Nghiên cứu sự tăng trưởng, sự tích lũy sắc tố, hàm lượng phenolic tổng và hoạt tính chống oxy hóa của H. pluvialis nhằm xác định cường độ ánh sáng thích hợp cho giai đoạn nuôi tăng trưởng cũng như giai đoạn nuôi ức chế tích lũy astaxanthin và các chất chống oxy hóa.
TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH HO CHI MINH CITY UNIVERSITY OF EDUCATION JOURNAL OF SCIENCE Tập 18, Số (2021): 559-571 ISSN: 1859-3100 Vol 18, No (2021): 559-571 Website: http://journal.hcmue.edu.vn Bài báo nghiên cứu * CƯỜNG ĐỘ ÁNH SÁNG ẢNH HƯỞNG LÊN SỰ TĂNG TRƯỞNG, TÍCH LŨY SẮC TỐ, HỢP CHẤT PHENOLIC VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA CỦA VI TẢO HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS Võ Hồng Trung*, Nguyễn Thị Hồng Phúc, Nguyễn Trần Khương Bắc Trường Đại học Nguyễn Tất Thành, Việt Nam Tác giả liên hệ: Võ Hồng Trung – Email: vohongtrung2503@gmail.com Ngày nhận bài: 21-12-2020; ngày nhận sửa: 25-3-2021; ngày duyệt đăng: 30-3-2021 * TÓM TẮT Haematococcus pluvialis lồi vi tảo lục đơn bào có giá trị thương mại cao nhờ khả tích lũy lượng lớn astaxanthin tế bào Ánh sáng tác nhân ảnh hưởng lên tăng trưởng tích lũy sắc tố, hợp chất phenolic khả chống oxy hóa tế bào H pluvialis Trong nghiên cứu này, bốn cường độ ánh sáng từ 20 µmol photon.m-2.s-1 đến 100µmol photon.m-2.s-1 thực nhằm khảo sát tăng trưởng, tổng hợp sắc tố, hàm lượng carotenoid, phenolic khả chống oxy hóa vi tảo H.pluvialis môi trường OHM BG11 Kết cho thấy, cường độ ánh sáng thấp 20 đến 50 µmol photon.m-2.s-1 tế bào H pluvialis trì giai đoạn tăng trưởng sinh dưỡng mật độ tế bào cao Tuy nhiên, cường độ ánh sáng cao 70 đến 100 µmol photon.m-2.s-1 tế bào chuyển sang giai đoạn bào nang sớm hơn, tăng trưởng thấp, hàm lượng sắc tố, phenolic khả chống oxy hóa cao điều kiện cường độ ánh sáng thấp mơi trường OHM BG11 Từ khóa: khả chống oxy hóa; carotenoid; Haematococcus pluvialis; phenolic Giới thiệu Hiện nay, vi tảo nguồn tự nhiên tiềm hợp chất có hoạt tính sinh học (Plaza, Cifuentes, & Ibáđez, 2008) Các chất có hoạt tính sinh học khơng sử dụng làm chất phụ gia hay chất bảo quản tự nhiên mà làm chất bổ sung thực phẩm thành phần nhằm tăng cường sức khỏe người (RodriguezMeizoso et al., 2010) Vi tảo đơn bào nguồn thay đầy hứa hẹn chất chống oxy hóa Chất chống oxy hóa cho có số tác dụng tích cực sức khỏe, bao gồm ngăn ngừa rối loạn tim mạch, số bệnh liên quan đến lão hóa Alzheimer số loại ung thư (Goiris et al., 2012) Nhiều nghiên cứu cho thấy số chi vi tảo có chứa chất chống oxy hóa mạnh, gồm chất có chất ưa lipid ưa nước Một loại chất chống oxy hóa quan trọng biết nhiều từ vi tảo carotenoid Carotenoid đóng vai trị quan trọng việc khử gốc Cite this article as: Vo Hong Trung, Nguyen Thi Hong Phuc, & Nguyen Tran Khuong Bac (2021) Light intensity effect on the growth, pigment, phenolic compound accumulation, and antioxidant capacity of Haematococcus pluvialis microalgae Ho Chi Minh City University of Education Journal of Science, 18(3), 559-571 559 Tập 18, Số (2021): 559-571 Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM oxy phản ứng (ROS) tạo trình quang hợp, đặc biệt oxy singlet Một loại chất chống oxy hóa quan trọng hợp chất phenolic, cụ thể flavonoid phức tạp Các flavonoid ức chế q trình oxy hóa lipid cách loại bỏ trực tiếp gốc ● OH, HOCl, oxy singlet gốc peroxyl hóa lipid, cách chelat kim loại ức chế enzym lipoxygenase Hàm lượng chất phenolic sinh khối vi tảo tăng lên tiếp xúc với ánh sáng UV, cho thấy chúng thực đóng vai trị phản ứng chống oxy hóa đáp ứng với ức chế môi trường (Goiris et al., 2012) Haematococcus pluvialis loại vi tảo lục đơn bào, nước nghiên cứu nhiều khả tích lũy astaxanthin điều kiện bất lợi môi trường, carotenoid màu đỏ có hoạt tính chống oxy hóa mạnh (Yuan, & Chen, 1998) Hoạt tính chống oxy hóa ketocarotenoid astaxanthin (3,3’-dihydroxy-β, β’-carotene-4,4-dione) cao gấp 10 lần so với loại carotenoid khác β-carotene, zeaxanthin, lutein, canthaxanthin cao gấp 500 lần so với α-tocopherol (Suh, Joo, & Lee, 2006) Sự tổng hợp astaxanthin H pluvialis liên quan đến trình giảm ngừng sinh trưởng chuyển trạng thái tế bào từ dạng sinh dưỡng sang dạng bào nang (Tocquin, Fratamico, & Franck, 2012) Sự tích lũy astaxanthin cảm ứng điều kiện thiếu hụt nitơ, phosphor, dư thừa acetat, cường độ ánh sáng cao bổ sung tiền chất carotenoid khác (Harker, Tsavalos, & Young, 1996) Cường độ ánh sáng coi yếu tố môi trường quan trọng ảnh hưởng đến tích tụ astaxanthin H pluvialis (Makio Kobayashi, Kakizono, Nishio, & Nagai, 1992) Cường độ ánh sáng mạnh giúp gia tăng tích lũy astaxanthin, nhiên cường độ q mạnh kìm hãm tăng trưởng tế bào vi tảo (Trinh, Truong, Huynh, Nguyen, & Tran, 2017) Trong nuôi cấy vi tảo Haematococcus cần xác định điều kiện chiếu sáng tối ưu cho giai đoạn nuôi tăng trưởng giai đoạn nuôi ức chế để giúp tế bào tích lũy lượng lớn astaxanthin chất chống oxy hóa khoảng thời gian thích hợp Vì vậy, cường độ ánh sáng từ 20µmol photon/m2/s đến 100 µmol photon/m2/s sử dụng để nghiên cứu tăng trưởng, tích lũy sắc tố, hàm lượng phenolic tổng hoạt tính chống oxy hóa H pluvialis nhằm xác định cường độ ánh sáng thích hợp cho giai đoạn ni tăng trưởng giai đoạn ni ức chế tích lũy astaxanthin chất chống oxy hóa Vật liệu phương pháp 2.1 Chủng Haematococcus pluvialis điều kiện nuôi cấy Chủng vi tảo Haematococcus pluvialis (UTEX2505) nuôi cấy Phịng thí nghiệm Hóa sinh – Độc chất, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành H pluvialis nuôi cấy môi trường OHM (Fabregas, Otero, Maseda, & Dominguez, 2001), cường độ ánh sáng 20 µmol photon/m2/s, chu kì chiếu sáng tối 12:12 giờ, nhiệt độ nuôi cấy khoảng 25 oC ± oC 2.2 Các phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Quan sát hình thái tế bào Haematococcus pluvialis Hình thái tế bào Haematococcus pluvialis quan sát kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400X ngày nuôi cấy 560 Võ Hồng Trung tgk Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM 2.2.2 Xác định tăng trưởng tế bào Haematococcus pluvialis 100 µL mẫu tảo lấy cố định lugol Số lượng tế bào đếm kính hiển vi quang học (100X) với 10 µL dịch tảo Mật độ tế bào hai thời điểm khác trình tăng trưởng mẫu dùng để tính tốc độ tăng trưởng đặc hiệu (µ: tế bào/mL/ngày) khoảng thời gian theo cơng thức (Levasseur, Thompson, & Harrison, 1993): ln( 𝐶𝐶2 ) 𝐶𝐶1 µ = 𝑡𝑡2−𝑡𝑡1 đó, C1, C2: Mật độ tế bào thời điểm t1, t2: Thời điểm 2.2.3 Xác định hàm lượng sắc tố Lấy mL dịch nuôi cấy, li tâm 13.000 vòng phút, bỏ dịch lấy phần cắn tảo bên dưới, thêm 1mL HCl 4M vào hịa tan cắn sau đem đun cách thủy 70 oC phút Thêm mL ethanol: hexane (2:1 v/v), vortex cẩn thận Thêm vào mL n-hexane, vortex kĩ Hỗn hợp li tâm 3000 vịng phút Lớp sắc tố có hexane bên đọc bước sóng 450nm, 662nm, 645nm Hàm lượng carotenoid tổng xác định theo công thức: Carotenoid (µg/mL) = A450 x 25,2 (Prieto, Pedro Canavate, & Garcia-Gonzalez, 2011) Hàm lượng diệp lục tố a b xác định theo công thức (LICHTENTHALER & Wellburn, 1983): Diệp lục tố a (µg/mL) = 11,75 (A662) – 2,35 (A645) Diệp lục tố b (µg/mL) = 18,61 (A645) – 3,96 (A662) Diệp lục tố tổng (µg/mL) = diệp lục tố a + diệp lục tố b đó, A645: độ hấp thụ bước sóng 645nm A662: độ hấp thu bước sóng 662nm 2.2.4 Xác định hàm lượng phenolic tổng Lấy 1,0 mL dịch tảo li tâm 12.000 vòng 05 phút, loại bỏ dịch Thêm mL methanol tuyệt đối vào cắn, trộn Li tâm 10.000 vòng phút, bỏ cắn thu dịch chiết Lấy 0,5 mL dịch chiết cho vào eppendorf mL, cho thêm 0,5 mL thuốc thử Folin Ciocalteu’s phenol, tiếp tục cho từ từ 0,5 mL dung dịch Na2CO3 10% Ủ 90 phút tối Đo quang bước sóng 750 nm (Goiris et al., 2012) Đường chuẩn phenolic: Sử dụng nồng độ acid gallic chuẩn 10 đến 200 mg/L xác định nồng độ phenolic tổng mẫu Haematococcus pluvialis phương trình: y = 30,263x – 0,0638; R² = 0,9948 2.2.5 Xác định khả chống oxy hóa Pha thuốc thử DPPH: Dung dịch DPPH pha loãng cách hòa tan 0,004 g DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 100 mL methanol (Das et al., 2011) Lấy 1,0 mL dung dịch tảo li tâm 12.000 vòng phút, loại bỏ dịch Thêm mL ethanol tuyệt đối vào cắn, trộn ủ oC Li tâm 10.000 vòng phút, bỏ cắn lấy dịch chiết Lấy 0,5 mL dịch chiết cho vào eppendorf mL, cho thêm mL thuốc thử DPPH trộn Ủ 30 phút tối, nhiệt độ phòng Đo quang bước sóng 517nm Khả chống oxy hóa (I%) tính dựa khả khử gốc tự DPPH theo công thức sau (Yaltirak, Aslim, Ozturk, & Alli, 2009): 561 Tập 18, Số (2021): 559-571 Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM I% = (AĐối chứng – AMẫu)/AĐối chứng x 100 2.3 Phương pháp thiết kế thí nghiệm Vi tảo Haematococcus pluvialis ni cấy môi trường OHM (Fabregas et al., 2001) BG11 (Andersen, 2005) đạt pha tăng trưởng sau 10 ngày nuôi cấy sử dụng để bố trí thí nghiệm Haematococcus pluvialis nuôi cấy môi trường OHM BG11 với cường độ ánh sáng 20 (OHM-20 BG11-20), 50 (OHM-50 BG11-50), 70 (OHM-70 BG1170) 100 (OHM-100 BG11-100) µmol photon/m2/s Thí nghiệm thực với 200 mL dịch nuôi cấy (gồm môi trường dịch tảo), mật độ tế bào ban đầu khoảng 0,3.106 tế bào/mL, sục khí liên tục, chu kì sáng tối 12:12 giờ, nhiệt độ 25 oC ± oC Đánh giá tăng trưởng dựa mật độ tế bào, biến đổi hình thái sắc tố quang hợp, hàm lượng phenolic tổng khả chống oxy hóa H pluvialis sau ngày nuôi cấy 2.4 Xử lí số liệu Các thí nghiệm lặp lại lần Số liệu xử lí Microsoft office Excel phân tích oneway ANOVA phần mềm SPSS 20.0 với sai số ý nghĩa p ≤ 0,05 Tất số liệu thí nghiệm trình bày dạng: Trung bình (Mean) ± Sai số chuẩn (SE) Kết thảo luận 3.1 Sự tăng trưởng Haematococcus pluvialis Sự tăng trưởng vi tảo H pluvialis cường độ ánh sáng từ 20 µmol photon/m2/s đến 100 µmol photon/m2/s thể Hình 3.1 a,b Mật độ tế bào H pluvialis cường độ ánh sáng 50 µmol photon/m2/s ni cấy môi trường BG11 OHM đạt giá trị cao cường độ ánh sáng 20, 70 100 µmol photon/m2/s Trong đó, cường độ ánh sáng 50 µmol photon/m2/s môi trường BG11 đạt mật độ cao ngày thứ 18 (18,79.106 tế bào/mL) (p≤0,05) Tốc độ tăng trưởng đặc hiệu vi tảo H pluvialis cường độ ánh sáng thấp từ 20 µmol photon/m2/s đến 50 µmol photon/m2/s môi trường OHM BG11 khơng có khác biệt (p>0,05) cao so với cường độ ánh sáng cao từ 70 µmol photon/m2/s đến 100 µmol photon/m2/s (p≤0,05) (Hình 3.1 c, d) So sánh cường độ ánh sáng thử nghiệm, tăng trưởng tế bào vi bào H pluvialis cường độ ánh sáng 50 µmol photon/m2/s cao Như vậy, môi trường OHM BG11 cường độ ánh sáng thấp từ 20 µmol photon/m2/s đến 50 µmol photon/m2/s phù hợp cho tăng trưởng phát triển H pluvialis Theo Tran cộng (2009), Haematococcus lacustris nuôi cấy cường độ ánh sáng thấp 40 µmol/m2/s ngày đầu mật độ tế bào đạt cực đại 2,2×105 tế bào/mL sau đạt phase ổn định Sau chuyển sang phase ức chế ánh sáng cao 200 µmol/m2/s, tế bào bắt đầu tích lũy astaxanthin, tế bào từ màu xanh chuyển sang dạng bào nang có màu đỏ (Tran, Park, & Lee, 2009) Điều kiện nuôi cấy với cường độ ánh sáng 40,6 ± 3,05 µmol photon/m2/s, ánh sáng trắng với chu kì chiếu sáng 24:0 giúp tế bào Haematococcus pluvialis trì giai đoạn tăng trưởng sinh dưỡng, đạt mật độ tế bào cực đại (8,58 ± 0,452 x 105 tế bào/mL), tốc độ tăng trưởng đặc hiệu (0,365 ± 0,004 tế bào/mL/ngày) (Wong, 2016) 562 Võ Hồng Trung tgk Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM 20 (a) BG11-20 20 BG11-50 15 BG11-70 10 BG11100 Mật độ tế bào (x106/mL) Mật độ tế bào (x106/mL) 25 (b) 15 OHM-70 12 15 18 21 OHM-100 Ngày (c) Tốc độ tăng trưởng đặc hiệu (Tế bào/mL/ngày) Tốc độ tăng trưởng đặc hiệu (Tế bào/mL/ngày) 0.25 OHM-50 10 0 OHM-20 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 Cường độ ánh sáng, môi trường BG11 0.25 12 15 18 21 Ngày (d) 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 OHM-20 OHM-50 OHM-70 OHM-100 Cường độ ánh sáng, mơi trường OHM Hình 3.1 Mật độ tế bào tốc độ tăng trưởng vi tảo H pluvialis cường độ ánh sáng môi trường BG11 (a,c) OHM (b,d) 3.2 Hàm lượng sắc tố 3.2.1 Hàm lượng diệp lục tố Hàm lượng diệp lục tố tổng vi tảo H pluvialis nuôi cấy môi trường OHM BG11 cường độ ánh sáng từ 20 µmol photon/m2/s đến 100 µmol photon/m2/s tăng dần q trình ni cấy Trong đó, hàm lượng diệp lục tố tổng H pluvialis môi trường BG11 cao so với môi trường OHM (p≤0,05) (Hình 3.3.) Sự gia tăng hàm lượng hàm lượng diệp lục tố tế bào dường phụ thuộc nhiều vào điều kiện thí nghiệm mối quan hệ mật độ tế bào cường độ ánh sáng mà khơng phụ thuộc vào hình thành astaxanthin (Fan et al., 1995) Nghiên cứu Chen Liang (2009), phân tích mối tương quan cho thấy có mối tương quan thuận hàm lượng diệp lục tố mật độ tế bào toàn thời gian thí nghiệm Trong hàm lượng diệp lục tố mật độ tế bào cho thấy có mối tương quan với cường độ ánh sáng (CHEN & LIANG, 2009) Hàm lượng diệp lục tố H pluvialis phụ thuộc vào yếu tố đa lượng môi trường đặc biệt nitơ phosphor, môi trường BG11 với dồi yếu tố đa lượng giúp tế bào tăng tổng hợp sắc tố quang hợp (diệp lục tố caroten sơ cấp) dẫn đến tế bào trì giai đoạn sinh dưỡng (tế bào xanh, Hình 3.2.) mật độ tế bào cao 563 Tập 18, Số (2021): 559-571 Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM Ngày 12 15 18 21 BG11-20 BG11-50 BG11-70 BG11-100 OHM-20 OHM-50 OHM-70 OHM-100 Hình 3.2 Sự thay đổi hình thái tế bào vi tảo H pluvialis qua ngày nuôi cấy cường độ ánh sáng 20 đến 100 µmol photon/m2/s môi trường BG11 OHM 10 (a) 12 BG11-20 15 18 21 Ngày Hàm lượng diệp lục tố tổng (µg/ml) Hàm lượng diệp lục tố tổng (µg/ml) 12 (b) BG11-50 OHM-20 564 12 OHM-50 15 18 OHM-70 21 Ngày OHM-100 Võ Hồng Trung tgk 200 (c) 150 100 50 BG11-20 12 BG11-50 15 18 BG11-70 21 Ngày Hàm lượng diệp lục tố tổng (pg/tb) Hàm lượng diệp lục tố tổng (pg/tb) Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM BG11-100 80 (d) 60 40 20 OHM-20 12 OHM-50 15 OHM-70 18 21 Ngày OHM-100 Hình 3.3 Hàm lượng diệp lục tố tổng đơn vị thể tích đơn vị tế bào vi tảo H pluvialis cường độ ánh sáng môi trường BG11 (a, c) OHM (b, d) 3.2.2 Hàm lượng carotenoid H pluvialis Hàm lượng carotenoid vi tảo H pluvialis nuôi cấy cường độ ánh sáng từ 20 µmol photon/m2/s đến 100 µmol photon/m2/s thể Hình 3.4 Mơi trường OHM, hàm lượng carotenoid (µg/mL) cường độ ánh sáng 50 µmol photon/m2/s cao so với điều kiện ánh sáng lại mật độ tế bào cường độ ánh sáng cao (p≤0,05) (Hình 3.4 a, b) Tuy nhiên, hàm lượng carotenoid (pg/tb) H pluvialis nuôi cấy môi trường OHM cường độ ánh sáng cao 70 µmol photon/m2/s đến 100 µmol photon/m2/s đạt giá trị cao (p≤0,05) (Hình 3.4 c, d) Ở mơi trường BG11, hàm lượng carotenoid H pluvialis đạt giá trị cao cường độ ánh sáng 100 µmol photon/m2/s (p≤0,05) (Hình 3.4 a, c) Cường độ ánh sáng cao gây tổng hợp tích lũy hàm lượng lớn astaxanthin H pluvialis Hàm lượng astaxanthin tương quan tỉ lệ với lượng ánh sáng (cường độ ánh sáng × thời gian chiếu sáng thực) Những thay đổi màu sắc, hình dạng kích thước tế bào H pluvialis phản ánh thích nghi sinh vật với môi trường bất lợi Sự gia tăng hàm lượng astaxanthin bào nang H pluvialis có liên quan chặt chẽ với tăng kích thước nang hai bị ảnh hưởng cường độ ánh sáng Khi tiếp xúc với stress quang oxy hóa, tế bào H pluvialis bắt đầu tổng hợp tích lũy astaxanthin để tự bảo vệ khỏi tổn thương quang oxy hóa Trong q trình tích lũy astaxanthin, gia tăng hàm lượng lipid carbohydrate (Li et al., 2019) Nghiên cứu cho thấy tăng cường độ ánh sáng dẫn đến tăng tổng hợp astaxanthin Hơn nữa, giới hạn hàm lượng nitrat cường độ chiếu sáng cao làm tăng tổng hợp carotenoid Ngoài thiếu nitrat chiếu sáng cao, việc khơng có sục khí tăng khả sản xuất suất astaxanthin (Dominguez-Bocanegra, PonceNoyola, & Torres-Munoz, 2007) Như vậy, H pluvialis tăng tích lũy carotenoid đặc biệt astaxanthin: tế bào chuyển sang bào nang có màu đỏ (Hình 3.2.) ni cấy cường độ ánh sáng cao 70 đến 100 µmol photon/m2/s 565 Tập 18, Số (2021): 559-571 Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM 15 (a) Hàm lượng carotenoid (µg/ml) Hàm lượng carotenoid (µg/ml) 20 15 10 BG11-20 12 BG11-50 15 18 BG11-70 (b) 10 21 Ngày OHM-20 BG11-100 250 OHM-50 200 Hàm lượng carotenoid (pg/tb) Hàm lượng carotenoid (pg/tb) 150 100 50 BG11-20 12 BG11-50 15 18 BG11-70 18 OHM-70 21 Ngày OHM-100 150 100 50 21 Ngày OHM-20 BG11-100 15 (d) (c) 200 12 12 OHM-50 15 18 OHM-70 21 Ngày OHM-100 Hình 3.4 Hàm lượng carotenoid đơn vị thể tích đơn vị tế bào vi tảo H pluvialis cường độ ánh sáng môi trường BG11 (a,c) OHM (b,d) 3.3 Hàm lượng phenolic tổng H pluvialis Hàm lượng phenolic H pluvialis nuôi cấy môi trường BG11 OHM cường độ ánh sáng từ 20 µmol photon/m2/s đến 100 µmol photon/m2/s tăng dần q trình ni cấy Ở môi trường BG11 OHM, cường độ ánh sáng 70 µmol photon/m2/s 100 µmol photon/m2/s đạt hàm lượng phenolic (µg/mL) cao so với cường độ ánh sáng thấp (p