Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học từ quả thể nấm đa niên lỗ đen (nigrofomes melanoporus (mont ) murrill) và nấm vân chi (trametes cubensis (mont ) sacc ) ở vùng bắc trung bộ

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH NGUYỄN THỊ NGẦN NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ QUẢ THỂ NẤM ĐA NIÊN LỖ ĐEN (Nigrofomes melanoporus (Mont.) Murrll) VÀ NẤM VÂN CHI (Tramites cubensis (Mont.) Sacc.) Ở VÙNG BẮC TRUNG BỘ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Tai Lieu Chat Luong CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỮU CƠ MÃ SỐ: 62 44 01 14 Nghệ An-2015 Công trin ̀ h đƣơ ̣c hoàn thành ta ̣i: Trƣờng Đa ̣i ho ̣c Vinh, Đại học Quốc gia Cheng Kung, Đài Loan Ngƣời hƣớng dẫn khoa ho ̣c: PGS TS Trầ n Đin ̀ h Thắ ng GS TS Tian Shung-Wu Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luâ ̣n án đƣơ ̣c bảo vê ̣ ta ̣i Hô ̣i đồ ng đánh giá luâ ̣n án cấ p Trƣờng vào hồi giờ phút, ngày tháng họp tại: năm 20 Có thể tìm hiểu luận án thƣ viện: Thƣ viê ̣n Quố c gia Viê ̣t Nam Trung tâm Thông tin & Thƣ viê ̣n Nguyễn Thúc Hào – Trƣờng Đa ̣i học Vinh MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Việt Nam nằm khu vực nhiệt đới gió mùa, thời tiết thuận lợi nên quốc gia có đa dạng sinh học cao so với các quốc gia khác giới với khoảng 12000 loài thực vật bậc cao 3000 loài động vật có xƣơng sống đƣợc mơ tả Số lồi nấm lãnh thổ Việt Nam ƣớc lƣợng gấp lần số loài thực vật bậc cao, khoảng 80.000 loài đó có 2500 loài nấm đƣợc định danh, nấm lớn chiếm 1400 loài thuộc 120 chi Nấm đảm (Basidiomycota) chiếm ƣu với 90% tổng số loài, nấm nang (Ascomycota) chiếm 8%; nấm nhầy (Myxomycota) chiếm 1,5%; nấm nội cộng sinh (Glomeromycota) chiếm khoảng 0,5% đƣợc ghi nhận Nấm dƣợc liệu Việt Nam có khoảng 700 loài đó có nhiều các loài dƣợc liệu quý nhƣ Linh chi (Ganoderma), nấm Vân chi (Trametes), đông trùng hạ thảo (Cordycep)… Ngày nay, với phát triển khoa học kỹ thuật cho thấy nấm lớn nguồn tài nguyên vô tận ẩn chứa các hợp chất có tác dụng dƣợc liệu (polysaccarit, polysaccarit-protein ) dùng để điều trị bệnh Ở Việt Nam có 651 loài thuộc 182 chi có chứa các hợp chất polysaccarit có tác dụng dƣợc liệu, chúng hầu hết các glucan với nhiều kiểu liên kết glucosit khác nhau, hợp chất có khả chống ung thƣ, diệt virut HIV hay hỗ trợ cho hệ miễn dịch thể ngƣời Ngoài hợp chất có khối lƣợng lớn, hợp chất chuyển hoá thứ cấp có khối lƣợng nhỏ nhƣ triterpenoit, flavonoit,…đƣợc phân lập từ nấm lớn, nhiều hợp chất đƣợc ghi nhận có khả kháng ung thƣ, kháng khối u, kháng virut hay kháng khuẩn, kháng nấm Nấm dƣợc liệu Việt Nam phong phú, nhiều loài thuốc quý y học cổ truyền, nguồn tài nguyên vô quý giá cho khoa học thực tiễn nhƣng chƣa đƣợc các nhà khoa học nghiên cứu nhiều, chủ yếu nghiên cứu đa dạng sinh học Hợp chất thiên nhiên tiếp tục đóng vai trò quan trọng chƣơng trình tìm kiếm thuốc ngành công nghiệp dƣợc ngành nghiên cứu khác Một lý quan trọng việc sử dụng các sản phẩm thiên nhiên nhƣ nguồn các hợp chất dẫn đƣờng phong phú đa dạng cấu trúc các hợp chất đƣợc phân lập từ thiên nhiên Hơn nũa, các hợp chất có hoạt tính sinh học đƣợc tìm thấy từ thiên nhiên có thể dùng trực tiếp y học, nhiều hợp chất khác đƣợc dùng nhƣ chất dẫn đƣờng phân tử hiên đại (mẫu) lĩnh vực tổng hợp bán tổng hợp thuốc Ngày nay, các hợp chất thiên nhiên dẫn xuất chúng chiếm 50% lƣợng thuốc điều trị lâm sàng Trong đó các hợp chất thiên nhiên có nguồn gốc từ thực vật bậc cao chiếm 25% Theo các nghiên cứu gần Tổ chức Y tế giới (WHO) khoảng 80% dân số giới lựa chọn các thuốc y học cổ truyền nhằm chăm sóc sức khoẻ Chúng nhận thấy việc nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học các lồi nấm dƣợc liệu cần thiết, giúp cho hiểu giá trị dƣợc học nhƣ kinh tế tầm quan trọng nguồn nấm dƣợc liệu nƣớc ta Chính vì vậy mà chúng tơi chọn đề tài “Nghiên cứu hợp chất có hoạt tính sinh học từ thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus (Mont.) Murrill) nấm vân chi (Trametes cubensis (Mont.) Sacc.) vùng Bắc Trung Bộ” nhằm nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên cách sử dụng các kỹ thuật hiện đại nhằm phân tích, phân lập xác định cấu trúc hiện đại Đờng thời, thử nghiệm hoạt tính sinh học gây độc tế bào ung thƣ hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm các hợp chất Đối tƣợng nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu luận án thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus (Mont.) Murrill) thể nấm vân chi (Trametes cubensis (Mont.) Sacc.) đƣợc thu hái vùng Bắc Trung Bộ, Việt Nam Nhiệm vụ nghiên cứu - Chiết hỗn hợp các chất từ thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) thể nấm vân chi (Trametes cubensis); - Sử dụng các phƣơng pháp sắc ký để phân lập các hợp chất từ dịch chiết hai loại nấm trên; - Xác định cấu trúc hợp chất phân lập đƣợc; - Thử hoạt tính sinh học số hợp chất phân lập đƣợc Phƣơng pháp nghiên cứu - Phƣơng pháp lấy mẫu: mẫu sau lấy đƣợc rửa sạch, sấy khô 40 C Việc xử lý tiếp các mẫu phƣơng pháp chiết chọn lọc với các dung mơi thích hợp để thu đƣợc hỗn hợp các hợp chất dùng cho nghiên cứu đƣợc nêu phần thực nghiệm - Phƣơng pháp phân tích, tách các hỗn hợp phân lập các chất: sử dụng các phƣơng pháp sắc ký cột thƣờng (CC), sắc ký lớp mỏng phân tích điều chế, sắc ký cột nhanh (FC) với các pha tĩnh khác nhƣ silica gel, sephadex LH-20, RP18, sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) phân tích điều chế các pha đảo, pha silica gel - Phƣơng pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất: cấu trúc hoá học các hợp chất đƣợc phân lập đƣợc xác định các phƣơng pháp vật lý hiện đại nhƣ phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lƣợng va chạm electron (EIMS), phổ khối lƣợng phun mù electron (ESI-MS), phổ khối lƣợng phân giải cao (HR-MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân chiều (1D-NMR) hai chiều (2D-NMR) với các kỹ thuật khác nhƣ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, 1H-1H COSY, HSQC HMBC - Cấu trúc lập thể tƣơng đối các hợp chất đƣợc xác định các phƣơng pháp phổ NMR với các kỹ thuật NOE, NOESY phƣơng pháp nhiễu xạ tia X (X-Ray) - Thăm dò các hoạt tính sinh học gây độc tế bào ung thƣ hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm Những đóng góp luận án Đây cơng trình nghiên cứu thành phần hoá học hoạt tính sinh học số chất phân lập đƣợc từ thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) thể nấm vân chi (Trametes cubensis) lần Việt Nam * Từ dịch chiết thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) phân lập xác định cấu trúc 11 hợp chất: - 04 hợp chất secquiterpenoit: nigrofomin A, nigrofomin B, madolin A dehydrovomifoliol Nigrofomin A nigrofomin B hợp chất mới; - 02 hợp chất steroit: ergosterol ergosterol peroxit; - 03 hợp chất phenolic: trans-p-hydroxycoumaric, metyl ferulat (2hydroxy-phenyl) axetat; - 01 hợp chất lacton: γ-(4-metyphenyl)-γ-metyl-γ-butyrolacton; - 01 hợp chất axit benzoic; Các hợp chất lần đƣợc phân lập từ loài nấm * Xác định đƣợc các thông số cấu trúc tinh thể hợp chất nigrofomin A Các số liệu tinh thể học hợp chất hiện đƣợc lƣu trữ Trung tâm liệu Cambridge * Hai hợp chất nigrofomin A nigrofomin B có khả gây độc các dịng tế bào bệnh bạch cầu cấp tính (Jurkat), ung thƣ biểu bì vòm họng ngƣời (NPC-TW01), ung thƣ phổi (NCI-H661) * Từ dịch chiết thể nấm vân chi (Trametes cubensis) phân lập đƣợc hợp chất: - 04 hợp chất triterpenoit: tramecubin A, tramecubin B, axit eburicoic, 3β-hydroxylanosta-8,24-dien-21-oic Tramecubin A tramecubin B hợp chất mới; - 02 hợp chất steroit: ergosterol, ergosterol peroxit; - 02 hợp chất coumarin: oospolacton oospoglycol; Các hợp chất lần đƣợc phân lập từ loài nấm * Hợp chất tramecubin A tramecubin B tiến hành thử hoạt tính khả gây độc tế bào ung thƣ gan (Hep-G2), ung thƣ phổi (Lu), ung thƣ biểu mơ liên kết (RD); hoạt tính kháng khuẩn với các chủng vi khuẩn Gr (-) (ATCC 25922), vi khuẩn Gr (+) (ATCC 25923); hoạt tính kháng nấm với chủng nấm sợi (439, M42), nấm men (ATCC 7754, SH 20) với các kết âm tính Kết thử sơ hoạt tính gây độc tế bào các hợp chất phân lập gợi mở khả ứng dụng nguồn nguyên liệu cho thực phẩm chức Cấu trúc luận án Luận án bao gồm 131 trang với 21 bảng số liệu, 39 hình sơ đồ với 127 tài liệu tham khảo Kết cấu luận án gồm: mở đầu (4 trang), tổng quan (25 trang), phƣơng pháp thực nghiệm (25 trang), kết thảo luận (61 trang), kết luận (2 trang), danh mục công trình công bố (1 trang), tài liệu tham khảo (13 trang) Ngồi cịn có phần phụ lục gồm 110 phổ số hợp chất chọn lọc Chƣơng 1: TỔNG QUAN Luận án tiến hành tổng quan tài liệu các nội dung: Những hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm lớn - Giới thiệu nấm lớn - Những hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm lớn: kháng khuẩn kháng nấm; khả kháng virut; gây độc tế bào, chống ung thƣ tăng cƣờng hệ thống miễn dịch hoạt tính khác Nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) - Đặc điểm phân bố - Thành phần hoá học hoạt tính các chất đƣợc phân lập Nấm vân chi (Trametes cubensis) - Đặc điểm phân bố - Thành phần hoá học hoạt tính sinh học Chƣơng 2: PHƢƠNG PHÁP VÀ THƢ̣C NGHIỆM 2.1 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.1.1 Phƣơng pháp lấy mẫu: Mẫu nấm đƣợc thu hái vào thời điểm thích hợp năm Mẫu tƣơi sau lấy đƣợc rửa sạch, để nơi thoáng mát sấy khô 40-600C Bảo quản điều kiện thích hợp dùng để thí nghiệm 2.1.2 Phƣơng pháp chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc chất phân lập đƣợc: Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân tích điều chế; sắc ký cột thƣờng (CC); sắc ký cột nhanh (FC); sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) phân tích điều chế; các phƣơng pháp kết tinh 2.1.3 Phƣơng pháp khảo sát cấu trúc hợp chất: Phổ tử ngoại (UV); phổ hồng ngoại (IR); phổ khối lƣợng (EI-MS), (ESIMS), (HR-ESI-MS); phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR; phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NMR; phổ cộng hƣởng từ hạt nhân DEPT, HMBC, HSQC; cấu trúc lập thể tƣơng các hợp chất đƣợc xác định các phƣơng pháp phổ NMR với các kỹ thuật NOE, NOESY phƣơng pháp nhiễu xạ tia X (X-Ray) 2.1.4 Phuơng pháp thử hoạt tính sinh học Quá trình thử hoạt tính Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp Skehan, Likhitwitayawuid, Vander, Vlietlinck, McKane; quá trình tiến hành Đại học Y Trung Quốc, Đài Loan đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp Hansen 2.2 Hóa chất thiết bị 2.2.1 Hố chất: Các dung mơi để ngâm chiết mẫu nấm dùng loại tinh khiết (pure), dùng cho các loại sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột nhanh sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA) 2.2.2 Thiết bị: sắc ký lớp mỏng (TLC); sắc ký cột (CC); sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC); phổ tử ngoại (UV); phổ hồng ngoại (FT-IR); phổ khối lƣợng (MS); phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR); phổ X-ray; điểm nóng chảy; độ quay cực riêng 2.3 Nghiên cứu hợp chất từ thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) 2.3.1 Mẫu nấm Quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) đƣợc thu hái Vƣờn Quốc gia Pù Mát, Nghệ An vào tháng 11/2009 Mẫu đƣợc định danh PGS TS Ngô Anh (khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Huế) Tiêu (ký hiệu Vinh- TSWu 200901) đƣợc lƣu khoa Hóa học, Trƣờng Đại học Vinh 2.3.2 Phân lập hợp chất Quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) (1350 g) thu hái Vƣờn Quốc gia Pù Mát đƣợc rửa sạch, phơi khô điều kiện thƣờng, xay nhỏ cho vào chiết lần với hệ dung môi cloroform: metanol (CHCl3:MeOH = 1:1) nhiệt độ thƣờng Dịch chiết sau cất quay chân không thu đƣợc cao chiết NDM (78,0 g) Sơ đồ 2.1 Sơ đồ phân lập các hợp chất (NDM) -1, -2, -3, -4, -8 -9 Sơ đồ 2.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất (NDM) -7, -8, -9, -10, -11 2.3.3 Thử hoạt tính gây độc tế bào hợp chất NDM-1, NDM-2 Tác dụng gây độc tế bào đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp MTT (Micoroculture Tetrazolium Assay) Hansen Hoạt tính gây độc tế bào đƣợc thử nghiệm cho hai hợp chất nigrofomin A (NDM-1) nigrofomin B (NDM2) phân lập từ nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) với dòng tế bào bệnh bạch cầu (Jurkat), ung thƣ phổi (NCI H226) ung thƣ biểu mơ vịm họng ngƣời (NPC-TW01) 2.4 Nghiên cứu hợp chất từ thể nấm vân chi (Trametes cubensis) 2.4.1 Mẫu nấm Quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis) đƣợc thu hái vào tháng 08/2012 huyện Kỳ Sơn, tỉnh Nghệ An Mẫu đƣợc định danh PGS TS Ngô Anh (khoa Sinh, Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Huế) Tiêu (ký hiệu Vinh- TSWu 201208) đƣợc lƣu giữ khoa Hoá học, Trƣờng Đại học Vinh 2.4.2 Phân lập chất Quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis) (6,4 kg) đƣợc thu hái, rửa sạch, sấy khô nhiệt độ 40-50oC 48 giờ, toàn mẫu nấm vân chi đƣợc ngâm chiết dung môi metanol 14 ngày Dịch lọc thu đƣợc sau ngâm chiết đƣợc cất thu hồi dung môi thu đƣợc cao tổng metanol (580 g) Quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis) 1.Chiết với dung môi MeOH Cất giảm áp loại dung môi Cao MeOH (580 g) Phân bố H2O 2.Chiết lần lƣợt với hexan, EtOAc Cất giảm áp loại dung môi Cao DQH (80 g) Cao DQE (380 g) Sơ đồ 2.3 Sơ đồ chiết thể nấm vân chi (Trametes cubensis) Sơ đồ 2.4: Sơ đồ phân lập các hợp chất DQE-2, DQE-6, DQE-7, DQE-8 Sơ đồ 2.5 Sơ đồ phân lập các hợp chất DQE-3, DQE-4, DQE-5 12 Dƣ̃ liêụ tinh thể Hê ̣ tinh thể : Orthorhombic Nhóm điểm không gian : P 21 21 21 a = 6.9722(2) Å b = 10.8015(3) Å c = 17.9302(4) Å  = 90o β = 90o  = 90o V = 1350.33(6) Å3 Ghi nhâ ̣n dƣ̃ liêụ Máy nhiễu xạ Bruker APEX DUO Nguồ n bƣ́c xa :̣ fine-focus sealed tube Phản xạ dùng 5000 Phản xạ tự 2584 Máy đơn sắc: graphite Dạng hiệu chỉnh hấp thụ : multi-scan T = 100 K Dc = 1,448 mg/m3 Z=4 T = 100 (2) K F000 = 624 Dạng xạ CuK\a λ = 1,54178 Å θ = 4,78 – 71,63o  = 0,943 mm-1 Kích thƣớc tinh thể: 0,68 x 0,34 x 0,14 mm3 Rint = 0,0218 R1 = 0,0384 với I > 2 (I) θmax = 71,63o θmin = 4,78o h = -8  k = -12  13 l = -21  20 Hình 3.10: Cấu trúc X-ray hợp chất NDM-1 Kết hợp liệu các loại phổ ESI-MS, HR-ESI-MS, 1H-NMR, 13CNMR, DEPT, COSY, NOESY, HSQC, HMBC, NOESY X-ray xác định đƣợc cấu trúc lập thể NDM-1 chất đặt tên nigrofomin A H O O O 15 12 10 14 O H3C 11 OH OH CH3 13 Nigrofomin A (NDM-1) 13 3.1.3.2 Hợp chất NDM-2 Chất NDM-2 chất dạng tinh thể không màu, nhiệt độ nóng chảy 2080 210 C, [α]D25 -94,0° (c = 0,1, MeOH) Phổ ESI-MS (positive) hợp chất NDM-2 xuất hiện pic m/z 301 [M+Na]+ Phổ khối lƣợng phân giải cao HR-ESI-MS NDM-2 cho tín hiệu m/z 301,1053 [M+Na]+ , theo tính toán tƣơng ứng với công thức C15H18O5Na m/z 301,1052, khẳng định công thức phân tử NDM-2 C15H18O5 Phổ 13C-NMR DEPT hợp chất NDM-2 tƣơng đồng với chất NDM1 cho thấy tín hiệu 15 nguyên tử cacbon bao gồm cacbon nhóm xeton (δ C 210,7 ppm); cacbon nhóm cacbonyl vòng lacton (δ C 175,0 ppm); cacbon olefin (C=C) δC 129,8 ppm 135,6 ppm; nhóm metylen (CH2) (δC 73,0; 56,7; 43,0 26,0 ppm); nhóm metyl (CH3) liên kết với cacbon bậc (δC 32,3 ppm 23,6 ppm) Sự khác NDM-1 NDM-2 phân tử NDM-2 có cacbon bậc (δC 80,8; 49,0; 39,5 ppm), đó có cacbon liên kết với nhóm hydroxyl (OH) (δC 80,8 ppm) ; nhóm metin (δC 107,8 ppm 42,0 ppm) So sánh liệu phổ với tài liệu hợp chất NDM-1 cho thấy hợp chất NDM-2 hợp chất secquiterpen có kiểu khung drimane với phần dioxabixiclooctan (Hình 3.16) Phổ 1H-NMR chất NDM-2 chứng minh các có mặt các proton phân tử NDM-2 giống nhƣ các proton phân tử NDM-1 Trên phổ 1H-NMR, có tín hiệu singlet proton nhóm metyl (CH3) δH 1,21 ppm 1,19 ppm proton vị trí C-13 C-14 (HSQC); tín hiệu singlet proton olefin phân tử δH 6,14 ppm; tín hiệu doublet proton trƣờng cao δH 4,79 ppm (J=10.8 Hz) δH 4,47 ppm (J=10,5 Hz) thuộc proton liên kết với C-12 Phổ HMBC H-5/C-3 (δC 56,7 ppm), C-9 (δC 80,8 ppm), C-15 (δC 175,0 ppm) cho thấy nhóm hydroxyl (OH) khơng liên kết với cacbon vị trí C-5 hợp chất So sánh với khối lƣợng phân tử, theo phổ HR-ESIMS với tín hiệu pic ion phân tử 301,1053 thì phân tử NDM-1 nhiều phân tử NDM-2 nguyên tử oxi công thức phân tử NDM-2 C15H18O5 Tín hiệu tƣơng tác xa các proton phổ NOESY (hình 3.16) hợp chất NDM-2: H-11(δH 5,67 ppm) /H-3α (δH 2,20 ppm), H-12α; H-5 (δH 3,19 ppm)/H-3α; H-3β (δH 2,57 ppm)/H-14 (δH 1,19 ppm); H-3α /H-13 (δH 1,21 ppm); H-3α (δH 2,20 ppm), H-6α (δH 2,48 ppm)/H-13 Chính vì vậy mà 14 cấu trúc không gian hợp chất NDM-2 tƣơng tự với cấu trúc hợp chất NDM-1 Bảng 3.3: Bảng số liệu phổ NMR hợp chất NDM-2 STT DEPT δC (ppm) δH (ppm) 2,27 (1H, d, J= 2,0 Hz, H-1) CH2 43,0 2,19 (1H, d, J=13,2 Hz, H-1β) C=O 210,7 2,57 (1H, d, J=12,8 Hz; H-3β) CH2 56,7 2,20 (1H, dd, J=12,8; 2,0 Hz, H-3α) C 39,5 CH 42,0 3,19 (1H, d, J=10,8 Hz) 2,49 (1H, d, J=12,0 Hz, H-6α) CH2 26,0 2,30 (1H, d, J= 12,3 Hz, H-6β) CH 129,8 6,02 (1H, br s) C 135,6 C 80,8 10 C 49,0 11 CH 107,8 5,62 (1H, s) 4,79 (1H, d, J=10,4 Hz, H-12α) 12 CH2 73,0 4,50 (1H, d, J=10,4 Hz, H-12β) 13 CH3 23,6 1,21 (3H, s) 14 CH3 30,8 1,15 (3H, s) 15 C=O 175,0 H (Đo 400 MHz CD3OD), C (Đo 100 MHz CD3OD) Kết hợp tín hiệu các loại phổ 1H-NMR, 13C-NMR, ESI-MS, HR-ESIMS, COSY, HSQC, HMBC, NOESY X-ray ta xác định đƣợc cấu trúc chất NDM-2, chất đƣợc đặt tên nigrofomin B H O O O 11 10 HO 14 12 H 3C O 15 H CH 13 Nigrofomin B (NDM-2) 3.1.4 Hoạt tính sinh học hợp chất nigrofomin A nigrofomin B Kết cụ thể quá trình thử hoạt tính gây độc tế bào chất với các dòng tế bào bệnh bạch cầu (Jurkat), ung thƣ phổi (NCI H226) ung 15 thƣ biểu mơ vịm họng ngƣời (NPC-TW01) đƣợc tiến hành Trƣờng Đại học Y Trung Quốc, Đài Loan thể hiện qua bảng 3.12 Bảng 3.12: Kết thử hoạt tính gây độc tế bào hợp chất nigrofomin A nigrofomin B STT Ký hiệu Tên chất Dòng tế bào (IC50 μM) mẫu Jurkat NPC-TW01 NCI-H226 NDM-1 nigrofomin A 124,91±6,22 237,53±28,50 158,52±11,54 NDM-2 nigrofomin B 99,44±5,20 246,32±20,57 188,46±14,04 1,25±0,55 0,1±0,0 10,25±2,30 Methot rexate Từ kết bảng 3.12 cho thấy, hợp chất nigrofomin A, nigrofomin B có hoạt tính với hai dịng tế bào bệnh bạch cầu (Jurkat) ung thƣ biểu mơ vịm họng (NCI-H226) với các giá trị IC50 tƣơng ứng: 124,91±6,22; 158,52±11,54; 99,44±5,20; 188,46±14,04 Khả gây độc với dòng tế bào Jurkat, hợp chất nigrofomin B mạnh hợp chất nigrofomin A Đối với dòng NCI-H226, khả gây độc nigrofomin A lại mạnh 3.2.2 Phân lập hợp chất từ thể nấm vân chi Từ dịch chiết etylaxetat thể nấm vân chi cách kết hợp các phƣơng pháp chiết, sắc ký mỏng, sắc ký cột silica gel, sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) với các hệ dung môi rửa giải phù hợp với phân đoạn Kết quá trình phân lập thể hiện bảng 3.13 Bảng 3.13: Các hợp chất phân lập từ thể nấm vân chi S Ký Tên hợp chất Công Khối T hiệu thức lƣợng T phân tử hợp chất (mg) DQE-1 Tramecubin A C30H46O6 1230 DQE-2 Tramecubin B C32H50O5 22 DQE-3 Oospolacton C11H10O3 DQE-4 Ergosterol C24H44O 20 DQE-5 Ergosterol peroxit C24H44O3 34 DQE-6 Oospoglycol C11H10O5 57 DQE-7 Axit eburicoic C31H50O3 8 DQE-8 Axit 3β-hydroxylanosta-8,24-dien-21-oic C30H48O3 10 3.2.3 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập 3.2.3.1 Hợp chất DQE-1 (Chất mới) 16 Hợp chất DQE-1 thu đƣợc dƣới dạng chất rắn không màu Trên phổ HRESI-MS (negative) (Hình 3.20) hợp chất DQE-1 xuất hiện pic m/z 501 [M-H]+ phù hợp với công thức C30H46O6 Phổ khối lƣợng phân giải cao HR-ESI-MS (positive) cho pic ion giả phân tử với giá trị m/z 525,3197 [M + Na]+ cho biết công thức phân tử tƣơng ứng C32H50O5Na, từ đó khẳng định công thức phân tử DQE-2 C32H50O5 Phổ 13C-NMR, DEPT khẳng định có mặt 30 cacbon phân tử DQE-1 đó có hai tín hiệu cacbon nhóm cacbonyl (C=O) axit (COOH) C 178,4 ppm 170,3 ppm; tín hiệu cacbon hai liên kết đơi C=C C 141,5, 134,7, 133,2 127,9 ppm đó có nhóm metin (CH) 141,5 ppm (theo phổ DEPT); tín hiệu cacbon nhóm metin (CH) liên kết với nhóm hydroxyl (OH) C 78,2 ppm 72,5 ppm Theo phổ DEPT, cacbon lại có nhóm metyl (CH3), nhóm metilen (CH2) nhóm metin (CH) Từ các tín hiệu cacbon phổ 13C-NMR DEPT kết hợp so sánh với các tín hiệu cacbon chất DQE-7 DQE-8 phổ 13C-NMR, DEPT hai chất này, có sai lệch chút độ dịch chuyển cacbon DQE-1 với cacbon chất DQE-7, DQE-8 chúng đƣợc đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân các dung môi khác (DQE-7, DQE-8 dùng pyridine, DQE-1 dùng hệ CHCl3:CH3OH-1:3), kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo [13] ta có thể cho chất DQE-1 lanostan có 30 nguyên tử cacbon với hệ thống vịng có liên kết đơi Phổ 1H-NMR xác nhận có mặt nhóm metin (CH) liên kết đôi H 6,55 ppm (H-24) với tín hiệu triplet J= 7,2 Hz tƣơng tác proton vị trí 23; tín hiệu tri doublet nhóm metin (CH) liên kết với nhóm hydroxyl (OH) xuất hiện H 2,99 ppm với J=5,6; 4,4 Hz, so sánh với tài liệu H-3 (nhóm hydroxyl liên kết với C-3) xuất hiện H 3,99 ppp; ngồi cịn xuất hiện tín hiệu singlet nhóm metyl (CH3) H 1,62, 0,80, 0,75, 0,62 ppm tƣơng ứng với proton các vị trí H-26, H-29, H-19, H-18, H-28, H-30 Vị trí các nhóm nhƣ cơng thức đƣợc khẳng định tƣơng tác xa H→C phổ HMBC (Hình 3.25): proton nhóm metyl (CH3) gắn với C-10 (H 0,8 ppm) (H-19) tƣơng tác với C-1 (C 37,4 ppm), C-5 (C 50,0 ppm), C-8 (C 133,2 ppm), C-10 (C 36,7 ppm) khẳng định nhóm metyl gắn với C-10; proton các nhóm metyl liên kết với C-4 (C 38,5 ppm) gồm H-29 (H 0,8 ppm) H-30 (H 0,62 ppm) tƣơng tác với C-3 (C 78,2 ppm), C4, C-5 khẳng định có hai nhóm metyl liên kết với C-4; proton nhóm metyl 17 liên kết với C-13 (C 44,4 ppm) H-18 (H 0,75 ppm) tƣơng tác xa với C-13, C-14 (C 51,0 ppm), C-16 (C 27,0 ppm), C-17 (C 45,4 ppm) khẳng định vị trí nhóm metyl liên kết với C-13; proton nhóm metyl liên kết với C-14 (H-28) tƣơng tác xa với C-9 (C 134,7 ppm), C-12 (C 72,5 ppm), C-13, C-14 với tín hiệu tƣơng tác xa H-19/C-9; H-28/C-8 khẳng định vị trí liên kết đơi thứ vòng thứ thứ C-8 C-9; proton nhóm metyl liên kết với C-25 (C 127,9 ppm) H-26 tƣơng tác xa với C-24 (C 141,5 ppm), C-27 (COOH, C 170,3 ppm) khẳng định vị trí nhóm metyl liên kết với C-25 Ngồi H-24 (H 6,55 ppm) tƣơng tác với C-27, C-26 (C 11,7 ppm) khẳng định vị trí liên kết đơi C=C vị trí C-24 C-25, với tƣơng tác H-25, H-24 với C-27 (COOH) khẳng định nhóm cacboxyl (COOH) liên kết với C-25 Sự tƣơng quan 1H-1H xuất hiện phổ COSYcũng góp phần khẳng định cấu trúc hợp chất DQE-1 Phổ NOESY hợp chất DQE-1 cho thấy tƣơng tác proton H-3 với H-5 H-12 với H-22 Bảng 3.14: Bảng số liệu phổ NMR hợp chất DQE-1 STT DEPT C (ppm) H (ppm) CH2 37,4 1,82-1,73 (1H, m) CH2 29,0 1,58-1,51 (1H, m) 1,18 (1H, td, J=16,5, 9,5 Hz) CH 78,2 2,99 (1H, td, J=5,6; 4,4 Hz) C 38,5 CH 50,0 0,83 (1H, d, J=15 Hz) CH2 17,9 1,58-1,51 (1H, m) 1,38-1,27 (1H, m) CH2 26,5 1,48-1,38 (1H, m) C 133,2 C 134,7 10 C 36,7 11 CH2 20,2 1,82-1,73 (2H, m) 12 CH 72,5 3,99 (1H, td, J=5,6; 4,0 Hz) 13 C 44,4 14 C 51,0 15 CH2 30,9 1,48-1,38 (2H, m) 16 CH2 27,0 2,06-1,96 (2H, m) 17 CH 45,4 2,06-1,96 (1H, m) 18 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 CH3 16,7 0,75 (3H, s) CH3 18,6 0,80 (3H, s) CH 47,5 2,06-1,96 (1H, m) C=O 178,4 CH2 35,3 1,08-1,00 (2H, m) CH2 26,2 2,06-1,96 (2H, m) CH 141,5 6,55 (1H, t, J=7,2 Hz) C 127,9 CH3 11,7 1,62 (3H, s) C=O 170,3 CH3 15,8 0,62 (3H, s) CH3 27,4 0,80 (3H, s) CH3 15,0 0,62 (3H, s) H (Đo 400 MHz CDCl3), C ( Đo 100 MHz CDCl3) Kết hợp liệu các loại phổ ESI-MS, HR-ESI-MS, 1H-NMR, 13CNMR, DEPT, COSY, NOESY, HSQC, HMBC với cấu trúc lập thể đƣợc xác định phổ NOESY, xác định đƣợc cấu trúc chất DQE-1, chất đƣợc đặt tên tramecubin A 26 21 22 HOOC OH 18 CH3 COOH 27 16 14 15 10 25 13 11 CH3 23 20 17 12 19 CH3 24 CH 28 HO H3C 30 CH3 29 tramecubin A (DQE-1) 3.2.3.2 Hợp chất DQE-2 Hợp chất DQE-2 thu đƣợc dƣới dạng chất lỏng màu vàng nhạt Trên phổ ESI-MS chất DQE-2 xuất hiện pic m/z 513,4 [M-H]+ (negative) phù hợp với công thức phân tử C32H50O5 Phổ khối lƣợng phân giải cao HR-ESI-MS (negative) cho pic ion giả phân tử với giá trị m/z 513,3587 [M-H]+ khẳng định công thức phân tử DQE-2 C32H50O5 Phổ 13C-NMR DQE-2 xác nhận có mặt 32 cacbon phân tử DQE-2, đó có tín hiệu cacbon cacbonyl (C=O) C 182,8 ppm (của nhóm –COOH) 171,0 ppm (của nhóm –COO-); cacbon olefin (C=C) 19 C 156,3, 135,4, 122,0, 106,4 ppm, cacbon nhóm metin (CH) liên kết với oxi C 79,9 ppm 75,4 ppm Theo phổ DEPT cacbon cịn lại thuộc nhóm metyl (CH3); nhóm metilen (CH2)và nhóm metin (CH) Những tín hiệu cacbon đó kết hợp số liệu phổ cho phép dự đoán hợp chất DQE2 có kiểu khung lanostan với hai liên kết đôi (C=C) C-8 (C 128,0), C-9 (C 135,4) C-24 (C 156,3), C-30 (C 106,4) Phổ 1H-NMR xác nhận có mặt proton nhóm metilen (H-30) liên kết đôi δH 4,63 (2H, dd); tín hiệu proton nhóm metin liên kết với hydroxyl δH 4,83 ppm (H-12, t); δH 3,96 ppm (H-3, dd), khẳng định phân tử DQE2 có nhóm metyl với tín hiệu singlet phía trƣờng mạnh nhóm metyl (H-32, H-29, H-19 H-18) δH 1,97; 1,13; 1,01; 0,68 ppm, với tín hiệu doublet nhóm metyl các vị trí H-26, H-27, H-21 phía trƣờng mạnh δH 0,98, 1,00, 0,87 ppm Việc xác định xác vị trí các nhóm nhƣ độ dịch chuyển hoá học proton cacbon phân tử dựa vào việc đo phân tích tƣơng tác xa phổ HMBC Phổ HMBC cho thấy tƣơng tác xa proton hai nhóm metyl (CH3) H-26, H-27 với C-24, C-30 khẳng định liên kết đôi vị trí C-24; proton nhóm metyl vị trí C-21 (H-21, δH 1,97 ppm) tƣơng tác với C-22 (δC 33,7 ppm), C-20 (δC 34,3 ppm), C-17 (δC 55,1 ppm) khẳng định có nhóm metyl (CH3) gắn với C-20 Tƣơng tác proton H-18 với C-12 (δC 79,9 ppm) tín hiệu H-32 (δH 1,01 ppm) tƣơng tác với C-11, C-31cho biết nhóm este (CH3COO-) liên kết với C-12 làm cho độ dịch chuyển C-12 dịch phía trƣờng thấp Mặt khác, tƣơng tác proton nhóm metyl vị trí C-29 (H-29, δH 1,13 ppm) với cacbon nhóm cacbonyl (C-28), C-4 (δC 53,7 ppm) chứng tỏ C-4 liên kết với nhóm metyl (C-29) nhóm axit cacboxylic (-COOH) (C-28); H-29 tƣơng tác với C-3 (δC 75,4 ppm) chứng minh nhóm hydroxyl (OH) gắn với C-3 Ngoài ra, với tƣơng tác H-19 (δH 0,87 ppm), H-11 (δH 1,91-1,83 ppm) với C-9 (δC 135,4 ppm) cho thấy vị trí liên kết đơi cịn lại C-8 (δC 128,0 ppm) C-9 Ngoài ra, phổ NOESY (Hình 3.36) cho thấy tƣơng tác proton H-3 với H-5; H-12 với H-14 H-19 với H-20 Bảng 3.15: Bảng liệu phổ NMR chất DQE-2 STT DEPT C (ppm) H (ppm) CH2 35,5 1,75-1,45 (1H, m) 1,41-1,31 (1H, m) CH2 23,5 1,75-1,45 (1H, m) 1,41-1,31 (1H, m) 20 CH C CH CH2 75,4 53,7 46,0 21,0 10 11 CH2 C C C CH2 32,6 128,0 135,4 36,4 25,9 12 13 14 15 16 17 18 19 20 CH C CH CH2 CH2 CH CH3 CH3 CH 79,9 46,0 51,6 27,7 27,1 55,1 8,2 20,1 34,3 21 22 23 CH3 CH2 CH2 21,0 33,7 30,1 24 25 26 27 28 29 30 31 32 3,96 (1H, dd, J=9,5; 5,5 Hz) 1,75-1,45 (1H, m) 1,41-1,31 (1H, m) 2,12-2,02 (2H, m) 1,91-1,83 (1H, m) 1,41-1,31 (1H, m) 4,83 (1H, t, J=10 Hz) 2,12-2,02 (2H, m) 2,12-2,02 (2H, m) 1,75-1,46 (1H, m) 1,75-1,46 (1H, m) 0,68 (3H, s) 0,87 (3H, d, J=8 Hz) 1,75-1,46 (1H, m) 1,10 (1H, d, J= 7,5 Hz) 0,97 (3H, s) 1,75-1,46 (2H, m) 2,50 (1H, dd, J=13,5; 8,0 Hz) 1,23-1,20 (1H, m) C 156,8 CH 33,9 2,22-2,15 (1H, m) CH3 22,0 0,98 (3H, d, J=3Hz) CH3 21,8 1,00 (3H, d, J=3 Hz) C 182,8 CH3 10,7 1,13 (3H, s) CH2 106,4 4,63 (2H, dd, J=23,6; 4,6 Hz) C 171,1 CH3 22,2 2,01 (3H, s) H (Đo 400 MHz CDCl3), C ( Đo 100 MHz CDCl3) Từ liệu các loại phổ ESI-MS, HR-ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, COSY, NOESY, HSQC, HMBC với cấu trúc lập thể đƣợc xác định 21 phổ NOESY, xác định đƣợc cấu trúc chất DQE-2, hợp chất đƣợc đặt tên tramecubin B 32 30 CH3 31 O CH2 21 O 17 CH3 27 13 10 25 23 16 20 12 19 CH3 CH3 24 CH3 11 26 22 H3C 14 15 HO H3C 29 COOH 28 Tramecubin B (DQE-2) 3.2.4 Hoạt tính sinh học hợp chất tramecubin A (DQE-1) Hợp chất tramecubin A đƣợc phân lập từ thể nấm vân chi (Trametes cubensis) đƣợc tiến hành thử các hoạt tính gây độc tế bào hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Quá trình thử hoạt tính sinh học tramecubin A (DQE-1) đƣợc trình bày phần thực nghiệm Bảng 3.20: Kết thử hoạt tính gây độc tế bào dòng ung thƣ hợp chất tramecubin A (DQE-1) STT Ký hiệu Tên chất Dòng tế bào (CS%) mẫu Hep-G2 Lu RD DQE-1 98,7±1,1 92,7±1,8 95,2±0,8 Chứng (+) 0,05±0,0 1,2±0,8 0,3±0,05 Kết cụ thể quá trình thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định hợp chất tramecubin A (DQE-1) đƣợc thể hiện bảng 3.21 Bảng 3.21: Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật hợp chất tramecubin A (DQE-1) S Ký hiệu Nồng Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC:μg/ml) T mẫu độ mẫu Vi khuẩn Vi khuân Nấm môc Nấm men T (μg/ml) Gr (-) Gr (+) DQE-1 DQE-2 50 50 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) Từ bảng số liệu cho thấy hợp chất tramecubin A B không có khả thể hiện hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn hay các chủng nấm đƣợc thử nghiệm 22 CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC TỪ QUẢ THỂ NẤM ĐA NIÊN LỖ ĐEN (Nigrofomes melanoporus) H O O O H O 11 15 O 12 10 H 3C 14 10 HO H CH 13 H CH 13 H 3C 14 Nigrofomin A (NDM-1) 12 HO O 11 15 O O Nigrofomin B (NDM-2) OH OH 4 O 11 CH3 12 CH3 7 8 10 HO O O 10 O H 3C 11 O O CH3 axit ferulic -(4-methylphenyl)--methyl--butyrolacton trans-p-hydroxycoumaric (NDM-3) (NDM-4) (NDM-5) 15 CH3 O 11 12 H 3C CH3 OH O 10 OHC14 19 11 13 CH3 14 20 28 CH3 CH3 26 21 CH3 18 CH3 19 27 16 CH3 15 H HO CH3 27 16 15 H ergosterol peroxit (NDM-9) O 25 23 OH ergosterol (NDM-8) O 14 O HO 20 17 10 13 10 11 CH3 24 CH3 12 26 22 H3C 25 23 17 13 madolin A (NDM-7) 24 CH3 CH3 12 H3C 28 22 H3C 18 H 11 dehydrovomifoliol (NDM-6) 12 13 21 H7 CH3 CH3 10 O axit benzoic (NDM-10) O CH3 O OH metyl(2-hidroxyphenyl) axetat (NDM-11) 23 CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC TỪ QUẢ THỂ NẤM NẤM VÂN CHI (Trametes cubensis) 32 26 21 22 HOOC OH 18 CH3 23 17 11 CH3 O 10 16 14 15 HO CH3 15 CH 28 25 23 27 13 CH3 10 20 17 12 19 16 14 CH3 24 CH3 11 27 26 22 H3C COOH 13 CH2 21 31 25 20 12 19 CH3 24 28 CH3 HO H3C H3C CH3 30 29 COOH 29 30 tramecubin A (DQE-1) tramecubin B (DQE-2) OH HO OH 10 O 8a O H 4a 3 4a CH3 OH 10 oospolacton (DQE-3) 21 11 CH3 26 20 21 CH3 CH3 CH3 15 H HO 11 13 14 10 O HO ergosterol (DQE-4) 25 23 CH3 27 16 15 H O 20 17 10 12 19 27 16 CH3 24 CH3 18 26 22 H3C 25 23 17 13 14 28 CH3 24 12 19 CH3 28 22 CH3 O oospoglycol (DQE-6) H3C 18 O 8a CH3 ergosterol peroxit (DQE-5) 31 CH2 21 HOOC 11 H3C 30 CH3 H CH3 29 axit eburicoic (DQE-7) H3 C 30 27 14 15 HO 25 23 16 10 28 CH3 CH3 13 15 10 11 CH3 14 17 12 19 27 16 CH3 13 CH3 HO 17 12 19 20 CH3 25 23 26 24 22 HOOC CH3 24 20 CH3 21 26 22 CH3 28 H CH3 29 axit 3β-hydroxylanosta-8,24-dien-21-oic (DQE-8) 24 KẾT LUẬN Nghiên cứu thành phần hoá học hoạt tính sinh học thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) thể nấm vân chi (Trametes cubensis) Việt Nam, thu đƣợc số kết nhƣ sau: Từ dịch chiết thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) phân lập xác định cấu trúc 11 hợp chất: - 04 hợp chất secquiterpenoit: nigrofomin A, nigrofomin B, madolin A dehydrovomifoliol Nigrofomin A nigrofomin B hợp chất - 02 hợp chất steroit: ergosterol ergosterol peroxit, - 03 hợp chất phenolic: trans-p-hydroxycoumaric, metyl ferulat, (2hydroxy-phenyl) axetat, - 01 hợp chất lacton: γ-(4-metyphenyl)-γ-metyl-γ-butyrolacton - 01 hợp chất axit benzoic Các hợp chất lần đƣợc phân lập từ loài nấm Xác định đƣợc các thông số về cấu trúc tinh thể hợp chất nigrofomin A Các số liệu tinh thể học hợp chất hiện đƣợc lƣu trữ Trung tâm liệu Cambridge Hai hợp chất nigrofomin A nigrofomin B có khả gây độc các dòng tế bào bệnh bạch cầu cấp tính (Jurkat), ung thƣ biểu bì vịm họng ngƣời (NPC-TW01), ung thƣ phổi (NCI-H661) Từ dịch chiết thể nấm vân chi (Trametes cubensis) phân lập đƣợc hợp chất: - 04 hợp chất triterpenoit: tramecubin A, tramecubin B, axit eburicoic, 3β-hydroxylanosta-8,24-dien-21-oic Tramecubin A, tramecubin B hợp chất - 02 hợp chất steroit: ergosterol, ergosterol peroxit, - 02 hợp chất coumarin: oospolacton oospoglycol Các hợp chất lần đƣợc phân lập từ loài nấm Hợp chất tramecubin A tramecubin B tiến hành thử hoạt tính khả gây độc tế bào ung thƣ gan (Hep-G2), ung thƣ phổi (Lu), ung thƣ biểu mô liên kết (RD); hoạt tính kháng khuẩn với các chủng vi khuẩn Gr (-) (ATCC 25922), vi khuẩn Gr (+) (ATCC 25923); hoạt tính kháng nấm với chủng nấm sợi (439, M42), nấm men (ATCC 7754, SH 20) với các kết âm tính 25 DANH MỤC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Hsui-Hui Chan, Shin-Hun Juang, Tran Dinh Thang, Min-Yu Chen, PingChung Kuo, Mei-Lin Yang, Nguyen Thi Ngan, Nguyen Ngoc Linh, Tian-Shung Wu (2012), Drimane-type secquiterpenes with a Dioxabicyclooctane Sketon from the fruiting bodies of Nigrofomes melanoporus and their cytotoxicity, Planta Medica, 78 (1) 737-739 Nguyễn Thị Ngần, Nguyễn Huy Hùng, Nguyễn Thị Bích Ngọc, Nguyễn Quyết Tiến, Trần Đình Thắng (2014), Thành phần hoá học thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus (Mont.) Murrill.) Việt Nam, Tạp chí Hố học, 52(6A) 93-97 Nguyễn Thị Ngần, Tian-Shung Wu, Trần Đình Thắng (2015), Hai hợp chất isocoumarin từ thể nấm vân chi (Trametes cubensis) Việt Nam, Tạp chí Khoa học (Trƣờng Đại học Vinh) 44 (2A) 70-73 Nguyễn Thị Ngần, Tian-Shung Wu, Trần Đình Thắng (2015), Các hợp chất steroid từ thể nấm vân chi (Trametes cubensis) Việt Nam, Tạp chí Khoa học (ĐHQG Hà Nội) (đã nhận đăng) 26