VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
Giống trầu bà cánh phượng Philodendron Xanadu
3.1.2 Vật liệu nghiên cứu Đỉnh sinh trưởng của cây.
Nội dung nghiên cứu
3.2.1 Tạo nguyên liệu khởi đầu Đỉnh sinh trưởng được khử trùng rồi cho vào môi trường nuôi cấy khởi động có bổ sung Xytokinin.
3.2.2 Giai đoạn tái sinh tạo chồi và nhân nhanh
- Nghiên cứu ảnh hưởng của Xytokinin tới khả năng tạo chồi của mẫu cấy:
* Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA tới khả năng tạo chồi của mẫu cấy với các công thức:
* Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin tới khả năng tạo chồi của mẫu cấy của các công thức:
- Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp Xytokinin + Auxin tới khả năng tạo chồi của mẫu cấy.
Sử dụng nồng độ Xytokinin tối ưu nhất ở 2 thí nghiệm trên kết hợp với thang nồng độ Auxin để bố trí các công thức thí nghiệm.
* Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA+IAA khả năng tạo chồi của mẫu cấy của các công thức:
+ CT2: MS + Xytokinin + 0,05mg/l IAA
+ CT3: MS + Xytokinin + 0,10mg/l IAA
+ CT4: MS + Xytokinin + 0,15mg/l IAA
+ CT5: MS + Xytokinin + 0,20mg/l IAA
Chú ý: Xytokinin là nồng độ Xytokinin tối ưu nhất cho khả năng tạo chồi mẫu cấy ở thí nghiệm 1 và 2)
* Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA+IBA tới khả năng tạo chồi của mẫu cấy của các công thức:
+ CT2: MS + Xytokinin + 0,05mg/l IBA
+ CT3: MS + Xytokinin + 0,10mg/l IBA
+ CT4: MS + Xytokinin + 0,15mg/l IBA
+ CT5: MS + Xytokinin + 0,20mg/l IBA
Chú ý: Xytokinin là nồng độ Xytokinin tối ưu nhất cho khả năng tạo chồi mẫu cấy ở thí nghiệm 1 và 2)
* Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của α-NAA đến giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh với các công thức:
* Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh với các công thức:
+ CT2: MS + 0,5mg/l than hoạt tính
+ CT3: MS + 1,0mg/l than hoạt tính
+ CT4: MS + 1,5mg/l than hoạt tính
+ CT5: MS + 2,0mg/l than hoạt tính
3.2.4 Thí nghiệm ngoài vườn ươm
* Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại giá thể đến tỷ lệ sống, sinh trưởng của cây trầu bà sau nuôi cấy in vitro.
Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên có điều chỉnh trên các loại giá thể khác nhau:
+ Giá thể 1: Xơ dừa + trấu hun (1:1)
+ Giá thể 3: Cát + trấu hun (1:1)
+ Giá thể 4: Đất + trấu hun (1:1)
Phương pháp nghiên cứu
Sử dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào in vitro bao gồm các công đoạn kỹ thuật:
3.3.1 Phương pháp khử trùng mẫu
Chọn cây trầu bà sạch bệnh, đang ở giai đoạn sinh trưởng mạnh, sau đó tách bỏ hết các lá để lấy phần chồi đỉnh sinh trưởng Chồi được ngâm trong xà phòng 15 – 20 phút rồi rửa sạch dưới vòi nước Chuyển chồi sang lọ sạch, rửa bằng nước cất vô trùng rồi rửa bằng cồn 70 0 trong 20 – 30 giây Sau đó khử trùng bằng HgCl2 0,1% có nhỏ thêm 2 – 3 giọt Tween 20 trong vòng 10 phút Mẫu được rửa lại bằng nước cất vô trùng 4 – 5 lần rồi đưa vào môi trường nuôi cấy khởi động (theo hướng dẫn của phong thí nghiệm).
3.3.2 Kỹ thuật dùng trong giai đoạn nhân nhanh
Sử dụng kỹ thuật tách cụm chồi thành từng chồi riêng rẽ rồi cho vào môi trường nhân nhanh Các cụm chồi được cấy chuyển 4 – 6 tuần 1 lần trên môi trường MS có bổ sung 30 g/l đường saccarose, 7g/l agar, pH = 5,7 và các chất điều tiết sinh trưởng với các nồng độ khác nhau tùy theo từng thí nghiệm nhằm tìm ra môi trường nhân nhanh tối ưu nhất.
3.3.3 Kỹ thuật dùng trong giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh
Các chồi đạt tiêu chuẩn về số lá (khoảng 5 lá trở lên) và chiều cao (từ 3 cm trở lên) được tách ra khỏi môi trường nhân nhanh và cấy chuyển sang môi trường ra rễ để xác định môi trường tạo cây hoàn chỉnh.
3.3.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn CRD với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 10 bình, một bình cấy 3 mẫu.
3.3.5 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô – Bộ môn Công nghệ sinh học Thực vật – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội.
Thí nghiệm ngoài vườn ươm tiến hành tại nhà lưới của bộ môn Công nghệ sinh học Thực vật – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội.
* Thí nghiệm trong phòng nuôi nhân tạo
* Quá trình nuôi cấy in vitro được tiến hành trong phòng, với điều kiện về nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm như sau:
+ Ánh sáng: Các mẫu cấy được nuôi dưới ánh sáng của bóng đèn neon với thời gian chiếu sáng 16/24h và cường độ chiếu sáng là 2400 – 3000 lux.
+ Nhiệt độ: Được duy trì ở nhiệt độ 20 -22 o C (đêm) và 25 – 27 o C (ngày) + Ẩm độ phòng: Luôn luôn được duy trì ở độ ẩm 70% độ ẩm tối đa.
Các chỉ tiêu theo dõi
* Để đánh giá hệ số nhân chồi in vitro, tiến hành theo dõi chỉ tiêu sau:
- Hệ số nhân (lần) * Để đánh giá sự sinh trưởng phát triển của mẫu cấy, tiến hành theo dõi các chỉ tiêu:
- Tổng chiều cao chồi - Số lá trung bình/chồi (lá) * Để đánh giá quá trình ra rễ, theo dõi các chỉ tiêu:
- Số rễ trung bình/chồi (rễ)
- Độ dài rễ (cm) 3.5.2 Thí nghiệm ngoài vườn ươm
* Đánh giá sự thích nghi của cây ở giai đoạn vườn ươm, chúng tôi tiến hành theo dõi các chỉ tiêu:
- Tỷ lệ cây sống sót (%) = x 100
Tổng số chồi tạo thành Tổng số mẫu đưa vào
Chiều cao trung bình chồi (cm)
Tổng số chồi theo dõi Chiều cao trung bình chồi (cm) Chiều cao trung bình chồi (cm)
Tổng số chồi ra rễ
Tổng số chồi ban đầu
Tổng số chồi ra rễ Tổng chiều dài rễ
Tổng số cây sốngTổng số cây đưa ra trồng
* Để đánh giá sinh trưởng của cây in vitro ngoài vườn ươm, chúng tôi tiến hành theo dõi các chỉ tiêu:
- Số lá trung bình/cây (lá) - Chiều cao trung bình cây (cm)
Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu được xử lý theo phương pháp phân tích thống kê toán học theo chương trình Exel và IRRISTAT 5.0
Tổng số láTổng số cây theo dõiTổng chiều cao câyTổng số cây theo dõi
