Đang tải... (xem toàn văn)
Cong nghe sinh hoc te bao Công nghệ tế bào động vật là quy trình công nghệ nuôi cấy các loại tế bào động vật và tế bào người trong môi trường nhân tạo để tạo ra một lượng lớn tế bào nhằm mục đích nghiên cứu và ứng dụng trong thực tế để tạo ra một lượng.Kết luận: Công nghệ tế bào động vật là quy trình công nghệ nuôi cấy các loại tế bào động vật và tế bào người trong môi trường nhân tạo để tạo ra một lượng lớn tế bào nhằm mục đích nghiên cứu và ứng dụng trong thực tế.
Công nghệ nuôi cấy tế bào Lược sử phát triển CNNCTB: Phương pháp giọt treo Harrison: quan sát phát triển in vitro tb thần kinh sợi dịch bạch huyết M.Burrow A.Carrel: nuôi cấy tb ung thư chứa huyết tương, huyết thanh, dịch chiết mô Tuy nhiên, có vấn đề xảy dịch chiết từ mơ hay huyết tương có thành phần khơng đồng nên đáp ứng tb không đồng nên kết thí nghiệm khơng lặp lại; khơng trì khả đáp ứng tb tức tb bị thối hóa sau thời gian nuối cấy ngắn I Công nghệ nuôi cấy tế bào Mục tiêu nuôi cấy tế bào - Sử dụng tế bào để sản xuất protein ứng dụng trị liệu, làm vaccin tiểu đơn vị chẩn đoán Phổ biến: CHO, BHK, HEK-293, WI38, MRC-5, SP2/0, NS0, tb côn trùng - Dùng tế bào vật chủ để nhân virus dùng cho liệu pháp gen vaccin virus: Vero, HEK-293, PER.C6 - Nghiên cứu phát triển khoa học hay phát triển sản phẩm, đặc biệt sàng lọc hoạt tính sinh học, phát minh thuốc mới, thử nghiệm độc tính thuốc tiến tới mơ hình phát triển thử nghiệm thuốc khơng thử nghiệm động vật Các dịng tb: tb thần kinh, nguyên bào sợi, Caco-2, MRC-5, tb biểu bì - Sử dụng liệu pháp tế bào y học tái tạo: tb phô, tb gốc Các đặc điểm tế bào động vật - Tính học yếu: khơng có vách tế bào → mỏng manh dễ vỡ, cần thao tác nhanh nhẹ nhàng - Tăng trưởng phân chia chậm (20-40h) → tăng nguy ngoại nhiễm → phải bổ sung kháng sinh vào môi trường nhằm ức chế phát triển mức vi khuẩn, vi nấm Một quy trình thử thuốc cần thời gian 5-7 ngày - Chịu ảnh hưởng chế kìm hãm ngược: kìm hãm tiếp xúc mật độ tế bào cao gây tương tác lẫn nên kìm hãm phát triển, thay đổ đáp ứng tb → cần kiểm sốt mật độ tb phù hợp - Tính chất cần giá đỡ: Tế bào bám dính vào giá đỡ để sống sót, phân chia Giá đỡ định đến đáp ứng tb Ngoài trừ: hồng cầu, TB ung thư, số dòng tế bào liên tục - Kiểu hình kiểu gene khơng bền vững: tb phân chia vài hệ tích lũy đột biến làm thay đổi đáp ứng tb → thử thuốc, thử với vài pass để đáp ứng với thuốc giống có tin cậy Các dòng tế bào Tế bào sơ cấp (primary cell culture): - Được phân lập trực tiếp từ quan hay mô (bước nuối cấy đầu) Không đồng có tính đại diện cho mơ gốc - Thường dùng để test xem đáp ứng thật thuốc mơ gốc Ví dụ để thử khả làm lành vết thương thuốc ta xem thuốc có làm tăng sinh dịng ngun bào sợi/ lớp trung bì mơ liên kết - Nhược điểm: Khả phát triển giới hạn cấy chuyển số lần (2-3 pass) Tính chất khơng đồng người khác → dịi hỏi cơng sức lớn, nhiều yếu tố gây nhiễu - Ưu điểm: yếu tố tăng trưởng tự nhiên, đặc tính mô gốc chưa bị biến đổi nhiều → đáp ứng với thuốc tương đồng với mô gốc Tế bào thứ cấp (secondary cell culture): tb thu sau vài lần cấy chuyển quần thể tb sơ cấp → dòng tế bào o Dòng tế bào tạm thời : thu từ mơ bình thường, có khả phân chia giới hạn, cấy chuyển từ 20-30 pass, chết đột ngột o Dòng tế bào liên tục : có khả phân chia - Nguồn gốc: khối u, tế bào ung thư, tế bào gốc, tế bào biến đổi từ dòng tế bào tạm thời hay BHK21 - nguyên bào sợi thận chuột đồng non, MDCK tb biểu mơ thận chó Madin-Darby, 3T3-ngun bào sợi - Cách hóa tế bào: đánh vào bước kiểm sốt chu kì tế bào + chất gây ung thư, + nhiễm virus (Epstein Barr virus retro virus) + đưa vào gen gen virus hay gen ung thư: HPV E6/E7, hTERT, SV40 oncogen (T antigen), siRNA protein p53 pRb + tạo tb lai cách dung hợp tb giới hạn với tb liên tục - Ưu điểm dòng tế bào liên tục • Phát triển nhanh, đạt mật độ tế bào cao • Có thể ni cấy mơi trường khơng chứa huyết protein • Có thể nuôi cấy dạng huyền dịch => Khả ứng dụng cơng nghiệp, dịng tb thương mại - Nhược điểm • Bộ nhiễm sắc thể ổn định Biến dị kiểu gene kiểu hình ni cấy kéo dài • Đặc tính sinh hố, chuyển hố, biểu gene đáp ứng với thuốc khơng hồn tồn tương đồng với mơ gốc Hiện tượng Hayflick: quần thể tế bào bào thai người bình thường phân chia từ 50 đến 70 lần nuôi cấy tế bào trước bước vào giai đoạn lão hóa Mỗi tế bào trải qua trình nguyên phân, telomere hai đầu nhiễm sắc thể rút ngắn lại chút Sự phân chia tế bào chấm dứt telomere rút ngắn đến chiều dài tới hạn II Điều kiện nuôi cấy tế bào Nguyên tắc: Đảm bảo cung cấp cho tế bào điều kiện dinh dưỡng yếu tố lý hoá in vitro tương đồng với điều kiện sống tự nhiên yếu tố cần lưu ý: Giá thể, môi trường nuôi cấy, điều kiện lý hố Giá thể ni cấy - Giá thể 2D: Bình, đĩa ni thuỷ tinh nhựa bao phủ bởi: • Proteins: collagen, gelatin, laminin, fribronectin • Các polymer thân nước: PEG, polyacrilamide Ưu điểm: thao tác đơn giản, rẻ tiền Nhược điểm: khơng mơ xác trạng thái tương tác in vivo tế bào Thực tế thường chọn tb có khả sống dạng huyền phù (tb gốc, tb ung thư), có khả lơ lửng mt để tăng suất, giảm diện tích giá mang., giảm chi phí vận hành - Giá thể 3D: cấu tạo từ vật liệu tổng hợp sinh học, polymer, matrix trơ, áp dụng công nghệ in 3d Microfluidic devices (Chip kênh vi dẫn lưu): • Mơ trạng thái tế bào đỉnh màng đáy • Mơ xác lưu lượng khuếch tán chất dinh dưỡng oxygen, gradient nồng độ dinh dưỡng yếu tố hồ tan • Kiểm sốt tương tác tế bào với mơi trường dịch thể, loại tế bào khác phần khác mơ • Mơ tác động học, lý học lên mô nuôi cấy Môi trường nuôi cấy tế bào - Là yếu tố quan trọng kỹ thuật nuôi cấy tế bào, đặc biệt thành phần từ động vật Ảnh hưởng lớn đến kết độ lặp lại thí nghiệm - Trong mơ, tb nhận chất dinh dưỡng từ máu, mt ni cấy ban đầu dịch sinh học huyết tương, dịch bạch huyết, huyết chất chiết từ phơi Tuy nhiên mt có thành phần khơng xác định khó đảm bảo đồng lô → phát triển thành mt nhân tạo có cơng thức xác định để việc kiểm sốt chất lượng mt sản phẩm dễ dàng - Phân loại môi trường tổng hợp tùy thuộc vào thành phần tính ổn định: ▪ Serum-containing : bổ sung 10-20% huyết thanh, đa số nuôi invitro dùng môi trường ▪ Serum-free: khơng cần huyết thanh, bổ sung thêm yếu tố xác định cần cho sinh trưởng protein, thường sử dụng quy mô công nghiệp (hạn chế huyết để giảm chi phí, hạn chế nhiễm) ▪ Protein-free : thay protein acid amin ▪ Chemical defined: hồn tồn từ chất hóa học tinh khiết, thực tế sử dụng - Các thành phần mơi trường: • Nước: Khơng chứa tạp, ion kim loại, độc tố, đạt tiêu chuẩn nước pha tiêm • Muối vơ – yếu tố vết: Các ion Na+, K+, Mg2+, Ca2+ Đóng vai trị cân áp suất thẩm thấu điện màng tế bào, co-factor hệ thống enzyme quan trọng tế bào • Hệ đệm: đệm CO2/HCO3- (yếu, trơ, phải thường xuyên theo dõi để bổ sung) đệm HEPES, thường kèm thị pH (giúp theo dõi mt cịn dinh dưỡng khơng, mật độ tế bào nhiễm vd methyl red thấy chuyển sang màu vàng phải thay) • Carbohydrate thành phần hữu cơ: Nguồn lượng cho tế bào, chủ yếu glucose (ngồi cịn galactose, maltose, fructose ) • Acid amins: quan trọng glutamine, methionine, serine • Vitamins: co-factor quan trọng cho hệ thống enzyme tế bào • Protein peptide: đóng vai trị quan trọng, đặc biệt mơi trường khơng huyết • Các yếu tố tăng trưởng – hormone: thường sử dụng thay môi trường không huyết thanh, loại thường gặp FGF, EGF, IGF, VEGF, PDGF, NGF, TGF • Kháng sinh: ức chế tăng trưởng vi khuẩn vi nấm không ức chế virus, mycoplasma, thường dùng hỗn hợp penicillin, streptomycin amphotericin B • Huyết thanh: thành phần phức tạp chứa protein, chất khoáng, lipid, hormone, yếu tố tăng trưởng yếu tố bám dính, môi trường nuôi thường bổ sung – 20% (thử tương tác virus thường dùng mt serum-free) Các điều kiện lý hóa - Độ pH: trì cân ion thích hợp điều kiện hoạt động tối ưu cho enzyme nội bào, khả gắn kết hormone thụ thể hoạt động chuyển hoá khác tế bào, thường dùng hệ bicacbonat - Nồng độ O2 loại khí: Điều chỉnh tỷ lệ O2-CO2-N2, tạo phân áp thích hợp với đặc điểm sinh lý tế bào mô sống - Nhiệt độ: phụ thuộc vào loài - Áp suất thẩm thấu: Duy trì mức sinh lý 260 mOsm/kg – 320 mOsm/kg - Độ nhớt: Quan trọng nuôi cấy tế bào dạng huyền phù nồi khuấy Theo mục đích, mt chia thành loại: trì phát triển, mt phát triển chứa yếu tố cần thiết để tb phân chia, mt trì nhằm đảm bảo tb nguyên vẹn cấu trúc chuyển hóa nhưng khơng kích thích tb phân chia III Thiết bị NCTB: Yêu cầu chung - Kiểm soát pH mt ni cấy - Kiểm sốt nhiệt độ - Có chế trao đổi khí để đảm bảo cung cấp O2 loại bỏ CO2 thừa - Cho phép cung cấp chất dinh dưỡng trình nuôi cấy - Cung cấp đủ bề mặt cần thiết để tb bám trường hợp ni cấy dịng tế bào phụ thuộc bề mặt - Duy trì trạng thái vô trùng tránh tạp nhiễm IV Ứng dụng cơng nghệ ni cấy tế bào Mơ hình hố bệnh lý - Công cụ phát triển dược phẩm - Thay thử nghiệm động vật Thử động vật Thử tế bào invitro Đắt Chi phí giảm Mất thời gian Tế bào đồng : đáp ứng ổn Vấn đề đạo đức định Mỗi cá thể đáp ứng với thuốc không Thời gian nhanh giống → Nhưng khơng thay hồn tồn thử mơ hình động vật đáp ứng thuốc thể khác với thuốc tế bào ( chịu chuyển hóa gan, đào thải thận,…) → Thử tế bào in vitro sàng lọc bước đầu → thử động vật - Sàng lọc dược phẩm, liệu pháp điều trị ung thư panel gồm 60 (59) dòng tế bào ung thư khác thử với thuốc xem xét hoạt tính thuốc dịng tb; đo hoạt tính proteomic, tức tổng số protein mà tb biểu đáp ứng với thuốc → đánh giá đáp ứng protein đích Có thể thử thuốc trực tiếp tế bào BN - Đánh giá khả khuyếch tán qua màng dươc phẩm Sản xuất kháng thể - protein tái tổ hợp- hoạt chất sinh học - Sản xuất protein phức tạp cần biến đổi sau dịch mã glycosyl hoá, hiệu suất tổng hợp cao chi phí cao hơn, thời gian cao hơn, điều kiện mt phức tạp - Các dòng tb thường sử dụng: CHO, BHK, HEK-293, PER-C6 - Các protein tự nhiên tái tổ hợp: + vaccin virus: viêm gan B, sởi, quai bị, rubella, lở mồm long món,… + cytokine (interferon interleukin) + yếu tố tạo máu: erythropoietin sản xuất công nghệ khác + hormone tăng trưởng: Serostim, Saizen + kháng thể đơn dịng: sx CNTB + yếu tố đông máu phân hủy cục đơng máu + Protein C hoạt hóa (APC), FSH, thụ thể TNF tan Nuôi cấy tế bào thực vật - Cơng nghệ ni cấy tế bào thực vật • Sản xuất chất chuyển hố thứ cấp có hoạt tính từ dược liệu • Nhân giống trồng • Thực vật biến đổi gene Liệu pháp tế bào - Y học tái tạo - Liệu pháp tế bào gốc - Thay sửa chữa mô hư hỏng - Nội tạng thay nhân tạo Nguồn tế Loại tế bào bào Ứng dụng Tủy xương Tạo máu Ung thư, suy giảm miễn dịch, bệnh chuyển hóa, bệnh hemoglobin, nhồi máu tim Mô phôi Neuron Bệnh Parkinson Da Biểu bì Bỏng, loét, bệnh da di truyền Tụy Tụy Tiểu đường thần kinh Liệu pháp CAR-T cell : Thu tế bào lympho TCD8 bệnh nhân, dùng kĩ thuật thao tác gen để đưa vào đoạn gen trình diện kháng nguyên → định hướng kháng nguyên, giúp nhận diện xác tiêu diệt tế bào ung thư (FDA cho phép dùng kĩ thuật để điều trị leukomia non-leukomia) Liệu pháp gene ADN vaccin - Dùng làm tế bào chủ để sản xuất vector - Nuôi cấy tế bào chuyển gen để đưa vào thể