Tĩnh năm 2003-2004 Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc Hà Nội 11-12/4/2005 Trang 494 -497 Phạm Văn Lầm, 2000 Nấm gây bệnh cho côn trùng Tạp chí Bảo vệ thực vật, số1/2000, tr 35 - 37 Tạ Kim Chỉnh, Hồ Thị Loan, Nguyễn Thị Hà Chi, 2005 "Một số đặc điểm sinh hóa hai chủng nấm Metarhizium anisopliae Ma.82 Beauveria bassiana Bb.75KC", Báo cáo khoa học, Hội nghị toàn quốc 2005, Nghiên cứu khoa học sống, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 2005, pp 433 - 436 Trần Ngọc Lân cộng sự, 2008 Đa dạng sinh học nấm ký sinh côn trùng Vườn Quốc gia Pù Mát đánh giá khả ký sinh số loài nấm số loài sâu hại trồng, Báo cáo đề tài cấp Bộ Giáo dục Đào tạo (Mã số B2007-27-25), 2008, 120 trang Trần Ngọc Lân, Thái Thị Ngọc Lam, Nguyễn Thị Thành, 2010 Đa dạng nấm ký sinh côn trùng giống Isaria vườn Quốc gia Phù Mát khu bảo tồn thiên nhiên Phù Huống 10 Trần Văn Hai, Trịnh Thị Xuân, Phạm Kim Sơn, 2006 Tạo sinh khối thử nghiệm hiệu lực số loại nấm ký sinh sâu ăn tạp rầy mềm hại rau cải TP Cần Thơ Tạp chí nghiên cứu khoa học, trường ĐHCT 11 Võ Thị Thu Oanh, Lê Đình Đơn, Bùi Cách Tuyến 2007 Đặc điểm sinh học khả gây bệnh nấm Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin đối vời sâu khoang (Spodoptera litura F.) hại rau cải xanh (Brassica juncea L.) Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp, số 1&2 Đại học Nông Lâm Tp HCM Trang 58-63 II Tài liệu tham khảo nước 12 Ahn Y J., Park S J., LeeS.C., Shin S C., Choi D H., 2000 Cordycepin: selective growth inhibitor derived from liquid culture of Cordyceps militaris against Clostridim ssp J Agric Food Chem., 2000, 48: 27442748 13 Akira Sakakura, Kazufumi Shioya et al., 2009 Isolation, structural elucidation and synthesis of a novel antioxidative pseudo-di-peptide, Hanasanagin, and its biogenetic precursor from the Isaria japonica mushroom 2009 14 Bok J W., Lermer L., Chlton J.; Klingeman H G., Towers G H N, Antitumor Sterols from the Mycelia of Cordyceps sinensis, Phytochemistry, 51, 891 – 898 15 Brown A H S and Smith G., 1957 The gennus Paecilomyces Bainier and it perfect stage Byssochlamys Westling Transactions of the British Mycological Society, 1957, 40: 17 - 89 16 Choi Y W., Hyde K D and Ho W W H., 1997 Fugal Diversity 2, 29-38 17 Chiou, W F.; Chang, P C.; Chou, C J.; Chen, C F (2001), Protein Constituent Contributes to the Hypotensive and vasorelaxant Activities of Cordyceps sinensis, Life Sci, 66, 1369 - 1376 18 Chen Y J., Shiao M S., Lee S S., Wang S Y., 1997 Effect of Cordyceps sinensis on the Proliferation and differentiation of human Leukemic U937 Cells Life Sci., 1997, 60, 2349 - 2359 19 Chen Y Q., Hu B., Xu F., Zhang W., Zhou H., Qu L H., 2004 Genetic Variation of Cordyceps sinensis, a Fruit - Body - Producing Entomopathogenic Species from Different geographical Regions in China, FEMS Microbial Lett, 2004, 230: 153 - 158 20 Cleaver Phillip D., John C., 2006 Novel method for growing Cordyceps sinensis on a substrate and novel method for hydridizing different strains of Cordyceps sinensis Publication Date, 2006, 13 pp 21 Goettel M S., and Inglis G D., 1997 Fungi: Hyphomycetes, In: Manuals of Techniques in Insect Pathology (ed L Lacey), Academic Press, 213247 22 Gi - Ho Sung, Nigel L Hywel - Jones, Jae - Mo Sung, Jennifer Luangsa - ard J., Bhushan Shrestha, Joseph W Spatafora, 2007 Phylogenetic classification of Cordyceps and the Clavicipitaceous fungi Studies in Mycology, 2007, 57(1): - 59 23 Hajek, A.E and R.J St Leger 1994 Interactions between fungal pathogens and insect hosts Annu Rev Entomol 39 293-322 24 Hywel - Jones N L., 1994 Cordyceps khaoyaiensis anh C pseudomilitaris, Two New Pathogens of Lepidopteran Larvae from Thailand Mycol Res., 1994, 98: 939 – 942 25 Hiroki Sato and Mitsuaki Shimazu, 2002 Stromata production of Cordyceps militaris (Clavicipitales: Clavicipitaceae) by injection of hyphal bodies to alternative host insects Appl Entomol Zool , 2002 37(1): 85 - 92 26 Isaka M., Tanticharoen M., Thebtaranonth Y., 2000 Cordyanhydrides A and B Two Unique Anhydrides from the Insect Pathogenic Fungus Cordyceps pseudomilitaris BCC 1620 Tetrahedron Lett, 2000, 41: 1657-1660 27 Isaka M., Tanticharoen M., Kongsaeree P., Thetaranonth Y., 2001 Structures of Cordypyridones A - D, Antimalarial N - Hydroxy - anh N - Methoxy - pyridonesn from the Insect Pathogenic Fungus Cordyceps nipponica J Org Chem, 2001, 66: 4803 – 4808 28 Jannet Jennifer Luangsa-ard, Kanoksri, Suchada Mogkosamrit, Somsak Sivachai, Nigel Hywer-Jones.2006 Workshop on the collection, Isolation, Cutivation an Identification of insect - Pathogenic Fungi, Viet Nam, 2006, 106 p 29 John Holliday, matt Cleaver, 2004 On the Trail of The Yak Ancient Cordyceps in the Modern World, 2004, 63 pp 30 Katsuji Yamanaka, Satoshi Inatomi, Mitsuyo Hanaoka, 1998 Cutivation characteristics of Isaria japonica 1998 31 Kikuchi H., Miyagawa Y., Nakamura K., Sahashi Y., Inatomi S., Oshima Y 2004 A Novel Carbon Skeletal Trichothecane, Tenuipesine A, Isolated from an Entomopathogenic fungus, Paecilomyces tenuipes Org Lett, 2004, 6: 4531 – 4533 32 Kocharin K., P Wongsa, 2006 Semi - defined Medium for in vitro Cultivation of the Fastidious Insect Pathogenic Fungus Cordyceps unilateralis Mycopathologia, 2006, 161(4): 255 - 260 33 Kuo Y C., Tsai W J., Wang J Y., Chang S C., Lin C Y., Shiao M S., 2001 Regulation of Bronchoalveolar Lavage Fluids Cell Function by the Immunomodulatory Agents from Cordyceps sinensis Life Sci, 2001, 68: 10671082 34 Kiho T., Tabata H., Ukai S., Hara C., A Minor, 1986 Protein - Containing Galactomannan from a Sodium Corbonate Extract of Cordyceps sinensis, Carbohydr Res, 1986, 156: 189 - 198 35 Kittakoop P., Punya J., Kongsaeree P., Lertwerawat Y., Jintasirikul A., Tanticharoen M., Thebtaranonth Y., 1999 Bioactive Naphthoquinones from Cordyceps unilateralis Phytochemistry, 1999, 52: 453 - 457