Đồ án tốt nghiệp phân lập bacillus subtilis từ ruột cá

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP BACILLUS SUBTILIS TỪ RUỘT CÁ Ngành CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn T S[.]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP BACILLUS SUBTILIS TỪ RUỘT CÁ Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : T.S NGUYỄN THỊ HAI Sinh viên thực MSSV: 1211100074 : HỒNG SẾCH HẾNH Lớp: 12DSH02 TP Hồ Chí Minh, 2016 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu thân hướng dẫn TS Nguyễn Thị Hai, giảng viên khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh Những kết có đồ án hồn tồn khơng chép từ đồ án tốt nghiệp người khác hình thức Các số liệu trích dẫn đồ án tốt nghiệp hồn tồn trung thực Tơi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm đồ án TP HCM, ngày 19 tháng 08 năm 2016 Sinh viên thực Hồng Sếch Hếnh ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Thị Hai tận tình hướng dẫn, bảo em suốt thời gian xây dựng đề cương, thực hoàn thành đồ án Em xin cám ơn đến thầy Huỳnh Văn Thành giúp đỡ, hỗ trợ tạo điều kiện tốt suốt trình em thực đồ án Em xin gửi lời cảm ơn đến quý Thầy, Cô khoa công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Mơi trường tận tình bảo truyền đạt kiến thức cho em suốt trình học tập để vận dụng kiến thức tảng vào thực đồ án Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình chăm sóc, dạy dỗ làm chỗ dựa tinh thần động viên, hỗ trợ kinh tế cho em suốt năm qua trình thực đồ án Em xin cám ơn đến bạn thực đề tài phịng thí nghiệm quan tâm, hỗ trợ em làm đồ án tốt nghiệp Cuối em xin cám ơn Thầy Cô Hội đồng phản biện dành thời gian đọc nhận xét đồ án Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến q Thầy Cơ Tp Hồ Chí Minh, 19 tháng năm 2016 Sinh viên thực Hồng Sếch Hếnh ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .1 LỜI CẢM ƠN .2 MỞ ĐẦU .1 Tính cấp thiết đề tài Tình hình nghiên cứu 2.1 Tình hình nghiên cứu nước 2.2 Tình hình nghiên cứu nước 3 Mục đích nghiên cứu Nhiệm vụ nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu .4 Ý nghĩa đề tài khoa học Các kết đạt đề tài Kết cấu đồ án tốt nghiệp .5 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .6 Đại cương Bacillus subtilis 1.1.Lịch sử phát 1.2.Đặc điểm phân loại phân bố vi khuẩn Bacillus subtilis 1.2.1.Đặc điểm phân loại 1.2.2.Phân bố 1.3.Đặc điểm hình thái [36] 1.4.Đặc điểm phân lập, nuôi cấy 1.4.1.Đặc điểm phân lập 1.4.2.Đặc điểm sinh hóa 1.5.Đặc điểm tế bào khả sinh bào tử 1.5.1.Đặc điểm tế bào 1.5.2.Cấu tạo bào tử 10 1.6.Tính đối kháng khả sinh bacteriocin 11 1.7.Ứng dụng Bacillus sản xuất đời sống [9] 11 i ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.8.Giới thiệu enzyme amylase protease tế bào 12 1.8.1.Enzyme amylase [12] 12 1.8.2.Enzyme protease 15 1.9.Một số enzyme cá 19 1.10.1.Thành phần cá, phụ phế phẩm cá 20 1.10.2.Tình hình đánh bắt, sản xuất Việt Nam 21 1.11.Phân bón có nguồn gốc từ cá 23 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1.Thời gian địa điểm thực đề tài 24 2.1.1.Địa điểm nghiên cứu: 24 2.1.2.Thời gian nghiên cứu 24 2.2.Vật liệu nghiên cứu: 24 2.2.3.Thiết bị dụng cụ 25 2.3.Bố trí thí nghiệm .26 2.3.1.Bố trí thí nghiệm chung 26 2.3.2.Bố trí thí nghiệm chi tiết 26 2.4.Phương pháp nghiên cứu .30 2.4.1.Phương pháp thu mẫu xử lý mẫu 30 2.4.2.Phương pháp tăng sinh 30 2.4.3.Phương pháp pha loãng mẫu 30 2.4.4.Phương pháp phân lập vi khuẩn có khả phân giải protein [14] 31 2.4.5.Phương pháp định tính khả sinh protease chủng vi khuẩn phân lập 31 2.4.6.Kiểm tra độ khiết giống : 32 2.4.8.Phương pháp cấy chuyền [38] 32 2.4.9.Phương pháp bảo quản lạnh sâu : 32 2.4.10.Các phương pháp xác định đặc điểm hình thái 33 2.4.11.Các thử nghiệm sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập nghi ngờ Bacillus subtilis 34 ii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.4.12.Phương pháp đục lỗ thạch 37 2.4.13.Phương pháp nghiên cứu khả phân giải tinh bột, protein 38 2.4.14.Phương pháp xử lý số liệu thống kê 38 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1.Kết phân lập lựa chọn chủng có khả Bacillus subtilis 39 3.2.Kết thử nghiệm sinh hóa 42 3.2.1.Kết test catalase 42 3.2.2.Nhuộm gram 42 3.2.3.Nhuộm bào tử 44 3.2.4.Kết thử nghiệm Citrate 45 3.2.5.Kết thử nghiệm Nitrate 46 3.2.6.Thử nghiệm MR - VP 47 3.2.7.Thử nghiệm indole 49 3.2.8.Thử nghiệm di động 50 3.2.9.Thử nghiệm lên men Carbohydrate 51 3.2.10.Khảo sát khả sinh enzyme protease amylase ngoại bào chủng vi khuẩn đề tài phân lập 52 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 4.1.Kết luận 58 4.2.Đề nghị 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 iii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC BẢNG Bảng 1 Kết định danh Bacillus subtiblis Bảng Phân loại protease theo Barret, 1984 18 Bảng Thành phần khối lượng cá tra số loài cá khác 22 Bảng Đặc điểm hình thái cụ thể chủng vi khuẩn đồ án phân lập .39 Bảng Kết định tính enzyme ngoại bào amylase protease chủng vi khuẩn phân lập 53 Bảng 3 Kết định danh sơ test sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập từ ruột cá 55 iv ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC HÌNH Hình 1 Tế bào Bacillus subtilis .6 Hình Sản lượng khai thác ni trồng thủy sản Việt Nam từ 1995 - 2015 22 Hình Sơ đồ bố trí bước thí nghiệm 26 Hình 2 Sơ đồ quy trình phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis có ruột cá .27 Hình Quy trình dịnh danh sơ chủng phân lập 29 Hình Kết thử nghiệm catalase .42 Hình Hình thái tế bào chủng vi khuẩn phân lập nhuộm Gram 44 Hình 3 Kết nhuộm soi bào tử chủng phân lập 45 Hình 4.Thử nghiệm Citrate chủng phân lập 46 Hình 3.5 Kết khảo sát khả khử nitrate chủng vi khuẩn phân lập .47 Hình Hình ảnh test Methyl red chủng phân lập 48 Hình 3.7 Kết phản ứng VP chủng vi khuẩn phân lập 49 Hình Phản ứng test indol chủng phân lập 50 Hình Khả di động chủng phân lập 51 Hình 10 Hình ảnh đặc trưng mơi trường khảo sát khả lên men đường .52 Hình 11 Khảo sát định tính protease Casein agar với thuốc thử TCA 10 % 54 Hình 12 Kết test định tính enzyme amylase chủng vi khuẩn phân lập 55 v ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT NA Nutrient agar NB Nutient broth MR Methyl red VP Voges Progkauer FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations TCA Trichloroacetic acid vi ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Ngành chế biến thủy sản nước ta sản lượng ngày tăng, mang lại nguồn lợi lớn cho quốc gia, song bên cạnh đó, việc chế biến thủy sản khơng sử dụng hết tồn phần chúng mà để lại nguồn phụ phế phẩm lớn, khơng xử lý lãng phí gây nhiễm mơi trường q trình phân giải protein, lipid…theo Trần Duy 2014, tồn cầu có khoảng 70 triệu thủy sản chế biến dạng phi lê, đơng lạnh, đóng hộp ngâm tẩm Trong năm 2011, sản lượng cá ngừ toàn cầu đạt 4,6 triệu tấn, nhiên sản phẩm cá ngừ đóng hộp có gần triệu [32], điều có nghĩa lượng phụ phẩm cá ngừ thải từ công nghiệp chế biến cá ngừ lên đến triệu Việc đánh bắt, chế biến thủy sản xuất kèm theo lượng phụ phế phẩm lớn, theo thống kê Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO) lượng phụ phế phẩm bao gồm: đầu, xương, da, vây, vẩy, thịt vụn nội tạng cá thải trình chế biến đồ hộp chiếm từ 30 – 65 %, sản xuất cá phi lê, cá khô, cá muối, cá xơng khói lượng phụ phế phẩm thải chiếm từ 50 – 75 % Sản xuất chế biến cá lấy phi lê, dùng đóng hộp thường lấy phần cơ, phụ phế phẩm sản xuất cá ngừ đóng hộp chiếm khoảng 65 % lượng nguyên liệu ban đầu, ngành sản xuất thịt cá ngừ cho thấy phế phẩm, phụ phẩm chiếm khoảng 50 % tổng nguyên liệu ban đầu, cá basa phụ phế phẩm chế biến cá phi lê gồm đầu, xương, mỡ, da, nội tạng, thịt vụn… chúng chiếm khoảng 65 – 70 % lượng nguyên liệu ban đầu [19] Phụ phế phẩm sản xuất chế biến thủy sản cá có thành phần chất hữu giàu Nitơ, sử dụng khơng mục đích xử lý không tốt chúng dễ bị phân hủy thành chất gây nhiễm khơng khí (các protein bị vi sinh vật phân giải hình thành H2S, NH3…) nhiều chất khác gây ô nhiễm nguồn đất, nguồn nước, ảnh hưởng nghiêm trọng đến đời sống, sức khỏe người mơi trường, cần có giải pháp khắc phục vần đề Tìm chủng vi sinh vật có khả phân giải protein giải pháp hữu hiệu, an toàn, tận dụng hiệu nguồn phụ phế phẩm từ ngành cơng nghiệp chế biến thủy sản nói chung chế biến cá nói riêng, từ có cách tận dụng hiệu Trong ruột cá có diện vi khuẩn có khả sinh enzyme protease phân giải tốt protein cá, đặc biệt chủng Bacillus [19] Nhiều chủng Bacillus ứng dụng nhiều lĩnh vực khác như: công nghiệp thực phẩm, sản xuất enzyme, probiotic… Và sản xuất phân bón vi sinh phân giải lân, silicat, ức chế vi sinh vật gây bệnh, phân giải cellulose… (Lê Thị Hồng Nhung, 2015) ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Các chủng vi sinh vật có sẵn mơi trường ruột cá, (Rahul Krishnan, 2014), chúng tự phát triển hỗ trợ tiêu hóa cho cá cịn sống loài khác tiết enzyme phân giải cá cá chết Trong điều kiện tự nhiên chúng sinh trưởng cần thời gian dài chúng phát triển nhanh chóng, tối ưu tăng sinh hoạt hóa giống từ chủng khiết, lúc chủng vi sinh vật cho sản phẩm enzyme nhiều tốt hơn, rút ngắn thời gian xử lý phân giải nguồn phụ phế phẩm cá cho sản phẩm tốt hơn, hiệu lên men tốt Sản xuất nông nghiệp hữu phương pháp canh tác tiến bộ, chứa đựng hàm lượng khoa học cơng nghệ tính nhân văn cao (Lê Văn Hưng, 2001) Tính nhân văn cao chỗ tất công đoạn sản xuất nông nghiệp hữu hướng đến an toàn cho người, vật nuôi môi trường sinh thái xung quanh, hướng đến hành tinh xanh [5] Việt Nam nước có dân số sản xuất nơng nghiệp lớn, diện tích đất sản xuất nơng nghiệp lớn Theo thống kê năm 2013, tổng diện tích đất nơng nghiệp 262.805 km2 (chiếm tới 79,4 %) bao gồm đất sản xuất nông nghiệp 101.511 km2, đất lâm nghiệp 153.731 km2, đất nuôi trồng thuỷ sản 7.120 km2 [7] Vì nhu cầu phân bón cho sản xuất nông nghiệp lớn Mặt khác sử dụng phân bón hóa học khơng có lợi cho đất, phân bón hóa học làm giảm pH đất, chúng hấp thụ nhanh, bón lượng lớn chất dinh dưỡng, hấp thụ không hết làm ô nhiễm môi trường đất Từ sở trên, đề tài “phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ ruột cá” thực để tận dụng hiệu an toàn nguồn tài nguyên cần thiết Tình hình nghiên cứu 2.1 Tình hình nghiên cứu nước Bacillus subtilis nghiên cứu rộng rãi nước nhằm sử dụng cho mục đích sản xuất probiotic, thu nhận enzyme… Một số cơng trình nghiên cứu phân lập ứng dụng Bacillus subtilis tiết loại protease như: Nguyễn Thị Trần Thụy, 2009 Nghiên cứu tuyển chọn số chủng Bacillus phân lập từ đất vườn sinh protease kiềm Bùi Thị Phi, 2007 Phân lập, khảo sát đặc điểm vi khuẩn Bacillus subtilis tìm hiểu khả sinh enzyme (protease, amylase) vi khuẩn để sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nghiên cứu tận dụng cá phế liệu để sản xuất dịch cao đạm dùng thức ăn nuôi tôm, cá Đặng Thị Mộng Quyên Trần Thị Xô, 2006 Nghiên cứu khảo sát khả thủy phân protein phụ phẩm cá tra enzyme protease từ Bacillus subtilis S5 Nguyễn Thị Nếp, 2005 2.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước Syeda Azeem Unnisa sản xuất phân bón từ thức ăn thừa có bổ sung đường nâu Mrunmaya Kumar Panda cộng nghiên cứu phân lập Bacillus sp ưa nhiệt từ suối nước nóng có hoạt tính protease cao Cũng có số cơng trình nghiên cứu phân lập Bacillus subtilis từ ruột cá Jamal K.H Al Faragi Sundus A.A Alsaphar, 2012 hay Rahul Krishnan phân lập từ cá nước ngọt, 2014 Mục đích nghiên cứu Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả sinh enzyme protease mạnh từ ruột cá Nhiệm vụ nghiên cứu Phân lập chọn lọc chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả sinh enzyme protease mạnh từ ruột cá Định danh sơ test sinh hóa Khảo sát ảnh hưởng pH đến khả sinh enzyme chủng vi khuẩn phân lập Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp tổng hợp tài liệu: + Thu thập, tìm hiểu tài liệu tham khảo, sách, giáo trình internet liên quan đến đề tài + Tổng hợp, lựa chọn tài liệu liên quan đến mục tiêu đề tài - Phương pháp nghiên cứu: + Phân lập chủng vi khuẩn có khả sinh enzyme protease tuyển chọn chủng có khả sinh enzyme mạnh từ nguồn ruột cá ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP + Thực số khảo sát hình thái, thử nghiệm sinh hóa đặc trưng cho chủng Bacillus subtilis để tuyển chọn chủng mong muốn, loại vi sinh vật có nguy gây bệnh + Bố trí thí nghiệm khảo sát khả sinh enzyme protease phân hủy protein từ chủng vi khuẩn tuyển chọn + Khảo sát khả thủy phân protein từ phụ phế phẩm cá từ chủng phân lập - Phương pháp thu thập xử lý số liệu: + Ghi nhận số liệu trực tiếp từ thí nghiệm bố trí khảo sát + Xử lý số liệu phần mềm Statistical Analysis System (SAS) Đối tượng phạm vi nghiên cứu - Đối tượng: Nghiên cứu thử nghiệm chủng vi khuẩn có khả phân giải protein từ nguồn ruột cá thu thập từ chợ - Phạm vi giới hạn đề tài: Vi khuẩn Bacillus subtilis phân giải protein có nguồn gốc từ cá Ý nghĩa đề tài khoa học - Ý nghĩa khoa học: Phân lập chủng vi khuẩn B.subtilis có khả phân giải protein đạt hiệu cao, góp phần xác định số đặc điểm hình thái tế bào hình thái khuẩn lạc số chủng vi khuẩn nhóm B.subtilis, xác định điều kiện yếu tố pH tố đến khả sinh enzyme vi khuẩn phân lập - Ý nghĩa thực tiễn: Dựa kết thí nghiệm nghiên cứu thu để góp phần tìm chủng vi khuẩn có khả sinh enzyme protease mạnh ứng dụng để tạo sản phẩm phân bón tận dụng phụ phế phẩm từ cá bảo vệ môi trường Các kết đạt đề tài - Phân lập chủng vi khuẩn có khả sinh enzyme protease phân giải protein từ cá, từ kết phân lập sau định danh sơ phản ứng test sinh hóa đặc trưng Bacillus subtilis trùng khớp ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -Kết khả tổng hợp enzyme protease thực cho chủng vi khuẩn phân lập môi trường nhân tạo giàu protein làm sở để sản xuất chế phẩm phân bón từ nguồn phụ phế phẩm cá -Bước đầu ứng dụng vi khuẩn phân lập tuyển chọn vào xử lý thủy phân protein từ phụ phế phẩm cá Kết cấu đồ án tốt nghiệp - Phần Mở đầu - Chương 1: Tổng quan tài liệu - nội dung chương đề cập đến nội dung liên quan đến tài liệu nghiên cứu -Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu - nội dung chương đề cập đến dụng cụ, thiết bị phương pháp nghiên cứu đồ án -Chương 3: Kết thảo luận - nội dung chương đưa kết mà đề tài thực đưa thảo luận, biện chứng cho kết thu -Phần Kết luận đề nghị: nội dung tóm lại kết mà đề tài đạt đề nghị cho hướng cần cải thiện thêm đề tài ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Đại cương Bacillus subtilis 1.1 Lịch sử phát Bacillus subtilis lần phát năm 1835 đặt tên “vibrio subtilis” nhà khoa học Christian Gottfried Ehrenberg Vào năm 1972 đổi tên thành Bacillus subtilis Ferdinand Cohn Ngày nay, vi khuẩn sử dụng rộng rãi y học, chăn nuôi thực phẩm (Lý Kim Hữu, 2005) 1.2 Đặc điểm phân loại phân bố vi khuẩn Bacillus subtilis 1.2.1 Đặc điểm phân loại Theo phân loại Bergey (1994) Bacillus subtilis thuộc: Lãnh giới: Bacteria Giới: Monera Ngành: Firrmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacilales Họ: Baccilaceae Chi: Bacillus Lồi: Bacillus subtilis Hình 1 Tế bào Bacillus subtilis (Nguồn: http://www.bharatvyapar.in/mitushi-pharma/bacillus-subtilis) ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.2.2 Phân bố Bacillus subtilis vi khuẩn hiếu khí túy nghi [21], chúng phân bố rộng khắp nơi tự nhiên, chúng tìm thấy tầng đất, đường tiêu hóa động vật nhai lại người [36], Bacillus subtilis thường tìm thấy nhiều cỏ khơ nên chúng cịn gọi trực khuẩn cỏ khô Phần lớn chúng cư trú đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu cfu/g Đất nghèo dinh dưỡng vùng sa mạc, vùng đất hoang vi khuẩn Bacillus subtilis Nước bùn cửa sông nước biển có mặt bào tử tế bào Bacillus subtilis (trích Bùi Thị Phi, 2007) Trong ruột cá có tồn chủng lồi vi khuẩn [19], [40] Bacillus subtilis trực khuẩn có lợi hệ vi khuẩn đường ruột, chúng ức chế phát triển vi sinh vật có hại đường tiêu hóa [11] 1.3 Đặc điểm hình thái [36] Bacillus subtilis trực khuẩn gram dương, hai đầu trịn, phản ứng catalase dương tính, chúng có khả tạo bào tử để tồn môi trường khắc nghiệt B.subtilis có roi giúp chúng di chuyển, chúng có khả di chuyển nhanh chóng chất lỏng Kích thước tế bào chúng khong 0,5 - 0,8 àm ì 1,8 - àm [37] Khi gặp điều kiện bất lợi, Bacillus subtilis hình thành bào tử để vượt qua điều kiện bất lợi, gặp điều kiện thuận lợi bào tử Bacillus subtilis nảy mầm phát triển tế bào với chu kỳ sống Bào tử B.subtilis có hình bầu dục, kích thước khoảng 0,6 - 0,9 µm Phân bố không theo quy tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm khơng tâm 1.4 Đặc điểm phân lập, nuôi cấy 1.4.1 Đặc điểm phân lập Bacillus subtilis phát triển tốt điều kiện có oxy nhiệt độ thích hợp chúng 36 – 50 0C, tối đa khoảng 60 0C (trích Nguyễn Thị Trần Thụy, 2009), nhiệt độ tối thích cho lồi vi khuẩn sinh trưởng 37 0C (Bùi Thị Phi, 2007) Trong điều kiện thiếu oxy loài vi khuẩn có khả tồn tại, phát triển yếu nhờ khả lên men nguồn carbonhydrate chúng Độ pH: pH tối ưu Bacillus subtilis khoảng - 7,4 Khi nuôi cấy môi trường đĩa thạch, khuẩn lạc B.subtilis khô, không màu màu xám trắng, có dạng trịn, khơng hay phân tán, rìa cưa khơng đều, mép nhăn, tâm có màu sẫm, sau - ngày bề mặt khuẩn lạc trờ nên nhăn nheo khô, màu nâu ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Trên môi trường lỏng NB B.subtilis phát triển mạnh làm đục mơi trường, song song vi khuẩn kết màng phía bề mặt mơi trường ni cấy 1.4.2 Đặc điểm sinh hóa Bacillus subtilis có số test sinh hóa đặc trưng sau: Lên men không sinh loại đường Glucose, Maltose, Mannitol, Sucrose, Xylose, Arabinose Indol (-), VP (+), Nitrate (+), H2S (-), NH3 (+), Catalase (+), Amylase (+), Casein (+), Citrate (+), có khả di động hiếu khí ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 1 Kết định danh Bacillus subtiblis Phản ứng sinh hóa Kết Catalase + Indol - MR + VP + Citrate + Nitrate + Gelatin + Di động + Amylase + Arabinose + Xylose + Saccharose + Mannitol + Glucose + Lactose - Maltose + (Theo Holt, 1992) (trích Lý Kim Hữu, 2005) 1.5 Đặc điểm tế bào khả sinh bào tử 1.5.1 Đặc điểm tế bào Tế bào Bacillus subtilis hình que, tế bào gram dương, chúng có khả sinh bào tử để tồn qua thời điểm khó khăn, điều kiện mơi trường khắc nghiệt nhiệt độ tăng cao, môi trường dinh dưỡng cạn kiệt, khơ hạn… Thành phần hóa học chủ yếu vách tế bào lớp peptidoglycan dày mang diện tích dương đóng vai trị trì cấu trúc vách tế bào ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.5.2 Cấu tạo bào tử Bacillus subtilis sinh bào tử, chiều ngang bào tử không vượt chiều ngang tế bào vi khuẩn nên khơng làm thay đổi hình thái tế bào mang bào tử [11] Bào tử cấu trúc hình thành biến đổi tế bào sinh dưỡng giai đoạn trình sinh trưởng vi khuẩn điều kiện môi trường không thuận lợi, tế bào phát triển đến giai đoạn định Hai chủng vi khuẩn gram dương có khả tạo bào tử Bacillus Clostridium Bào tử vi khuẩn cấu trúc phức tạp [38], bào tử có nhiều lớp màng bao bọc, lớp gọi lớp màng mỏng lớp vỏ tế bào mẹ, lớp áo bào tử, lớp áo bào tử gồm nhiều lớp protein mỏng khơng có tính thấm, lớp áo bào tử đảm bảo tính kháng bào tử Vỏ bào tử gồm nhiều lớp peptidoglycan chiếm thể tích lớn, cầu nối nội peptide liên kết chéo Trong bào tử lõi bào tử vách bào tử bao bọc có cấu trúc tế bào bình thường tình trạng bất hoạt [38] 1.5.2.1 Đặc điểm bào tử Bào tử Bacillus subtilis khơng phải hình thức sinh sản nấm mà chúng dạng cấu trúc đặc biệt có tính kháng chun biệt giúp chủng lồi tồn qua giai đoạn điều kiện sống bất lợi Bào tử khả lưu tồn tốt điều kiện khó khăn mơi trường sống mà chúng cịn có khả sống lâu (bào tử xác sinh vật cổ đại 1000 năm đáy băng hà 3000 năm quặng mỏ 250 triệu năm đến sống) [11] Nhiệt độ 100 0C, bào tử số lồi Bacillus chịu đựng từ 2,5 20 Ngoài việc chịu nhiệt độ khơ cao, bào tử chịu khơ hạn tác động nhiều loại hóa chất loại tia sáng [11] Quá trình hình thành bào tử: tế bào sinh bào tử điều kiện thiếu thức ăn có tích lũy sản phẩm trao đổi chất có hại bắt đầu thực trình hình thành bào tử Trong bào tử nước liên kết chiếm đến 40 % chứa nhiều ion Ca2+ Sự nảy mầm bào tử 10 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Quá trình chuyển từ trạng thái nghỉ sang tế bào sinh dưỡng vi khuẩn gọi trình nảy mầm bào tử Quá trình gồm giai đoạn là: hoạt hóa, nảy mầm sinh trưởng [11] Khả tạo bào tử: theo Bùi Thị Phi, 2007 đặc điểm quan trọng Baciluss subtilis khả sinh bào tử điều kiện định Bacillus subtilis hình thành bào tử theo chu kỳ sống hay gặp điều kiện bất lợi [11] Theo Bùi Thị Phi, 2007 tạo bào tử diễn gồm nhiều giai đoạn đến để hồn tất 1.5.2.2 Sự hình thành bào tử Hình thành búi chất nhiễm sắc Tế bào chất bắt đầu phân cắt không đối xứng, tạo vùng nhỏ gọi tiền bào tử Tiền bào tử hình thành hai lớp màng, tăng cao tính kháng xạ Lớp vỏ sơ khai hình thành giữ hai lớp màng bào tử sau tích lũy nhiều peptidoglycan tổng hợp DPA (acid dipicolinic), tích lũy calci, tính chiết quang cao Kết thúc việc hình thành áo bào tử Kết thúc việc hình thành vỏ bào tử, bào tử thành thục, bắt đầu có tính kháng nhiệt Bào nang vỡ giải phóng bào tử ngồi [38] 1.6 Tính đối kháng khả sinh bacteriocin Trong môi trường điều kiện môi trường khác nhau, chủng lồi vi khuẩn lại có khả sinh trưởng phát triển khác Khi thay đổi môi trường sống chúng hay yếu tố môi trường bất lợi làm điều kiện môi trường sống thay đổi theo chiều hướng bất lợi cho vi sinh vật làm chúng sinh trưởng phát triển ức chế phát triển vi sinh vật Theo Bùi Thị Phi, mơi trường ni cấy nấm bệnh có diện Bacillus subtilis với số lượng lớn cạnh tranh sinh dưỡng không gian sống vi khuẩn nấm Bacillus phát triển nhanh nên phát triển trước so với nấm nên sử dụng phần lớn chất dinh dưỡng sinh số chất ức chế phát triển nấm bệnh 1.7 Ứng dụng Bacillus sản xuất đời sống [9] 11 ... kết có đồ án hồn tồn khơng chép từ đồ án tốt nghiệp người khác hình thức Các số liệu trích dẫn đồ án tốt nghiệp hồn tồn trung thực Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm đồ án TP HCM, ngày 19 tháng 08... phân lập Bacillus subtilis từ ruột cá Jamal K.H Al Faragi Sundus A.A Alsaphar, 2012 hay Rahul Krishnan phân lập từ cá nước ngọt, 2014 Mục đích nghiên cứu Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus subtilis. .. 1 Tế bào Bacillus subtilis (Nguồn: http://www.bharatvyapar.in/mitushi-pharma /bacillus- subtilis) ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.2.2 Phân bố Bacillus subtilis vi khuẩn hiếu khí túy nghi [21], chúng phân bố