Công nghệ gen (còn được gọi là kỹ thuật di truyền hoặc di truyền sửa đổi) là một tập hợp các kỹ thuật cơ bản để thực hiện thay đổi cấu trúc và chức năng của gen – đơn vị di truyền cơ bản trong các tế bào của tất cả các cuộc sống sinh vật.
CÔNG NGHỆ GEN I ĐỊNH NGHĨA - Tổng quát: Các thao tác di truyền dùng để tạo cá thể có tổng hợp đặc điểm di truyền - Cụ thể: + Các thao tác tế bào, liên quan đến việc tạo tế bào lai + Các thao tác phân tử, liên quan đến việc tạo phân tử AND tái tổ hợp nhân tạo, đưa chúng vào vector chuyển vào tế bào vật chủ II CÁC CÔNG CỤ CƠ BẢN Chủng vi sinh vật: Chọn chủng vi sinh vật phù hợp với mục đích vector sử dụng Chủng vi sinh vật dùng tạo dịng gen gồm loại chính: Chủng tạo dòng - Mang đột biến cho phép nhận DNA ngoại lai - Duy trì ổn định với số lượng cao - Cho phép chiết tách trở lại lượng lớn DNA đích - Dễ dàng phát dịng mang DNA đích, kĩ thuật bổ sung alpha - Ví dụ: + JM103: Nhân vector phage M13, Dùng với plasmid pUC - plasmid có sử dụng kĩ thuật bổ sung alpha để chọn lọc dòng tái tổ hợp Mất gen β-galactosidase NST có gen đoạn omega βgalactosidase plasmid F, cho phép bị nhiễm phage M13 Nếu plasmid F khơng cịn chức → trì mt tối thiểu + JM109: Tương tự JM103 Mang đột biến recA, làm khả tái tổ hợp tương đồng → biến đổi đoạn gen ngoại lai, không tích hợp vào DNA NST Hiệu suất thấp JM103 + DH5α: Đặc tính bổ sung alpha Đột biến recA1, làm khả tái tổ hợp tương đồng Đột biến deoR, giúp dễ thu nhận DNA lớn Chủng biểu - Mang yếu tố cần thiết để biệu gen đích ổn định protein tái tổ hợp - Thường đưa vector vào chủng tạo dòng trước để tăng số plasmid sau chiết đưa vào chủng biểu - Ví dụ: + BL21 (DE3): promotor T7 giúp biểu gen đích, đột biến gen protease lon ompT để tránh tạo protease phá hủy protein đích + BL21 (DE3) plysS: thêm T7 lysozym ức chế hoạt động T7 polymerase → giảm biểu hệ thống phiên mã T7 trường hợp protein tạo thành độc với tế bào chủ + BL21trxB: đột biến trxB để giúp hình thành cầu disulfit để protein gập cho Vector tạo dòng PLASMID Tất plasmid dùng làm vector tạo dòng phải thỏa điều kiện: - Có yếu tố đánh dấu để chọn lọc dịng tái tổ hợp (gen kháng kháng sinh kỹ thuật bổ sung alpha) - Có điểm khởi đầu chép (Ori): kiểm soát điểm ori để tăng số sao, tăng hiệu suất chiết tách - Có vùng tạo dịng (MCS): chứa trình tự nhận diện enzym cắt giới hạn, cho phép cắt để duỗi plasmid chèn đoạn gen mong muốn Các plasmid sau tái tổ hợp đưa vào tế bào chủ cách biến nạp hay thẩm điện Dễ sử dụng, đa năng, chuyển vào nhiều dòng tế bào khác khó tạo dịng DNA lớn (thơng thường thao tác với DNA đích nhỏ 3kb) pUC (tạo dịng) + Mang số đặc tính vector M13 pBR + Kích thước nhỏ (2,7 kb), có gen kháng ampicillin (dùng để chọn lọc), điểm Ori pBR322 phần gen lac Z E.coli + Vùng tạo dòng (tương tự M13) nằm đoạn lacZ, dùng kỹ thuật bổ sung alpha + Số cao + Có thể khuếch đại chloramphenicol Chọn lọc dịng tái tổ hợp kĩ thuật bổ sung alpha: gen lacZ nằm cạnh vùng MSC mã hóa cho mảnh alpha enzym β-galactosidase, giúp enzym có hoạt tính Khi chèn đoạn gen đích vào MCS, gen lac Z khơng hoạt động; tế bào nhận plasmid nối thành cơng gen đích khơng tạo enzym βgalactosidase → phân biệt dòng tái tổ hợp pBluecript – pGEM (tạo dòng) + Mang nhiều yếu tố thuận tiện cho thao tác + Kích thước nhỏ (3kb) + Số cao E.coli + Vùng tạo dòng nằm promoter cho phép phiên mã từ trình tự chèn vào pGEX pET: + Ít dùng để tạo dòng, thường dùng để biểu gen, tinh chế protein + Có vùng tạo dịng, vị trí gắn ribosom, promoter tối ưu hóa để biểu gen đích (có vùng kết thúc phiên mã, có stop codon kiểm sốt dịch mã) + Có trình tự mã hóa cho đoạn chức polyhistidin tag, S-tag, GST-tag,… → giúp tinh chế nhận diện protein pGEX: + Promoter: P tag + Gen ức chế: lacI, hoạt động cảm ứng với IPTG + Gen mã hóa: Gluthathione-Stransferase + Giữa GST MCS có trình tự mã hóa vị trí cắt thrombin + RSB, terminator: tối ưu hóa + Tinh chế: sắc ký lực với cột GST, chuỗi polypeptid mang gen đích-GSH taq giữ lại dùng thrombin để cắt GST khỏi chuỗi cho hh qua cột lần để loại GST, thu protein đích VECTOR TỪ PHAGE LAMBDA Phage lambda phage tiêu giải, sau xâm nhập vật chủ tự nhân DNA tạo virion, ly giải tế bào phóng thích phage Khi dùng làm vector: - Đã loại bỏ phần không liên quan đến trình tiêu giải, thay DNA ngoại lai - Kích thước DNA sau tái tổ hợp 78%-102% (38kb-51kb) → phải ý kích thước đoạn gen muốn chèn - Bộ gen sau tái tổ hợp đóng gói in vitro đơn giản cách trộn với protein vỏ → cần lượng vector DNA đích - ưu điểm lớn so với vector plasmid: chuyển đoạn gen lớn khả tự xâm nhập vào tế bào đích - Ứng dụng để xây dựng thư viện tái tổ hợp → dễ dàng phát với mẫu dò, khuếch đại bảo quản thời gian dài: λgt10, λgt11, λZAPII,… VECTOR COSMID Cosmid dạng lai phage plasmid, có ưu dạng: đóng gói in vitro phage, hoạt động tế bào plasmid Cosmid vector: - Tạo dịng DNA có kích thước lớn đến 50 kb - Mang yếu tố chọn lọc, điểm Ori plasmid, vị trí tạo dịng trình tự phage lambda mã hóa cho vị trí cos đầu - Vector cắt RE vị trí tạo dịng, trộn với đoạn gen muốn chèn (35-45 kb), nối ligase, tạo thành sợi DNA thẳng sợi đôi với đoạn chèn bị kẹp vector, đầu có vị trí cos ủ với protein vỏ tạo thành phage xâm nhiễm vào E.coli - Khi vào tế bào chủ, DNA tái tổ hợp đóng vịng hoạt động plasmid (khơng bị thủy phân exonuclease) Các enzym biến đổi acid nucleic a) Enzym cắt giới hạn Đặc điểm - Cắt DNA vị trí xác định - Tạo đầu dính đầu tù - Lưu ý tính thương thích cắt nối Chức năng: - Là endonuclease có khả cắt DNA hay gần trình tự nhận diện đặc hiệu - Hoạt tính methylase xúc tác việc methyl hóa trình tự nhận diện đặc hiệu ngăn cản tác động enzym cắt giới hạn (trong công nghệ gen khơng cần hoạt tính - Lồi khác có cặp RE/metylase khác Phân loại RE: - Loại I III: hoạt tính endonuclease methyl hóa, loại cần ATP để có lượng, cắt DNA vị trí xa điểm nhận diện → thường khơng dùng - Loại II: có hoạt tính endonuclease, không cần ATP để hoạt động cắt DNA gần vị trí nhận diện → thường dùng công nghệ gen (3 ưu điểm gạch dưới) - Tên RE dùng kí tự Latin tên chi loài, ký tự thứ tư để chủng plasmid số La Mã thứ tự phát enzym Ví dụ: Sma I RE Serratia marcescens, phát lồi Vị trí nhận diện: - Vị trí nhận diện đa số RE loại II thường chứa 4-6 nucleotid theo kiểu palindrome (đối xứng nhau, đọc từ trái sang hay từ phải sang giống nhau) - Có kiểu xếp trình tự nhận diện: + palindrome (BamHI, EcoRI) + palindrome bị ngắt (HinfI, XmnI) + trình tự bị thối biến, thường có phần cịn lại palindrome (EcoRII, HincII) + khơng phải palindrome (MboII) (thường chọn kiểu để tránh dầu dính lại nhau) - Cắt đầu gen đích với RE : xu hướng đầu tự nối lại với nhau, nối ngược chiều promoter → không chọn - Cắt đầu gen đích với hai loại RE khác nhau: đầu không nối lại, ghép chiều vào plasmid → chọn cách b) Polymerase DNA polymerase phụ thuộc DNA - Ecoli DNA polymerase I (thường dùng) + Chức năng: Đánh dấu DNA, tổng hợp sợi thứ ADNbs + Đặc tính : Hoạt tính tổng hợp 5’-3’ dùng đọan mồi DNA hay ARN Exonuclease 3’-5’ : yếu polymerase T4 T7 Exonuclease 5’-3’ - Đoạn Klenow (đoạn lớn polymerase I Ecoli) + Khơng có hoạt tính exonuclease 5’-3’ → khơng gặm đầu 5’, DNA sau th bảo quản tốt + Chức năng: Làm tà đầu 3’ bị hụt (đầu dính), loại bỏ đầu 3’ nhơ ra, đánh dấu đầu 3’ DNA sợi đơi, giải trình tự DNA pp dideoxy - Taq AND polymerase + Ly trích từ Thermus aquaticus, có dạng tái tổ hợp + Hoạt động tối ưu 75-80oC → bền nhiệt + Ứng dụng: Khuếch đại DNA phản ứng PCR, giải trình tự DNA PP dideoxy Polymerase phụ thuộc ARN (hoặc DNA) - Enzym chép ngược (reverse transcriptase): + Có loại AMV MMLV + Ứng dụng: tổng hợp sợi thứ cDNA, giải trình tự DNA pp dideoxy DNA polymerase không phụ thuộc khn mẫu: + Cịn gọi terminal (deoxynucleotidyl) transferase + Ly trích từ thymus bê + Có khả thêm nucleotid nhóm 3’-hydroxyl mồi, tạo đoạn đầu dính giúp nối đoạn DNA ARN polymerase phụ thuộc DNA + Là ARN polymerase phage SP6, T3, T7 + Có khả phiên mã ARN khn mẫu DNA + Ưu điểm : Chỉ phiên mã từ vị trí khởi động (promoter) đặc hiệu phage Tổng hợp nhanh phân tử ARN dài hàng nghìn nucleotid Có thể cho 5-30 ARN từ khn mẫu DNA c) Ligase Xúc tác tạo liên kết phosphodiester 3’-OH 5’-P sợi acid nucleic Polymerase chỗ tạo liên kết đầu 5’ chứa đủ gốc phosphat, tức hình thành liên kết với nucleotic tự do, hoạt động không cần lượng Ligase tạo liên kết đầu 5’ chứa gốc phosphat → cần bổ sung NAD ATP - DNA ligase : HĐ DNA sợi đôi - ARN ligase : HĐ ARN hay DNA sợi đơn - DNA ligase Ecoli cần NAD để hoạt động dùng để sửa chỗ bị cắt khía hay nối đầu dính - DNA ligase T4 cần ATP để hoạt động dùng để sửa chỗ bị cắt khía hay nối đầu dính đầu tù → thường dùng lượng dùng ATP, ATP bền NAD - ARN ligase T4 xúc tác nối ARN, đánh dấu đầu 3’ ARN/ sản xuất đoạn dò III KỸ THUẬT TẠO DỊNG GEN - Tạo dịng tế bào mang đoạn gen cần nghiên cứu - Mục đích: + lập đoạn gen cần nghiên cứu khỏi tập hợp gen chung để nghiên cứu chức thực thao tác biến đổi + sản xuất lượng lớn gen đích Bước Tạo đoạn DNA cần tạo dịng Trình tự: Cắt giới hạn DNA nguồn PCR biết trình tự đầu / RT-PCR Tổng hợp DNAc PCR - Nguyên lý: chép DNA in vitro: Trong điều kiện có sẵn nucleotid, enzym polymerase kéo dài mạch DNA theo nguyên tắc bổ sung đầu 3’OH trống - Kỹ thuật PCR gồm bước: + biến tính dsDNA thành sợi đơn, + ủ đoạn mồi (chuỗi oligonucleotid tổng hợp đặc hiệu) với ssDNA + enzym kéo dài đoạn mồi theo nguyên tắc bổ sung với ssDNA mẫu Hình: Tổ hợp vật liệu di truyền Ở tb nhân thật, tổ chức vật liệu di truyền khơng có tính liên tục nên khơng dùng DNA NST để tạo dịng gen mà thay vào ARNtt Để sử dụng thông tin di truyền ARNtt phải phiên mã ngược tạo ADNbs Hình: Tổng hợp tạo dịng DNAbs Có phương pháp để tổng hợp DNAbs từ ARNtt tổng hợp thay tổng hợp thích ứng đoạn mồi Với phương pháp sợi DNAbs tổng hợp nhờ đoạn mối bổ sung với ARNtt có polythimin nhờ enzym phiên mã ngược thu sợi lai ARNtt/DNAbs Giai đoạn 2: + PP tổng hợp thay (thường dùng): dùng enzym ribonuclease H phân hủy ARNtt dùng làm mồi để tổng hợp DNA nhờ DNA polymerase I, sau nối lại DNA ligase PP chừa lại vùng 5’ ARN cap + PP tổng hợp thích ứng đoạn mồi: xử lý kiềm loại bỏ sợi ARN, thêm poly C vào đầu 3’ DNA nhờ enzym terminal transferase Sau đó, lắp đoạn mồi poly G để tổng hợp sợi DNA thứ hai DNA polymerase PP tạo phân tử DNAtt với vùng 5’DNA cap nguyên vẹn, nhiên nhiều bước khó kiểm sốt Giai đoạn 3: thêm polyC vào đầu 3’ terminase transferase nối chúng với vector có sẵn đầu polyG bổ sung Bước Cắt nối DNA tạo phân tử tái tổ hợp Xử lý vector DNA đích với RE + Tạo đầu tương thích để nối ligase + Đầu tù ln tương thích Đầu dính tương thích cắt với RE phù hợp + Các đầu dính RE khác thường khơng tương thích + Đầu dính dễ nối đầu tù (thường ta chọn nối đầu dính, nối đầu tù cần ligase hoạt động sợi đôi, tạo vô số sản phẩm) Bước Đưa vector vào tế bào chủ Biến nạp - Một số VK thu nhận DNA ngoại lai mt như: Baccilus, E.coli, Helicobacter - Tạo tế bào khả nạp E.coli + TB nuôi đến pha tăng trưởng + Thu tb xử lý với CaCl2 tạo tế bào khả nạp + TB khả nạp trộn với DNA plasmid điều kiện lạnh + Sốc nhiệt 42oC thời gian ngắn thu nhận plasmid - Không phải loại tế bào biến nạp Thẩm điện - Dùng sorbitol để thay đổi tính thấm màng tế bào sau dùng điện trường cao làm thủng tạm thời màng tế bào, cho phép đưa DNA với hầu hết kích thước vào tế bào - Có thể thực với tế bào nhân nguyên thủy tế bào nhân thật Tiếp hợp - Chỉ plasmid mang yếu tố tiếp hợp thực Tải nạp - Chuyển DNA vào tế bào virus - Dùng để đưa phage cosmid tái tổ hợp vào E.coli Bước Chọn lọc thư viện gen Các cách sàng lọc dịng tái tổ hợp Lai hóa - Nhận diện DNA nhờ đoạn dò đánh dấu - Dùng biết phần trình tự gen cần tìm có mảnh gen - Cách làm : cấy dòng khác lên hộp thạch tạo màng lai với đoạn dò có đánh dấu phóng xạ chứa phần trình tự gen đích, đoạn dị bám vào chỗ khóm hay plaque dịng mang gen đích đối chiếu với hộp thạch ban đầu để biết dòng mang đoạn gen đích Miễn dịch - Tìm gen mã hóa cho protein mà ta có kháng thể đặc hiệu - Protein phải biểu Hoạt tính - Dựa vào hoạt tính đặc hiệu - Protein phải biểu Hình: Kỹ thuật tạo dịng gen xây dựng thư viện gen plasmid Hình: Kỹ thuật tạo dòng gen xây dưng thư viện gen phage IV BIỂU HIỆN GEN TÁI TỔ HỢP Biểu gen tái tổ hợp Sự phù hợp vector hệ thống biểu Chọn lọc hệ thống biểu - Theo protein đích - Năng suất - Giá thành - An tồn Tối ưu hóa biểu - Phiên mã: Promoter, chất cảm ứng - Dịch mã: rbs, codon khởi đầu, sử dụng mã hợp lý, protein dung hợp - Biến đổi hậu dịch mã: In vivo, in vitro - Vector biểu mạnh, ví dụ pGEX Sản xuất protein tái tổ hợp: Chiết tách từ mô, nội tạng động vật hay Con đường tái tổ hợp người - Hàm lượng protein thể - Gen qui định protein thấp, suất thấp người tạo dịng dùng để - Quy trình sản xuất khó khăn sản xuất protein nhờ vi sinh vật tốn kém, giá thành cao tái tổ hợp - Protein từ động vật khơng hồn - Sản phẩm thu hồn tồn có tồn giống người, phản ứng nguồn gốc từ người, vấn đề dị phụ hay phản ứng dị ứng ứng tác dụng phụ giải - Nguyên liệu hay sản phầm chứa triệt để mầm virus nguy hiểm - Các nồi lên men sản xuất protein trị liệu : 2000-5000 lít So sánh tế bào chủ biểu gen TTH Tế bào chủ Ưu điểm E.coli Dễ nuôi cấy quy mô lớn Các kiểm soát phiên mã dịch mã biết rõ Đã sử dụng thành công để sản xuất insulin, interferon, somatostatin Bacillus subtilis Nhiểu protein xuất vào môi trường nuôi cấy (protein ngoại bào) Dễ nuôi cấy quy mô lớn S.cerevisiae Dễ nuôi cấy quy mơ lớn Glycosyl hóa tốt Nhược điểm Khó làm cho số protein xuất vào môi trường (protein nội bào nên phải phá vỡ thành tb, làm lẫn LPS vào sản phẩm) Phân hủy protein nhỏ protease Không thể thực hầu hết biến đổi hậu dịch mã Nhiều protein nẳm tế bào chất dạng khơng tan Điều hịa biểu gen chưa hiểu rõ hết Ít vector có mức biểu cao Không thể thục hầu hết biến đổi hậu dịch mã Điều hòa biểu gen chưa hiểu rõ hết Nấm men TB côn trùng TB động vật có vú Động vật chuyển gen Xuất protein vào mơi trường tốt Có hệ thống biểu mức cao Protein tái tổ hợp không tạo thể không tan tế bào chất Dễ nuôi cấy quy mô lớn Có thể glycosyl hóa: Pichia pastroris Hansenula polymorpha Dễ xuất protein vào môi trường Mức biểu cao Khơng có nguy virus hay prion Glycosyl hóa chình xác Biến đổi hậu dịch mã xác protein người Các hệ thồng biểu gen tốt Protein tái tổ hợp ổn định cao Đôi không thực biến đổi hậu dịch mã cách xác Biểu gen khó kiểm sốt Đơi biến đổi hậu dịch mã khơng xác Khó lên quy mơ lớn Các chuỗi mannose gây ung thư Điều hòa biểu gen chưa hiểu rõ hết Tỷ lệ protein xuất thấp Giá thành cao Có nguy nhiễm virus Khó lên quy mơ lớn tốc độ sinh sản chậm Biến đổi hậu dịch mã xác Nguy nhiễm cao Dễ dàng thu lượng lớn SP không ổn định protein tái tổ hợp, ví dụ dê (giá trị sp khơng cao) cho 1kg protein tái tổ hợp sữa năm Tương đối rẻ V ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ GEN