BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VÙNG GEN ITS CỦA NẤM MEN NHIỄM BỆNH TRÊN DA CHÓ NUÔI TẠI TP HỒ CHÍ MINH Ngành CÔNG NGHỆ SINH HỌC T[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VÙNG GEN ITS CỦA NẤM MEN NHIỄM BỆNH TRÊN DA CHĨ NI TẠI TP HỒ CHÍ MINH Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC- THỰC PHẨM- MÔI TRƯỜNG Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: Ts Hồng Quốc Khánh Ngơ Đức Duy Sinh viên thực hiện: Huỳnh Long Thủ MSSV: 1051110154 Lớp: 10DSH01 TP Hồ Chí Minh, 2014 LỜI CAM ĐOAN Tơi tên Huỳnh Long Thủ, sinh viên đại học chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học, khóa 2010, trường Đại học Cơng Nghệ TP Hồ Chí Minh Tơi xin cam đoan: ✓ Cơng trình nghiên cứu tơi thực ✓ Các số liệu luận văn hoàn toàn trung thực chưa công bố nghiên cứu khác hay phương tiện truyền thông Tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm kết nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp SINH VIÊN Huỳnh Long Thủ Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH ẢNH v MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình ni chó 1.1.1 Thống kê số lượng chó giới 1.1.2 Tình hình ni chó Việt Nam 1.2 Tổng quan bệnh da 1.2.1 Bệnh ngồi da chó 1.2.2 Bệnh da người 1.3 Các tác nhân gây bệnh 1.3.1 Vi khuẩn 1.3.1.1 Một số nhóm vi khuẩn gây bệnh ngồi da thường gặp 1.3.1.2 Các biểu nhóm vi khuẩn gây 1.3.1.3 Khả lây lan sang người 1.3.2 Nấm men 1.3.2.1 Các loài nấm men thường gây bệnh da chó 1.3.2.2 Các biểu bệnh nhóm nấm men gây 1.3.2.3 Khả lây lan sang người 1.3.3 Nấm sợi 1.3.3.1 Một số nhóm nấm mốc gây bệnh thường gặp 1.3.3.2 Bệnh biểu bệnh nhóm nấm mốc gây 1.4 Tổng quan nấm men 10 1.4.1 Hình thái tế bào nấm men 10 1.4.2 Dinh dưỡng sinh trưởng nấm men 10 i Đồ án tốt nghiệp 1.4.3 Sinh sản nấm men 11 1.4.4 Nấm men gây bệnh 12 1.5 Những nghiên cứu giới nấm men gây bệnh 12 1.6 Định danh nấm men 13 1.6.1 Định danh nấm men phương pháp truyền thống 14 1.6.1.1 Quan sát đặc điểm hình thái 14 1.6.1.2 Khảo sát đặc tính sinh lí, sinh thái 14 1.6.2 Định danh nấm men sinh học phân tử 15 1.6.2.1 Đoạn gen rDNA 15 1.6.2.2 Nhân gen Kỹ thuật giải trình tự định danh lồi 17 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19 2.1 Vật liệu thiết bị 19 2.1.1 Dụng cụ 19 2.1.2 Thiết bị 19 2.1.3 Vật liệu 19 2.1.3.1 Nguồn phân lập 19 2.1.3.2 Hóa chất 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Phân lập nấm men gây bệnh 21 2.2.2 Quan sát hình thái nấm men 22 2.2.2.1 Quan sát tế bào nấm men 22 2.2.2.2 Quan sát khuẩn ty thật khuẩn ty giả 23 2.2.3 Sử dụng sinh học phân tử định danh nấm men 24 2.2.3.1 Tách chiết DNA 24 2.2.3.2 Điện di 24 2.2.3.3 Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) 25 2.2.3.4 Giải trình tự định danh mẫu nấm men 29 ii Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 33 3.1 Kết hình thái học nấm men 33 3.1.1 Kết khuẩn lạc 33 3.1.2 Kết hình ảnh tế bào sinh dưỡng 34 3.1.3 Kết quan sát tế bào sinh sản 35 3.1.4 Kết quan sát khuẩn ty 35 3.2 Kết li trích, thu nhận nhân đoạn gen ITS rDNA nấm men 36 3.2.1 Kết ly trích thu nhận gen nấm men 36 3.2.2 Kết nhân đoạn gen bảo tồn ITS rDNA nấm men 36 3.3 Kết so sánh vùng gen bảo tồn ITS rDNA nấm men ngân hàng gen NCBI thiết lập phân loài 37 3.3.1 Kết Giải trình tự vùng gen ITS rDNA mẫu nấm men 37 3.3.2 Kết so sánh trình tự ITS rDNA ngân hàng gen NCBI xây dựng phân loài 39 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43 4.1 Kết luận 43 4.2 Đề nghị 43 Tài liệu tham khảo 45 iii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Bp Base Pair DNA Deoxyribonucleotide Acid EDTA Ethylene- diamine-Tetraacetic-Acid PCR Polymerase Chain Reatio PDA Potato Dextrose Agar TAE Tris-Acetic acid- Ethylenediamine- Tetraacetae TE Tris- Ethylenediamine- Tetraacet iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH ẢNH Bảng Bảng 1.1 Phát nấm men gây bệnh từ năm 1989 đến 1993………… ……… 13 Bảng 1.2 Internal transcribed spacer region (ITS region, including the 5.8S gene)… 17 Bảng 3.1 Hình ảnh kết hình thái khuẩn lạc ………………………………………33 Bảng 3.2 Hình ảnh tế bào sinh dưỡng…………………………………………………34 Bảng 3.3 Hình ảnh tế bào sinh sản nấm men…………………………………… 35 Bảng 3.4 Hình ảnh quan sát khuẩn ty ………………………… …………… …… 35 Hình ảnh Hình 1.1 Bảng đồ primer ITS…………………………………………… ………… 17 Hình 3.1 Kết kiểm tra ly trích gen mẫu nấm men……… …………… 36 Hình 3.2 Kết sản phẩm PCR ……………………………………….…………….37 Hình 3.3 Kết sản phẩm PCR M23-2 …………………………………… ………37 Hình 3.4 Cây phát sinh lồi dựa so sánh trình tự vùng gen ITS rDNA chủng nấm men phân lập( M9-1, M9-5, M11-1, M23-2) loài nấm men ngân hàng gen…………………………………………………………………………………… 39 v Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Chó người bạn thân thiết người, người tiếp xúc với chó gần lúc, dù trực tiếp hay gián tiếp Chính mà việc lây nhiễm bệnh nguy hiểm chó sang người vấn đề đáng quan tâm Hiện nay, nhu cầu sở hữu chó làm thú cưng người ngày cao, đa dạng, chủng loài số lượng ngày nhiều, với điều kiện nuôi đa dạng có nhiều bệnh xuất chó có khả lây lan sang người Trong bệnh dễ lây lan sang người bệnh ngồi da chó bệnh dễ cơng sang người Vì cần thơng qua tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp, điều kiện thích hợp người bị lây nhiễm Có nhiều tác nhân gây bệnh ngồi da chó, nấm men tác nhân quan trọng gây nên hậu nghiêm trọng cho chó người Vì để xác định lồi nấm men khóa luận tiến hành phân lập bước đầu định danh kỹ thuật sinh học phân tử vùng gen ITS rDNA nhằm xác định số chủng nấm men nhiễm bệnh da chó ni thành phố Hồ Chí Minh Mục đích nghiên cứu ✓ Cung cấp thơng tin xác số chủng nấm men nhiễm bệnh da chó khả lây lan chúng sang người, nhằm tăng khả điều trị phòng ngừa lây lan chó bị nhiễm loại nấm men Đồ án tốt nghiệp ✓ Tạo nguồn giống nấm men cho nghiên cứu chuyên sâu bệnh học loài nấm men định danh Nhiệm vụ nghiên cứu ✓ Phân lập số nấm men nhiễm bệnh da chó ni thành phố Hồ Chí Minh ✓ Định danh nấm men phương pháp sinh học phân tử dựa việc giải trình tự đoạn gen ITS rDNA nấm men ✓ Bước đầu xác định khả gây bệnh loài nấm men định danh dựa nghiên cứu giới Phương pháp nghiên cứu ✓ Sử dụng phương pháp sinh học phân tử giải trình tự đoạn gen bảo tồn ITS rDNA nấm men để định danh nấm men ✓ Các tài liệu phục vụ nghiên cứu tham khảo từ nghiên cứu, báo khoa học, luận văn khoa học sưu tầm internet ✓ Đề tài có sử dụng phần mềm: BioEdit 7.2.5.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview4 4.32.0.0 ✓ Ngân hàng gen http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Các kết đạt Sau trình nghiên cứu đề tài phân lập định danh loài nấm men, dựa nghiên cứu giới bước đầu nhận định lồi nấm men có khả gây bệnh nguy hiểm chó người Kết cấu đề tài Đề tài gồm chương Đồ án tốt nghiệp Chương 1: Tổng quan tài liệu Trình bày thơng tin liên quan đến chó, nấm men thơng tin phương pháp sinh học phân tử sử dụng định danh nấm men Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu Trình bày tồn ngun vật liệu, địa điểm, máy móc thiết bị phục vụ nghiên cứu tồn quy trình, thao tác thực phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết biện luận Trình bày kết chi tiết tồn q trình thực nhiên cứu Chương 4: Kết luận đề nghị Tổng kết lại kết nghiên cứu đạt đưa đề nghị liên quan nhằm hoàn thiện đề tài Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình ni chó Ngay từ thời tiền sử, lồi người cịn phải sống phương thức săn bắt, hái lượm, sống hang động Khi tìm lửa, người biết chế biến thức ăn phương pháp nướng thịt thú rừng sản phẩm thừa xương động vật, khối chó rừng, lồi động vật có khứu giác phát triển Đó ngun nhân khiến lồi người lồi chó "tiếp cận" với chung sống Chó nhờ vào tự nhiên thính tai, thính mũi, tìm dấu vết khả nhìn bóng đêm rõ người, tỉnh ngủ, có trí thơng minh dễ huấn luyện.Vì người sớm biết sử dụng chó để bảo vệ cho Chó lại giống vật có tình nghĩa so sánh với vật khác sống gần gũi với người trâu, bò, ngựa v.v… 1.1.1 Thống kê số lượng chó giới Số lượng chó người ni giới số thống kê khó để đạt độ xác cao, số quốc gia đặc biệt quốc gia châu Á châu Phi chó ni cách tự do, có nghĩa khơng có hệ thống quản lý nhằm quản lý kiểm soát số lượng chó người dân Tuy nhiên nỗ lực nghiên cứu thị trường, nhằm đánh giá tiềm ngành công nghiệp sản xuất thực phẩm vật nuôi Mỹ, đưa số thống kê sơ số lượng chó giới Theo Mỹ quốc gia đứng đầu số lượng chó mà người dân họ sở hữu, với 42,5 triệu hộ gia đình Mỹ ni nhiều chó tổng số chó nước 73 triệu Canada có triệu chó [1] Các nước Tây Âu sở hữu 43 triệu đó: đứng đầu Pháp 8,8 triệu chó, Ý Balan có 7,5 triệu, Anh có 6,8 triệu Ở Đơng Âu, Nga có 12 triệu Đồ án tốt nghiệp chó Ukraina có 5,1 triệu chó Ở Nam Mỹ Brazil với 30 triệu con, Argentina 6,5 triệu con, Columbia triệu [1] Ở châu Á châu Úc việc thống kê số lượng chó gặp nhiều khó khăn việc đăng ký sở hữu chó điều khơng cần thiết nhiều quốc gia châu lục Nhưng theo ước tính Trung Quốc có khoảng 110 triệu chó, Ấn Độ có khoảng 32 triệu con, Úc khoảng triệu Các số chưa tính tới số lượng chó sống tự hoang Tuy nhiên, Nhật Bản lại quốc gia thuộc châu Á quản lý chặt chẽ số lượng chó ni người dân theo ước tính khoảng 9,5 triệu [1] Ở châu Phi, theo thống kê tổ chức Y tế giới số lượng chó nhằm kiểm soát bệnh dại người gia tăng, có khoảng 78 triệu chó tồn châu lục số có tới 70 triệu chó hoang vơ chủ [1] 1.1.2 Tình hình ni chó Việt Nam Ở Việt Nam, việc ni chó mèo chim cảnh gia đình có từ lâu đời Hầu gia đình người dân nước ta ni chó mèo, với chức bảo vệ, diệt chuột… Ngày nay, kinh tế tương đối phát triển, nghề nuôi chim, thú cảnh nhà phát triển, thành phố lớn Gần đây, nước ta việc sử dụng chó nghiệp vụ vào cơng tác an ninh quốc phòng phát triển theo nhu cầu bảo vệ xí nghiệp, quan, sở nông nghiệp, kho tàng mục tiêu quân Số người u thích chó nghiệp vụ chó làm cảnh ngày tăng Vì số lượng chó béc giê giống chó cảnh châu Âu gia đình, thành phố lớn ngày tăng Việc chăn ni chó nghiệp vụ tập trung trường huấn luyện nghiệp vụ chó cảnh gia đình, năm qua gặp nhiều khó khăn, khó khăn dịch bệnh làm chó chết Vì số lượng chó nghiệp vụ chó cảnh tăng lên chậm Đồ án tốt nghiệp Nước ta có trung tâm chăn ni giống chó nghiệp vụ giống chó Nga Đức Bên cạnh đó, có số địa phương ý phát triển giống chó nghiệp vụ lai có chất lượng tốt Ngày 19-01-2009, Bộ Nội vụ ban hành định số 71 QĐ/BNV việc thành lập Hiệp hội ni chó giống Việt Nam (Vietnam kennel Association-VKA) Về việc quản lý số lượng chó Việt Nam gần đưa định, quy định chủ sở hữu chó phải đến UBND để đăng ký cấp số (Quyết định số 2891/QĐ-BNN-TY ngày 14/11/2012 Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn phê duyệt kế hoạch khống chế loại trừ bệnh dại năm 2012) [32] Tuy nhiên số nước châu Á người dân có tâm lý thoải mái việc ni sở hữu chó thường khơng quan tới điều lệ việc ni sở hữu chó 1.2 Tổng quan bệnh da 1.2.1 Bệnh da chó Chó vật ni gần gũi với người cho trung thành với người Tuy nhiên việc chăm sóc người bạn khơng tốt chúng dễ mắc bệnh Cũng giống người, chó dễ mắc số bệnh đường tiêu hóa dẫn đến triệu chứng tiêu chảy, chán ăn, tụt cân Chó dễ mắc bệnh hô hấp với triệu chứng tương tự người sổ mũi, nghẹt mũi khó thở Và chó thường xuyên mắc bệnh nghiêm trọng liên quan đế nội tạng gan, phổi, tim hay bệnh xương khớp v.v… Trong bệnh thường gặp chó nói bệnh đáng lo ngại người bệnh ngồi da chó Vì người thường xuyên gần gũi tiếp xúc trực tiếp gián tiếp với chó nên việc chó bị bệnh ngồi da điều đáng lo ngại tính chất lây lan bệnh Đồ án tốt nghiệp Các bệnh ngồi da ảnh hưởng đến tính mạng chó chúng lại gây tổn thương nghiêm trọng thể chó có nguy ảnh hưởng đến người Các triệu chứng thường thấy cục vùng da như: rụng lơng, đỏ tấy có chảy nước dịch dịch mủ màu vàng, da dầy hóa bì, lt sùi Con vật khó chịu, ngứa ngáy hay gãi, kêu rên, thần kinh không ổn định, lở loét vùng cổ, chân, kẻ móng, mũi, mặt, tai Có mùi khó chịu 1.2.2 Bệnh ngồi da người Là bệnh thường gặp nhiều tác nhân gây ra, bệnh thường gây thương tổn da gây nguy hiểm đến tính mạng Một số bệnh thường gặp là: ghẻ, nấm cạn, nhiễm trùng da thông thường, mụn trứng cá, chàm, vẩy nến, luput đỏ, bệnh lao da 1.3 Các tác nhân gây bệnh 1.3.1 Vi khuẩn 1.3.1.1 Một số nhóm vi khuẩn gây bệnh ngồi da thường gặp Các tác nhân gây bệnh da chó thường thuộc nhóm: Staphylococcus, Micrococcus, Bacillus , Escherichia, Pseudomonas, Proteus 1.3.1.2 Các biểu nhóm vi khuẩn gây Các nhóm vi khuẩn thường gây nên triệu chứng viêm bề mặt da chó Trong điều kiện bình thường da chó ln có chế để vơ hiệu hóa vi khuẩn yêu tố vi sinh vật gây bệnh khác Nhưng trường hợp da bị tổn thương va chạm học tạo chỗ hở bề mặt da làm thay đổi điều kiện sinh lý Đồ án tốt nghiệp bề mặt da, lúc vi sinh vật gây bệnh dễ dàng xâm nhập, gây bệnh da chó có số biểu viêm da vi khuẩn sau: Viêm da mủ bề mặt: dấu hiệu bề mặt đặc trưng vết lt xói mịn, bao gồm viêm da ẩm cấp tính (viêm da chấn thương) viêm da nếp gấp (hăm da) [33] Viêm da mủ cạn: bao gồm phần bề mặt nang lơng biểu bì kể bệnh chốc lở (viêm da mủ chó con) viêm nang lơng vi khuẩn bề mặt (mụn mủ với phần lông lồi ra) [33] Viêm da mủ sâu: bao gồm phần nang lơng chân bì kể viêm nang lông sâu, mụn nhọt viêm mô tế bào, viêm mủ mũi, mụn chó, viêm bì móng [33] 1.3.1.3 Khả lây lan sang người Các loại vi khuẩn thường có khả lây lan từ chó sang người Và điều đáng quan tâm tổn thương chúng gây lây lan sang người cịn nguy hiểm chó staphylococcus aureus gây bệnh mụn nhọt da, viêm phổi, áp xe phổi, nhiễm khuẩn huyết Bệnh nặng, dễ gây tử vong Các vi khuẩn Proteus vulgaris có khả gây nên bệnh đường tiểu viêm cầu thận, sỏi thận cấp, viêm bàng quang , v.v… 1.3.2 Nấm men 1.3.2.1 Các loài nấm men thường gây bệnh da chó Các lồi nấm men Melasezia vàCandida loài xác định thường xuyên trường hợp chó bị bệnh ngồi da [2] 1.3.2.2 Các biểu bệnh nhóm nấm men gây Đồ án tốt nghiệp Bệnh biểu đặc trưng vẩy trắng, hay màng giả niêm mạc miệng hay lưỡi, lan đến mơi, bệnh tích thường lên với sung huyết xung quanh bên ngồi cịn lt, bệnh tích lan tràn đến hầu thực quản 1.3.2.3 Khả lây lan sang người Lồi nấm men Candida lây lan sang người thông qua tiếp xúc gián tiếp hay trực tiếp Khi lây sang người chúng có khả gây tổn hại giống chó Ngồi chúng cịn có khả gây tổn thương cho quan sinh dục người Đặc biệt gây bệnh thể người bị suy giảm miễn dịch (người bị nhiễm HIV, điều trị ung thư, cấy gép tủy) chúng trở thành nguyên nhân gây tử vong hàng đầu thương tổn lan toàn thân mà chúng gây 1.3.3 Nấm sợi 1.3.3.1 Một số nhóm nấm mốc gây bệnh thường gặp Các nhóm nấm mốc gây bệnh da thường phân lập da lơng chó là: Aspergillus, Microsporum, Trichophyton, Epidermophyton.[3] 1.3.3.2 Bệnh biểu bệnh nhóm nấm mốc gây Chúng thường gây bệnh hốc mũi chó Chó bị nhiễm bị thương hít phải dị vật Khi bị nhiễm nấm sinh trưởng sinh độc tố phá hủy lớp niêm mạc mũi, hình thành khối u sưng phịng, kèm theo triệu chứng viêm mũi, viêm xoang Nếu bệnh kéo dài dẫn đến tử vong gây tổn thương lên não [4] Các nhóm nấm gây rụng mảng lông, gãy sợi lông, vùng mặt, tai, ngứa ngáy Đồ án tốt nghiệp khó chịu, hay dùng móng gãi tai Bệnh diễn biến chậm, lâu ngày gây viêm da bội nhiễm, viêm thận, nhiễm trùng máu tử vong 1.4 Tổng quan nấm men Nấm men vi sinh vật nhân thực, phần giới nấm với 1500 loài phát Tuy nhiên, theo ước tính số chiếm 1% giới nấm tồn trái đất[5] Đa số nấm men đơn bào số lồi cịn có khả hình thành chuỗi liên kết đa bào gọi khuẩn ty thật khuẩn ty giả [6] Nấm men có kích lớn nhiều so sới cộng đồng vi sinh khác Nấm men có lợi gây bệnh cho người, chúng có mặt khắp nơi diện nhiều nơi giàu nguồn đường trái cây, số lồi cịn tìm thấy đất, thể động vật, trùng [7] 1.4.1 Hình thái tế bào nấm men Nấm men vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân thật Tế bào nấm men thường lớn gấp 10 lần so với tế bào vi khuẩn Kích thước khoảng từ 2.5µm-10µm, quan sát rõ kính hiển vi quang học Tùy lồi nấm men mà tế bào có hình cầu, hình trịn, hình van, hình elip, hình thoi, hình chai, hình lê … Tuy nhiên hình dạng nấm men khơng ổn định, phụ thuộc vào tuổi nấm men điều kiện ni cấy Saccharomyces cerevisiace có hình bầu dục ni mơi trường giàu dinh dưỡng, cịn ni điều kiện yếm khí có hình trịn, ngược lại ni mơi trường có oxy tế bào có hình thon dài 1.4.2 Dinh dưỡng sinh trưởng nấm men Nấm men nhóm vi sinh vật hóa dị dưỡng hữu Chúng sử dụng hợp chất hữu nguồn lượng không cần ánh sáng để phát triển Những loại đường mà nấm men dễ sử dụng đường đơn glucose, fructose, 10 Đồ án tốt nghiệp đường đôi saccharose, maltose, vài lồi cịn có khả sử dụng đường pentose, rượu hợp chất acid hữu [8] Hơ hấp nấm men hơ hấp hiếu khí kỵ khí tùy nghi Khơng giống vi khuẩn nấm men phát triển môi trường kỵ khí bắt buộc [8] Nấm men sinh trưởng tốt mơi trường trung tính chua Một số chủng nấm men sinh trưởng độ cồn lên đến 10-11% Các lồi nấm men khác có phạm vi nhiệt độ sinh trưởng khác nhau, có lồi sống -2oC có lồi đạt ngưỡng 45oC Chủng Leucosporidium frigidum phát triển -2 đến 20°C, Saccharomyces telluris 535°C, Candida slooffi 28-45°C [9] Các tế bào tồn điều kiện đông lạnh định, với khả giảm theo thời gian Trong phịng thí nghiệm nấm men nuôi cấy phát triển tốt môi trường giàu nguồn đường như: Potato Dextrose Agar (PDA), Yeast Peptone Dextrose Agar(YPD), Sabouraud Agar… 1.4.3 Sinh sản nấm men Nấm men giống tất loại nấm, sinh sản vơ tính hữu tính Nhưng hình thức phổ biến sinh sản vơ tính cách nảy chồi [10] Nhân tế bào mẹ chia tách thành nhân (nhân hoàn chỉnh) di chuyển đến tế bào Chồi tiếp tục phát triển tách từ tế bào mẹ, tạo thành tế bào [11] Các tế bào cịn tạo qua hình thức sinh sản thường nhỏ tế bào mẹ Cũng có số lồi nấm men sinh sản hình thức phân bào tạo hai tế bào gần kích thước [10] Trong điều kiện mơi trường nghèo dinh dưỡng tế bào đơn bội chết, nhiên điều kiện đó, tế bào lưỡng bội sống sót nhờ tiếp hợp với (sinh sản hữu tính) tạo thành hợp tử hợp tử phân chia thành bào tử nằm 11 Đồ án tốt nghiệp nang sau phát tán ngồi nang chín Nếu tế bào nấm men có hình thái kích thước giống tiếp hợp với gọi tiếp hợp đẳng giao Nếu tế bào nấm men khác gọi tiếp hợp dị giao 1.4.4 Nấm men gây bệnh Một số loài nấm men tác nhân gây bệnh hội gây nhiễm trùng người bị tổn thương hệ thống miễn dịch Cryptococcus neoformans Cryptococcus gattii tác nhân gây bệnh quan trọng suy giảm miễn dịch người Chúng nguyên nhân gây 600.000 ca tử vong cho người điều trị HIV/AIDS [12] Các tế bào bao quanh nang khuẩn polysaccharide giúp chúng tránh bị phát công tế bào bạch cầu [13] Các nấm men thuộc chi Candida nhóm tác nhân gây bệnh hội thường gây tác động bệnh lý lên miệng quan sinh dục Candida tìm thấy vi sinh vật hội sinh sống vùng nhầy ẩm ướt thể người động vật máu nóng Khi xâm nhập vào niêm mạc tế bào nấm men nảy mầm gây kích ứng biến đổi mô gây nên triệu chứng bệnh lý 1.5 Những nghiên cứu giới nấm men gây bệnh Trong kỷ thứ năm trước Công nguyên, Hippocrates mô tả bệnh tưa miệng [14] ơng coi người mô tả triệu chứng nhiễm trùng nấm men Đến năm 1839 nhờ xuất kính hiển vi nghiên cứu Langenbeck sau Berg Gruby chứng minh Candida albicans tác nhân nấm men gây bệnh ảnh hưởng đến tính mạng Chúng nấm men điểm hình phân lập từ bệnh phẩm người bị bệnh [15] Đến năm 1960 với đời phương pháp điều trị ung thư, biện pháp điều trị kháng sinh, vơ tình làm bùng phát tăng nguy nhiễm trùng 12 Đồ án tốt nghiệp nấm men nghiêm trọng (Candida chứng minh triệu chứng nhiểm trùng người suy giảm miễn dịch) [16] Bảng 1.1 Phát nấm men gây bệnh từ năm 1989 đến 1993 Các chủng phát Năm 1989 Malassezia vàTrichosporon nấm bệnh hội ngày phát nhiều [17] 1989 C tropicalis, Malassezia spp, Hansenulaspp,T beigelii [18] 1989 Phổ nấm men kết hợp với ung thư có nhiều thay đổi bao gồm T beigelii, Saccharomyces spp, Torulopsis pintolopesii, Pichiafarinosa, Rhodotorula spp [19] 1992 Các báo cáo Saccharomyce,Hansenula, Rhodotorula Malassezia spp Và C glabrata [20] 1993 Kết theo dõi từ năm 1980-1990 số ca nhiễm nấm C albicans tăng từ (52%-60%), loài khác giảm (21%-16%) [21] 1993 So sánh kết phân lập 15 tháng (1991-1992) với kỳ (1987-1988) C glabrata tăng gấp đôi, C krusei tăng nhẹ; Tỷ lệ C guilliermondii, C lipolytica, C kefyrtăng [22] 1.6 Định danh nấm men Có hai phương pháp để định danh nấm men phương pháp truyền thống phương pháp sinh học phân tử Hiện nay, phương pháp dùng nhiều sử dụng sinh học phân tử ưu điểm nhanh chóng, xác hiệu cao 13 ... án tốt nghiệp ✓ Tạo nguồn giống nấm men cho nghiên cứu chuyên sâu bệnh học loài nấm men định danh Nhiệm vụ nghiên cứu ✓ Phân lập số nấm men nhiễm bệnh da chó ni thành phố Hồ Chí Minh ✓ Định danh. .. trọng cho chó người Vì để xác định lồi nấm men khóa luận tiến hành phân lập bước đầu định danh kỹ thuật sinh học phân tử vùng gen ITS rDNA nhằm xác định số chủng nấm men nhiễm bệnh da chó ni thành... Đồ án tốt nghiệp 1.4.3 Sinh sản nấm men 11 1.4.4 Nấm men gây bệnh 12 1.5 Những nghiên cứu giới nấm men gây bệnh 12 1.6 Định danh nấm men 13 1.6.1 Định danh