Đồ án tốt nghiệp phân lập vi khuẩn lactic trong khoang miệng có khả năng ức chế sự tạo màng sinh học của một số lactobacillus spp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH o H hi C M h in ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP C ity PHÂN LẬP VI KHUẨN LACTIC TRONG KHOANG MIỆNG U CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SỰ TẠO MÀNG SINH HỌC ity rs ve ni CỦA MỘT SỐ Lactobacillus spp : Công nghệ sinh học Chuyên ngành : Công nghệ sinh học of Ngành Sinh viên thực : Nguyễn Tuấn Anh lo MSSV: 1311100148 - Lớp: 13DSH02 no TS Nguyễn Hoàng Dũng ch Te Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Hoài Hương gy TP Hồ Chí Minh, 2017 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN o H Người thực đề tài: Nguyễn Tuấn Anh Sinh viên trường: Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh Khoa: Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường hi C Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Lớp: 13DSH02 MSSV: 1311100148 h in M Ngành: Đồ án tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu thân tơi hướng C dẫn TS Nguyễn Hoài Hương TS Nguyễn Hoàng Dũng, thực Viện ity Sinh học Nhiệt đới phịng thí nghiệm lầu trường Đại học Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh Những số liệu kết phân tính đề tài hồn tồn trung U thực, khơng chép từ nguồn tài liệu tham khảo khác hình ni thức Một số nội dung đồ án tốt nghiệp có tham khảo sử dụng liệu ve trích dẫn cơng bố công khai báo khoa học, website, tác phẩm theo rs danh mục tài liệu tham khảo đồ án ity Nếu có chép không trung thực báo này, người thực đề tài xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước khoa Công nghệ sinh học – Thực of phẩm – Môi trường trươc ban giám hiệu trường Đại học Cơng nghệ Thành phố Hồ Te Chí Minh ch Ngày … tháng … năm 2017 lo no Sinh viên thực i gy Nguyễn Tuấn Anh Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Trong suốt trình học tập, rèn luyện trau dồi kiến thức em gặp phải khơng lần khó khăn nhờ có quan tâm, giúp đỡ hướng dẫn tận tình o H TS Nguyễn Hoài Hương, kiến thức kỹ cần thiết Cơ truyền dạy mà em hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp lần Từ tận đáy tim, em hi C xin chân thành cám ơn Hồi Hương Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Tiến sĩ Nguyễn Hoàng Dũng mở M lòng nhận hướng dẫn em thực đề tài tốt nghiệp Viện Sinh học Nhiệt đới h in (VSHND) Đây hội quý báu mà thầy dành cho em, em xin cám ơn thầy Dũng nhiều C Ngoài ra, VSHND em cịn nhận khơng giúp đỡ từ Thạc sĩ Lê Quỳnh ity Loan Suốt thời gian làm việc nghiên cứu VSHND, chị người bên cạnh nhắc nhở em nhiều điều cần thiết thực thí nghiệm nghiên U cứu Em xin cám ơn chị Loan ni Ngoài ra, xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến ba mẹ, gia đình, người ve bên tạo điều kiện tốt cho trình thực đồ án tốt rs nghiệp ity Lời cuối cùng, em xin gửi lời chúc tới tồn thể q thầy q giảng dạy, nghiên cứu Viện Sinh học Nhiệt Đới Đại học thành phố Hồ Chí of Minh, thật dồi sức khỏe, để tiếp tục thực sứ mệnh cao đẹp truyền Te đạt kiến thức cho hệ mai sau ch TP.HCM, ngày … tháng … năm 2017 Sinh viên thực lo no ii gy Nguyễn Tuấn Anh Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CÁM ƠN ii o H MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v hi C DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vii M MỞ ĐẦU 10 h in CHƯƠNG 1:TỔNG QUAN .14 1.1 SÂU RĂNG .14 1.1.1 Bệnh học 14 C 1.1.2 Men 20 ity 1.2 VI KHUẨN RĂNG MIỆNG .27 U 1.2.1 Streptococcus spp 27 ni 1.2.2 Lactobacillus spp 29 1.3 ve 1.2.3 Vi khuẩn lactic .35 MÀNG SINH HỌC 36 rs 1.3.1 Sự hình thành 36 ity 1.3.2 Thành phần .38 1.3.3 Một số yếu tố ảnh hưởng lên hình thành màng sinh học 40 of 1.3.4 Tính chất màng sinh học 42 Te 1.3.5 Phân bố 43 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 47 no 1.4 ch 1.3.6 Giả thuyết chế bảo vệ miệng probiotic LAB nói chung 45 1.4.1 Ngoài nước .47 lo 1.4.2 Trong nước .50 gy CHƯƠNG 2:PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 51 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu .51 2.2 Vật liệu nghiên cứu 51 iii Đồ án tốt nghiệp 2.2.1 Dụng cụ thiết bị 51 2.2.2 Giống vi khuẩn .51 2.2.3 Hóa chất 51 o H 2.2.4 Các phần mềm sử dụng 54 2.3 Phương pháp nghiên cứu 55 hi C 2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 55 2.3.2 Thu mẫu 56 2.3.4 Chọn lọc vi khuẩn lactic .59 h in M 2.3.3 Tăng sinh 58 2.3.5 Bảo quản 59 2.3.6 Chọn lọc chủng có khả tạo màng sinh học mạnh 59 C 2.3.7 Định danh chủng BG .60 ity 2.3.8 Khảo sát khả ức chế màng sinh học NBG 64 U CHƯƠNG 3:KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 65 Tình trạng miệng đối tượng thu mẫu 65 3.2 Phân lập vi khuẩn Lactic 65 3.3 Chọn lọc chủng có khả tạo màng sinh học mạnh .67 3.4 Định danh 71 ity rs ve ni 3.1 3.4.1 Ly trích, thu nhận DNA 71 3.4.2 Nhân sợi DNA phương pháp PCR 71 of Te 3.4.3 Xác định trình tự DNA – So sánh với ngân hàng liệu gen NCBI 72 ch 3.5 Khảo sát khả ức chế hình thành màng sinh học vi khuẩn NBG L fermentum 76 CHƯƠNG 4:KẾT LUẬN 82 no Kết luận .82 4.2 Kiến nghị 83 lo 4.1 gy TÀI LIỆU THAM KHẢO 84 PHỤ LỤC BẢNG .1 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT o H EPS Extracellular polymeric substance DT Decayed teeth FT Filled teeth MT Missing teeth hi C Decayed teeth, filled teeth, and missing teeths HA Hydroxyapatite LBS Lactobacillus Selection medium LAB Lactic acid batería MRS deMan, Rogosa and Sharpe LBM Lactobacillus biofilm medium h in M DFMT Biofilm group Non-biofilm group ity rs ve ni U NBG Opical density at 600 nm ity BG C OD600 of lo no ch Te gy v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Lactobacillus spp phân lập từ người lớn mắc bệnh sâu 33 o H Bảng 1.2 Lactobacillus spp phân lập từ trẻ em 4-7 tuổi mắc bệnh sâu 34 hi C Bảng 1.3 Tổng hợp nghiên cứu khảo sát số chủng probiotic việc bảo vệ miệng 48 M Bảng 2.1 Thành phần môi trường LBS (g/l) 52 h in Bảng 2.2 Thành phần môi trường MRS (g/l) 52 Bảng 2.3 Thành phần môi trường tạo màng sinh học Lactobacillus spp – C Lactobacillus biofilm medium (LBM) 52 ity Bảng 2.4 Thành phần môi trường thử khả lên men nguồn carbohydrates khác (g/l) 53 U Bảng 2.5 Mô tả nghiệm thức (NT) thí nghiệm khảo sát khả ức ni chế hình thành màng sinh học 64 ve Bảng 3.1 Thơng kê khảo sát tình trạng miệng đối tượng thu mẫu rs .65 ity Bảng 3.2 Danh sách chủng vi khuẩn lactic phân lập hình thái tế bào chúng 66 of Bảng 3.3 Kết định lượng khả tạo màng sinh học chủng vi Te khuẩn lactic .69 ch Bảng 3.5 So sánh kết thử khả lên men nguồn carbonhydrates khác chủng 1B, 12R2 30B2 với số loài Lactobacillus có kết no hiển thị so sánh DNA ngân hàng gen NCBI 75 lo Bảng 3.4 So sánh độ tương đồng DNA chủng L fermentum 1B, 12R2 gy 30B2 (%) 76 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Đốm trắng – dấu hiệu khử khống men .15 Hình 1.2 Răng bị tổn thương nghiêm trọng q trình khử khống 16 o H Hình 1.3 Giản đồ mơ tả lý thuyết nguyên nhâu gây sâu 17 Hình 1.4 Cấu trúc người 20 hi C Hình 1.5 Các cấp kết cấu men 21 Hình 1.6 Mô cột tinh thể HA 22 M Hình 1.7 Sơ đồ cấu trúc lục giác HA nhìn dọc theo hướng trục C 22 h in Hình 1.8 Hình chụp cột tinh thể kính hiển vi điện tử [37] 23 Hình 1.9 Hình vẽ mơ tả hướng phát triển rod 24 C Hình 1.10 Mặt cắt dọc men .24 ity Hình 1.11 Mơ tả hình thành lỗ khóa Rod Interrod 25 Hình 1.12 Các giai đoạn cột tinh thể HA bị bào mòn acid A: cột tinh thể bình U thường; B: giai đoạn đầu ăn mịn: C: bị ăn mịn hồn tồn 26 ni Hình 1.13 Cơ chế bảo vệ ion F- 26 ve Hình 1.14 Một số kiểu hình thái Lactobacillus spp 30 rs Hình 1.15 Tỷ lệ Lactobacillus spp phân lập miệng trẻ bị sâu ity người mẹ 34 Hình 1.16 Sự thay đổi cấu trúc màng sinh học bước qua giai đoạn phát of tán 37 Te Hình 1.17 Các giai đoạn hình thành màng sinh học 38 ch Hình 1.18 Mơ tả mạng lưới EPS ngoại bào lực tương tác polysaccharides 39 no Hình 1.19 Mạng lưới EPS tế bào vi khuẩn màng sinh học, hình thành lo đáy chai thủy tinh chụp kính hiển vi điện tử 40 gy Hình 1.20 Vi sinh vật, bùn đất bám đáy tàu thơng qua hình thành màng sinh học .44 vii Đồ án tốt nghiệp Hình 1.21 Vi khuẩn chịu nhiệt hình thành màng sinh học dày khoảng 20 mm hồ nước nóng Mickey, Oregon 44 Hình 1.22 Cơ chế tác động Lactobacillus spp lên vi khuẩn khoang o H miệng 47 Hình 2.1 Mơ tả phương pháp thu mẫu nước bọt .57 hi C Hình 2.2 Một số vị trí lấy mẫu mảng bám 58 Hình 2.3 Dùng lực chảy dịch môi trường để tác động lên màng sinh học 60 M Hình 2.4 Mơ tả giai đoạn loại bỏ protein tủa DNA 62 h in Hình 2.5 Chu trình phản ứng PCR 16S rRNA 63 Hình 3.1 Hình thái tế bào số chủng nhóm vi khuẩn lactic phân lập C vật kính 100x 67 ity Hình 3.2 Mật độ màng sinh học hình thành đáy giếng của chủng 1Ba, 12R2a, 30B2b nhiều so với chủng 21B2i 68 U Hình 3.3 Các ống giống khảo sát khả hình thành màng sinh học sau 24 ủ: ni .70 ve Hình 3.4 Kết điện di sản phẩm tách chiết DNA chủng vi khuẩn Nhìn rs vệt màu kéo dài cho thấy hệ DNA vi khuẩn bị gãy thành nhiều đoạn có ity kích thước khác 71 Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm PCR chủng vi khuẩn cho vệt DNA đơn of rõ hẳn kết điện di sản phẩm tách DNA 72 Te Hình 3.6 Cây phát sinh lồi dựa phân tích trình tự vùng gen 16S rRNA ch chủng 1B, 12R2 30B2 với số chủng khác ngân hàng gen NCBI .73 Hình 3.7 Hình thái tế bào chủng 1B, 12R2, 30B2 L fermentum YB5 74 no Hình 3.8 Kết khả kháng màng sinh học NBG lên L fermentum 1B 78 lo Hình 3.9 Kết khả kháng màng sinh học NBG lên L fermentum 12R2 gy .78 Hình 3.10 Kết khả kháng màng sinh học NBG lên L fermentum 30B2 79 viii Đồ án tốt nghiệp Hình 3.11 Kết khả kháng màng sinh học NBG lên C.albicans .79 Hình 3.12 Kết so sánh khả tạo màng sinh học số chủng NBG BG thí nghiệm chọn lọc vi khuẩn lactic có khả tạo màng sinh học 80 o H Hình 3.13 Tổng hợp khả kháng tạo thành màng sinh học chủng NBG .81 hi C h in M ity C ity rs ve ni U of lo no ch Te gy ix Đồ án tốt nghiệp [79] A F P J W Mark Keen, "The clinical significance of nasal irrigation bottle contamination," 2010 [80] P M R P J P I B H C J W G E P Davies D G., "The involvement of cell-to- o H cell signals in the Science,development of a bacterial biofilm," Science, pp 295-298., 1998 hi C [81] K P Watnick P., "Biofilm, city of microbes," Journal of Bacteriology, pp 182(10), pp 2675-2679, 2000 [82] C W G., "Biofilm processes," Biofilms, pp 195-231., 1990 M [83] R H H M A K Z A J B Bendinger B., "Physicochemical cell surface and h in adhesive properties of coryneform bacteria related to the presence and chain length of mycolic acids," in Applied, 1993, pp 59, pp 3973-3977 C [84] J W U S P S S A R & S K Hans-Curt Flemming, "Biofilms: an emergent form ity of bacterial life," Nature Reviews Microbiology, p 563–575, 11 August 2016 [85] C D Nadell, J B Xavier and K R Foster, "The sociobiology of biofilms," in FEMS U Microbiology Reviews, January 2009, p 33 (1): 206–224 ni [86] C J Stewart PS, "Antibiotic resistance of bacteria in biofilms," Lancet, p 358 (9276): ve 135–8, July 2001 rs [87] E J R K E P a R P Kristi L Frank, "In Vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus lugdunensis Clinical Isolates," ity ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, p 888–895, Mar 2007 of [88] D A W., "Microbial exopolymer secretion in ocean environment:," Oceanography and Marine, pp 73-153, 1990 Te [89] B B O S S A L B Andersen PC, "Influence of xylem fluid chemistry on planktonic Letters, p 274 (2): 210–7, September 2007 no ch growth, biofilm formation and aggregation of Xylella fastidiosa," FEMS Microbiology [90] W Characklis, M Nevimons and B Picologlou, "Influence of Fouling Biofilms on Heat Transfer," Heat Transfer Engineering, p 3: 23–37, 1981 11 July 2017 [Online] 90 Available: gy https://en.wikipedia.org/wiki/Biofilm [Accessed 04 08 2009] lo [91] "Wikipedia," Đồ án tốt nghiệp [92] R Bollinger, A Barbas, E Bush, S Lin and W Parker, "Biofilms in the large bowel suggest an apparent function of the human vermiform appendix," The Journal of Theoretical Biology, p 249 (4): 826–831, 24 June 2007 o H [93] D J B P D Marsh, "Dental plaque as a biofilm," Journal of Industrial Microbiology Volume 15, p 169, 1995 hi C [94] S P & W R T Humphrey, " A review of saliva: normal composition, flow, and function," The Journal of prosthetic dentistry, pp 85(2), 162–69., 2001 [95] M A D D Marsh PD, "Dental plaque biofilms: communities, conflict, and control," h in M Periodontology 2000, pp 55(1), 16–35., 2011 [96] K K V S M J Stamatova I, "In vitro evaluation of yoghurt starter lactobacilli and Lactobacillus rhamnosus GG adhesion to saliva-coated surfaces.," Oral Microbiol C Immunol 2009, p 24:218–223., 2009 ity [97] Y T M M Kato I, "Macrophage activation by Lactobacillus casei in mice," Micr Immunol , p 27: 611–618, 1983 U [98] A H S S Meurman JH, "Recovery of Lactobacillus strain GG (ATCC 53103) from ni saliva of healthy volunteers after consumption of yoghurt prepared with the ve bacterium," Microb Ecol Health Dis, p 7: 295–298., 1994 rs [99] J N D C G S Silva M, "Antimicrobial substance from a human Lactobacillus strain.," Antimicrob Agents Chemother, p 31: 1231–1233, 1987 ity [100] G Y J A V D M H C G G B K R & B H J REID, "Microbiota restoration: natural and supplemented recovery of human microbial communities.," Nat Rev of Microbiol, pp 9, 27-38 , 2011 Te [101] H L S Y.-L T D G HALLSTROM, "Effect of probiotic lozenges on inflammatory reactions and oral biofilm during experimental gingivitis.," Acta Odontol Scand., ch Jan 2013 of dental caries as a biofilm-mediated disease , pp 13 - 17, 2013 lo no [102] P Hasslöf, "Use of probiotics in the oral cavity," Probiotic Lactobacilli in the context [103] "Oral health surveys - basic methods," in World Health Organization 4th edition, gy 1997 [104] e a Tran Van Truong, National oral health survey of Vietnam 2001, Hanoi, Vietnam: Medical Publishing House, 2002, 2002 91 Đồ án tốt nghiệp [105] T Le, "Người Lao Động," 24 2003 [Online] Available: http://nld.com.vn/suckhoe/tren-90-nguoi-viet-nam-bi-benh-rang-mieng-49913.htm [106] M a W Rogosa, "J Bacteriol," 1951 o H [107] T S R Sudhir K Shuklaa, "An Improved Crystal Violet Assay for Biofilm Quantification in 96-Well Microtitre Plate" hi C [108] G A O'Toole, "Microtiter Dish Biofilm Formation Assay," Journal of Visualized Experiments, 30 Jan 2011 populations of Candida albicans," in Microbiology,, 2003, p 353 h in M [109] Y Z & X J Li X, "Quantitative variation of biofilms among strains in natural [110] Z W T H W a Q Y Wu, "A simplified method for chromosome DNA preparation from filamentous Fungi.," Mycosystema 20, p 575–577, 2001 C [111] B S P D L D Weisberg WG, " 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic ity study," in J Bacteriol, 1991, p 173: 697–703 U [112] S N a N M., "The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees.," in Molecular Biology and Evolution , 1987, pp 4:406-425 ni [113] F J., "onfidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap.," in ve Evolution, 1985, pp 39:783-791 rs [114] N M a K S Tamura K., "Prospects for inferring very large phylogenies by using the ity neighbor-joining method.," in Proceedings of the National Academy of Sciences , 2004, pp 101:11030-11035 of [115] G H J G Carlsson J, "Lactobacilli and streptococci in the mouth of children.," in Caries Res, 1975, pp 9(5):333-9 Te [116] J K a Y Q X Zhang, "Isolation and characterization of a Lactobacillus fermentum ch temperate bacteriophage from Chinese yogurt," The Society for Applied Microbiology, Journal of Applied Microbiology, p 857–863, 2006 no [117] B A P A P Z MATTHEW D COLLINS, "Deoxyribonucleic Acid Homology subsp tolerans, and Lactobacillus rhamnosus sp nov., lo Studies of Lactobacillus casei,Lactobacillus paracasei sp nov., subsp paracasei and comb nov.," gy INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY Vol 39, No , pp 105-108 , April 1989 92 Đồ án tốt nghiệp [118] P V U S W H Joanna Koort, "Lactobacillus curvatus subsp melibiosus is a later synonym of Lactobacillus sakei subsp carnosus," International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, pp 54, 1621–1626, 2004 o H [119] J A E F A M D COLLINS, "Lactobacillus oris sp nov from the Human Oral Cavity," INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY Vol 38, hi C No , pp 116-118 , Jan 1988 [120] D M WHEATER, "The Characteristics of Lactobacillus plantarum, L helveticus and L casei," J gen Microbial, pp 12, 133-139, 1955 M [121] A C W Ratih Dewanti, "Influence of culture conditions on biofilm formation by h in Escherichia coli 0157:H7," International Journal of Food Microbiology 26, pp 147164 , 1995 C [122] D C V B K K Z J Elleni Michu, "Biofilm formation on stainless steel by ity Staphylococcus epidermidis in milk and influence of glucose and sodium chloride on the development of ica-mediated biofilms," in International Dairy Journal, Volume U 21, Issue 3, March 2011, pp 179-184 ni [123] S S K S a M J F M A Patrauchan, "Calcium influences cellular and extracellular ve product formation during biofilm-associated growth of a marine Pseudoalteromonas sp.," in Microbiology, 2005, pp 151, 2885–2897 rs [124] S A M E B V L L a R S S Maria I Rockenbach, "Salivary flow rate, pH, and ity concentrations of calcium, phosphate, and sIgA in Brazilian pregnant and nonpregnant women," Head Face Med, p 44, 28 Nov 2006 of [125] D T Z M e a Rozkiewicz D, "Oral Candida albicans carriage in healthy preschool Te and school children.," in Adv Med Sci., 2006, p 51:187–90 [126] H S S N N T H U H Kubota, " Biofilm formation by lactic acid bacteria and ch resistance to environmental stress.," J Biosci Bioeng, pp 106, 381–386., 2008 no [127] H Silk, "Diseases of the mouth," in Primary care, March 2014, p 75–90 [128] H O H M Y B Yimin Cai, "Lactobacillus paralimentarius sp nov., isolated from lo sourdough," International Journal of Systematic Bacteriology, pp 49, 1451-1455 , gy 1999 [129] P H F J A S E A M.-S S S C S C B R Leverett DH, "Caries risk assessment in a longitudinal discrimination study.," J Dent Res., p 72(2):538–543, 1993 93 Đồ án tốt nghiệp [130] R A C.-V C D S D C e a C C C Ribeiro, "The effect of iron on Streptococcus mutans biofilm and on enamel demineralization," in Brazilian Oral Research, vol 26, no 4, 2012, p 300–305 o H [131] S a K M Twetman, "Probiotics for caries," Adv Dent Res, p 24: 98–102, 2012 [132] S I W., "Biofilm exopolysaccharides: a strong and sticky," Microbiology, pp 147, hi C pp 3-9., 2001 [133] T T Hằng, "PHÂN LẬP, NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG TẠO MÀNG SINH HỌC Ở VIỆT NAM," h in M 2011 [134] D T Truyền, "Hiệu biện pháp chăm sóc miệng cho," Y Học Thực Hành, pp 48-50, 2004 C [135] e a Dickson, " A novel species-specific PCR assay for identifying Lactobacillus ity fermentum," J Med Microbiol 54, pp 299-303, 2005 [136] P J a P Sharma, "Probiotics and Their Efficacy in Improving Oral Health: A U Review," Journal of Applied Pharmaceutical Science Vol 2, pp pp 151-163, ity rs ve ni November 2012 of lo no ch Te gy 94 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC BẢNG Trình tự DNA L fermentum 1B đem so sánh với ngân hàng gen: ATGGTGCTTGCACCTGATTGATTTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGACGGG o H TGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAGAAGCGGGGGACAACATTTGGA AACAGATGCTAATACCGCATAACAACGTTGTTCGCATGAACAACGCTTA hi C AAAAATGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTATCT TGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGGGATGATGCATAGCCAAGTTGA M CAGACTGATCGGCCACAATGGGACTGAGACACGGCCCATACTCCTACGG h in GAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGC AACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTA C AAGAATAACACGTATGACAGTAACTGTTCATACTTTGACGGTATTTAAC ity CAAAATGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAACCTCGGTAATACGTACGT GGCAAGGGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGAGAGTGCAGGCGGTTT U TCTAACTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGGA ni AACTGGATAACTTGAGTGCAG ve Trình tự DNA L fermentum 12R2 đem so sánh với ngân hàng gen: rs TGGTGCTTGCACCTGATTGATTTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGACGGGT ity GAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAGAAGCGGGGGACAACATTTGGAA ACAGATGCTAATACCGCATAACAACGTTGTTCGCATGAACAACGCTTAA of AAGATGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTT Te GTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGATGATGCATAGCCAAGTTGAG ch AGACTGATCGGCCACAATGGGACTGAGACACGGCCCATACTCCTACGGG AGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCA no ACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAA lo AGAAGAACACGTATGAGAGTAACTGTTCATACGTTGACGGTATTTAACC gy AAAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGT GGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGAGAGTGCAGGCGGTTT Đồ án tốt nghiệp TCTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGGA AACTGGATAACTTGAGTGCAGA Trình tự DNA L fermentum 30B2 đem so sánh với ngân hàng gen: o H GATGGTGCTTGCACCTGATTGATTTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGACGG GTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAGAAGCGGGGGACAACATTTGG hi C AAACAGATGCTAATACCGCATAACAACGTTGTTCGCATGAACAACGCTT AAAAAATGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTATC M TTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGATGATGCATAGCCAAGTTG h in ACAGACTGATCGGCCACAATGGGACTGAGACACGGCCCATACTCCTACG GGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAG C CAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTT ity AAGGAAGAACACGTATGAGAGTAACTGTTCATACTTTGACGGTATTTAA CCAAAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTACG U TGGCAAGGGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGAGAGTGCAGGCGGTT ni TTCTAACTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGG ity rs ve AAACTGGATAACTTGAGT of lo no ch Te gy o H Đồ án tốt nghiệp C Tỷ lệ 1:2 18B2 4.85 ± 3.71 0.1 ± 0.17 20R 4.08 ± 3.51 0.04 ± 0.07 5.57 ± 5.38 21R2 2.46 ± 1.86 0.25 ± 0.44 8.34 ± 2.25 21B2 6.03 ± 1.6 1.52 ± 2.03 10.2 ± 3.57 23R 0.4 ± 0.69 0.28 ± 0.48 23B1 10.09 ± 9.88 16.53 ± 7.57 23B2 4.91 ± 5.03 13.7 ± 5.71 26R1 7.14 ± 2.49 12.16 ± 3.06 2.77 ± 1.21 0.77 ± 0.74 2.28 ± 2.6 7.49 ± 7.07 8.61 ± 7.5 27R 4.66 ± 1.89 16.62 ± 18.45 10B2 3.89 ± 1.43 10.76 ± 3.67 27B2 20.89 ± 24.93 11B2 6.03 ± 6.08 0.93 ± 1.6 30R2 7.72 ± 3.02 0.17 ± 0.3 12R1 7.86 ± 5.21 0.61 ± 1.05 30B1 0.62 ± 1.07 16B 72.36 ± 5.76 71.44 ± 3.68 Te Tỷ lệ 1:1 Tỷ lệ 1:2 1R2 1.24 ± 2.14 2.04 ± 3.51 2R2 2.92 ± 4.04 4R2 0.5 ± 0.54 5R1 2.2 ± 2.85 5B1 3.8 ± 5.04 7R2 7.92 ± 8.23 1.57 ± 1.5 7B2 2.39 ± 2.7 3.59 ± 0.42 8R2 5.6 ± 3.02 18.14 ± 6.18 8B 70.03 ± 10.5 9B1 h in M Tỷ lệ 1:1 rs hi Kết khảo sát khả ức chế hình thành màng sinh học NBG lên L fermentum 1B: ity C ve ni U 26R2 ity of 0.23 ± 0.29 gy lo no ch o H Đồ án tốt nghiệp C Tỷ lệ 1:2 18B2 1.92 ± 3.33 20R 3.41 ± 5.9 42.84 ± 12.43 21R2 0.65 ± 1.12 34.02 ± 22.1 51.73 ± 12.79 21B2 61.04 ± 11.55 23R 0 23B1 34.67 ± 14.03 71.41 ± 10.03 23B2 22.12 ± 20.53 69.68 ± 13.01 26R1 77.38 ± 6.63 78.17 ± 3.28 0.17 ± 0.3 rs 1.25 ± 2.17 10.36 ± 17.95 35.47 ± 5.67 32.82 ± 27.99 27R 0 10B2 59.28 ± 12.91 49.55 ± 33.48 27B2 2.48 ± 4.3 11B2 0 30R2 0 12R1 0.72 ± 1.25 30B1 41.33 ± 9.05 16B 46.36 ± 12.42 59.04 ± 8.95 Te Tỷ lệ 1:1 Tỷ lệ 1:2 1R2 0 2R2 4R2 5R1 31.11 ± 29.01 5B1 7R2 35.08 ± 22.4 59.19 ± 3.96 7B2 55.09 ± 19.71 68.34 ± 7.82 8R2 25.22 ± 30.77 8B 9B1 h in M Tỷ lệ 1:1 U hi Kết khảo sát khả ức chế hình thành màng sinh học NBG lên L fermentum 12R2: ity C ve ni 26R2 ity of gy lo no ch o H Đồ án tốt nghiệp C Tỷ lệ 1:2 18B2 28.41 ± 9.65 0 20R 0 21R2 54.06 ± 4.9 54.45 ± 6.49 21B2 63.15 ± 3.6 60.34 ± 4.17 23R 12.22 ± 5.51 23B1 61.48 ± 4.64 46.89 ± 7.19 10.71 ± 18.55 23B2 57.01 ± 1.02 40.08 ± 19.86 26R1 0 rs 0 0 27R 0 10B2 1.02 ± 1.77 27B2 0 11B2 0 30R2 0 12R1 0 30B1 16B 65.39 ± 9.31 Te Tỷ lệ 1:1 Tỷ lệ 1:2 1R2 0 2R2 4R2 5R1 5B1 7R2 0 7B2 8R2 0 8B 9B1 h in M Tỷ lệ 1:1 U hi Kết khảo sát khả ức chế hình thành màng sinh học NBG lên L fermentum 30B2: ity C ve ni 26R2 ity of gy lo no ch o H Đồ án tốt nghiệp C Tỷ lệ 1:2 18B2 0 20R 0 21R2 2.06 ± 1.9 51 ± 7.91 21B2 48.37 ± 4.34 23R 0 23B1 11.73 ± 10.41 23B2 1.4 ± 2.42 54.13 ± 3.89 26R1 0.61 ± 1.05 25.82 ± 14.95 rs 0 0 27R 0 10B2 54.75 ± 47.41 27B2 0 11B2 0 30R2 3.02 ± 5.23 12R1 0 30B1 16B 0 Te Tỷ lệ 1:1 Tỷ lệ 1:2 1R2 0 2R2 4R2 5R1 5B1 7R2 0 7B2 8R2 35.39 ± 5.68 65.83 ± 9.28 8B 9B1 h in M Tỷ lệ 1:1 U hi Kết khảo sát khả ức chế hình thành màng sinh học NBG lên Candida albicans: ity C ve ni 26R2 ity of gy lo no ch Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC HÌNH ẢNH o H hi C h in M ity C ity rs ve ni U of no ch Te gy khuẩn lactic phân lập lo Kết phân nhóm khả hình thành màng sinh học chủng vi Đồ án tốt nghiệp KẾT QUẢ KHÁNG MÀNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG ĐÁNG CHÚ Ý o H hi C Chủng 16B kháng màng L fermentum 1B h in M ity C U ity rs ve ni Chủng 26R1 kháng màng L fermentum 12R2 of lo no ch Te Chủng 21B2 kháng màng L fermentum 30B2 gy Chủng 8R2 kháng màng C albicans Đồ án tốt nghiệp CÁC ĐĨA THÍ NGHIỆM 96 SAU KHI NHUỘM MÀNG BẰNG CV o H hi C h in M (thí nghiệm kháng màng L fermentum 1B) ity C rs ve ni U (thí nghiệm kháng màng L fermentum 12R2) ity of lo no ch Te (thí nghiệm kháng màng L fermentum 30B2) gy Đồ án tốt nghiệp o H hi C M (thí nghiệm kháng màng C albicans) h in ity C ity rs ve ni U of no ch Te 10 gy 12R2, 30B2 lo Thí nghiệm thử khả lên men nguồn carbohydrate chủng 1B,