Đang tải... (xem toàn văn)
tính của chủng vi khuẩn lactic thuộc loài Lactobacillus plantarum DC2 phân lập từ sản phẩm dưa cải tại thành phố Huế, đã được khảo sát kết quả cho thấy chủng này có một số tiềm năng [r]
(1)799 XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG CHỊU MẶN VÀ MỘT SỐ TÍNH CHẤT
CĨ TIỀM NĂNG PROBIOTIC CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTIC
THUỘC LOÀI LACTOBACILLUS FERMENTUM PHÂN LẬP TỪ RUỘT
CÁ NỤC (DECAPTERUS LAJANG)
Đỗ Thị Bích Thủy, Nguyễn Thị Diễm Hương
Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế
Liên hệ email: dothibichthuy@huaf.edu.vn
TÓM TẮT
Tám chủng vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá nục (Decapterus lajang) (CN) (NU1, NU2, NU3,
NU7, NU8, NU17, NU18, NU21) thuộc loài Lactobacillus fermentum tiến hành khảo sát khả
chịu mặn Kết cho thấy tất chủng khảo sát phát triển nồng độ muối khảo sát từ 5% đến 25% với thời gian ủ 48 Trong đó, chủng NU17 có khả chịu mặn cao nhất, OD600nm đo sau ủ chủng NU17 48 với nồng độ muối 25% 0,1809 Chủng
chọn để xác định số tính chất có tiềm probiotic khả chịu axit khả tự kết dính Số tế bào sống sót chủng NU17 sau hai ủ pH 4,895 log CFU/ml Khả tự kết dính chủng NU17 36,58%
Từ khóa: khả chịu mặn, probiotic, vi khuẩn lactic
Nhận bài: 20/04/2018 Hoàn thành phản biện: 25/05/2018 Chấp nhận bài: 30/05/2018
1 MỞ ĐẦU
Vi khuẩn lactic (lactic acid bacteria - LAB) có vai trị quan trọng đời sống Chúng loại vi khuẩn có lợi, có khả bảo quản, chế biến làm tăng giá trị dinh dưỡng cho số thực phẩm Nhiều nghiên cứu thực công bố nhiều công dụng khác LAB Tiềm probiotic đặc tính có lợi LAB Việc khảo sát tiềm để tuyển chọn làm lợi khuẩn probiotic có ý nghĩa lớn y học công nghệ thực phẩm Khi tồn hệ đường ruột người hay động vật chúng kích thích tiêu hóa, giảm cholesterol máu, tăng hệ miễn dịch
Chủng vi sinh vật có tính chất probiotic trước hết phải sống sót qua điều kiện khắc nghiệt dày pH dày người thường dao động khoảng đến - Một số nghiên cứu khảo sát khả sống sót chủng nghiên cứu mốc pH từ đến (Liong Shah, 2005; Maragkoudakis cs., 2006) Một số nghiên cứu khác khảo sát pH đại diện dày (pH = – 2,5) (Maria, 2006), Sangtiago cs., 2008) Khả bám dính tiêu chí để đánh giá tiềm probiotic LAB Nó thể khả sống sót, khả cạnh tranh khả đối kháng với vi sinh vật có hai đường ruột Có ba tiêu quan trọng việc đánh giá khả bám dính vi khuẩn probiotic có liên quan đến tác động chúng với vật chủ, khả tự kết dính, đồng kết dính bám dính với đường ruột vật chủ Đã có nhiều cơng bố có liên quan đến khả bám dính LAB (Kos cs., 2003; Greene cs., 1994) Trong nghiên cứu nghiên cứu hai tính chất probiotic LAB khả chịu pH thấp khả tự kết dính
(2)800
tính chủng vi khuẩn lactic thuộc loài Lactobacillus plantarum DC2 phân lập từ sản phẩm dưa cải thành phố Huế, khảo sát kết cho thấy chủng có số tiềm probiotic chịu pH thấp, kết dính, đồng kết dính cao Ba mươi chủng vi khuẩn lactic phân lập định danh từ tôm chua cơng bố có tiềm probiotic cao đồng thời có khả kháng Escherichia coli tốt Các tính chất có lợi chủng vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá cơm trắng, mắm ruốc Huế, mắm rị chúng tơi nghiên cứu (Đỗ Thị Bích Thủy, 2014; Đỗ Thị Bích Thủy cs., 2013; Võ Văn Quốc Bảo Đỗ Thị Bích Thủy, 2016; Nguyễn Thị Diễm Hương Đỗ Thị Bích Thủy, 2015)
Với mục đích khai thác nguồn vi khuẩn lactic có tiềm probiotic từ ruột cá có khả chịu mặn để ứng dụng hồn thiện quy trình sản xuất sản phẩm lên men truyền thống có độ mặn cao, cơng trình này, chúng tơi tiến hành khảo sát khả chịu mặn số tính chất có tiềm probiotic chủng vi khuẩn lactic thuộc loài
Lactobacillus fermetum phân lập từ ruột cá nục, loại nguyên liệu chủ yếu sử dụng để sản xuất nước mắm Việt Nam
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu
Tám chủng vi khuẩn lactic (NU1, NU2, NU3, NU7, NU8, NU17, NU18, NU21) thuộc loài Lactobacillus fermentum phân lập từ ruột cá nục định danh phương pháp MALDI-TOF MS giải trình tự gen PheS phịng thí nghiệm vi sinh, Đại học Ghent, Bỉ
2.2 Khảo sát khả chịu mặn
Khả chịu mặn chủng vi khuẩn lactic đánh giá qua giá trị OD600nm
(mật độ quang – optical density) nuôi chúng mơi trường MRS lỏng có chứa nồng độ muối tương ứng 0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25% sau 48 theo phương pháp Kobayashi (2004) Phân tích kết dựa so sánh giá trị OD nồng độ muối để đưa kết luận khả tồn phát triển chủng nồng độ muối khác
Khuẩn lạc vi khuẩn từ môi trường MRS agar đĩa petri cấy chuyền vào ống fancol 50 ml có chứa MRS lỏng tiến hành ni cấy 24 37oC Sinh khối sau
nuôi cấy thu nhận cách ly tâm 5.000 vòng/phút nhiệt độ 4oC phút Sinh
khối tiếp tục tái huyền phù nước muối sinh lý điều chỉnh để OD600nm ~
Phân phối vào ependoff 100µL huyền phù 900 µL mơi trường MRS lỏng bổ sung nồng độ muối 0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25% Đo OD600nm sau 48 ủ
ở 37oC
2.3 Khảo sát khả chịu axit
Khả chịu axit chủng khảo sát đánh giá qua lượng vi khuẩn sống sót sau ủ pH qua mốc thời gian giờ, Số tế bào vi khuẩn sống sót xác định theo phương pháp Kock (Maragkoudakis cs 2006)
Theo đó, chủng vi khuẩn nuôi cấy 24 giờ, ly tâm thu sinh khối 5.000 vòng/phút phút nhiệt độ 4oC, rửa sinh khối đệm phosphate 0,1M pH 7,2 hai
lần, sau tái huyền phù 1mL đệm votex, trộn 1mL dịch sau tái huyền phù với 24,5 mL dung dịch NaCl 0,2%, pH (pH chỉnh dịch HCl 5M)
(3)801
trường MRS Mẫu ủ 48 37oC đếm số khuẩn lạc đơn
Số tế bào vi khuẩn mL mẫu (CFU: colony forming units) N (CFU/mL) =
i ivd n vd
n
C 1
Trong đó, N số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn mL mẫu, C tổng số khuẩn lạc đếm hộp petri chọn, ni số hộp petri cấy độ pha loãng
thứ i, di hệ số pha loãng tương ứng, v thể tích dịch mẫu (mL) cấy vào đĩa 2.4 Khảo sát khả tự kết dính
Khi tế bào vi khuẩn tự kết dính lại với tạo nên hạt có kích thước lớn lắng xuống dung dịch Do theo thời gian mật độ tế bào bề mặt dịch vi khuẩn giảm Mức giảm OD phản ánh tỷ lệ vi khuẩn kết dính Thí nghiệm tiến hành theo phương pháp Kos cs (2003) Chủng vi khuẩn nuôi cấy môi trường MRS 24 37oC Sinh khối sau nuôi cấy thu nhận cách ly tâm
5.000 vòng/phút phút 4oC rửa hai lần đệm phosphat pH 7,2 Sinh khối sau
đó tái huyền phù đệm để OD Huyền phù tiếp tục phân phối vào ống nghiệm, votex 10 giây để yên 37oC Đo OD
600nm lớp dịch phía
thời điểm sau Tỷ lệ tự kết dính (%) tính cơng thức: )
A At (
0
100 Trong đó, At Ao OD600nm thời điểm
2.5 Phương pháp xử lý số liệu:Sử dụng phần mềm SPSS 18.0 exel 2007 để xử lý số liệu
3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Kết khả chịu mặn hệ vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá nục
Khả chịu mặn chủng LAB phân lập từ ruột cá nục đánh giá qua giá trị OD600nm sau nuôi cấy chúng môi trường MRS lỏng có chứa nồng độ muối tương
ứng 0%, 5%, 10%, 15%, 20% 25% sau 48 Kết thu trình bày Bảng
Bảng Khả chịu mặn hệ vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá nục sau 48 nuôi cấy
Tên chủng 0% 5% 10% 15% 20% 25%
NU1 0,2324b 0,8691a 0,1148c 0,1251c 0,1728b 0,1801b
NU2 0,2479b 0,9507a 0,0772f 0,1003e 0,1253d 0,1746c
NU3 0,2520b 1,2760a 0,0883f 0,1266d 0,1101e 0,1621c
NU7 0,2094b 1,2759a 0,0773f 0,1150d 0,0866e 0,1508c
NU8 0,2300b 0,4880a 0,0944e 0,1263d 0,1264d 0,1661c
NU17 0,18773b 1,3926a 0,1024e 0,1328d 0,1315d 0,1809c
NU18 0,2239b 1,0590a 0,1734c 0,1163f 0,1273e 0,1366d
NU21 0,1888b 0,9698a 0,1019f 0,1162e 0,1233d 0,1741c
Ghi chú: Số liệu xử lý ducan’s theo dòng (chữ in thường) thể sai khác theo nồng độ muối chủng Các chữ khác thể sai khác ý nghĩa thống kê (P< 0,05) (-) : không phát
Qua Bảng 1, nhận thấy tất chủng vi khuẩn lactic phân lập có khả thíchnghi phát triển tất nồng độ muối từ 5% - 25% Giá trị OD600nm
(4)802
chủng vi khuẩn lactic có khả thích nghi phát triển mạnh nồng độ muối 5% với giá trị OD chủng NU17 đạt 1,3926 cao chủng NU8 đạt 0,4880 thấp sau 48 nuôi cấy Khả phát triển chủng vi khuẩn lactic nồng độ muối 10% giảm so với nồng độ 15% khơng có khác biệt lớn Ở nồng độ muối 20% 25% thích nghi phát triển chủng vi khuẩn lactic nhìn chung giống với nồng độ khảo sát nhiên giá trị OD có xu hướng tăng dần Đặc biệt có chủng lactic NU17 phát triển tốt nồng độ 20% 25% với giá trị OD 0,1315 0,1809
Tất chủng vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá nục có khả thích nghi phát triển nồng độ muối 5-25%, hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu Udomsil cs (2010) loài Tetragenococcus halophilus. Tác giả tiến hành khảo sát khả chịu muối T halophilus nồng độ 25% mẫu nước mắm cho thấy, chúng sống sót sau bảy tháng nước mắm Juste cs (2008) cơng bố T halophilus có khả phát triển nồng độ muối 25% 28,5% pH7
Điều chứng tỏ rằng, khả chịu muối chủng vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá nục cao, chủng NU17 có khả thích nghi phát triển tốt Chính vậy, chủng vi khuẩn lactic NU17 phân lập từ ruột cá nục có tiềm ứng dụng lớn việc sản xuất sản phẩm lên men chứa nồng độ muối cao nước mắm, sản phẩm mắm cá
3.2 Kết khả chịu axit hệ vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá nục
Kết khảo sát khả chịu axit chủng vi khuẩn qua mốc liên tục từ đến dịch axit có pH Kết trình bày Đồ thị
Đồ thị 1.Kết khả chịu axit chủng NU17 pH
Kết Đồ thị cho thấy số lượng tế bào lại sau ủ với dịch pH giảm rõ rệt theo thời gian Số tế bào sau ủ với dịch pH qua mốc thời gian 0, 1, 9,573; 8,267 4,895 log CFU/ml Chủng NU17 có sức chịu đựng môi trường axit số tế bào sống cịn lại với tỷ lệ thấp khơng phát tế bào sống sau ủ với dịch pH Điều chứng tỏ rằng, khả chịu axit chủng NU17 thấp
0 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000 6.000 7.000 8.000 9.000 10.000
0h 1h 2h 3h
(5)803
Kết phù hợp với nghiên cứu Maragkoudakis cs (2006) khảo sát khả chịu axit số chủng Lactobacillus, kết cho thấy chủng có khả chịu axit mạnh L paracasei subsp; L paracasei ACA-DC 130, L plantarum ACA-DC 146, L rhamnosus
ACA-DC 112, với mức giảm log CFU/ml từ 8,6 xuống 6,8; 5,7 7,1 sau ủ pH 2, ra, số chủng nghiên cứu nhóm tác giả khơng có khả sống sót pH2 sau giờ
Kết nghiên cứu Kim cs (2007) cho thấy xử lý dịch dày pH 2,5, có 3/7 chủng vi khuẩn có khả chịu môi trường axit Tỉ lệ sống chủng giảm từ khoảng 8,519 - 8,477 (logCFU/ml) xuống 6,431 - 7,380 (logCFU/ml) sau 30 phút xử lý tiếp tục giảm 5,568 - 5,699 (logCFU/ml) sau
Chang cs (2015) phân lập 207 chủng vi khuẩn lactic, có mười chủng tồn pH2 0,3% muối mật chủng thuộc loài Lactobacillus plantarum
(E1, E38, E40, E51 E55), chủng thuộc loài Lactobacillus casei (E7, E15, E30, E33 E40), chủng thuộc loài Lactobacillus rhamnosus (E8) Các chủng vi khuẩn tồn pH 0,3% muối mật sau Lactobacillus casei E33, Lactobacillus plantarum
E51, E7
Chủng vi khuẩn lactic NU17 có khả chịu axit thấp khơng đáp ứng tiêu chí chịu axit chủng probiotic
3.3 Kết khả tự kết dính hệ vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá nục
Khảo sát khả tự kết dính vi khuẩn lactic nghiên cứu có ý nghĩa thực tiễn Nhờ có tự kết dính mà vi khuẩn lactic dòng liên kết với tạo thành “tổ”, chúng giúp tăng cường sức sống phát triển chúng theo kiểu mối quan hệ hỗ trợ loài Khả tự kết dính cịn có liên quan đến khả bám dính đường ruột cịn làm tăng khả lưu lại đường tiêu hóa chủng vi sinh vật Đây đặc tính mang lại nhiều lợi ích cho vi khuẩn lactic q trình sinh trưởng phát triển Chính vậy, khả tự kết dính chủng vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá nục khảo sát
Kết cho thấy khả tự kết dính chủng NU17 có tỷ lệ kết dính cao đạt 36,58% Kết tương tự số nghiên cứu công bố.Kos cs (2003) nghiên cứu khả tự kết dính chủng probiotic Lactobacillus acidophilus M92 Chủng có tỷ lệ tự kết dính cao, đến 70% nhiệt độ phịng Maria cs (2006) nghiên cứu khả tự kết dính Lactobacillus và Bifidobacterium nhận thấy có biến động lớn khả tự kết dính chủng, năm chủng khảo sát thí nghiệm có kết tự kết dính 5,5%, 15%, 23%, 75% 77% nhiệt độ phịng, nhóm tác giả kết luận khả bám dính vi khuẩn lactic phụ thuộc vào chủng vi khuẩn, tức chủng khác lồi có tỷ lệ tự kết dính khác
Theo kết nghiên cứu Đỗ Thị Bích Thủy cộng (2012) đưa tỷ lệ kết dính chủng Lactobacillus fermentum DC1 sau 24,49% Rauta cs (2013) cho kết kết dính chủng vi khuẩn lactic thuộc lồi Lactobacillus acidophilus NCDC 291 43,21% chủng thuộc loài Lactobacillus acidophilus NCDC 13 đạt 40%
(6)804
4. KẾT LUẬN
- Tất chủng vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá nục có khả chịu muối NaCl nồng độ 5% đến 25% Trong đó, chủng NU17 chủng có khả phát triển tốt nồng độ muối Vì chủng chọn để tiến hành khảo sát tiêu
- Số tế bào sống sót chủng NU17 sau hai ủ pH 4,895 log CFU/ml khơng có khả sống sót sau ủ
- Khả tự kết dính chủng NU17 36,58%
TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Tài liệu tiếng Việt
Bộ Y tế (2006) Quyết định số 08/2006/QĐ-BYT ngày 06/02/2006 việc ban hành tiêu chuẩn ngành y tế
Võ Văn Quốc Bảo, Đỗ Thị Bích Thủy (2016) Phân lập, định danh khảo sát số tính chất probiotic
của vi khuẩn lactic từ mắm ruốc Huế Tạp chí khoa học – Đại học Huế,121(7), 35-44
Nguyễn Thị Diễm Hương, Đỗ Thị Bích Thủy (2015) Định danh khảo sát số tính chất vi
khuẩn lactic phân lập từ ruột cá cơm trắng Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển nông thôn, 14,
72 – 80
Đỗ Thị Bích Thủy (2010) Phân lập, tuyển chọn, xác định khảo sát số tiềm probiotic
chủng Lactobacillus fermentum MC9 từ sản phẩm măng chua Huế Tạp chí Nơng nghiệp &
Phát triển nơng thơn, 18, 19-26
Đỗ Thị Bích Thủy Nguyễn Thị Diễm Hương, (2012) Xác định khảo sát số tính chất có lợi
của chủng Lactobacillus fermentum DC1 phân lập từ sản phẩm dưa cải Huế Tạp chí khoa học,
Đại học Huế,71(2), 175 -185
Đỗ Thị Bích Thủy, Phan Thị Bé, Trần Thị Ái Luyến (2013) Khảo sát số đặc tính chủng
Lactobacillus plantarum DC2 phân lập từ sản phẩm dưa cải thành phố Huế, Việt Nam Tạp
chí cơng nghệ sinh học, 11 (1), 145-152
Đỗ Thị Bích Thủy (2014) Định danh khảo sát số tính chất có tiềm probiotic vi khuẩn
lactic phân lập từ tôm chua Huế Tạp chí Nơng nghiệp & phát triển nơng thơn, 4-2014, 97-104
Hồ Văn Thảo, Hoàng Quốc Khánh (2007) Phân lập, định danh tuyển chọn chủng Enterococcus
có tiềm probiotic từ phân trẻ sơ sinh Kỷ yếu khoa học công nghệ viện sinh học nhiệt đới,
2007, 249-254.
2 Tài liệu tiếng nước
Chang S.M., ChiLin T., Wan C W & Tsong R Y (2013) Isolation and functional study of potentially probiotic
Lactobacilli from Taiwan traditional paocai African Journal of Microbiology Research, 7(8),
683-691
FAO/WHO (2001) Joint expert consultation on evaluation of health and nutritional properties of
probiotics in food including powder milk with live lactic acid bacteria, Córdoba, Argentina
FAO/WHO (2002) Joint working group report on drafting guidelines for the evaluation of probiotics
in food, Ontario, Canada
Greene J D., & Kalenhammer T R (1994) Fctore invilved in adhenrence of Lactobacilli to human
Caco-2 cells Applied Envirnoment Microbiology,60, 4487 – 4494
Juste A., Lievens B., Frans I., Marsh T.L., Klinge berg M., Michiels C.W & Willems K.A (2008)
Geretic and physiological diversity of Tetragnococcus halophilus strains isolated from sugar
anh salt rich environment Microbilogy,154, 2600-2610
Kim P.I., Jung M Y., Chang Y H., Kim S., Kim S J & Park Y.H (2007) Probiotic properties of
Lactobacillus and Bifidobacterium strains isolated from porcine gastrointestinal tract Applied
(7)805
Kos B., Suskovic M J., Vukovic S., Simpraga M & Frece1 J (2003) Adhesion and aggregation ability
of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92 Journal of Applied Microbiology, 94, 981–
987
Kobayashi, Kajiwara, Wahyuni M., Hamada-Sato N., Imada C & Watanabe E (2004) Effect of culture
conditions on lactic acid production of Tetragenococcus species Journal Appl Microbiol.,
96(6), 1215-1221
Liong M T & Shah N P (2005) Acid and bile tolerance and cholesterol removal ability of Lactobacilli strains Journal of Dairy Science, 88, 55 – 66
Maragkoudakis P.A., Zoumpopouloua G., Miarisa C., Kalantzopoulosa G., Potb B & Tsakalidou E
(2006) Probiotic potential of Lactobacillus strains isolated from dairy products International
Dairy Journal, 16, 189–199
Maria V.P (2006) Molecular and physiological studies on the functionality of probiotic lactobacilli
Doctor thesis on Biochemistry, Karlsruhe University, Argentina
Udomsil N., Rodtong S., Tanasupawat S & Yongsawatdigul J (2010) Proteinase-producing halophilic lactic acid bacteria isolated from fish sauce fermentation and their ability to produce volatile
compounds International Journal of Food Microbiology, 141, 186–194
Sangtiago R M., Alberto M., Marias J B., Frangcisco P N & Maria G C (2008) Screening of lactic acid bacteria and Bifidobacteria for potential probiotic use in Inberian dry fermented sausages
(8)806
DETERMINATION OF PROBIOTIC PROPERTIES AND THE SALT INTOLERANCE OF LACTIC ACID BACTERIA STRAINS ISOLATED
FROM GUT OF POMPANO
Do Thi Bich Thuy, Nguyen Thị Diem Huong
Hue University - University of Agriculture and Forestry
Contact email: dothibichthuy@huaf.edu.vn
ABSTRACT
Eight lactic acid bacteria strains isolated from gut of Pompano (NUs) (NU1, NU2, NU3, NU7,
NU8, NU17, NU18, NU21) belong to Lactobacillus fermentum were studied on the salt intolerance
The results showed that all of the strains could grow in the medium with from 5% to 25% of NaCl for
48 hours of incubation at room temperature A strain NU17 had highest salt intolerance OD600nm values
after 48 hours of incubation in medium contained 25% of NaCl at room temperature of NU17 strain were 0.1806 This strain was then selected to study on some properties of probiotic potential, acid intolerance and auto-aggregation The number of survival cells of NU17 strain after two hours of incubation at pH was 4.895 log CFU/ml The auto-aggregation of them was 36,58%
Key words: lactic acid bacteria, probiotic, salt intolerance
Kobayashi, Kaj iwara, Wahyuni M. , Hamada-Sato N. , Imada C. & Watanabe E. ,