Nâng cao năng suất sản xuất astaxanthin từ vi tảo haematococcus pluvialis bằng quy trình 3 pha

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA SINH – MƠI TRƢỜNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NÂNG CAO NĂNG SUẤT SẢN XUẤT ASTAXANTHIN TỪ VI TẢO HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS BẰNG QUY TRÌNH PHA Chun ngành : Cơng nghệ sinh học Khóa : 2019-2023 Sinh viên thực : Lê Phạm Thị Nhƣ Ý Giáo viên hƣớng dẫn : TS Trịnh Đăng Mậu Đà Nẵng, 05/2023 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƢỜNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NÂNG CAO NĂNG SUẤT SẢN XUẤT ASTAXANTHIN TỪ VI TẢO HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS BẰNG QUY TRÌNH PHA Chun ngành : Cơng nghệ sinh học Khóa : 2019-2023 Sinh viên thực : Lê Phạm Thị Nhƣ Ý Giáo viên hƣớng dẫn : TS Trịnh Đăng Mậu Đà Nẵng, 05/2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan liệu trình bày khóa luận trung thực Đây kết của trình nghiên cứu dƣới hƣớng dẫn TS Trịnh Đăng Mậu khoa Sinh - Môi trƣờng, trƣờng Đại học Sƣ Phạm - ĐHĐN chƣa đƣợc công bố cơng trình khác trƣớc Tơi hồn toàn chịu trách nhiệm vi phạm quy định đạo đức khoa học Tác giả Lê Phạm Thị Nhƣ Ý i LỜI CẢM ƠN Đầu tiên tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Trịnh Đăng Mậu, giảng viên khoa Sinh - Môi trƣờng, trƣờng Đại học Sƣ Phạm - Đại học Đà Nẵng tận tình hƣớng dẫn, bảo giúp đỡ tơi suốt q trình thực nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Thứ hai, tơi xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo khoa Sinh - Môi trƣờng, trƣờng Đại học Sƣ Phạm, Đại học Đà Nẵng giảng dạy, truyền đạt kiến thức, kỹ nhƣ truyền lửa để có tính thần học tập, cầu tiến Bên cạnh thầy tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập hồn thành khóa luận tốt nghiệp Thứ ba, tơi xin chân thành cảm ơn anh Phan Nhật Trƣờng, anh Đinh Công Duy Hiệu, anh Đoạn Thế Bảo, chị Trần Thị Tƣờng Vy, chị Nguyễn Hoài Nhƣ Ý, chị Trƣơng Thị Kim Oanh, em Bùi Thị Phƣơng Liên tất thành viên nhóm nghiên cứu ABR hỗ trợ động viên tơi suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Và cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè ngƣời giúp đỡ suốt thời gian vừa qua Tôi xin chân thành cảm ơn! ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH M C C C TỪ VI T TẮT .v DANH M C BẢNG BIỂU vi DANH M C HÌNH ẢNH vii TÓM TẮT ix MỞ ĐẦU .1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu Ý nghĩa đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3.3 Nội dung nghiên cứu CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4 1.1 Tổng quan vi tảo Haematococcus pluvialis .4 1.1.1 Đặc điểm phân loại phân bố Haematococcus pluvialis 1.1.2 Đặc điểm hình thái đặc điểm sinh thái học Haematococcus pluvialis 1.1.3 Giới thiệu khả tích lũy astaxanthin vi tảo Haematococcus pluvialis 1.2 Tổng quan quy trình sản xuất astaxanthin vi tảo Haematococcus pluvialis 1.2.1 Quy trình pha sản xuất astaxanthin vi tảo Haematococcus pluvialis 1.2.2 Quy trình pha sản xuất astaxanthin vi tảo Haematococcus pluvialis 1.3 Tổng quan astaxanthin 1.3.1 Định nghĩa astaxanthin 1.3.2 Ứng dụng astaxanthin 1.3.3 Thị trƣờng tiêu thụ astaxanthin 1.4 Tình hình nghiên cứu nƣớc 10 1.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 10 1.4.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc 11 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PH P NGHIÊN CỨU .13 2.1 Vật liệu nghiên cứu .13 iii 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 13 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 13 2.3.1 Bố trí thí nghiệm 13 2.3.2 Phƣơng pháp đánh giá tiêu vi tảo 17 2.3.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu .18 CHƢƠNG 3: K T QUẢ NGHIÊN CỨU 19 3.1 Khảo sát ảnh hƣởng cƣờng độ ánh sáng thiếu nitơ đến kích thích chuyển trạng thái tế bào vi tảo H pluvialis 19 3.1.1 Ảnh hƣởng cƣờng độ ánh sáng thiếu nitơ đến khả chuyển trạng thái tế bào vi tảo H pluvialis 19 3.1.2 Ảnh hƣởng cƣờng độ ánh sáng thiếu nitơ đến hàm lƣợng sắc tố vi tảo H pluvialis 20 3.1.3 Ảnh hƣởng cƣờng độ ánh sáng thiếu nitơ đến mật độ kích thƣớc tế bào vi tảo H pluvialis 24 3.2 Đánh giá suất sản xuất astaxanthin vi tảo H pluvialis quy trình pha 28 3.2.1 Đánh khả tăng suất sản xuất sắc tố vi tảo H pluvialis quy trình pha 28 3.2.2 Đánh giá ảnh hƣởng quy trình pha đến khả chuyển trạng thái tế bào vi tảo H pluvialis 32 3.2.3 Đánh giá ảnh hƣởng quy trình pha đến đến mật độ kích thƣớc tế bào vi tảo H pluvialis 33 K T LUẬN VÀ KI N NGHỊ 37 K T LUẬN 37 KI N NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 iv DANH MỤC C C TỪ VI T TẮT H pluvialis Haematococcus pluvialis ROS Reactive oxygen species CAGR Compound annual growth rate PTOX The plastid terminal oxidas BBM Bold's Basal Medium OHM Optimal Haematococcus medium RM Rudic’s medium F/2 Guillard Walne v DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Tên bảng Trang 2.1 Bố trí thí nghiệm kích thích chuyển trạng thái tế bào H pluvialis 14 2.2 Bố trí thí nghiệm đánh giá suất sản xuất Astaxanthin vi tảo 15 Haematococcus pluvialis 3.1 Năng suất, hàm lƣợng trung bình chlorophyll, astaxanthin vi 24 tảo H pluvialis thí nghiệm kích thích vào ngày ngày 3.2 Mật độ tế bào vi tảo H pluvialis thí nghiệm kích thích 26 3.3 Năng suất, hàm lƣợng trung bình chlorophyll, astaxanthin vi 32 tảo H pluvialis thí nghiệm đánh giá suất vào ngày ngày 3.4 Mật độ tế bào vi tảo H pluvialis thí nghiệm đánh giá suất vi 35 DANH MỤC HÌNH ẢNH Tên hình vẽ Hình 1.1 Vịng đời phát triển Haematococcus pluvialis (Niizawa & cs., Trang 2021) 1.2 Sơ đồ tích tụ astaxanthin tảo H pluvialis điều kiện căng thẳng (Focsan & cs., 2017) 1.3 Con đƣờng sinh tổng hợp astaxanthin H pluvialis theo Grünewald cs., (2000) 1.4 Cấu trúc phân tử astaxanthin (ASTAXANTHIN - Chiết xuất từ vi tảo đỏ) 1.5 Biểu đồ thị trƣờng tiêu thụ astaxanthin qua năm (Astaxanthin Market Size, Share, Growth & Trends Report, 2030) 3.1 Cấu trúc quần thể vi tảo H pluvialis thí nghiệm kích thích 19 3.2 Hàm lƣợng astaxanthin trung bình vi tảo H pluvialis thí 20 nghiệm kích thích qua ngày 0, ngày 3.3 Hàm lƣợng chlorophyll trung bình vi tảo H pluvialis thí 21 nghiệm kích thích qua ngày 0, ngày 3.4 Năng suất astaxanthin trung bình vi tảo H pluvialis thí 22 nghiệm kích thích qua ngày 0, ngày 3.5 Năng suất chlorophyll trung bình vi tảo H pluvialis thí nghiệm kích thích qua ngày 0, ngày vii 23 3.6 Mật độ tế bào vi tảo H pluvialis thí nghiệm kích thích 25 3.7 Kích thƣớc tế bào H pluvialis thí nghiệm kích thích 28 3.8 Năng suất trung bình astaxanthin vi tảo H pluvialis thí 29 nghiệm đánh giá suất vào ngày 0, ngày 3.9 Năng suất trung bình chlorophyll vi tảo H pluvialis thí 30 nghiệm đánh giá suất vào ngày 0, ngày 3.10 Hàm lƣợng trung bình astaxanthin vi tảo H pluvialis thí 31 nghiệm đánh giá suất vào ngày 0, ngày 3.11 Hàm lƣợng trung bình chlorophyll vi tảo H pluvialis thí 31 nghiệm đánh giá suất vào ngày 0, ngày 3.12 Cấu trúc quần thể vi tảo H pluvialis thí nghiệm đánh giá 33 suất 3.13 Mật độ tế bào vi tảo H pluvialis thí nghiệm đánh giá 34 suất 3.14 Kích thƣớc tế bào vi tảo H pluvialis thí nghiệm đánh giá suất viii 35 Cụ thể, đƣờng kính tế bào cao đạt 25 μm sau ngày nuôi nghiệm thức đối chứng (DC tăng đáng kể so với ngày đầu (19 μm , gấp 1,5 lần so với nghiệm thứ thiếu hụt nitơ Tƣơng tự, nghiệm thức ánh sáng (AS đạt 23,7 μm Ở nghiệm thức kết hợp ánh sáng cao với thiếu hụt nitơ (KH nghiệm thức thiếu hụt nitơ (ON , đƣờng kích tế bào ban đầu 19±1 μm giảm xuống 16±1 μm Sự giảm xuống kích thƣớc tế bào vi tảo đƣa vào điều kiện tích lũy sinh trƣởng phát triển tạo thành nhiều tế bào non có kích thƣớc nhỏ Hiện tƣợng đƣợc quan sát rõ rệt dƣới kính hiển vi Sự tăng lên kích thƣớc tế bào, tác động cao tế bào không sinh trƣởng phát triển bắt đầu sản sinh chất chống oxy hóa bảo vệ tế bào, đƣờng kích tế bào vi tảo H pluvialis tăng lên Kết có tƣơng đồng với nghiên cứu tác giả Baroni, báo cáo kích thƣớc tế bào tăng lên quần thể tế bào, đƣờng kính tế bào trung bình khoảng 30% (Baroni & cs., 2019) Kết nghiên cứu yếu tố kích thích chuyển trạng thái tế bào, cho thấy kết hợp cƣờng độ ánh sáng với thiếu hụt nitơ (KH yếu tố kích thích chuyển trạng thái tế bào tốt nghiệm thức, nâng cao suất sản xuất astaxanthin bên tế bào Đồng thời, rút ngắn thời gian, giảm tỷ lệ tế bào vi tảo H pluvialis chết Tuy nhiên, yếu tố chƣa tối ƣu tế bào sinh trƣởng phát triển dẫn đến dẫn đến hàm lƣợng chất bên tế bào chƣa đạt, cần nâng cao yếu tố kích thích để ngăn chặn trình sinh trƣởng Kết tƣơng đồng với nhận định số tác giả việc tích lũy astaxanthin nội bào đƣợc cải thiện cách nuôi cấy môi trƣờng thiếu chất dinh dƣỡng thông qua stress nitơ Nghiên cứu Shah cộng sự, nhóm tác giả ảnh hƣởng việc thiếu nitơ sản xuất astaxanthin tối ƣu so với ảnh hƣởng cƣờng độ ánh sáng (Shah & cs., 2016) Ngoài Scibilia cộng báo cáo q trình ni cấy vi tảo H pluvialis điều kiện thiếu nitơ kết hợp với chiếu sáng cƣờng độ cao 400 μmol photon/m2/s tạo hiệu mạnh mẽ tạo sản lƣợng astaxanthin 306 mg/mL Nguồn cung cấp ánh sáng cao đèn huỳnh quang trình ni cấy, góp phần tăng 215% so với mơi trƣờng ni cấy thiếu nitơ nhƣng có kiểm sốt ánh sáng (40 μmol photon /m2/s) (Scibilia & cs., 2015) 27 3.2 Đánh giá suất sản xuất astaxanthin vi tảo H pluvialis quy trình pha 3.2.1 Đánh khả tăng suất sản xuất sắc tố vi tảo H pluvialis quy trình pha Kết nghiên cứu quy trình pha tác động tích đến suất sản xuất astaxanthin vi tảo H pluvialis, cho thấy gia tăng nghiệm thức có ý nghĩa thống kê (p-value0,05, cao gấp 1,75 so với nghiệm thức đƣa vào tích lũy từ đầu (DC (0,08±0,019 µg/mL/ngày Ở nghiệm thức có pha kích thích, thay mơi trƣờng sau kích thích (NT3 đạt 0,059±0,020 28 µg/mL/ngày Đối với suất chlorophyll có xu hƣớng giảm sau ngày nuôi không quan sát thấy ngày cuối thí nghiệm Hình 3.9 Năng suất trung bình chlorophyll vi tảo H pluvialis thí nghiệm đánh giá suất vào ngày 0, ngày Cụ thể, suất chlorophyll sụt giảm nhanh chóng ngày ni thứ hai, giao động khoảng 2-3,5 µg/mL/ngày, suất thấp nghiệm thức thay hoàn toàn mơi trƣờng dinh dƣỡng (NT2 với 0,3±0,153 µg/mL/ngày Khơng ghi nhận đƣợc chlorophyll ngày cuối (Hình 3.9) Ngồi ra, đánh giá hàm lƣợng astaxanthin chlorophyll dƣới ảnh hƣởng quy trình pha, cho thấy gia tăng chênh lệch nghiệm thức có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% 29 Hình 3.10 Hàm lƣợng trung bình astaxanthin vi tảo H pluvialis thí nghiệm đánh giá suất vào ngày 0, ngày Trong đó, hàm lƣợng cao đạt 4,213±0,657 pg/tế bào nghiệm thức thay hồn tồn mơi trƣờng dinh dƣỡng, đƣa vào tích lũy (NT2 , cao gấp 1.2 lần so với nghiệm thức đƣa vào tích lũy từ đầu (DC đạt 3,449±0,480 pg/tế bào đạt, có khác biệt đáng kể với p-value0,05) Ở ngày cuối thí nghiệm khơng ghi nhận đƣợc hàm lƣợng chlorophyll 31 Bảng 3.3 Năng suất, hàm lƣợng trung bình chlorophyll, astaxanthin vi tảo H pluvialis thí nghiệm đánh giá suất vào ngày ngày Nghiệm thức Năng suất chlorophyll astaxanthin(µg/mL/ngày) Hàm lƣợng Chlorophyll Astaxanthin (pg/tế bào) Ngày Chlorophyll Astaxanthin Chlorophyll Astaxanthin DC 3,5a±0,102 0,058b±0,002 64a±5,148 1,065b±0,053 NT1 2,4b±0,250 0,083b±0,001 12,8b±1,525 0,441c±0,008 NT2 0,3c±0,153 0,133a±0,019 3,8c±1,448 1,496a±0,123 NT3 2,2b±0,508 0,070b±0,004 12,1b±2,816 0,396c±0,020 Ngày DC - 0,080ab±0,019 - 3,449a±0,480 NT1 - 0,143a±0,012 - 2,105b±0,177 NT2 - 0,144a±0,014 - 4,213a±0,657 NT3 - 0,059b±0,020 - 1,039b±0,284 Ghi chú: DC (đối chứng , NT1 (kích thích, khơng thay mơi trƣờng , NT2 (thay mơi trƣờng, tích lũy , NT3 (kích thích, có thay mơi trƣờng 3.2.2 Đánh giá ảnh hƣởng quy trình pha đến khả chuyển trạng thái tế bào vi tảo H pluvialis Kết nghiên cứu cho thấy ảnh hƣởng nhanh chóng quy trình pha đến khả chuyển trạng thái tế bào vi tảo H pluvialis Nhìn chung, cấu trúc quần thể nghiệm thức vào ngày đầu chƣa có khác biệt, Sự chênh lệch ngày thứ nghiệm thức trừ nghiệm thức đối chứng với môi trƣờng dinh dƣỡng BBM (Hình 3.12) 32 Hình 3.12 Cấu trúc quần thể vi tảo H pluvialis thí nghiệm đánh giá suất Trong đó, nghiệm thức thay hồn tồn mơi trƣờng dinh dƣỡng, đƣa vào tích lũy (NT2) cho thấy tốc độ tỷ lệ chuyển trạng thái vƣợt trội, đạt 87% tế bào tích lũy 13% tế bào nang đạt 100% tỷ lệ vào ngày Tƣơng tự, nghiệm thức có pha kích thích, khơng thay mơi trƣờng (NT1 có pha kích thích, thay mơi trƣờng sau kích thích (NT3 tỷ lệ tế bào tích lũy lần lƣợt 51%, 53% ngày thứ 2, không quan sát thấy tế bào sinh trƣởng đạt 100% sau Tỷ lệ cao gấp 2,7 lần so với nghiệm thức DC đạt 19% tế bào tích lũy ngày đạt 100% vào ngày cuối (p-value0.05 Sự suy giảm kích thƣớc ngày đầu q trình ni, tế bào có khả sinh trƣởng tạo thành nhiều tế bào non có kích thƣớc nhỏ hơn, nên ghi nhận đƣợc suy giảm mặt kích thƣớc Sau tăng lại tế bào chuyển sang kích ứng sản sinh chất chống oxy hóa bảo vệ thể kích thƣớc gia tăng lại Nhƣ vậy, sau đánh giá suất sản xuất astaxanthin thông qua thông số thể đƣợc tầm quan trọng pha kích thích q trình ni, việc việc sử dụng quy trình pha giải đƣợc số vấn đề mà quy trình pha gặp phải chẳng hạn nhƣ việc chuyển pha từ sinh trƣởng (pha xanh sang tích lũy (pha đỏ cách đột ngột dẫn đến lƣợng lớn tế bào chết tế bào chƣa chuyển trạng thái sang dạng bào nang, khơng có khả chống chịu đƣợc với điều kiện stress đột ngột Ngồi cịn giúp nâng cao đƣợc suất sản xuất astaxanthin, Kết phù hợp với nghiên cứu Feng li cộng năm 2022 việc biến đổi tế bào H pluvialis làm giảm hiệu chết tế bào xảy giai đoạn đỏ làm tăng đáng kể sinh khối sản xuất astaxanthin so với nhóm đối chứng, tỷ lệ tế bào chết giai đoạn đỏ nhóm biến đổi tế bào giảm tới 81,6%, đồng thời sản xuất sinh khối astaxanthin tăng lần lƣợt 1,63 lần 2,1 lần (Li & cs., 2020) Một nghiên cứu khác Feng li cộng năm 2019 thực so sánh khác biệt tế bào di động (sinh trƣởng tế bào không di động (nang suất astaxanthin thu đƣợc kết cao 48,42 ± 3,13 mg/L-1 môi trƣờng nuôi cấy tế bào không di động (nang với suất cao 5,04 ± 0,15 mg/L-1, cao đáng kể so với nuôi cấy tế bào di động (sinh trƣởng Tác giả cho thấy tích lũy astaxanthin đƣợc cải thiện đáng kể nhờ tế bào không di động H pluvialis, điều mang lại khả tối ƣu hóa chiến lƣợc canh tác H pluvialis có cho sản xuất công nghiệp (Li & cs., 2019) 36 K T LUẬN VÀ KI N NGHỊ K T LUẬN Sau thực thí nghiệm tơi rút đƣợc kết luận sau - Đối với thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng cƣờng độ ánh sáng thiếu nitơ đến kích thích chuyển trạng thái tế bào vi tảo H pluvialis Sự thiếu hụt nito kết hợp cƣờng độ ánh sáng cao góp phần đ y nhanh tốc độ chuyển trạng thái tế bào, sau hai ngày không tồn tế bào sinh trƣởng, đối chứng đến ngày thứ 20% tế bào sinh trƣởng Hàm lƣợng sắc tố nghiệm thức có thay đổi, với astaxanthin tế bào tăng mạnh môi trƣờng không chứa nitơ kết hợp với ánh sáng cao đạt 1,36±0,055 pg/tb sau ngày suất 0,11±0,002 µg/mL/ngày Ngồi ảnh hƣởng đến gia tăng mật độ tế bào, nhƣ kích thƣớc - Đối với thí nghiệm đánh giá hiệu suất sản xuất astaxanthin vi tảo Haematococcus pluvialis quy trình pha Bổ sung pha kích thích vào quy trình tích ni có tiềm việc gia tăng suất astaxanthin (0,143±0,012 µg/mL/ngày Khơng quy trình pha có ảnh hƣởng đến gia tăng mật độ tế bào, giảm tỷ lệ tế bào chết đƣa vào tích lũy, kích thƣớc tế bào giảm KI N NGHỊ Sau thực thí nghiệm tơi có số kiến nghị sau đây: - Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng cƣờng độ ánh sáng thiếu nitơ đến kích thích chuyển trạng thái tế bào vi tảo H pluvialis chƣa thực tối ƣu, cần nâng cao điều kiện stress để ngăn cản trình sinh trƣởng phát triển khơng làm kích thƣớc tế bào giảm, giúp nâng cao hàm lƣợng sắt tố bên tế bào - Từ sở thực tiễn nhƣ vậy, em kiến nghị sử dụng quy trình pha sản xuất astaxanthin từ vi tảo Haematococcus pluvialis quy công nghiệp 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt ASTAXANTHIN - Chiết xuất từ vi tảo đỏ (n.d.) Nasol Retrieved May 12, 2023, from https://nasol.com.vn/chong-oxy-hoa/astaxanthin-nguyen - lieu- TPCN Buihuongnhai (2017, September 18 Nghiên cứu đặc điểm sinh học khả sinh astaxanthin số chủng vi tảo Haematococcus đƣợc phân lập Việt Nam Site Title Nam T N., Trân T N B., Hiếu H T., Hiền N T D., & Liên T T B (n.d Nghiên cứu nâng cao tích lũy astaxanthin vi tảo Haematococcus pluvialis điều kiện stress môi trƣờng nuôi cấy Trung V H., Phúc N T H., & Bắc N T K (2021 Cƣờng độ ánh sáng ảnh hƣởng lên tăng trƣởng, tích lũy sắc tố, hợp chất phenolic khả oxi hóa vi tảo Haematococcus pluvialis Tạp chí Khoa học, 18(3), Article Tài liệu tiếng Anh Ambati, R R., Siew Moi, P., Ravi, S., & Aswathanarayana, R G (2014) Astaxanthin: Sources, Extraction, Stability, Biological Activities and Its Commercial Applications—A Review Marine Drugs, 12(1), 128–152 Astaxanthin Market Size, Share, Growth & Trends Report 2030 (n.d.) Retrieved May 11, 2023, from https://www.grandviewresearch.com/industry-analysis/globalastaxanthin-market Baroni, É G., Yap, K Y., Webley, P A., Scales, P J., & Martin, G J O (2019) The effect of nitrogen depletion on the cell size, shape, density and gravitational settling of Nannochloropsis salina, Chlorella sp (Marine) and Haematococcus pluvialis Algal Research, 39, 101454 Focsan, A L., Polyakov, N E., & Kispert, L D (2017) Photo Protection of Haematococcus pluvialis Algae by Astaxanthin: Unique Properties of Astaxanthin Deduced by EPR, Optical and Electrochemical Studies Antioxidants, 6(4), Article Goiris, K., Muylaert, K., Fraeye, I., Foubert, I., De Brabanter, J., & De Cooman, L (2012) Antioxidant potential of microalgae in relation to their phenolic and carotenoid content Journal of Applied Phycology, 24, 1477–1486 38 Hoang, M H., Nguyen, C., Pham, H Q., Van Nguyen, L., Hoang Duc, L., Van Son, L., Hai, T N., Ha, C H., Nhan, L D., Anh, H T L., Thom, L T., Quynh, H T H., Ha, N C., Van Nhat, P., & Hong, D D (2016) Transcriptome sequencing and comparative analysis of Schizochytrium mangrovei PQ6 at different cultivation times Biotechnology Letters, 38(10), 1781–1789 Hong, H., Kubik, J D., & Scheinkman, J A (2012) Financial Constraints on Corporate Goodness (Working Paper No 18476) National Bureau of Economic Research Kobayashi, M., Kakizono, T., Yamaguchi, K., Nishio, N., & Nagai, S (1992) Growth and astaxanthin formation of Haematococcus pluvialis in heterotrophic and mixotrophic conditions Journal of Fermentation and Bioengineering, 74(1), 17– 20 Li, F., Cai, M., Lin, M., Huang, X., Wang, J., Ke, H., Wang, C., Zheng, X., Chen, D., & Yang, S (2020) Enhanced Biomass and Astaxanthin Production of Haematococcus pluvialis by a Cell Transformation Strategy with Optimized Initial Biomass Density Marine Drugs, 18(7), 341 Li, F., Cai, M., Lin, M., Huang, X., Wang, J., Zheng, X., Wu, S., & An, Y (2019) Accumulation of Astaxanthin Was Improved by the Nonmotile Cells of Haematococcus pluvialis BioMed Research International, 2019, 8101762 Li, F., Cai, M., Wu, Y., Lian, Q., Qian, Z., Luo, J., Zhang, Y., Zhang, N., Li, C., & Huang, X (2022) Effects of Nitrogen and Light Intensity on the Astaxanthin Accumulation in Motile Cells of Haematococcus pluvialis Frontiers in Marine Science, 9, 909237 Molino, A., Rimauro, J., Casella, P., Cerbone, A., Larocca, V., Chianese, S., Karatza, D., Mehariya, S., Ferraro, A., Hristoforou, E., & Musmarra, D (2018) Extraction of astaxanthin from microalga Haematococcus pluvialis in red phase by using generally recognized as safe solvents and accelerated extraction Journal of Biotechnology, 283, 51–61 Mularczyk, M., Michalak, I., & Marycz, K (2020) Astaxanthin and other Nutrients from Haematococcus pluvialis—Multifunctional Applications Marine Drugs, 18(9), Article Mulders, K J M., Lamers, P P., Martens, D E., & Wijffels, R H (2014) Phototrophic pigment production with microalgae: Biological constraints and opportunities 39 Journal of Phycology, 50(2), 229–242 Mamikunian, G., & Briggs, M H (2013) Current Aspects of Exobiology Elsevier Nam, J., Mysore, K S., Zheng, C., Knue, M K., Matthysse, A G., & Gelvin, S B (1999) Identification of T-DNA tagged Arabidopsis mutants that are resistant to transformation by Agrobacterium Molecular and General Genetics MGG, 261(3), 429–438 Niizawa, I., Espinaco, B Y., Zorrilla, S E., & Sihufe, G A (2021) Chapter Astaxanthin production by autotrophic cultivation of Haematococcus pluvialis: A success story In G A Ravishankar & A Ranga Rao (Eds.), Global Perspectives on Astaxanthin (pp 71–89) Academic Press Nishshanka, G K S H., Liyanaarachchi, V C., Nimarshana, P H V., Ariyadasa, T U., & Chang, J.-S (2022) Haematococcus pluvialis: A potential feedstock for multiple-product biorefining Journal of Cleaner Production, 344, 131103 Pan-utai, W., Parakulsuksatid, P., & Phomkaivon, N (2017) Effect of inducing agents on growth and astaxanthin production in Haematococcus pluvialis: Organic and inorganic Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 12, 152–158 Plaza, M., Cifuentes, A., & Ibáñez, E (2008) In the search of new functional food ingredients from algae Trends in Food Science & Technology, 19(1), 31–39 Recht, L., Töpfer, N., Batushansky, A., Sikron, N., Gibon, Y., Fait, A., Nikoloski, Z., Boussiba, S., & Zarka, A (2014) Metabolite profiling and integrative modeling reveal metabolic constraints for carbon partitioning under nitrogen starvation in the green algae Haematococcus pluvialis The Journal of Biological Chemistry, 289(44), 30387–30403 Rodríguez-Meizoso, I., Jaime, L., Santoyo, S., Señoráns, F J., Cifuentes, A., & Ibáñez, E (2010) Subcritical water extraction and characterization of bioactive compounds from Haematococcus pluvialis microalga Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 51(2), 456–463 Sarada, R., Tripathi, U., & Gokare, R (2002) Influence of stress on astaxanthin production in Haematococcus pluvialis grown under different culture conditions Process Biochemistry, 37, 623–627 Scibilia, L., Girolomoni, L., Berteotti, S., Alboresi, A., & Ballottari, M (2015) Photosynthetic response to nitrogen starvation and high light in Haematococcus 40 pluvialis Algal Research, 12, 170–181 Shah, M M R., Liang, Y., Cheng, J J., & Daroch, M (2016) Astaxanthin-producing green microalga Haematococcus pluvialis: From single cell to high value commercial products Frontiers in Plant Science, 7, 531 Suh, I S., Joo, H.-N., & Lee, C.-G (2006) A novel double-layered photobioreactor for simultaneous Haematococcus pluvialis cell growth and astaxanthin accumulation Journal of Biotechnology, 125(4), 540–546 Tocquin, P., Fratamico, A., & Franck, F (2012) Screening for a low-cost Haematococcus pluvialis medium reveals an unexpected impact of a low N/P ratio on vegetative growth Journal of Applied Phycology, 24, 365–373 Wan, M., Zhang, J., Hou, D., Fan, J., Li, Y., Huang, J., & Wang, J (2014) The effect of temperature on cell growth and astaxanthin accumulation of Haematococcus pluvialis during a light-dark cyclic cultivation Bioresource Technology, 167, 276– 283 Wang, F., Gao, B., Wu, M., Huang, L., & Zhang, C (2019) A novel strategy for the hyper-production of astaxanthin from the newly isolated microalga Haematococcus pluvialis JNU35 Algal Research, 39, 101466 Yuan, J.-P., & Chen, F (1998) Chromatographic separation and purification of transastaxanthin from the extracts of Haematococcus pluvialis Journal of Agricultural and Food Chemistry, 46(8), 3371–3375 Zhang, C., Liu, J., & Zhang, L (2017) Cell cycles and proliferation patterns in Haematococcus pluvialis Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 35(5), 1205–1211 Zhang, W., Zhou, X., Zhang, Y., Cheng, P., Ma, R., Cheng, W., & Chu, H (2018) Enhancing Astaxanthin Accumulation in Haematococcus pluvialis by Coupled Light Intensity and Nitrogen Starvation in Column Photobioreactors Journal of Microbiology and Biotechnology, 28(12), 2019–2028 41