Đồ án tốt nghiệp phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng ức chế nấm mốc sinh aflatoxin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH o H hi C ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP h in M C PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC ity CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ NẤM MỐC SINH AFLATOXIN rs ve ni U Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ity Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC of ch Te Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Hoài Hương Lớp: 13DSH01 lo MSSV: 1311100092 : Nguyễn Trần Yến Tiên no Sinh viên thực gy TP Hồ Chí Minh, 2017 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu hướng dẫn o H Tiến sĩ Nguyễn Hồi Hương khoa Cơng Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi trường trường Đại Học Cơng Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh hi C Những kết hồn tồn khơng chép từ nghiên cứu khoa học khác hình thức Các số liệu trích dẫn đồ án hồn tồn trung thực Tơi xin chịu trách nhiệm tồn đồ án h in M Tp.HCM, ngày 09 tháng 08 năm 2017 Sinh viên thực ity C U ity rs ve ni Nguyễn Trần Yến Tiên of lo no ch Te gy Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành đồ án “Phân lập định danh vi khuẩn lactic có khả o H ức chế nấm mốc sinh Aflatoxin” suốt trình học tập, rèn luyện trau dồi kiến thức Cũng khơng lần gặp khó khăn trắc trở nhờ hướng dẫn tận tình hi C Cơ Nguyễn Hồi Hương em hồn thành đồ án Em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ tận tình Cơ Nguyễn Hồi Hương Khoa Cơng nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường trường Đại học Công nghệ M TPHCM Chính nhờ Cơ truyền tải kiến thức kỹ để em đạt h in thành đồ án mà em thực hôm Chân thành gửi lời cám ơn sâu sắc đến Thầy cô giảng viên Ban lãnh C đạo Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường trường Đại học Công ity nghệ TPHCM tạo điều kiện cho em tìm hiểu tài liệu để hồn thành đồ án U tốt nghiệp thời gian quy định ni Dù hồn thành đồ án khó tránh khỏi sai sót ve định khả hiểu biết hạn hẹp thông tin tài liệu khơng khả quan để rs phục vụ q trình thực đồ án Kính mong có góp ý hướng dẫn tận tình thầy để em học hỏi thêm kinh nghiệm, tích lũy cho trình học ity tập rèn luyện chuẩn bị hành trang bước sang môi trường làm việc sau of Kính chúc Cơ Nguyễn Hồi Hương Thầy cô giảng viên, Ban lãnh đạo Te Khoa Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường trường Đại học Công nghệ no Em xin chân thành cảm ơn! ch TPHCM sức khỏe, thành công may mắn TP.HCM, ngày 09 tháng 08 năm 2017 lo Sinh viên thực gy Nguyễn Trần Yến Tiên Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT o H DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH hi C MỞ ĐẦU 10 Tính cấp thiết đề tài 10 M Tình hình nghiên cứu 11 h in Mục tiêu nghiên cứu 12 Nội dung nghiên cứu 12 C Phương pháp nghiên cứu .12 ity 5.1 Phương pháp luận 12 5.2 Phương pháp xử lý số liệu 13 TỔNG QUAN .14 ni CHƯƠNG 1: U Kết cấu đồ án 13 ve 1.1 Tổng quan nấm 14 Giới thiệu chung 14 1.1.2 Độc tố nấm 15 1.1.3 Tác hại nấm 17 1.1.4 Một số chủng nấm gây độc thực phẩm .18 1.1.5 Một số phương pháp khử nhiễm độc tố 19 ity rs 1.1.1 of Te 1.2 Tổng quan vi khuẩn lactic .21 Giới thiệu vi khuẩn lactic 21 1.2.2 Phân loại .22 1.2.3 Đặc điểm hình thái vi khuẩn lactic 23 1.2.4 Đặc điểm sinh lý – sinh hóa 25 1.2.5 Nhu cầu dinh dưỡng vi khuẩn lactic 26 1.2.6 Quá trình trao đổi chất 28 lo no ch 1.2.1 gy 1.2.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men, trình sinh trưởng phát triển vi khuẩn lactic .31 1.2.8 Ứng dụng vi khuẩn lactic .32 Đồ án tốt nghiệp 1.2.9 Hoạt tính sinh học 33 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1 Địa điểm nghiên cứu .38 o H 2.2 Thời gian thực .38 2.3 Vật liệu 38 Nguồn phân lập .38 2.3.2 Thiết bị dụng cụ 38 2.3.3 Hóa chất 38 2.3.4 Giống nấm 40 hi C 2.3.1 h in M 2.4 Phương pháp luận 40 C 2.5 Phương pháp thí nghiệm 43 Thu thập mẫu 43 2.5.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic 43 2.5.3 Khảo sát hình thái, sinh lý, sinh hố .45 ity 2.5.1 U ni 2.6 Khảo sát khả tăng trưởng lên men lactic 49 ve 2.7 Khảo sát khả kháng nấm chủng vi khuẩn lactic phương pháp in vitro .49 Khảo sát khả đối kháng nấm trực phương pháp in vitro 49 2.7.2 Khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào 53 ity rs 2.7.1 of 2.8 Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn lactic bảo quản hạt 55 Te Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 102/12g hạt: 55 2.8.2 Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 101/12g hạt: 57 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .60 no CHƯƠNG 3: ch 2.8.1 3.1 Kết khảo sát hình thái, sinh lý, snh hoá .60 Thử nghiệm Catalase 61 3.1.2 Nhuộm Gram .62 3.1.3 Nhuộm bào tử 63 3.1.4 Khả lên men đường khả sinh khí 64 3.1.5 Thử nghiệm khả di động phương pháp thạch mềm .66 lo 3.1.1 gy Đồ án tốt nghiệp 3.2 Khảo sát khả tăng trưởng lên men lactic 71 3.3 Khảo sát khả kháng nấm chủng vi khuẩn lactic phương phap in vitro 73 o H 3.3.1 Khảo sát khả kháng nấm trực tiếp chủng vi khuẩn lactic 73 3.3.2 Khả sinh enzyme ngoại bào 76 hi C 3.4 Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 102/12g hạt: 78 3.5 Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 101/12g hạt: 87 M CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .94 h in 4.1 Kết luận 94 4.2 Kiến nghị 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO 95 C PHỤ LỤC ity ity rs ve ni U of lo no ch Te gy Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT o H LAB lactic acid bacteria /Lactobacillales VK Vi khuẩn hi C MRS de Man, Rogosa and Sharpe PDA Potato Detrose Agar ĐC Đối chứng M TN Thí nghiệm h in ity C ity rs ve ni U of lo no ch Te gy Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh trưởng chi vi khuẩn lactic 25 o H Bảng 1.2 Một số hợp chất xác định có tiềm kháng nấm mốc nấm men (Corsetti cộng sự, 1998) .34 hi C Bảng 1.3 Các sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn lactic có tính kháng sinh (Holzapfel cộng sự, 1995) 35 Bảng 1.4 Khả đối kháng sản phẩm biến dưỡng vi khuẩn LAB M (Holzapfel cộng sự, 1995) 37 h in Bảng 2.1: Kí hiệu nguồn phân lập 43 Bảng 3.1: Bảng kí hiệu chủng vi khuẩn phân lập .61 ity C Bảng 3.2 Trình bày hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào vi khuẩn phân lập 67 U Bảng 3.3 Trình bày tóm tắt chủng phân lập có đặc điểm đặc trưng cho vi ni khuẩn lên men lactic 70 ve Bảng 3.4: Bảng xử lý số liệu khả sinh acid giá trị OD 11 chủng vi .71 rs khuẩn phân lập .71 Bảng 3.5: Phân nhóm chủng vi khuẩn lactic 72 ity Bảng 3.6 Thống kê số liệu phần trăm tỉ lệ ức chế 11 chủng vi khuẩn phân lập of với chủng nấm mốc theo phương pháp cấy đường vi khuẩn 74 Bảng 3.7 Kết khả sinh enzyme chủng vi khuẩn 76 Te Bảng 3.8 Khả kháng nấm CĐP1 Canh trường nuôi cấy chủng vi ch khuẩn ứng dụng đậu phộng với mật độ nhiễm 102 bào tử/g đậu phộng .78 no Bảng 3.9 Khả kháng nấm CĐP2 Canh trường nuôi cấy chủng vi khuẩn ứng dụng đậu phộng với mật độ nhiễm 102 bào tử/g đậu phộng .82 lo Bảng 3.10 Khả kháng nấm CĐP1 Canh trường nuôi cấy chủng vi gy khuẩn ứng dụng đậu phộng với mật độ nhiễm 101 bào tử/g đậu phộng .87 Bảng 3.11 Khả kháng nấm CĐP2 Canh trường nuôi cấy chủng vi khuẩn ứng dụng đậu phộng với mật độ nhiễm 101 bào tử/g đậu phộng .89 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.12 Thời gian bắt đầu xuất tơ nấm (ngày) 11 chủng vi khuẩn với mật độ cảm nhiễm 101bt/g đậu phộng 102bt/g đậu phộng 90 Bảng 3.13 So sánh khả tăng trưởng, lên men lactic, kháng nấm in vitro in o H vivo chủng vi khuẩn phân lập 91 hi C h in M ity C ity rs ve ni U of lo no ch Te gy Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH o H Hình 1.1: Một số vi khuẩn lactic điển hình 24 Hình 1.2 Sơ đồ đường lên men lactose vi khuẩn lactic .29 hi C Hình 2.1 Sơ đồ phân lập định danh sơ vi khuẩn lactic 42 Hình 2.2: Cách pha lỗng mẫu 44 Hình 2.3: Sơ đồ khảo sát khả đối kháng chủng vi khuẩn với nấm mốc M theo phương pháp cấy đường vi khuẩn .50 h in Hình 2.4: Mơ tả cách đo đường kính vịng ức chế phương pháp vạch đường vi khuẩn 52 C Hình 2.5: Sơ đồ thí nghiệm khả sinh enzyme chủng LAB 53 ity Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn lactic 60 U Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn lactic mơi trường có chứa chất thị 61 ni Hình 3.3: Thử nghiệm catalase chủng vi khuẩn (Từ trái qua phải): Thử nghiệm âm ve tính chủng vi khuẩn KC1A, Đối chứng âm nước cất, thử nghiệm dương tính rs Bacillus spp 62 Hình 3.4 Kết nhuộm gram chủng vi khuẩn: A Vi khuẩn Bacillus subtilis ity bắt màu tím B Vi khuẩn E.coli bắt màu hồng C Vi khuẩn phân lập 63 of Hình 3.5 Kết nhuộm bào tử chủng vi khuẩn A Vi khuẩn Bacillus subtilis sinh bào tử B Vi khuẩn E.coli không sinh bào tử C Vi khuẩn phân lập không sinh Te bào tử 64 ch Hình 3.6 Thử nghiệm lên men đường Ống 1: Vi khuẩn không lên men đường Ống no 2: Vi khuẩn lên men đường có sinh khí Ống 3: Vi khuẩn lên men đường khơng sinh khí 65 lo Hình 3.7 Vi khuẩn lactic phân lập có khả lên men đường 66 gy Sau thử nghiệm lên men đường, thu kết cho thấy số 11 chủng phân lập có 10 chủng vi khuẩn lên men đồng hình, chủng cịn lại lên men dị hình Các chủng phân lập từ Kim chi lên men đồng hình sinh acid lactic, với chủng phân lập từ Nem chua có chủng lên men dị hình, Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận o H Từ kim chi phân lập chủng từ nem chua phân lập chủng vi khuẩn vi khuẩn lên men lactic, 10 chủng vi khuẩn lên men lactic hình que hi C chủng hình cầu, 10 chủng lên men đồng hình chủng lên men dị hình với khả lên men sinh acid lactic tăng trưởng khác Khả kháng nấm in vitro 11 chủng xác định phương pháp M đối kháng trực tiếp cách ria đường vi khuẩn, 11 chủng thể khả h in đối kháng nấm Aspergillus spp sinh aflatoxin, chủng NC412 kháng nấm Aspergillus sp CĐP1 mạnh nhất; chủng KC242 KC1A kháng nấm C Aspergillus sp CĐP2 mạnh ity Các chủng có khả kháng nấm mạnh đa số có khả sinh U enzyme chủng KC1A NC412 sinh enzyme protease, chủng KC242 ni sinh enzyme protease chitinase ve Trong số chủng phân lập, chủng KC1A NC412 phân lập từ kim chi rs nem chua thể khả kháng nấm số ngày bảo quản đậu phộng cao nhất, ngồi cịn thể khả tăng trưởng, lên men lactic nồng độ acid ity lactic sau 24 nuôi cấy môi trường MRS lỏng tốt of 4.2 Kiến nghị Tiếp tục phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả kháng lo no Ứng dụng bảo quản nhiều loại hạt khác ch Mở rộng thêm chủng nấm thị Te nấm cao từ thực phẩm lên men truyền thống gy 94 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt: o H Đậu Ngọc Hào, Lê Thị Ngọc Diệp (2003) Nấm mốc độc tố aflatoxin thức ăn chăn nuôi NXB nông nghiệp hi C Hoàng Quốc Khánh cộng Phân lập, định danh xác định chủng Lactobacillus có tiềm Probiotic từ người Viện Sinh Học Nhiệt Đới Lưu Đại Kim Phượng (2016) “Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men M truyền thống có khả kháng nấm mốc sinh Aflatoxin Aspergillus spp.” Trường h in Đại học Công nghệ TP.HCM Lê Ngô Vũ Phượng (2016) “Thử nghiệm phương pháp đánh giá khả C đối kháng chủng vi khuẩn Bacillus spp Lactobacillus spp ity số nấm mốc Aspergillus spp sinh aflatoxin” Trường Đại học Công nghệ Trần Lê Bích Trâm( 2016) “Khảo sát khả kháng nấm hợp chất thứ ni U TP.HCM rs Công nghệ TP.HCM ve cấp vi khuẩn lactic ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng” Trường Đại học Nguyễn Thị Hiền, Phan Thị Kim, Trương Thị Hòa, Lê Thị Lan Chi, Vi sinh ity vật nhiễm tạp lương thực - thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội, 2009 Nguyễn Lân Dũng, 2003, Vi sinh vật học, NXB nông nghiệp of Te Tài liệu Tiếng Anh: Holzapfel, W H., R Geisen, and U Schillinger 1995 Biological ch no preservation of foods with reference to protective cultures, bacteriocins and foodgrade enzymes lo Scott, P.M 1984 Effects of food processing on mycotoxins J Food Prot., 10 Magnusson, J and J Schnurer 2001 Lactobacillus coryniformis subsp coryniformis strain Si3 produces a broad-spectrum proteinaceous antifungal compound Appl Environ Microbiol 67(1):1-5 95 gy 47(6): 489 Đồ án tốt nghiệp 11 Corsetti, A., M Gobbetti, J Rossi, and P Damiani 1998 Antimould activity of sourdough lactic acid bacteria: identification of a mixture of organic acids produced by Lactobacillus sanfrancisco CB1 Applied Microbiology and o H Biotechnology 50(2):253-256 12 Roy, U., V K Batish, S Grover, and S Neelakantan 1996 Production of hi C antifungal substance by Lactococcus lactis subsp lactis CHD-28.3 International Journal of Food Microbiology 32(1-2):27-34 M 13 Corsetti, A., M Gobbetti, and E Smacchi 1996 Antibacterial activity of h in sourdough lactic acid bacteria: isolation of a bacteriocin-like inhibitory substance from Lactobacillus sanfrancisco C57 Food Microbiology 13(6):447-456 C 14 De Man, J.C., Rogosa, M & Sharpe, M.E (1960) A medium for the ity cultivation of Lactobacilli Journal of Applied Bacteriology, 23, 130-135 https://vi.wikipedia.org/wiki/Nấm ity rs ve ni U Tài liệu Internet: of lo no ch Te gy 96 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC PHỤ LỤC A o H Đặc điểm sinh lý, sinh hoá chủng vi khuẩn Thử nghiệm khả di động Thử nghiệm lên men đường hi C Chủng vi khuẩn KC211 h in M ity C ity rs ve ni U KC1A of Te lo no ch KC1B gy Đồ án tốt nghiệp KC106 o H hi C h in M KC242 ity C ity rs ve ni U KC13 of lo no ch Te gy Đồ án tốt nghiệp NC2 o H hi C h in M NC12 ity C ity rs ve ni U NC15 of lo no ch Te gy Đồ án tốt nghiệp NC172 o H hi C h in M NC412 ity C ity rs ve ni U of lo no ch Te gy Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B Xử lý số liệu theo phần mềm SAS 9.4 Tỉ lệ ức chế nấm CĐP1 11 chủng vi khuẩn o H Class Level Information Levels Values hi C Class CHUNG 11 KC106 KC13 KC1A KC1B KC211 KC242 NC12 NC15 NC172 NC2 NC412 M Number of Observations Read 33 h in Number of Observations Used 33 Dependent Variable: TYLEUCCHE C Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F ity Model 10 2242.614819 224.261482 22 28.719273 1.305422 Corrected Total 32 2271.334093 ve ni U Error 171.79 F 224.261482 171.79 F 288.48346 133.94 F F CHUNG DF Anova SS Mean Square F Value 10 162.6080663 16.2608066 457.88 Pr ve ni The SAS System U