Đồ án tốt nghiệp phân lập và tuyển chọn lactobacillus sp từ thực vật ủ chua có tiềm năng sản xuất probiotic

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH o H hi C h in M ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP C PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN LACTOBACILLUS sp ity TỪ THỰC VẬT Ủ CHUA CÓ TIỀM NĂNG U SẢN XUẤT PROBIOTIC rs ve ni Ngành: Công nghệ SH-TP-MT ity Chuyên ngành: Công nghệ sinh học of Te Sinh viên thực : Trần Quang Huy MSSV: 1311101070 Lớp: 13DSH05 lo no ch Giảng viên hƣớng dẫn : TS Hoàng Quốc Khánh gy TP Hồ Chí Minh, 2017 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN o H Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học Các số liệu, kết hi C nêu đồ án trung thực bắt nguồn từ thực tiễn nghiên cứu Các tài liệu tham khảo có nguồn gốc xác thực M Ngƣời thực h in Trần Quang Huy ity C ity rs ve ni U of lo no ch Te gy Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Hoàng Quốc Khánh, o H ngƣời tận tình hƣớng dẫn,chia sẻ khó khăn chỉnh sửa đồ án cho em thời gian em thực đồ án viện sinh học nhiệt đới TP Hồ Chí Minh hi C Xin gửi lời cảm ơn đến TS Nguyễn Hoài Hƣơng, ngƣời động viên giúp em có thêm động lực để hồn thành đồ án M h in Xin cảm ơn thầy Ngô Đức Duy, nhiệt tình hƣớng dẫn giúp đỡ em trình định danh sinh học phân tử C Xin cảm ơn anh, chị đồng nghiệp viện sinh học nhiệt đới giúp đỡ ity tơi q trình thực đồ án U Xin cảm ơn viện sinh học nhiệt đới TP Hồ Chí Minh, tạo điều kiện thuận ni lợi cho em thực thí nghiệm để hồn thành đồ án ve Xin cảm ơn trƣờng ĐH Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh nói chung thầy cô rs khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm Mơi Trƣờng nói riêng tận tình ity dạy dỗ, cung cấp kiến thức vững vàng cho em bốn năm học tập trƣờng Cuối xin cảm ơn ba mẹ sinh cho điều kiện để học tập để trở of thành ngƣời nhƣ hôm Te ch Xin chân thành cảm ơn! Ngƣời thực no lo Trần Quang Huy gy Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC o H Phiếu giao đề tài ĐATN hi C Lời cam đoan Lời cảm ơn h in M Mục lục Danh mục từ viết tắt Danh mục bảng C ity Danh mục biểu đồ, đồ thị, sơ đồ, hình ảnh MỞ ĐẦU U ni CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 ve 1.1 Tổng quan rau lên men ity rs 1.2 Tổng quan probiotic .4 1.3 Lịch sử nghiên cứu probiotic of 1.4 Các vi sinh vật probiotic thƣờng gặp Te 1.4.1 Chi Lactibacillus 1.4.2 Chi Bifidobacterium 10 ch 1.4.3 Chi Sacharomyces 10 no 1.4.4 Chi Bacillus 11 lo 1.5 Hƣớng dẫn lựa chọn chủng probiotic .13 gy 1.5.1 Chi, loài chủng probiotic .14 1.5.2 Các thử nghiệm invitro để sàng lọc chủng có tiềm probiotic 14 I Đồ án tốt nghiệp 1.5.3 Nguồn phân lập probiotic 15 1.5.4 Probiotic an toàn 15 o H 1.6 Vi khuẩn lactic 17 hi C 1.6.1 Tổng quan vi khuẩn lactic 17 1.6.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, phân loại 17 M 1.6.3 Chi Lactobacillus .18 h in 1.6.4 Quá trình lên men lactic 22 C CHƢƠNG 2.VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .24 ity 2.1 Vật liệu 24 U 2.1.1 Nguyên liệu 24 ve ni 2.1.2 Hóa chất 24 2.1.3 Thiết bị dụng cụ 24 rs 2.1.4 Môi trƣờng nuôi cấy .25 ity 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .27 of 2.2.1 Phƣơng pháp phân lập tuyển chọn 27 Te 2.2.2 Phƣơng pháp quan sát hình thái khuẩn lạc .27 ch 2.2.3 Phƣơng pháp xác định khả sinh acid lactic .27 no 2.2.4 Phƣơng pháp nhuộm Gram 27 lo 2.2.5 Phƣơng pháp khảo sát khả di động 28 gy 2.2.6 Phƣơng pháp xác định kiểu hô hấp 28 2.2.7 Phƣơng pháp thử nghiệm hoạt tính catalase 29 2.2.8 Phƣơng pháp xác định hoạt tính protease 29 II Đồ án tốt nghiệp 2.2.9 Phƣơng pháp xác định hoạt tính amylase 30 2.2.10 Phƣơng pháp xác định khả kháng khuẩn .30 o H 2.2.11 Phƣơng pháp định danh sinh học phân tử .31 hi C CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 33 3.1 Phân lập LAB từ nguồn thực vật ủ chua 33 M 3.2 Đặc điểm sinh học chủng LAB đƣợc tuyển chọn 36 h in 3.2.1 Đặc điểm hình thái chủng CP1 MC3 36 C 3.2.2 Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng CP1 MC3 37 ity 3.3 Phổ kháng khuẩn hai chủng lactic nghiên cứu 40 U 3.4 Định danh chủng Lactobacillus CP1và Lactobacillus MC3 sinh học ni phân tử 42 ve CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 ity rs 4.1 Kết luận 45 4.2 Kiến nghị 45 of Tài liệu tham khảo lo no ch Te Phụ lục gy III Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VK Vi khuẩn o H DC Đối chứng hi C G- Gram âm G+ Gram dƣơng M KS Kháng sinh h in LAB Lactic Acid Bacteria (Vi khuẩn lactic) C MT Môi trƣờng ity MRS De Man - Rogosa – Sharpe ity rs ve ni VSV Vi sinh vật U ST Sinh trƣởng of lo no ch Te gy IV Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Trang o H Bảng 1.1 Các vi sinh vật có tiềm probiotic 12 hi C Bảng 1.3 Phân loại Lactobacillus dựa vào sản phẩm 19 Bảng 3.1 Kết hình thái khuẩn lạc 11 chủng đƣợc phân lập 32 M Bảng 3.2 Kết xác định hình thái tế bào 34 h in Bảng 3.3 Tổng hợp đặc điểm sinh lý sinh hóa hai chủng nghiên cứu 38-39 C Bảng 3.4 Kết thử phổ kháng khuẩn hai chủng Lactobacillus CP1 ity Lactobacillus MC3 41 ity rs ve ni U of lo no ch Te gy V Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH Trang o H Hình 1.1 Kim Chi số loại rau củ lên men truyền thống hi C Hình 1.2 Hƣớng dẫn lựa chọn chủng probiotic FAO & WHO 16 Hình 1.3 Quá trình lên men lactic 22 M Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc số mẫu sau làm 33 h in Hình 3.2 Định tính aicid lactic thuốc thử Uphemen 35 Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc (A) hình thái tế bào (B) chủng CP1 nhuộm C Gram kính hiển vi x100 36 ity Hình 3.4 Hình thái khuẩn lạc (A) hình thái tế bào (B) chủng MC3 nhuộm U Gram kính hiển vi x100 36 ni Hình 3.5 Cây phát sinh lồi hai chủng Lactobacillus CP1 Lactobacillus ve MC3 lồi có liên quan 43 ity rs of lo no ch Te gy VI Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài o H Ngày nay, với phát triển kinh tế xã hội, chất lƣợng hi C sống không ngừng đƣợc nâng cao, vấn đề chăm sóc sức khỏe ngƣời ngày đƣợc trọng Do vậy, việc tạo chế phẩm sinh học nhằm cải thiện tăng cƣờng sức khỏe ngƣời đƣợc tạo ngày nhiều Một chế phẩm M sinh học probiotic, chúng đƣợc tạo từ việc ứng dụng vi sinh vật có lợi h in bổ sung vào hệ tiêu hóa ngƣời Việc sử dụng vi sinh vật probiotic thực tế mang lại nhiều ảnh hƣởng tích cực sức khỏe ngƣời, thơng qua đặc C tính probiotic vốn có chúng Điển hình điều trị chứng bệnh rối loạn ity đƣờng tiêu hóa, khắc phục số hạn chế việc điều trị kháng sinh dài ngày, giúp U đồng hóa lactose sữa uống bệnh nhân khơng có khả dung nạp ni lactose sữa Bên cạnh đó, chúng cịn có khả ảnh hƣởng đến hoạt tính ve biến dƣỡng nhƣ đồng hóa cholesterol, tạo vitamin giải phóng enzyme rs có lợi giúp cho việc tiêu hóa thức ăn dễ dàng hơn, hấp thu chất dinh dƣỡng cần thiết, khử chất có khả gây ung thƣ hợp chất độc hại, kích thích điều ity hòa hệ miễn dịch, tăng khả đề kháng cho thể vật chủ, of Những chủng vi sinh vật probiotic thƣờng đƣợc nghiên cứu ứng dụng chủ yếu Te vi khuẩn lactic (LAB), nhờ chúng có đặc tính ƣu việt phù hợp cho việc sử dụng tạo chế phẩm probiotic cho ngƣời nhƣ vật ni Những đặc tính là: ch khả sống sót phát triển tốt điều kiện bất lợi đƣờng tiêu hóa no ngƣời nhƣ acid mật, pH thấp, kháng sinh, Đồng thời, chúng có khả sản lo sinh nhiều hoạt chất kháng khuẩn nhƣ acid lactic, bacteriocin, H2O2, diacetyl,… tạo gy môi trƣờng bất lợi, từ ức chế vi sinh vật gây bệnh thiết lập cân hệ vi sinh vật đƣờng ruột Bên cạnh đó, chúng cịn có khả sản sinh nhiều enzyme thúc đẩy trình tiêu hóa hấp thu chất thể vật chủ Trang Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.3 Tổng hợp đặc điểm sinh lý sinh hóa hai chủng nghiên cứu Đặc điểm hình thái, Đặc điểm o H sinh lý, sinh hóa hi C Chi Lactobacillus Lactobacillus CP1 Lactobacillus MC3 Que dài Que dài Que dài 1,2 chuỗi ngắn 1,2 chuỗi ngắn 1,2 chuỗi ngắn G+ G+ Tròn lồi Tròn lồi Tròn lồi Trắng sữa Trắng sữa Trắng sữa Tùy loài 1,0-2,0 mm 1,0-2,0 mm Vi hiếu khí Vi hiếu khí Tế bào Hình dạng M Sắp xếp tế bào h in Tính chất Gram G+ U Màu sắc ity Hình dạng C Khuẩn lạc Quan hệ với Vi hiếu khí Tùy lồi Khả tạo - Đồng hình Dị hình - - ity Lên men lactic rs oxy ve ni Kích thƣớc of bào tử - Hoạt - tính - - - catalase Hoạt - lo no tính - - ch động Te Khả di - gy Protease Trang 39 Đồ án tốt nghiệp 10 Lên men đƣờng o H + + + Galactose + + + Maltose + + + Manitol Tùy loài + + Lactose + + + Saccharose + + + Dextrin Tùy loài - - Tùy loài - - hi C Glucose h in M ity C Sorbitol ni U Ghi chú: „-„ âm tính ; „+‟ dƣơng tính ve Nhƣ nghiên cứu trƣớc đó, chủng Lactobacillus CP1 Lactobacillus MC3 rs có khả đối kháng lại với Ba.subtilis, tức có khả kháng khuẩn, ity nhiên thực phẩm nhƣ môi trƣờng sống ngày có chứa of nhiều vi sinh vật xâm nhập vào hệ tiêu hóa gây bệnh cho ngƣời động vật Chính vậy, chủng probiotic có phổ kháng khuẩn rộng, tức ức chế đƣợc Te nhiều loại vi sinh vật khác đƣợc quan tâm trọng nhiều việc ch sản xuất chế phẩm probiotic Do đó, để đƣợc sử dụng probiotic, chủng lo 3.3 Phổ kháng khuẩn hai chủng lactic nghiên cứu no Lactobacillus CP1 Lactobacillus MC3 phải có phổ kháng khuẩn rộng gy Để tìm hiểu khả này, sử dụng phƣơng pháp khếch tán qua giếng thạch, khảo sát hoạt tính đối kháng hai chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu với chủng vi khuẩn kiểm định chuyên gây bệnh đƣờng ruột cho ngƣời động vật Hoạt tính Trang 40 Đồ án tốt nghiệp ức chế đƣợc đánh giá thơng qua kích thƣớc vành kháng khuẩn (( D-d)/2, mm) Kết đƣợc thể bảng 3.4 o H Từ bảng 3.4, hai chủng có khả ức chế Gram âm Gram dƣơng Nhờ có tồn chúng ruột ngƣời gây bất lợi cho vi khuẩn hi C gây bệnh gây thối đƣờng ruột Khả kháng khuẩn mà ngƣời thực đo đƣợc không khác biệt với chủng Lactobacillus phân lập đƣợc từ phân trẻ em M thí nghiệm Hoàng Quốc Khánh Phạm Thị Lan Thanh (2011) [3], mặc h in dù có khác biệt kích thƣớc vành kháng khuẩn Đặc biệt chủng Lactobacillus CP1 có khả ức chế vi khuẩn C Salmonella Từ kết cho thấy hai chủng Lactobacillus CP1 ity Lactobacillus MC3 tạo hợp chất kháng khuẩn gồm acid hữu U hợp chất kháng khuẩn khác Các hợp chất kháng khuẩn bacteriocin, ni hydroxy peroxyde, diacetyl, reutorin Chính thành phần tạo khả ve ức chế vi khuẩn thị dịch ly tâm vi khuẩn Khi xét tỷ lệ ức chế vi rs khuẩn thị, ngƣời thực nhận thấy chủng Lactobacillus CP1 có khả kháng mạnh kháng đƣợc nhiều vi khuẩn thị chủng Lactobacillus MC3, ity đặc biệt ức chế Salmonella of Khi tiến hành đo vòng kháng khuẩn đĩa peptri, phƣơng pháp đo thô sơ, Te dựa mắt thƣờng dùng thƣớc mm để đo Kết có độ tin cậy khơng cao, chƣa có độ nhạy kết quả, ngồi cần đƣợc chuẩn hóa độ dày mơi ch trƣờng, nồng độ vi khuẩn thị thể tích dịch ly tâm cho vào giếng thạch lo no gy Trang 41 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.4 Kết thử phổ kháng khuẩn hai chủng Lactobacillus CP1 Lactobacillus MC3 o H Trung bình bề rộng vành kháng Đánh giá hoạt tính kháng kiểm Khả gây VSV bệnh [4] khuẩn [3] Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus CP1 MC3 CP1 MC3 2,33 2,10 ++ ++ 2,50 ++ ++ ++ - ++ ++ E.coli h in M Lactobacillus rs hi C định khuẩn ,mm Viêm ruột,tiêu chảy Viêm màng ity C Pseudomonas tim 2,83 Viêm đƣờng Salmonella Tiêu chảy, ói buồn 3,17 nôn Gây ngộ độc 3,67 3,01 ity S.aureus ve mửa, ni U hô hấp, of 3.4 Định danh chủng Lactobacillus CP1và Lactobacillus MC3 sinh học phân tử Te Để xác định xác tên lồi chủng Lactobacillus CP1 MC3, ngƣời thực ch gửi chủng đến phịng xét nghiệm cơng ty Nam Khoa- TP Hồ Chí Minh no Kết định danh đến lồi phƣơng pháp giải trình tự gen 16sRNA tra cứu BLAST SEARCH lo gy Kết hợp với nghiên cứu hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào đặc điểm sinh lý-sinh hóa đến kết luận kết giải trình tự gen xác có độ tin cậy cao Trang 42 Đồ án tốt nghiệp Kết giải trình tự gen 16s chủng Lactobacillus CP1 GATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGA o H ACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTG GTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGA hi C TGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCG GCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTC ACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGA M GACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACG AAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTC h in TGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACC AGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGC C Kết luận: Chủng Lactobacillus CP1 Lactobacillus plantarum strain LPL-1 ity với độ tƣơng đồng 100% ni U Kết giải trình tự gen 16s chủng Lactobacillus MC3 ATGCTAATACCGCATAACAGCGTTGTTCGCATGAACAACGCTTAAAAGATGGCTTCTCGCT ve ATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGC GATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGGACTGAGACACGGCCCAT rs ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAA ity CACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACACGTA TGAGAGTAACTGTTCATACGTTGACGGTATTTAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCC of AGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGAGAGT GCAGGCGGTTTTCTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGGAA Te ACTGGATAACTTGAGTGCAGAAGAGGGTAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTA GATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGACT ch CGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGT GCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTG no AGGAGTACGACCGCAAGGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGGT lo Kết luận: Chủng Lactobacillus MC3 Lactobacillus fermentum strain 17-2b với gy độ tƣơng đồng 100% Trang 43 Đồ án tốt nghiệp 40 o H hi C 53 CP1 99 Lactobacillus plantarum strain LPL-1 Lactobacillus plantarum strain SRCM102022 Lactobacillus plantarum strain TMW 1.1623 Lactobacillus acidophilus partial Lactobacillus fermentum strain 17-2b MC3 Leuconostoc lactis strain CAU1761 M 10 Hình 3.5 Cây phát sinh lồi hai chủng Lactobacillus CP1 Lactobacillus h in MC3 lồi có liên quan ity C ity rs ve ni U of lo no ch Te gy Trang 44 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ o H 4.1 Kết luận Từ mẫu thực phẩm rau củ lên men, ngƣời thực thu đƣợc 11 chủng VK hi C sinh acid chọn đƣợc chủng Lactobacillus CP1 Lactobacillus MC3 có đặc điểm: thuộc chi Lactobacillus, tế bào hình que, Gram dƣơng, vi hiếu khí, lên M men lactic đồng hình, catalase âm tính, khơng tạo hoạt tính protease amylase, lên h in men nhiều nguồn đƣờng khác Cả hai chủng có khả kháng khuẩn với Ba.subtilis, phổ kháng khuẩn C rộng với vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột, đặc biệt chủng Lactobacillus CP1 có ity khả kháng với Salmonella, vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột nguy hiểm U Kết nghiên cứu đặc điểm hình thái sinh lý sinh hóa, kết hợp với kết ni định danh đến loài Dựa vào khóa phân loại Bergey‟s (1986) kết luận chủng Lactobacillus fermentum 17-2b rs ve Lactobacillus CP1 Lactobacillus plantarum LPL-1, chủng Lactobacillus MC3 ity Qua kết nghiên cứu trên, ngƣời thực nhận thấy rằng, chủng Lactobacillus CP1và chủng Lactobacillus MC3 mang đặc điểm sinh học có of tiềm probiotic Do sử dụng để làm probiotic cho ngƣời động vật Te ch 4.2 Kiến nghị Xác định chất yếu tố đối kháng LAB với vi khuẩn kiểm định no Xác định thêm khả tồn chủng LAB hệ thống tiêu hóa lo gy Trang 45 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt o H Trần Thị Ái Liên (2012), Nghiên cứu đặc điểm vai trò lactobacillus chế phẩm probiotic., Luận văn thạc sĩ sinh học, Trƣờng Đại Học Sƣ hi C Phạm Hồ Chí Minh, TP Hồ Chí Minh Đỗ Quế Mi Hƣơng (2009), Thử nghiệm so sánh phương pháp đo hoạt M tính kháng vi sinh vật vi khuẩn lên men lactic để chọn chủng tiềm h in probiotic., Đồ án tốt nghiệp, ĐH Công Nghệ TP Hồ Chí Minh, TP Hồ Chí Minh Hồng Quốc Khánh Phạm Thị Lan Thanh (2012), "Phân lập, định danh C ity xác định chủng Lactobacillus có tiềm probiotic từ phân trẻ sơ sinh.", Tạp Chí Phát Triển Khoa Học Cơng Nghệ 14, tr 62-76 U Trần Linh Thƣớc (2013), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, ni thực phẩm mỹ phẩm., NXB Giáo Dục Việt Nam, TP Hồ Chí Minh ve Phạm Hùng Vân (2007), Bacilulus clausii vai trò probiotics điều trị ity Tài liệu tiếng anh rs tiêu chảy, Hội thảo chuyên đề, Hội nhi khoa Tp HCM Guarner F Schaafsma G J (1998), "Probiotics.", International Journal of Minelli E B and Benini A (2008), "Relationship between number of bacteria Te of Food Microbiology 39, tr 237–238 and their probiotic effects.", Microbial Ecology and Health Diseases 20, tr ch 1651-2235 no Cardoso E M and Miura E Trois L (2008), "Use of probiotics in HIV- gy Tropical Pediatrics 54, tr 19-24 lo infected children: a randomized double-blind controlled study", Journal of Chill D and Maida N Carr F J (2002), "The lactic acid bacteria: a literature survey", Critical Reviews in Microbiology 28, tr 281–370 Trang 46 Đồ án tốt nghiệp 10 Cencic A and Chingwaru W (2010), " Antimicrobial agents deriving from indigenous plants", RPFNA 2, tr 83-92 o H 11 Stiles J Chumchalova J, Josephsen J and Plockova M, (2004), "Characterization and purification of acidocin CH5, a bacteriocin produced hi C 1082-1089 S K DASH (2009), "Selection criteria for probiotics.", Focus on Dietary M 12 by Lactobacillus acidophilus CH5", Journal of Applied Microbiology 96, tr 13 h in fibres - Pre/Probiotics 20(3), tr 26-28 FAO/WHO (2002), Guidelines for the evaluation of probiotics in food, Food C and Agriculture Organization of the United Nations and World Health ity Organization Working Group Report,, London, Ontario Fuller R (1991), "Probiotics in human medicine", Gut 32, tr 439–442 15 Guarner F and Schaafsma G J (1998), "Probiotics", International Journal of ni U 14 Food Microbiology, 39, tr 237–238 ve 16 Antoine J M Kalliomaki M, Herz U, Rijkers G T, Wells J M and Mercenier rs A, ( 2010), "Guidance for substantiating the evidence for beneficial effects of ity probiotics: prevention and management of allergic diseases by probiotics", Journal of Nutrition 140, tr 713S-721S of 17 Marcelino Kongo (2013), Lactic Acid Bacteria – R & D for Food, Health Te and Livestock Purposes, Tập 1, InTech, Janeza Trdine 9, 51000 Rijeka, Croatia, tr.202-204 ch 18 Kumar A Kumar M, Nagpal R, Mohania D, Behare P, Verma V, Kumar P, no Poddar D, Aggarwal P K, Henry C J, Jain S and Yadav H, (2010), "Cancer- 19 gy Food Science and Nutrition 61(5), tr 473-496 lo preventing attributes of probiotics: an update.", International Journal of Laparra J M Sanz Y (2010), "Interactions of gut microbiota with functional food components and Research 61, tr 219–225 Trang 47 nutraceuticals.", Pharmacological Đồ án tốt nghiệp 20 Levin R (2011), "Probiotics-the road map", International Journal of Probiotics and Prebiotics 6, tr 133-40 o H 21 Lilley D M and Stillwell R H (1965), " Probiotics: growth promoting factors produced by microorganisms", Science 147, tr 747–748 hi C 22 Longdet I Y, Kutdhik R J Nwoyeocha I G (2011), "The probiotic efficacy of Lactobacillus casei from human breast milk against Shigellosis in Albino M rats", Advances in Biotechnology and Chemical Processes 1, tr 12-16 Maity T K Misra A K (2009), "Probiotics and human health: Synoptic h in 23 review", Brazilian Journal of Food Agriculture 9(8), tr 1778-1796 Metchnikoff E (1907), The prolongation of life, London, UK: William Heinemann 25 ity C 24 Nissen L cộng (2009), " Gut health promoting activity of new U putative probiotic/protective Lactobacillus spp strains: a functional study in ni the small intestinal cell model.", International Journal of Food ve Microbiology 135, tr 288-294 Zoumpopoulou G Papadimitriou K, Foligne B, Alexandraki V, Kazou M, Pot rs 26 ity B D and Tsakalidou E, (2015), "Discovering probiotic microorganisms: in vitro, in vivo, genetic and omics approaches", Frontiers in Microbiology 6, of tr 58 Parvez S cộng (2006), "Bile salt hydrolase and cholesterol removal Te 27 effect by Bifidobacterium bifidum NRRL 1976", World Journal of no 28 ch Microbiology and Biotechnology 22, tr 455-459 Sabina Fijan (2014), "Microorganisms with Claimed Probiotic Properties: lo An Overview of Recent Literature", Int J Environ Res Public Health 11, 29 gy tr 4745-4767 Vaughan R B (1965), "The romantic rationalist: A study of Elie Metchnikoff", Medical History 9, tr 201–215 Trang 48 Đồ án tốt nghiệp 30 Chang C J Yao T C, Hsu Y H and Huang J L, (2009), "Probiotics for allergic diseases: Realities and myths", Pediatrics, Allergy and Immunology 21(6), o H tr 900-919 31 Sachi haruguChi Ayaka iuChi , Wiyada Mongkolthanaruk , Jiro ariMa , hi C Mitsutoshi nagase , cộng (2012), "Characterization of Novel Amylase from Amylolytic Lactic Acid Bacteria Pediococcus ethanolidurans M Isolated from Japanese Pickles (Nuka-zuke)", Food Sci Technol Res 18(6), 32 h in tr 861 – 867 Anupama Gupta (2015), Characterization of potentially active new probiotic C strains isolated from different sources and to study their prospects as 33 ity nutraceutical agents, University of Horticulture and Forestry, Nauni-Solan F and De Vuyst Leroy, L, (2004), "Functional lactic acid bacteria starter U cultures for the food fermentation industry.", Trends in Food Science and ni Technology 15, tr 67-78 ve Tài liệu mạng http://microbeonline.com/gram-staining-principle-procedure-results/ 35 https://microbiologyinfo.com/catalase-test-principle-uses-procedure-resultinterpretation-with-precautions/ of 36 ity rs 34 https://www.hccfl.edu/media/680327/starch%20hydrolysis.pdf lo no ch Te gy Trang 49 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC o H Kết kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn vi sinh vật phƣơng pháp khếch tán qua giếng thạch chủng CP1 hi C h in M ity C ity rs ve ni U of 1: Ba.subtilis; 2: Pseudomonas;3: Salmonella;4: E.coli; 5:S.aureus Te Kết thử nghiệm khả sinh acid lactic làm tan CaCO3 lo no ch gy Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC o H Kết giải trình tự hi C Trình tự gen so sánh chủng MC3 với chủng ngân hàng gen NCBI Lactobacillus fermentum 17-2b, mức độ tƣơng đồng 98% M Query Query GCTAGTTCGTGGCAAGTCGAACGCGTTGGCCCAATTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATT 73 |||||| | | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| h in Sbjct 14 GCTAGTACAT-GCAAGTCGAACGCGTTGGCCCAATTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATT 59 74 GATTTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAGAAG 133 C |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 60 GATTTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAGAAG 119 Query 134 CGGGGGACAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAGCGTTGTTCGCATGAACA 193 ity Sbjct |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| U 120 CGGGGGACAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAGCGTTGTTCGCATGAACA Query 194 ACGCTTAAAAGATGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTTGT ni Sbjct 179 253 ve |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 180 ACGCTTAAAAGATGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTTGT 239 Query 254 TGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCC rs Sbjct 313 Sbjct 240 TGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCC 299 Query 314 ACAATGGGACTGAGACACGGCCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCAC 373 ity |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| of |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 300 ACAATGGGACTGAGACACGGCCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCAC Query 374 AATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAA Te Sbjct 359 433 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ch Sbjct 360 AATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAA 419 Query 434 GCTCTGTTGTTAAAGAAGAACACGTATGAGAGTAACTGTTCATACGTTGACGGTATTTAA 493 no |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 420 GCTCTGTTGTTAAAGAAGAACACGTATGAGAGTAACTGTTCATACGTTGACGGTATTTAA 479 Query 494 CCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTT 553 lo Sbjct Sbjct 480 CCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTT gy |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 539 Đồ án tốt nghiệp Trình tự gen so sánh chủng CP1 với chủng ngân hàng gen NCBI Lactobacillus plantarum LPL-1, mức độ tƣơng đồng 100% o H Query GATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAACTCT 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAACTCT Query GGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAA hi C Sbjct 1960681 1960622 61 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| M GGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAA Query CACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCA h in Sbjct 1960621 1960562 121 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 181 ity Query CACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCA C Sbjct 1960561 1960502 TAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATG 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATG Query GTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGC ni 241 U Sbjct 1960501 1960442 300 ve |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGC Query CGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAG 301 360 ity rs Sbjct 1960441 1960382 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAG Query GCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTG 361 of Sbjct 1960381 1960322 420 Te |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTG Query AAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTG 421 ch Sbjct 1960321 1960262 480 Sbjct 1960261 1960202 no |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTG lo gy Đồ án tốt nghiệp o H hi C h in M ity C ity rs ve ni U of lo no ch Te gy