Nghiên cứu tác dụng điều hòa lipid máu của chế phẩm từ bột sấy phun đài hoa của cây bụp giấm (hibiscus sabdariffa l , malvaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LÊ THỊ LAN PHƯƠNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ĐIỀU HÒA LIPID MÁU CỦA CHẾ PHẨM TỪ BỘT SẤY PHUN ĐÀI HOA CỦA CÂY BỤP GIẤM (Hibiscus sabdariffa L., Malvaceae) LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LÊ THỊ LAN PHƯƠNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ĐIỀU HÒA LIPID MÁU CỦA CHẾ PHẨM TỪ BỘT SẤY PHUN ĐÀI HOA CỦA CÂY BỤP GIẤM (Hibiscus sabdariffa L., Malvaceae) NGÀNH: DƯỢC LÝ – DƯỢC LÂM SÀNG MÃ SỐ: 62720405 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS NGUYỄN PHƯƠNG DUNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2022 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận án trung thực, khách quan chưa công bố nơi Tác giả luận án Lê Thị Lan Phương MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH – VIỆT i DANH MỤC CÁC BẢNG iii DANH MỤC CÁC HÌNH vi MỞ ĐẦU CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Rối loạn lipid máu 1.2 Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L., Malvaceae) 32 1.3 Phương pháp nghiên cứu tác dụng thuốc lên chuyển hóa lipid40 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 47 2.1 Đối tượng nghiên cứu .47 2.2 Thời gian địa điểm thực nghiên cứu 49 2.3 Phương pháp nghiên cứu 49 CHƯƠNG III KẾT QUẢ 68 3.1 Xác định liều có tác dụng điều hòa lipid máu bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm 68 3.2 Xác định quy trình bào chế, tiêu chuẩn sở độ ổn định cốm Bụp giấm từ Bột sấy phun đài hoa Bụp giấm 71 3.3 Tác dụng cốm Bụp giấm số gen điều hòa chuyển hóa lipid 88 3.4 Tác dụng điều hòa lipid máu dự phịng gan nhiễm mỡ khơng rượu cốm Bụp giấm 94 3.5 Độc tính cấp độc tính bán trường diễn cốm Bụp giấm chuột nhắt .104 CHƯƠNG IV BÀN LUẬN 112 4.1 Liều có tác dụng bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm 112 4.2 Cốm Bụp giấm 114 4.3 Tác dụng cốm Bụp giấm số gen điều hịa chuyển hóa lipid .119 4.4 Tác dụng điều hòa rối loạn lipid máu dự phòng gan nhiễm mỡ không rượu cốm Bụp giấm 124 4.5 Độc tính cốm Bụp giấm chuột nhắt 129 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .132 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CÓ LIÊN QUAN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH – VIỆT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ALP Alkaline phosphatase Alkaline phosphatase ALT Alanine transaminase Alanine transaminase AMPK 5’adenosine monophosphate- Adenosin monophosphat activated protein kinase kích hoạt protein kinase AST Aspartate transaminase Aspartate transaminase BG Hibiscus Bụp giấm BSP Spray drying powder Bột sấy phun BTMXV Atherosclerotic Bệnh tim mạch xơ vữa cardiovascular disease CDV Cardiovascular diseases Bệnh tim mạch CE Cholesterol ester Cholesterol ester DĐVN Vietnamese Pharmacopoeia Dược điển Việt Nam HDL High density lipoprotein Lipoprotein tỷ trọng cao HMGCR HMG coenzym reductase HMG coenzym reductase IDL Intermediate density Lipoprotein tỷ trọng trung lipoprotein gian Lethal dose 50 Liều làm chết 50% động vật LD50 thử nghiệm LDL Low density lipoprotein Lipoprotein tỷ trọng thấp LDLR Low density lipoprotein Thụ thể LDL receptor LPL Lipoprotein lipase Lipoprotein lipase LRP LDL receptor related protein Protein liên quan thụ thể lipoprotein tỷ trọng thấp LXR Liver X receptor Thụ thể X gan ii NAFLD NASH Non-alcoholic fatty liver Bệnh gan nhiễm mỡ không disease rượu Non-alcoholic steatohepatitis Viêm gan nhiễm mỡ không rượu NHANES National health and nutrition Khảo sát nghiên cứu sức examination survey khỏe dinh dưỡng quốc gia Proprotein converse Proprotein converse subtilisin/kexin subtilisin/kexin PL Appendix Phụ lục PP Phospholipid Phospholipid RLLM Dyslipidemia Rối loạn lipid máu SREBP Sterol regulatory element – Yếu tố gắn protein điều hòa binding protein sterol TG Triglycerid Triglycerid THA Hypertension Tăng huyết áp VLDL Very low density lipoprotein Lipoprotein tỷ trọng thấp PCSK9 iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm thuốc statin .17 Bảng 1.2 Phân loại thuốc statin 18 Bảng 1.3 Một số dược liệu sử dụng dự phòng điều trị rối loạn lipid máu .27 Bảng 1.4 Một số thuốc (cơng thức phối hợp) sử dụng dự phịng điều trị rối loạn lipid máu 28 Bảng 1.5 Một số nghiên cứu đánh giá tác động thuốc lên trình chuyển hóa lipid mức độ phân tử tế bào 41 Bảng 1.6 Một số mơ hình gây tăng lipid máu chế độ ăn .43 Bảng 1.7 Một số mô hình gây tăng lipid máu tyloxapol (triton WR1339 44 Bảng 2.1 Các công thức bào chế khảo sát 52 Bảng 2.2 Các tiêu thử nghiệm theo dõi độ ổn định .57 Bảng 2.3 Theo dõi độ ổn định điều kiện lão hóa cấp tốc 57 Bảng 2.4 Theo dõi độ ổn định điều kiện thường .57 Bảng 2.5 Trình tự nucleotid mồi (primer) 60 Bảng 3.1 Nồng độ lipid máu lô thử nghiệm thời điểm ban đầu 68 Bảng 3.2 Kết khảo sát công thức phối hợp bào chế cốm Bụp giấm 72 Bảng 3.3 Độ ẩm chế phẩm cốm Bụp giấm 75 Bảng 3.4 Độ đồng khối lượng chế phẩm cốm Bụp giấm 75 Bảng 3.5 Độ tan chế phẩm cốm Bụp giấm 76 Bảng 3.6 Phản ứng thay đổi màu môi trường anthocyanin 76 Bảng 3.7 Hàm lượng hoạt chất lô cốm Bụp giấm 79 Bảng 3.8 Các thông số sắc ký ứng với đỉnh delphinidin-3-O-sambubiosid lần tiêm mẫu liên tiếp 80 Bảng 3.9 Các thông số sắc ký ứng với đỉnh cyanidin-3-O-sambubiosid lần tiêm mẫu liên tiếp 80 iv Bảng 3.10 Kết diện tích đỉnh theo nồng độ delphinidin-3-O-sambubiosid cyanidin-3-O-sambubiosid 81 Bảng 3.11 Kết đánh giá độ lặp lại quy trình định lượng delphinidin-3-Osambubiosid cyanidin-3-O-sambubiosid cốm Bụp giấm 83 Bảng 3.12 Kết độ quy trình định lượng delphinidin-3-Osambubiosid cyanidin-3-O-sambubiosid cốm Bụp giấm 84 Bảng 3.13 Kết theo dõi độ ổn định cốm Bụp giấm điều kiện lão hóa cấp tốc .85 Bảng 3.14 Kết định lượng cốm Bụp giấm thời điểm ban đầu 85 Bảng 3.15 Kết theo dõi độ ổn định cốm Bụp giấm điều kiện bảo dài hạn 86 Bảng 3.16 Kết định lượng cốm Bụp giấm thời điểm sau tháng 87 Bảng 3.17 Kết định lượng cốm Bụp giấm thời điểm sau 12 tháng 87 Bảng 3.18 Phần trăm gây độc mẫu dòng tế bào ung thư gan Hep G2 nồng độ khác xác định phương pháp SRB 88 Bảng 3.19 Sự thay đổi biểu gene mẫu .91 Bảng 3.20 Nồng độ lipid máu lô thử nghiệm thời điểm ban đầu 94 Bảng 3.21 Nồng độ lipid máu lô thử nghiệm thời điểm ban đầu 97 Bảng 3.22 Nồng độ lipid máu lô thử nghiệm sau tuần gây bệnh dung dịch giàu lipid 97 Bảng 3.23 Nồng độ lipid máu lô thử nghiệm thời điểm ban đầu 100 Bảng 3.24 Kết thử nghiệm độc tính cấp cốm Bụp giấm .104 Bảng 3.25 Kết theo dõi cân nặng lơ thử nghiệm độc tính bán trường diễn 105 Bảng 3.26 Chỉ số xét nghiệm sinh hóa sau tuần lơ chuột thử nghiệm độc tính bán trường diễn 107 v Bảng 3.27 Chỉ số xét nghiệm sinh hóa sau 12 tuần lơ chuột thử nghiệm độc tính bán trường diễn 108 Bảng 3.28 Chỉ số xét nghiệm huyết học sau tuần lô chuột thử nghiệm độc tính bán trường diễn 109 Bảng 3.29 Chỉ số xét nghiệm huyết học sau 12 tuần lô chuột thử nghiệm độc tính bán trường diễn 109 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh xxvii 357 207,91 107,09 72,48 114,01 70 93 116,80 189 162,59 104,48 52,86 88,83 97 101 108,81 268 132,72 103,51 48,88 63,14 70 80 96,19 278 161,74 110,39 59,10 80,56 82 89 131,60 279 143,88 103,51 48,58 74,60 340 361 95,42 Trung bình 143,83 105,44 54,29 68,46 110,22 108,72 108,72 SD 32,10 3,77 7,86 25,22 87,51 89,41 10,79 346 148,56 108,08 57,91 69,03 79 96 123,20 347 143,11 114,72 46,79 73,38 18 48 93,89 348 114,35 105,13 47,98 45,34 404 450 102,31 349 99,00 98,35 46,99 32,34 154 215 95,42 257 120,92 110,06 41,38 57,53 290 435 102,95 235 111,74 118,77 43,36 44,63 119 177 107,41 239 104,07 99,95 41,47 42,61 90 99 110,23 367 142,93 98,03 42,60 80,72 62 87 108,57 246 111,89 100,60 38,87 52,90 484 443 107,41 Trung bình 121,84 105,97 45,26 55,39 188,89 105,71 105,71 SD 18,39 7,49 5,63 16,10 164,64 168,62 8,70 Lipid C (10) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh xxviii PL16 Trọng lượng chuột lô thử nghiệm khảo sát mơ hình gan nhiễm mỡ chuột nhắt Ban đầu (g) Tuần (g) Tuần (g) Tuần (g) Tuần (g) 289 27,20 26,60 25,00 25,80 26,20 359 19,60 23,80 24,50 27,30 28,10 238 25,40 27,90 28,20 28,00 28,50 267 26,40 31,90 33,00 34,10 35,70 2789 27,50 34,20 34,40 35,50 37,40 259 25,80 29,40 29,00 39,50 38,90 247 27,10 30,10 30,90 32,70 33,20 248 27,70 32,70 34,60 36,80 38,40 Trung bình 25,84 29,58 29,95 32,46 33,30 SD 2,65 3,42 3,96 4,95 5,08 16 27,00 27,90 28,90 28,90 30,00 18 28,30 33,50 33,50 35,30 36,60 23 27,20 29,20 24,00 26,80 29,80 24,20 28,00 28,10 30,00 31,20 25 24,50 27,50 26,20 25,60 28,00 27 25,10 24,30 25,10 26,80 28,50 27,70 29,60 30,50 29,80 30,90 29 24,10 24,00 21,00 22,70 24,30 Trung bình 26,01 28,00 27,16 28,24 29,91 SD 1,71 3,03 3,93 3,73 3,47 249 26,90 32,60 32,80 34,50 34,40 256 25,40 32,20 35,00 34,40 33,80 258 25,90 29,50 32,20 35,60 35,80 245 26,40 29,30 33,00 35,70 36,50 189 27,70 34,70 31,70 34,60 35,20 268 25,00 28,90 31,10 27,70 28,90 278 26,80 31,90 35,60 39,20 42,20 Lô Nước cất Lipid A Lipid B Chuột Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh xxix 279 28,50 32,00 34,70 34,80 35,10 Trung bình 26,58 31,39 33,26 34,56 35,24 SD 1,16 1,99 1,65 3,19 3,65 346 24,40 29,90 31,60 33,20 35,00 347 27,80 31,00 32,70 35,30 35,70 349 27,00 30,50 33,30 35,20 35,40 257 25,20 29,00 30,00 30,60 31,00 235 28,10 33,30 30,20 33,40 35,90 239 24,60 29,40 30,00 31,80 31,60 367 26,10 26,10 24,10 28,30 29,20 246 26,70 30,00 31,40 34,10 35,40 Trung bình 26,24 29,90 30,41 32,74 33,65 SD 1,41 2,02 2,83 2,40 2,63 Lipid C Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh xxx PL17 Chỉ số sinh hóa ban đầu chuột lô thử nghiệm đánh giá tác dụng cốm Bụp giấm mơ hình gan nhiễm mỡ Lơ Chuột Cholesterol Triglycerid HDL LDL ALT AST Glucose (mg/dl) (mg/dl) (U/L) (U/L) (mg/dl) TP (mg/dl) (mg/dl) 49 91,36 124,14 49,86 16,67 24,00 77,00 66,96 27 85,03 116,17 53,67 8,13 16,00 64,00 68,48 19 99,68 115,10 60,63 16,03 24,00 69,00 85,90 23 100,34 117,61 57,35 19,47 27,00 92,00 104,83 38 82,25 113,32 47,94 11,65 40,00 77,00 91,57 68 112,18 120,86 72,43 15,58 27,00 64,00 83,06 47 111,71 113,68 64,12 24,85 31,00 47,00 90,59 Trung bình 97,51 117,27 58,00 16,05 27,00 70,00 84,48 SD 11,94 3,97 8,56 5,35 7,35 14,05 13,35 16 102,33 119,05 63,74 14,78 36,00 57,00 95,63 18 91,78 115,10 57,95 10,81 30,00 74,00 81,69 79 109,37 117,61 63,36 22,49 27,00 48,00 69,46 104,34 112,26 66,40 15,49 27,00 54,00 106,04 12 85,03 114,03 53,91 8,31 23,00 71,00 101,77 124 108,91 141,41 61,86 18,77 49,00 95,00 75,22 26 101,66 109,44 59,40 20,37 11,00 70,00 79,03 Trung bình 100,49 118,41 60,95 15,86 29,00 67,00 86,98 SD 8,98 10,63 4,19 5,11 11,68 15,75 14,10 35 105,02 118,33 68,08 13,27 22,00 42,00 64,68 37 99,46 116,89 58,31 17,77 25,00 69,00 83,59 39 99,90 123,41 58,43 16,79 22,00 73,00 86,63 25 103,67 117,25 60,51 19,71 46,00 67,00 100,41 46 102,33 121,58 62,36 15,65 27,00 83,00 93,97 92,61 122,68 59,65 8,42 19,00 48,00 106,78 48 99,68 123,77 59,89 15,04 29,00 61,00 71,03 Trung bình 100,38 120,56 61,03 15,24 27,14 63,29 86,73 SD 4,04 2,98 3,39 3,64 8,97 15,19 Nước cất Bệnh lý Atorvastin 10 mg/kg Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 14,27 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh xxxi 59 102,55 120,49 54,49 23,96 3,00 64,00 69,04 67 126,98 114,03 75,13 29,04 17,00 68,00 85,90 Cốm 69 93,88 123,41 57,59 11,61 21,00 81,00 87,74 Bụp giấm 89 115,76 124,50 78,17 12,69 48,00 94,00 88,67 400 mg/kg 104,34 125,97 65,64 13,51 22,00 53,00 108,28 34 75,88 107,69 46,71 7,63 22,00 58,00 75,06 126 98,48 140,44 55,49 14,90 49,00 67,00 113,52 Trung bình 90,80 108,50 55,00 14,44 24,93 60,46 79,91 SD 16,21 10,28 11,54 7,54 16,73 14,00 16,19 128 106,38 117,61 64,49 18,37 20,00 67,00 85,72 123 108,91 127,45 69,25 14,17 40,00 74,00 85,18 Atorvastatin 15 94,51 122,31 52,62 17,43 26,00 42,00 83,24 + Cốm Bụp 134 96,22 121,58 56,87 15,03 16,00 78,00 70,60 giấm 86,24 110,85 55,44 8,63 26,00 54,00 95,00 57 99,25 131,17 49,75 23,27 20,00 73,00 82,55 85,03 80,83 54,49 14,37 25,00 57,00 90,59 Trung bình 96,65 115,97 57,56 15,90 24,71 63,57 84,70 SD 9,13 16,82 6,89 4,50 7,72 7,61 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 13,02 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh xxxii PL18 Chỉ số sinh hóa cuối thí nghiệm chuột lô thử nghiệm đánh giá tác dụng cốm Bụp giấm mơ hình gan nhiễm mỡ Lơ Chuột Cholesterol Triglycerid HDL LDL AST Glucose (U/L) (U/L) (mg/dl) TP (mg/dl) (mg/dl) 49 113,69 139,04 54,02 31,86 30,00 62,00 113,03 27 90,70 106,15 47,53 21,94 28,00 47,00 114,87 19 96,38 116,39 55,07 18,03 16,00 59,00 119,28 23 107,85 183,13 50,37 20,85 40,00 99,00 120,14 38 98,84 121,27 52,78 21,81 37,00 54,00 121,30 68 116,92 112,32 57,88 36,58 45,00 74,00 108,28 47 107,87 128,51 56,58 25,59 44,00 46,00 104,98 Trung bình 104,61 129,54 53,46 25,24 34,29 63,00 114,55 SD 9,57 25,97 3,59 6,66 10,34 18,53 6,22 16 156,47 199,31 40,80 75,81 93,00 88,00 132,11 18 112,61 159,14 40,34 40,44 184,00 110,00 140,17 79 163,59 125,40 68,04 70,47 108,00 66,00 124,30 125,67 150,66 74,04 21,50 56,00 57,00 125,23 12 115,54 146,77 47,64 38,55 59,00 114,00 123,69 124 164,80 182,61 68,68 59,60 70,00 90,00 126,17 26 174,80 151,44 52,82 91,69 74,00 93,00 135,65 Trung bình 144,78 159,33 56,05 56,86 92,00 88,29 129,62 SD 25,97 24,45 14,07 24,56 44,56 20,95 6,44 35 89,86 126,08 40,37 24,27 335,00 1,00 78,43 37 102,54 133,12 53,31 22,61 6,00 328,00 129,07 39 100,51 176,23 52,48 12,78 275,00 100,00 141,35 25 117,26 181,13 62,01 19,02 29,00 54,00 140,56 46 119,26 163,82 66,11 20,39 29,00 52,00 157,42 112,85 124,44 59,63 28,33 60,00 68,00 136,39 48 87,76 104,60 41,00 25,84 186,00 167,00 127,44 Trung bình 104,29 144,20 53,56 21,89 131,43 110,00 130,09 SD 12,68 29,40 9,99 5,11 133,45 108,79 24,83 Nước cất Bệnh lý Atorvas 10 mg/kg Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn (mg/dl) (mg/dl) ALT Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh xxxiii 59 96,96 128,32 63,54 7,76 62,00 72,00 131,08 67 117,02 144,07 74,27 13,94 49,00 65,00 133,51 Cốm 69 121,80 127,22 74,54 21,82 47,00 49,00 133,51 Bụp giấm 89 120,02 160,18 60,52 27,46 31,00 57,00 126,49 400 mg/kg 119,01 137,98 70,22 21,19 27,00 54,00 111,24 34 114,07 136,48 68,68 18,09 53,00 75,00 124,30 126 153,81 121,42 73,22 56,31 93,00 85,00 113,29 Trung bình 120,38 136,52 69,28 23,80 51,71 65,29 124,77 SD 16,94 12,91 5,46 15,64 21,91 12,84 9,23 128 137,51 156,58 69,44 36,75 84,00 83,00 130,74 123 113,09 111,61 79,55 11,22 70,00 78,00 136,02 Atorvas + 15 111,73 164,63 61,10 17,70 78,00 83,00 125,23 Cốm 134 110,93 132,29 68,68 15,79 88,00 60,00 127,12 Bụp giấm 119,20 127,31 67,66 26,08 59,00 62,00 136,76 57 138,66 121,19 65,33 49,09 68,00 75,00 118,99 95,42 108,87 64,40 9,25 68,00 66,00 115,41 Trung bình 118,08 131,78 68,02 23,70 73,57 72,43 127,18 SD 15,45 21,44 5,83 14,63 10,20 9,71 8,08 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh xxxiv PL19 Trọng lượng thể trọng lượng gan chuột lô thử nghiệm đánh giá tác dụng cốm Bụp giấm mơ hình gan nhiễm mỡ 49 23,00 25,40 28,10 33,90 37,10 Tỷ lệ gan/ trọng lượng (%) 5,37 27 26,00 31,50 33,30 36,70 34,40 5,55 1,91 19 24,60 28,00 30,00 33,50 36,00 5,21 1,88 23 25,00 27,00 22,60 27,90 33,10 5,12 1,70 38 25,70 28,00 31,90 34,50 36,00 4,87 1,75 68 25,00 28,00 33,30 35,20 32,40 5,51 1,79 47 26,00 31,30 38,00 37,50 33,20 5,91 1,96 Trung bình 25,04 28,46 31,03 34,17 34,60 5,36 1,85 SD 1,05 2,21 1,79 0,34 0,11 16 26,00 29,00 35,90 38,60 43,70 5,27 2,30 18 26,00 31,50 33,30 33,30 37,50 5,01 1,88 79 26,00 30,40 34,10 33,00 34,40 5,83 2,00 24,10 26,00 28,00 30,00 35,00 5,80 2,03 12 25,70 31,00 34,50 31,80 29,10 6,37 1,85 124 25,20 29,50 30,90 32,60 36,00 6,01 2,17 26 26,00 31,00 33,30 34,50 37,20 5,24 1,95 Trung bình 25,57 29,77 32,86 33,40 36,13 5,65 2,03 SD 0,71 1,88 4,36 0,49 0,16 35 26,00 29,50 31,60 35,70 28,90 8,36 2,42 37 25,60 30,90 32,20 36,00 37,80 5,46 2,07 Atorvastatin 39 25,60 31,00 34,20 38,00 38,20 4,65 1,78 10 mg/kg 25 25,30 29,20 29,40 33,00 34,00 4,98 1,69 46 26,00 31,00 35,20 37,80 38,90 5,11 1,99 25,70 25,90 26,00 29,00 35,30 4,43 1,56 Lô Nước cất Bệnh lý Ban đầu Chuột (g) T1 (g) T2 (g) 4,84 2,62 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn T3 (g) 3,12 2,68 T4 (g) Gan (g) 1,99 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh xxxv 48 26,00 30,50 34,80 37,70 35,30 6,52 2,30 Trung bình 25,74 29,71 31,91 35,31 35,49 5,65 1,97 SD 0,27 1,83 3,42 1,38 0,32 59 26,00 31,60 32,10 34,00 32,00 4,50 1,44 67 25,20 30,90 30,00 31,00 33,20 4,71 1,57 Cốm 69 26,00 30,20 35,20 35,00 34,10 4,91 1,67 Bụp giấm 89 25,80 28,30 33,70 34,90 37,00 5,54 2,05 400 mg/kg 26,00 30,80 33,80 35,00 38,90 3,61 1,40 34 26,00 32,00 36,80 35,00 38,90 5,42 2,11 126 24,10 32,90 35,10 36,00 31,00 5,43 1,68 Trung bình 25,59 30,96 33,81 34,41 35,01 4,88 1,70 SD 0,72 1,47 3,25 0,69 0,28 128 26,00 29,00 32,90 36,00 37,40 5,53 2,07 123 25,70 31,40 38,00 40,80 38,00 5,51 2,09 Atorvastatin 15 25,20 30,00 34,30 37,00 39,50 5,19 2,05 + Cốm 134 25,60 31,50 32,00 34,00 34,40 4,46 1,54 Bụp giấm 26,00 32,40 40,80 43,00 42,50 5,04 2,14 57 25,70 29,30 29,20 34,50 34,30 6,03 2,07 26,00 30,10 35,20 36,80 35,00 4,93 1,73 Trung bình 25,74 30,53 34,63 37,44 37,30 5,24 1,96 SD 0,29 1,26 0,50 0,23 3,31 2,24 3,86 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 3,29 1,61 3,30 3,03 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh xxxvi XÁC ĐỊNH DNA MẪU BỤP GIẤM 1.Phương pháp chiết tách : Sử dụng DNA Dneasy Plant Mini Kit – Qiagen ( Đức) Phương pháp tách chiết Để mẫu nhiệt độ 12 Kb Khuếch đại Bảng : Các primer Primer sequence authors names ITS1 _ ITS TCCGTAGGTGAACCTGCGG White et al (1990) TCCTCCGCTTATTGATATGC locus ITS15,8SITS2 Master Mix: Phire direct plant Master Mix có thành phần chủ yếu bảng Phire buffer có nồng độ MgCl2 7.5 mM tạo nồng độ cuối phản ứng khoảng 1.5 mM Agarose (Thermo Scientific) Đệm điện di (Thermo Scientific) Phương pháp Khuếch đại gen Bảng : Nồng độ thành phần tham gia phản ứng Thành phần phản ứng Thể tích 10mmM dNTPs 0,4 µL Phire Hot Start II DNA polymerase 0,4 µL Buffer Phire 5x µL Primer F 0,5 µL Primer R 0,5 µL template 1-3 µL Nước Vừa đủ 23 µL Thiết kế chương trình chạy PCR Cách tính nhiệt độ bắt cặp ( cho primer 25 nucleotides): Tm = 40C (G+C)+20C(A+T) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh xxxviii Nhiệt độ bắt cặp (Ta) nên nhỏ 50C so với nhiệt độ chảy (melting temperature - Tm) primer Hoặc tính nhiệt độ bắt cặp theo cơng thức: Trong đó, L chiều dài dự tính đoạn gen cần khuếch đại Bảng : Chương trình chạy cho primer ITS1-ITS4 Các bước Nhiệt độ (0C) Thời gian Số chu kỳ Khởi đầu 98 phút Biến tính 98 30 giây Bắt cặp 56 40 giây Kéo dài 72 phút Kết thúc 72 10 phút 35 Phương pháp kiểm tra kết khuếch đại gen phương pháp điện di Sản phẩm khuếch đại điện di gen agarose nồng độ 1% dung dịch TBE 1X, hiệu điện 50 mV 25 phút Chuẩn bị gel agarose: Cân 0,3 g agarose vào 30 ml TBE 1X Đun chảy Để nguội 450C đổ vào khuôn cài lược sẵn Để gel đông nhiệt độ phòng Chuẩn bị đệm điện di: Đệm TBE 10X pha thành 1X, cho vào bể điện di ngập gel Chuẩn bị mẫu điện di: mẫu + loasding dye + thuốc nhuộn run safe Tổng cho vào giếng Điện di hiệu điện 50 mV 25 phút Bản gel soi máy soi gel Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh xxxix 3.Kết giải trình tự: TCAGGGGGGGGTAAAAATATCGGAAGTGACGAGTGGAGGTGTTATCAAAAA TCAAAGGAGAGGGGGTGCGGTCGCATCCTTGCGCCCCGTCCCCTCCCTGACA CGGTGACATGGGAACCCGTGTCCCCGTGGCAAAACAAACAACCCCCGGCGTG AATTACGCCAAGGAATCTGAATGAAAAGGTGGTCGTCTGTTGTCGCACCCCC GTTCGCGGTGCGTGTGCGGCGGAGACGAGCCCACTTTGTCGTGAATACACAA AACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAAAACGTAGC GAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTTTTTG AACGCAAGTTGCGCCCCAAGCCATTAGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGTGT CACGCATCGTTGCCCCCATCCAACCCTTACCCACAGGGCATCGGTTGAGGTGT GGGCGGAGAATGGCCTCCCGTGCGCTCACCGCTCGCGGTTGGCCTAAAATCG AGTCCTCGGCGACCACGGTGCCGCGACAATCGGTGGTGTTGCTTCGAGCTGC CTCGTTTTTTGTCGTGTGCTGCCGTCGATCCGTGCTCTCTGACCCTTTCGGCAC CGCAAGCACGGTGCTCGCATCGCGACCCCAGGTCAGGCGGGGATTACCCGCT GAGTTTAACCATATCAATGGATCGGGAAGAGAGGAAAAATCCCCCCA Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh xl Hibiscus sabdariffa haplotype D 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence GenBank: KP262034.1 FASTA Graphics Go to: LOCUS DEFINITION KP262034 729 bp DNA linear PLN 31-DEC-2016 Hibiscus sabdariffa haplotype D 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence ACCESSION KP262034 VERSION SOURCE KP262034.1 KEYWORDS Hibiscus sabdariffa ORGANISM Hibiscus sabdariffa Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta; Spermatophyta; Magnoliopsida; eudicotyledons; Gunneridae; Pentapetalae; rosids; malvids; Malvales; Malvaceae; Malvoideae; Hibiscus REFERENCE (bases to 729) AUTHORS Joung,Y.H and Kim,H.M TITLE Roselle ribosomal RNA partial sequence JOURNAL Unpublished REFERENCE (bases to 729) AUTHORS Joung,Y.H and Kim,H.M TITLE Submission JOURNAL Direct Submitted (11-DEC-2014) School of Biological Sciences and Technology, Chonnam National University, 77 Yongbong-ro, Buk-gu,N Gwangju 500757, Korea FEATURES Location/Qualifiers source Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 729 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh xli /organism="Hibiscus sabdariffa /mol_type="genomic DNA" /db_xref="taxon:183260" /haplotype="D" rRNA 729 /product="28S ribosomal RNA" ORIGIN tccgtaggtg aacctgcgga aggatcattg tcgaaacctg cctagcagaa cgacccgtga 61 acgtgttatc waacatcaaa gggagggggt gcggtcgcat cattgcgccc cgtccccttc 121 ctgacccggt gacatgggaa cccgtgtccc cgtggcaaaa caaacaaccc ccggcgtgaa 181 ttacgccaag gaatctgaat gaaaaggtgg tcgtctgttg tcgcaccccc gttcgcggtg 241 cgtgtgcggc ggagacgtgc ccactttgtc gtgaatacac aaaacgactc tcggcaacgg 301 atatctcggc tctcgcatcg atgaagaacg tagcgaaatg cgatacttgg tgtgaattgc 361 agaatcccgt gaaccatcga gtttttgaac gcaagttgcg ccccaagcca ttaggccgag 421 ggcacgtctg cctgggtgtc acgcatcgtt gcccccatcc aacccttacc cacagggcat 481 cggttgaggt gtgggcggag aatggcctcc cgtgcgctca ccgctcgcgg ttggcctaaa 541 atcgagtcct cggcgaccac ggtgccgcga caatcggtgg tgttgcttcg agctgcctcg 601 ttttttgtcg tgtgctgccg tcgatccgtg ctctctgacc ctttcggcac cgcaagcacg 661 gtgctcgcat cgcgacccca ggtcaggcgg gattacccgc tgagtttaag catatcaata 721 agcggagaa Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn