Đang tải... (xem toàn văn)
Công nghệ protein và enzyme (CNPE) là một trong những công nghệ chủ yếutrọng điểm của công nghệ sinh học (CNSH) có tiềm năng phát triển rất lớn. Thị trường enzyme công nghiệp Việt Nam được dự đoán sẽ tăng trưởng mạnh mẽ vào năm 2025, thể hiện qua nhu cầu sử dụng ngày càng nhiều các loại enzyme công nghiệp để lên men, chế biến các sản phẩm sữa, các loại enzym tái tổ hợp trong các ngành công nghiệp tẩy rửa, dược phẩm. Đến cuối năm 2020, thị trường protein thay thế của Việt Nam đạt 249 triệu USD, với thị phần chủ đạo là protein làm từ đậu nành (70%). Trong lĩnh vực dinh dưỡng thể thao, protein thể thao dự kiến sẽ vẫn là danh mục lớn nhất và là danh mục duy nhất có doanh số bán hàng đáng chú ý vào năm 2020. Tình hình sản xuất dược phẩm trong nước vẫn còn nhiều hạn chế, chỉ đáp ứng được khoảng 52,5% nhu cầu dược phẩm trong nước, số còn lại phải thông qua nhập khẩu. Thị trường thức ăn chăn nuôi của Việt Nam cũng đang có sự chuyển dịch nhu cầu sử dụng các thức ăn thay thế thức ăn truyền thống giàu năng lượng bằng các phụ phẩm nông nghiệp. Protein đơn bào (vi sinh vật, nấm, rong biển), protein đa bào (nấm men) cũng đang dần phổ biến trong lĩnh vực chăn nuôi tại Việt Nam, dự kiến nhu cầu những sản phẩm này cũng sẽ ngày càng tăng trong tương lai.
Công nghệ enzyme – protein I Đại cương - Công nghệ enzym: ứng dụng enzym xúc tác sinh học để tạo sản phẩm hay dịch vụ - Ứng dụng enzym : • • • - II Cơng nghiệp: ▪ Thực phẩm: Làm bánh mì, rượu bia, sản phẩm sữa ▪ Tẩy rửa: protease, lipase ▪ Xử lý tinh bột: amylase, isomerase, CGTase ▪ Dệt-da: amylase, lipase, cellulase Y Dược ▪ Trợ tiêu hóa: amylase, protease ▪ Chẩn đoán: Alcol dehydrogenase, Cholesterol esterase, Creatinase ▪ Điều trị: Asparaginase, Uricase, Streptokinase ▪ Hóa dược: Ibuprofen, Salbutamol… Nghiên cứu: Endonuclease, RNase, DNase, Polymerase, Ligase Nhu cầu sử dụng enzyme Xúc tác sinh học Khái niệm - Enzym chất xúc tác trình sinh học - Bản chất protein - Giúp phản ứng đạt điểm cân nhanh - Giúp phản ứng xảy nhanh điều kiện bình thường áp suất, nhiệt độ, pH - Enzym xúc tác PƯ với thay đổi lượng tự khơng thuận lợi trừ PƯ song hành với PƯ có thay đổi lượng tự thuận lợi ( làm giảm NL tự phản ứng giúp phản ứng xảy nhanh hơn) Ưu điểm xúc tác sinh học so với xúc tác hóa học - Tính đặc hiệu cao → hiệu suất phản ứng cao (>= 99%) - Thân thiện với người - Hoạt động điều kiện pH, áp suất thppng thường Đặc tính xúc tác sinh học - Tính chọn lọc cao • Chọn lọc theo vị trí hóa học Nếu xúc tác sinh học phải thực qua bước: Enzym đặc hiệu cho vị trí 5’ ▪ Bảo vệ che chắn nhóm OH vị trí khác 5’ ▪ Thực phản ứng hóa học ▪ Gỡ bỏ nhóm bảo vệ OH • Chọn lọc khơng gian → Chỉ tác động đồng phân S - Hoạt động chất đa dạng: với enzyme thuộc nhóm thủy phân, có nguồn gơc từ VSV - Hoạt động mơi trường khơng phải nước • Đa số enzyme hoạt động môi trường nước Tuy nhiên số enzyme lipase, protase hoạt động môi trường khan nước - Khả đảm nhận chất cao: • Nếu chất nhiều ức chế hoạt động enzyme có số enzyme hoạt động nồng độ chất cao - Có độ bền đủ cao - Tính kinh tế: • Enzym có giá thành cao xét hiệu suất tổng giá thành quy trình sản xuất với enzyme giá thành nhiều trường hợp rẻ so với xức tác hóa học III Enzym cố định Khái niệm - Là enzym định vị không gian xác định giữ hoạt tính Đặc điểm enzyme cố định - Ưu điểm: • Enzym sử dụng lặp lại nhiều lần phải đảm bảo q trình sử dụng khơng bị rị rỉ enzyme cố định gắn vào pha rắn để làm cho không tan nên việc tách enzyme khỏi thành phần phản ứng trở nên dễ dàng • Chế phẩm bền enzyme tự nhờ chúng bảo vệ chất mang • Enzym cố định có tốc độ phản ứng lớn, dễ tổ chức sản xuất mức độ tự động hóa cao ( nhồi enzyme vào cột nhổi cho chất chảy qua) • Nhờ cố định mà enzym khơng lẫn vào sản phẩm cuối→ tiết kiệm thời gian chi phí cho việc tinh chế sản phẩm • Enzym cố định bảo quản tốt enzym tự loại ( enzyme cố định dạng rắn nên dễ bảo quản enzyme tự dạng hòa tan) - Nhược điểm: • Giảm hoạt tính enzym so với ban đầu gắn enzyme với chất mang thay đổi phần cấu trúc enzyme • Rị rỉ ngồi làm giảm hoạt tính lần tái sử dụng • Cản trở khơng gian liên kết với chất mang làm hạn chế tiếp xuc enzyme chất Ứng dụng enzyme cố định Vật liệu cố định ( chất mang) - Vật liệu cố định phương pháp cố định hai yếu tố định hiệu trình cố định - Yêu cầu chất mang: - • Chất mang phải rẻ tiền, dễ tìm dễ tổng hợp • Chất mang phải có tính lý ổn định • Chất mang phải bền vững mặt hóa học, khơng hịa tan mơi trường phản ứng • Chất mang phải có diện tích bề mặt lớn • Có khả trương nở mơi trường Phân loại chất mang • Chất mang hữu Polime tự nhiên ✓ Tính tương thích sinh học cao Polime tổng hợp ✓ Khả tương thích sinh học với enzyme ✓ Kém bền vững với tác nhân ✓ Ổn định bền vững TC mơi trường lý, trương nở tốt, điều chỉnh kích thước lỗ ✓ Dễ bị vi sinh vật phân hủy • ✓ Không phân hủy tự nhiên Chất mang vơ ✓ Bền với tác động bên ngồi, khơng bị phân hủy VSV, có cấu tạo xốp, phân tử nhỏ, mịn nên dễ hấp phụ enzym ✓ Gắn kết với enzym yếu, phù hợp với PP cố định thuận nghịch - Các phương pháp cố đinh enzyme Các phương pháp cố định thuận nghich • ✓ Hấp phụ: Lực liên kết lực tương tác yếu liên kết hydro, liên kết van der Waals, ✓ Ít ảnh hưởng đến hoạt tính enzym ✓ Trong q trình tái sử dụng enzyme dễ bị rửa trơi • Liên kết ion ✓ Liên kết ion điện tích dương điện tích âm ✓ Cần lưu ý đến pH môi trường enzyme dễ thay đổi điện tích pH mơi trường thay đổi • Liên kết lực ✓ Sự cố định dựa vào tương tác protein-lignand ✓ Chỉ thực chất mang có lignand ✓ Là liên kết bền vững ✓ Liên kết ion kim loại chelate dạng liên kết lực • Liên kết disulfit ✓ Mặc dù liên kết đồng hóa trị độ bền thay đổi pH, nhiệt độ thay đổi Các phương pháp cố định enzyme không thuận nghịch • Liên kết đồng hóa trị ✓ Phương pháp dựa vào lực enzyme chất mang để tạo phức enzyme – chất mang liên kết cộng hóa trị Liên kết bền vững nên enzyme khơng thể tách và dung dịch lúc sử dụng ✓ Quá trình gắn kết enzyme chất mang tiến hành theo cách: o Liên kết qua bước: chất mang có chứa nhóm có khả gắn trực tiếp với enzyme o Liên kết qua bước: chất mang liên kết với enzyme thơng qua chất trung gian B1: Hoạt hóa chất mang B2: Tạo liên kết enzyme chất mang ✓ Các chất hoạt hóa chất mang ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme làm giảm hoạt tính enzyme q trình cố định • Phương pháo bắt giữ enzyme ✓ Phương pháp dựa nguyên tắc hút giữ enzyme vào mạng lưới mà chất sản phẩm qua không cho enzyme khuyếch tán vào môi trường ✓ Các chất mang tổng hợp polime tổng hợp polime sinh học o Với polime sinh học tiến hành cách trộn lẫn enzyme với polyme sau tạo liên kết polyme ion đa hóa trị để tạo thành cấu trúc mạng lưới giữ enzyme o Với polime tổng hợp cố định cách trộn enzyme với monomer sau q trình polime hóa xảy nhốt enzyme vào khe hở mạng lưới ✓ Hiệu suất phương pháp cao hầu hết enzyme cố định hết Tuy nhiên hoạt tính enzyme thay đổi vào tùy vị trí Vị trí gần bề mặt chất mang hoạt tính enzyme cao Enzym vị trí lõi chất mang hoạt tính thấp • Tạo vi hạt bao ✓ Enzym giữ bao vi thể dạng tự ✓ Nếu phân tử chất có kích thước lớn khơng thể qua lại màng nên thực phản ứng với enzyme • Liên kết chéo ✓ Phương pháp không cần chất mang Các phân tử enzyme tự liên kết với cầu nối tạo nên mạng lưới phân tửu enzyme trạng thái không hịa tan ✓ Cản trở khơng gian chất mang nhỏ phải nghiên cứu điều kiện để cầu nối bền vững - Ảnh hưởng cố định đến hoạt tính enzyme: • Hoạt tính enzym CĐ phụ thuộc vào chất mang ✓ Hiệu ứng phân phối: chất mang polyme lôi kéo tới bề mặt đẩy khỏi chất sản phẩm phản ứng chất khác làm tăng hay giảm tương đối chúng phạm vi môi trường vi mô nằm sát cạnh enzym ✓ Hiệu ứng ngăn chặn: thân chất mang polyme ngăn cản khuếch tán tự phân tử hướng tới enzym (cơ chất) khỏi enzym (sản phẩm phản ứng) • Hoạt tính enzym cố định phụ thuộc vào khuếch tán chất, sản phẩm phân tử khác ✓ Tốc độ khuếch tán chất, sản phẩm chất khác phụ thuộc vào yếu tố: kích thước lỗ gel chất mang polyme, trọng lượng phân tử chất, ✓ Sự sai khác “hiệu ứng phân phối” IV Enzym trị liệu Trị liệu enzym - Thay enzym bệnh di truyển hay mắc phải - Cung cấp tác dụng sinh học đặc hiệu: + Thủy phân VK, protein bị nặng + Chế phẩm enzym làm phân hủy chất nhày gây tắt nghẽn đường tiêu hóa - Hỗ trợ, phối hợp liệu pháp hác Yêu cầu - Phải đến vị trí tác động - Có hoạt tính nơi tác động: + Cơ chất co-factor + Thế oxh-khử + pH + Sự diện chất ức chế - Đủ độ bền - Có hiệu điều trị - An toàn: hiệu điều trị cao phản ứng phụ - Hiệu chứng minh thử nghiệm lâm sàng - Dạng sử dụng thuận tiện: điều trị rối loạn tiêu hóa Vấn đề dặc thù protein Vấn đề Nguyên nhân Giải pháp - Không ổn định - Enzym peptide: khơng biệt nhiệt, pH cực đoạn, chất biến tính dễ bị phân ủy sinh học - Chất ức chế nội sinh làm giảm hoạt tính enzym - Sinh khả dụng - Enzym tan thân nước khó qua màng TB, khơng có SKD đường uống Chỉ điều trị chỗ - Tính thấm TB - Khơng vào mơ Khơng tác động nội bào Giảm kích thước phân tử - Giới hạn tác dụng hệ tuần hoàn - Dung hợp trình tự làm trung gian xuyên màng - Enzym chất lạ nên đáp ứng miễn dịch - Biến đổi hóa học: PEGlylat - Dị ứng hít bột enzym protease hóa - Di truyền: che, loại bỏ epitop - Gây miễn dịch - Sản xuất vả kiểm định Giá thành cao - Kiểm nghiệm sản phẩm khó khăn - Liên hợp PEGylat hóa - Liên kết chéo hóa học - Hệ thống phịng thích kiểmsốt hay trữ thuốc - Bao liposome nhân tạo hay xác TB máu - Độ biến enzym vị trí nhận thụ thể - Hướng đến mô đặc hiệu: + Biến đổi nhóm đường + Dung hợp di truyền với chất định hướng đích – peptideghim + CN gen: gắn theo hướng đích 4 Nguồn enzym Nguồn enzym Đặc điểm - TB người/ Động vật - Chất lượng tốt - Năng suất tốt - Nhiễm virus - Nấm men - Biến đổi hậu dịch mã khác người - VK - Năng suất cai - Không thực hiên biến đổi hậu dịch mã, không sử dụng - Tăng suất - Sản xuất yếu tố đông máu - SV chuyển gen - Liệu pháp gen IV - Chuyển gen vào người,, mangtính cá thể Liệu pháp enzym thay Enzym sử dụng đường tiêm - Adagen (Adenosine Deaminase, ADA bò): Điều trị SCID (suy giảm miễn dịch kết hợp trầm trọng) Loại adenosine dư thừa máu Xử lý PEG: tăng T1/2 từ lên ngày; tăng tác động lên lần - Ceradase (chế phẩm tiêm Alglucerase): Trị bệnh Gaucher bệnh tổn trữ thể ly giải LSD khác thiếu enzyme glucocerebrosidae - Myozym (acid α-galactosidase tái tổ hợp) : Trị bệnh Pompe rối loạn tích lũy glycogen II, thiếu α-glucosidase Enzym sử dụng đường uống - Sacrosidase (β-fructofuranoside fructohydrolase – S.cerevisae) Điều trị CSID (thiếu sucrse-isomaltase) - Phenylalanin amoniac lyase (PAL) (phenylalanine hydroxylase) Điều trị phenylkeon niệu - Enzym tụy (PEP) HH enzyme hỗ trợ tiêu hóa amylase, lipase protease Liệu pháp enzyme dựa vào đặc tính xúc tác Điều trị mô bị tổn thương - Enzym thủy phân protein: chùi rửa vết bỏng (kết chưa khả quan) - Chế phẩm gel bôi chứa hh enzyme từ dứa: điều trị bỏng nặng (đang thử nghiệm) - Vibrolysin: loại bỏ protein biến tính da bị bỏng (đang thử nghiệm) - Chrondroitinase hydronidase: có ứng dụng điều trị tổn thương cột sống Điều trị bệnh nhiễm - Lyzozym: phân hủy chọn lọc ARN virus, chống HIV - Chitinase: thủy phân chitin, ức chế phát triển nấm Điều trị ung thư - Arginin deaminase: ức chế u hắc tố u tế bào gan - Aspaginase : ung thư nguyên bào lympho cấp - Liệu pháp thuốc tiến ch61t enzym: định hướng kháng thể - Urate oxidase: trị chứng cao acid uric máu – tác dụng phụ hóa trị liệu ung thư