Nghiên cứu bệnh lá vàng greening hại cây ăn quả có múi ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam và đề xuất biện pháp phòng chống

Chân thành cảm ơn các bạn đồng nghiệp trong nhóm nghiên cứu về bệnh hại cây ăn quả có múi, nơi mà tôi đã từng công tác trong nhiều năm, cũng là nơi sinh hoạt chuyên môn của tôi đã luôn c

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học:

1 TS Ngô Vĩnh Viễn

2 PGS.TS Nguyễn Văn Viết

Hà Nội, 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày 8 tháng 6 năm 2014

Tác giả luận án

Lê Mai Nhất

LỜI CẢM ƠN !

Để hoàn thành bản luận án này, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ về mọi mặt của các cấp Lãnh đạo, các tập thể và cá nhân

Trước hết tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng tới

TS Ngô Vĩnh Viễn và PGS.TS Nguyễn Văn Viết, những người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn về chuyên môn cũng như phương pháp luận trong suốt quá trình thực hiện đề tài và luôn chia sẻ, động viên để tôi hoàn thành luận án này

Luận án được thực hiện tại Bộ môn Bệnh cây, Viện Bảo vệ thực vật và một số vùng trồng cây ăn quả có múi ở miền Bắc, Việt Nam Tôi đã nhận được

sự giúp đỡ của Ban Lãnh đạo Viện Bảo vệ thực vật; Tập thể cán bộ Bộ môn Bệnh cây; Phòng Khoa học và hợp tác quốc tế trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ quí báu đã dành cho tôi

Tôi xin gửi lời cảm ơn GS Hong Ji Su luôn tạo điều kiện giúp đỡ tôi về vật tư, hóa chất và đã chỉ cho tôi các hướng nghiên cứu mới về bệnh cây, luôn chia sẻ kinh nghiệm đồng thời đã tìm nguồn kinh phí để giúp tôi học tập và làm thí nghiệm tại Trường Đại học tổng hợp Đài Loan, tham dự Hội nghị quốc tế về bệnh Huanglongbing

Chân thành cảm ơn các bạn đồng nghiệp trong nhóm nghiên cứu về bệnh hại cây ăn quả có múi, nơi mà tôi đã từng công tác trong nhiều năm, cũng là nơi sinh hoạt chuyên môn của tôi đã luôn chia sẻ kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu và giúp đỡ tôi trên mọi phương diện

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Lãnh đạo Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Ban Đào tạo Sau đại học cùng tập thể cán bộ và quý thầy cô đã giúp đỡ trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận án

Xin ghi nhận nơi đây tình cảm yêu thương của vợ, con, cha mẹ, anh chị

em và toàn thể bạn bè, đồng nghiệp đã luôn hết lòng động viên tinh thần trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận án

Xin chân thành cảm ơn!

Lê Mai Nhất

CHƯƠNG I

CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU

5

1.2.2.1 Triệu chứng, lịch sử phát hiện, phân bố của bệnh vàng lá greening

6

1.2.2.2 Chẩn đoán và giám định bệnh vàng lá greening 11 1.2.3 Nghiên cứu về dịch tễ và sinh thái học của bệnh vàng lá greening 14

1.2.3.1 Nghiên cứu sự lan truyền bệnh vàng lá greening 14

1.2.3.2 Đặc điểm sinh học, sinh thái của rầy chổng cánh Diaphorina

citri Kuwayama

15

1.2.3.3 Nghiên cứu về ký chủ của rầy chổng cánh Diaphorina citri và

vi khuẩn Liberibacter asiaticus

1.2.4.6 Biện pháp hóa học trong phòng trừ côn trùng môi giới

(Diaphorina citri Kuwayama)

24

1.3.1 Cây ăn quả có múi ở Việt Nam và thành phần sâu bệnh hại 26 1.3.2 Nghiên cứu về bệnh vàng lá greening và nguyên nhân gây bệnh 28 1.3.2.1 Lịch sử và sự phân bố của bệnh vàng lá greening 28

1.3.2.3 Chẩn đoán và giám định bệnh vàng lá greening 30 1.3.3 Nghiên cứu về dịch tễ học của bệnh vàng lá greening 30 1.3.3.1 Nghiên cứu về sự lan truyền bệnh vàng lá greening 30

1.3.3.2 Nghiên cứu về ký chủ của rầy chổng cánh Diaphorina citri và

vi khuẩn Liberibacter asiaticus

31

1.3.4 Nghiên cứu các giải pháp quản lý bệnh vàng lá greening 33

1.3.4.1 Sử dụng cây giống sạch bệnh 33

1.3.4.2 Biện pháp cánh tác và cải thiện giống cây ăn quả có múi 35

1.3.4.3 Biện pháp sinh học trong phòng trừ côn trùng môi giới

(Diaphorina citri Kuwayama)

37

1.3.4.4 Biện pháp hóa học trong phòng trừ côn trùng môi giới

(Diaphorina citri Kuwayama)

39

CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

41

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu mức độ phổ biến và triệu chứng

2.4.1.3 Phương pháp điều tra rầy chổng cánh (Diaphorina citri

Kuwayama) trên cây ăn quả có múi

44

2.4.2 Phương pháp nghiên cứu giám định tác nhân gây bệnh

và sự lan truyền bệnh vàng lá greening

44

2.4.2.1 Phương pháp xác định tác nhân gây bệnh bằng hiển vi điện tử 44

2.4.2.2 Phương pháp chẩn đoán bệnh vàng lá greening 45

2.4.2.5 Phương pháp nghiên cứu sự lan truyền bệnh vàng lá greening

bằng môi giới rầy chổng cánh (Diaphorina citri Kuwayama)

2.4.4.2 Phương pháp nghiên cứu làm tăng tỷ lệ sống và sạch bệnh trong

vi ghép đỉnh sinh trưởng

53

2.4.4.3 Phương pháp cải tiến trong vi ghép đỉnh sinh trưởng 54 2.4.4.4 Phương pháp sản xuất cây giống sạch bệnh 54 2.4.4.5 Phương pháp đánh giá tính chống chịu của gốc ghép hiện đang 58

sử dụng trong sản xuất cây giống đối với bệnh vàng lá greening

2.4.4.6 Phương pháp nghiên cứu chống tái nhiễm bệnh vàng lá greening trên đồng ruộng

58

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

60

3.1 Mức độ phổ biến và triệu chứng của bệnh vàng lá greening 60 3.1.1 Hiện trạng sử dụng giống cây ăn quả có múi tại Hà Nội và Hòa Bình

tử

81

3.2.3 Khả lan truyền của bệnh vàng lá greening trên cây ăn quả có múi 82 3.2.3.1 Nghiên cứu sự lan truyền bệnh vàng lá greening qua hạt giống 82 3.2.3.2 Nghiên cứu sự lan truyền bệnh vàng lá greening qua nhân giống

vô tính

84

3.2.3.3 Nghiên cứu sự lan truyền bệnh vàng lá greening qua rầy chổng

cánh Diaphorina citri Kuwayama

86

3.2.3.4 Mật độ rầy chổng cánh Diaphorina citri Kuwayama trên cây ăn

quả có múi

91

3.3 Nghiên cứu xác định ký chủ và sự phân bố của các chủng vi khuẩn

gây bệnh vàng lá greening trên cây ăn quả có múi ở phía Bắc Việt Nam

96

3.3.2 Xác định chủng vi khuẩn gây bệnh vàng lá greening qua phản ứng

của một số chủng loại cây ăn quả có múi với nguồn bệnh

3.4.1.4 Ảnh hưởng của tuổi cây vi ghép lần 1 đến sự sinh trưởng và

phát triển của cây vi ghép lần 2

122

3.4.2 Sản xuất cây giống có múi sạch bệnh trong hệ thống nhà lưới 3

cấp

125

3.4.3 Tính chống chống chịu của gốc ghép hiện đang sử dụng trong sản

xuất cây giống với bệnh vàng lá greening

3.4.4.2 Hiệu quả chống tái nhiễm bệnh vàng lá greening trên đồng

ruộng ở các điều kiện quản lý khác nhau

138

PHỤ LỤC

DANH MUC VIẾT TẮT

CEVd Bệnh exocortis (Citrus exocortis viroid)

CLTV Bệnh tatter leaf (Citrus tatter leaf capillovirus)

CTV Bệnh tristeza (Citrus tristeza closterovirus)

EDTA Ethylene diammine tetraacetic acid

DNA-extraction (pH 8,0): 100mM Tris-HCL, 100mM EDTA

FFTC Food and Fertilizer Technology Centre

IOCV International Organization Citrus Virologist

Iodine Kit KI 3%; I2 1,5%

dNTPs Deoxy nucleotide triphosphates

Loading buffer 0,25% bromphenol blue, 30% glycerol theo tỷ lệ 1:4

MS Môi trường cơ bản của Murashige và Skoog

PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (polymerase chain reaction

RCC Rầy chổng cánh Diaphorina citri Kuwayama

RT-PCR Reverse-transcription polymerase chain reaction

STG Vi ghép đỉnh sinh trưởng (Shoot-tip micrografting)

TAE buffer Tris acetate EDTA buffer

0,5 TAE buffer/l 242 gam Tris base; 57,1 ml Glacial acetic acid; 100ml 0,5 M

3.3 Số mẫu bệnh vàng lá greening thu thập trên các giống điều tra ở

bốn vùng sinh thái khác nhau (2010 - 2012)

65

3.4 Tỷ lệ bệnh vàng lá greening trên một số chủng loại cây ăn quả có

múi ở phía Bắc Việt Nam (2010 – 2012)

66

3.5 Kết quả xác định sự hiện diện của bệnh vàng lá greening và một

số bệnh vi rút hại cây có múi trên cùng một mẫu bệnh bằng sinh

học phân tử (tại Viện Bảo vệ thực vật, 2010 – 2012)

67

3.6 Kết quả giám định một số nhóm triệu chứng bệnh vàng lá

greening trên cây ăn quả có múi bằng kỹ thuật PCR (Viện Bảo vệ

thực vật năm 2010 – 2012)

69

3.7 Kết quả giám định nhóm triệu chứng bệnh hỗn hợp giữa vàng lá

greening với bệnh tristeza trên cây ăn quả có múi bằng sinh học

phân tử (tại Viện Bảo vệ thực vật năm 2010 – 2012)

72

3.8 Kết quả giám định bệnh vàng lá greening trên một số chủng loại

cây có múi chủ lực ở Hà Nội và Cao Phong – Hoà Bình (năm

2010)

74

3.9 Sự phân bố của một số loài vi rút và viroid trên cây ăn quả có múi

thu nhận ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (Viện Bảo vệ thực vật,

2011)

75

3.10 Cải tiến phương pháp tách chiết thô DNA trong chẩn đoán bệnh 78

vàng lá greening, (Phòng thí nghiệm trường Đại học tổng hợp Đài

Loan, 11/2011)

3.11 Khả năng lan truyền bệnh vàng lá greening qua hạt giống (Nhà

lưới Viện Bảo vệ thực vật, 2011)

83

3.12 Khả năng lan truyền bệnh vàng lá greening trên một số chủng loại

cây ăn quả có múi bằng phương pháp ghép, (Nhà lưới Viện Bảo

3.14 Ảnh hưởng của mật độ rầy chổng cánh đến khả năng lan truyền

bệnh vàng lá greening (Nhà lưới Viện Bảo vệ thực vật, tháng

4/2011)

87

3.15 Ảnh hưởng của thời gian nhiễm rầy chổng cánh đến khả năng lan

truyền bệnh vàng lá greening (Nhà lưới Viện Bảo vệ thực vật,

2011)

88

3.16 Khả năng di chuyển của rầy chổng cánh trên các cây thí nghiệm

(Nhà lưới Viện Bảo vệ thực vật, 4/2011)

90

3.17 Khả năng gây bệnh của vi khuẩn Liberibacter asiaticus trên một

số chủng loại thuộc họ Rutacea (Nhà lưới Viện Bảo vệ thực vật,

2011)

97

3.18 Phản ứng của các chủng loại cây ăn quả có múi với

các nguồn mẫu thu thập từ cam (Citrus sinensis) bị bệnh vàng lá

greening (Nhà lưới Viện Bảo vệ thực vật, 2013)

100

3.19 Phản ứng của các chủng loại cây ăn quả có múi với

các nguồn mẫu thu thập từ quýt (Citrus reticulata) bị bệnh vàng

lá greening (Nhà lưới Viện Bảo vệ thực vật, 2013)

102

3.20 Phản ứng của các chủng loại cây ăn quả có múi với

các nguồn mẫu thu thập từ bưởi (Citrus grandis) bị bệnh vàng lá

greening (Nhà lưới Viện Bảo vệ thực vật, 2013)

103

3.21 Phản ứng của các chủng loại cây ăn quả có múi với

các nguồn mẫu thu thập từ chanh (Citrus aurantifolia) và quất

(Citrus fortunella) bị bệnh vàng lá greening (Nhà lưới Viện Bảo

vệ thực vật, 2013)

104

3.22 Kết quả đánh giá phản ứng của giống chanh Thanh Yên

với nguồn bệnh thuộc chủng I và II (Nhà lưới Viện Bảo vệ thực

vật, 2013)

109

3.23 Triệu chứng cơ bản của bốn chủng vi khuẩn gây bệnh

vàng lá greening ở Việt Nam và Đài Loan

111

3.24 Ảnh hưởng của các loại môi trường đến chất lượng cây cam ba lá

sử dụng làm gốc ghép lần 1 (Viện Bảo vệ thực vật, 2010)

114

3.25 Ảnh hưởng của các loại gốc ghép gieo trên môi trường MS

đến tiêu chuẩn cây gốc ghép lần 1 (Viện Bảo vệ thực vật, 2010)

115

3.26 Ảnh hưởng của các loại gốc ghép đến tỷ lệ sống của cây vi ghép

lần một (Viện Bảo vệ thực vật, 2010 – 2011)

116

3.27 Ảnh hưởng của tuổi cây gốc ghép lần 1 đến tỷ lệ cây sống sau vi

ghép với giống cam Trưng Vương (Viện Bảo vệ thực vật, 2010)

117

3.28 Ảnh hưởng của BAP đến tỷ lệ cây sống sau vi ghép lần 1 trên

giống bưởi Phục Hòa (Viện Bảo vệ thực vật, 2010 - 2011)

118

3.29 Ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng được bổ sung

vào môi trường lỏng trong vi ghép đỉnh sinh trưởng cam Xã Đoài,

(Phòng thí nghiệm Viện Bảo vệ thực vật, 2012)

119

3.30 Kết quả thử nghiệm các kích thước đỉnh sinh trưởng khác nhau 121

đến khả năng làm sạch bệnh sau vi ghép lần 1 (Phòng thí nghiệm

Viện Bảo vệ thực vật, 2012)

3.31 Ảnh hưởng tuổi cây vi ghép lần 1 đến tỷ lệ sống của vi ghép lần 2

(Phòng thí nghiệm Viện Bảo vệ thực vật, 2010 - 2012)

122

3.32 Kết quả cải tiến giá thể làm bầu đối với sản xuất cây giống

sạch bệnh (Nhà lưới Viện Bảo vệ thực vật, 2010)

127

3.33 Ảnh hưởng của thời vụ ghép đến tỷ lệ sống của cam Xã Đoài sau

ghép (Nhà lưới Viện Bảo vệ thực vật, 2011)

129

3.34 So sánh hiệu quả của 2 loại dây ghép trong phương pháp ghép

mắt nhỏ có gỗ với chủng loại cam Xã Đoài (Nhà lưới Viện Bảo

vệ thực vật, 2011)

131

3.35 Tỷ lệ bệnh sau lây nhiễm nhân tạo bằng ghép mắt bệnh đối với

cây gốc ghép hiện đang sử dụng trong sản xuất giống cây có múi

(Nhà lưới Viện Bảo vệ thực vật, 2012)

132

3.36 Ảnh hưởng của bệnh vàng lá greening đến chiều cao cây gốc

ghép sau 6 tháng lây bệnh (Nhà lưới Viện Bảo vệ thực vật, 2013)

134

3.37 Tỷ lệ bệnh sau lây nhiễm nhân tạo bằng ghép mắt bệnh với cây

gốc ghép nhập nội (Nhà lưới Viện Bảo vệ thực vật, 2012 - 2013)

135

3.38 Ảnh hưởng của xử lý Streptomycine đến triệu chứng bệnh

vàng lá greening (Nhà lưới Viện Bảo vệ thực vật, 2012)

137

3.39 Hiệu quả của cây giống sạch bệnh và quản lý dịch hại tổng hợp

đến bệnh vàng lá greening (năm 2011)

139

3.40 Tỷ lệ tái nhiễm bệnh vàng lá greening trên đồng ruộng với các

giải pháp quản lý bệnh khác nhau (Nghi Lộc, Nghệ An, 10/2013)

140

3.41 Một số giải pháp trong phòng chống bệnh vàng lá greening

đạt hiệu quả ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (năm 2013)

144

DANH MỤC CÁC HÌNH

3.1 Triệu chứng lá vàng lốm đốm (A) cam Xã Đoài; (B) cam Canh 69

3.3 Triệu chứng lá vàng lốm đốm, vàng cục bộ (A) Lá cam Xã Đoài;

(B) Lá Cam Canh (Blotchy)

70

3.4 Triệu chứng bệnh vàng lá greening trên Cam Xã Đoài (Vàng lá,

khô cành)

70

3.6 Triệu chứng lá vàng, gân trong (A) cam Sáp; (B) cam Xã Đoài 72 3.7 Triệu chứng gân lá bị sưng và nổ (A) Quýt Hà Trì (B) cam Xã

Đoài

73

3.8 Nhóm triệu chứng thấp lùn cây (A) Quýt Trà Lĩnh; (B) Cam Xã

Đoài và cam Canh

73

3.9 Kết quả giám định bệnh hại cây có múi bằng sinh học phân tử

(A) bệnh tatter leaf; (B) bệnh Exocortis; (C) bệnh tristeza

3.20 Mật độ rầy chổng cánh trên vườn cam Xã Đoài tại Cao Phong,

Hòa Bình, 2010

94

3.21 Rầy chổng cánh gây hại trực tiếp trên cây gieo làm gốc ghép 95

3.23 Ký chủ và môi giới lan truyền bệnh vàng lá greening 98 3.24 Phản ứng của các giống đến các mẫu bệnh vàng lá greening 105 3.25 Chủng I gây bệnh trên cam Xã Đoài và cam Canh; Chủng II gây

bệnh trên 4 giống (bưởi Diễn, chanh Eureka, Xã Đoài và cam

trưởng

119

3.32 Cây sau vi ghép lần 1 nuôi trong ống nghiệm: 4; 6 và 8 tuần 123

3.35 Đánh giá tính chống chịu bệnh vàng lá greening với vật liệu làm

gốc ghép

133

3.36 Ảnh hưởng của vi khuẩn gây bệnh bệnh vàng lá greening thuộc

chủng II đến chiều cao cây gốc ghép

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Cây ăn quả có múi (cam, quýt, chanh, bưởi, v.v.) là nhóm cây ăn quả quan trọng trong sản xuất nông nghiệp ở nước ta Năm 2011, diện tích cây ăn quả có múi ở Việt Nam đạt 124.057 ha, trong đó diện tích trồng cam quýt chiếm tới 70.300 ha, bưởi 45.000 ha và chanh là 18.000 ha Các loại quả có múi không chỉ là hàng hóa đáp ứng cho tiêu thụ nội địa mà còn là mặt hàng xuất khẩu có giá trị kinh tế cao Bên cạnh đó, cây ăn quả có múi còn có ý nghĩa như một loại cây cảnh trang trí trong các gia đình Việt Nam cứ mỗi độ xuân về Đồng thời, sản phẩm của cây ăn quả có múi còn là những vị thuốc quý trong dân gian, là gia vị chủ lực trong một số món ăn nổi tiếng của Việt Nam

Nghề trồng cây ăn quả có múi được phát triển mạnh mẽ ở nhiều nước thuộc vùng nhiệt đới, á nhiệt đới và ôn đới Song sự đa dạng khí hậu ở các vùng trồng trọt là điều kiện thích hợp cho nhiều loài sâu bệnh phát sinh gây hại trên cây có múi, đặc biệt là bệnh vàng lá greening Đây được coi là một trong những nhân tố trở ngại chính để phát triển cây có múi Bệnh lan truyền với tốc độ nhanh và gây hại nghiêm trọng cho nhiều vùng trồng cam quýt trên thế giới, năm 2004 bệnh đã tàn phá nghiêm trọng các vườn cây ăn quả có múi

ở Braxin, năm 2005 tiếp tục diễn ra ở bang Florida, Hoa kỳ

Bệnh vàng lá greening là bệnh hại quan trọng nhất, khốc liệt nhất, nguy hiểm nhất, nghiêm trọng nhất, hủy diệt nhất và tàn phá nặng nề nhất đối với nghề trồng cây ăn quả có múi trên thế giới (Su và cs., 1991; Bové, 2006)[134][48] Triệu chứng bệnh điển hình phát hiện được ở trên cây sau trồng từ 5 đến 8 năm (Aubert và cs., 1988; Roistacher, 1996)[40][124] hoặc từ

1 đến 5 năm sau khi triệu chứng đầu tiên xuất hiện, tùy thuộc vào tuổi cây, giống cây và phương pháp quản lý vườn (Lin và cs., 1996; Schwarz và cs., 1973)[106][130] Bệnh làm cây bị suy thoái, sinh trưởng và phát triển kém,

làm năng suất, chất lượng quả bị ảnh hưởng Sản lượng quả bị giảm từ 30 đến 100%, tùy thuộc vào tỷ lệ tán cây bị bệnh (Bassanezi và cs., 2005; Schwarz và cs., 1973)[41][130], vườn cây không còn giá trị kinh tế sau trồng 7 đến 10 năm (Gottwald, 2010)[65] Quả bị bệnh thường nhỏ hơn, nhẹ hơn và chua hơn,

độ Brix giảm, tỷ lệ nước quả và các chất hòa tan cũng giảm theo Đồng thời, chất lượng nước quả sau chế biến cũng bị ảnh hưởng đáng kể (Bassanezi và cs., 2005)[41]

Các kết quả nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng vi khuẩn gây bệnh vàng lá xuất hiện, đến nay các chủng mới, có độc tính nặng hơn đã hình thành (Hung

và cs., 2012)[95]

Ở Việt Nam, cây ăn quả có múi được trồng phổ biến khắp ba miền Bắc, Trung và Nam Bệnh vàng lá greening đã được ghi nhận gây hại trên cây ăn quả có múi từ những năm 1960 Từ khi xuất hiện gây hại đến nay, bệnh vàng

lá greening đã có hai đợt cao điểm gây hại; năm 1970 bệnh đã gây hại tại hầu hết các nông trường cam phía Bắc và năm 1990 tại hầu hết các vùng trồng cam quýt trên cả nước (Hà Minh Trung, 2005)[30] Mức độ thiệt hại trên bưởi

từ 17 – 25%, trên cam quýt từ 54 – 70% (Hà Minh Trung và cs., 2008; Ngô Vĩnh Viễn và cs., 2009)[149][154] Các tác giả cho rằng nguyên nhân do việc

sử dụng giống cây ăn quả có múi không đạt tiêu chuẩn kỹ thuật, cây giống đã nhiễm sâu bệnh đặc biệt là bệnh vàng lá greening, tristeza và do không được thâm canh, chăm sóc đúng kỹ thuật nên ngay từ khi trồng mới bệnh vàng lá greening đã gây hại trầm trọng, sau vài năm cho quả cây đã bị kiệt sức và nhanh chóng tàn lụi

Bệnh vàng lá greening lan truyền từ các vật liệu nhân giống như cành chiết, mắt ghép đã nhiễm bệnh và côn trùng môi giới Những nghiên cứu bước đầu về bệnh này ở Việt Nam đã được tiến hành, song những vấn đề về bản chất của bệnh vẫn chưa được tìm hiểu một cách đầy đủ Vì vậy, những biện pháp phòng trừ bệnh vẫn còn ít hiệu quả Nhằm giải quyết được các yêu

cầu phòng chống bệnh vàng lá greening và để duy trì sản xuất cây ăn quả có múi bền vững cho các vùng trồng cam quýt phía Bắc, việc tiến hành đề tài

“Nghiên cứu bệnh vàng lá greening hại cây ăn quả có múi ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam và đề xuất biện pháp phòng chống” mang tính thời sự cấp thiết

2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài

2.1 Mục tiêu

Xác định được đặc điểm phát sinh, phát triển và phương thức lan truyền bệnh vàng lá greening (VLG) làm cơ sở khoa học xây dựng các giải pháp phòng chống có hiệu quả cho cây ăn quả có múi ở một số tỉnh phía Bắc

2.2.Yêu cầu

Nắm được tình hình phân bố của bệnh vàng lá greening ở một số vùng trồng cây ăn quả có múi ở các tỉnh phía Bắc

Xác định được các chủng vi khuẩn gây bệnh vàng lá greening và sự phân

bố của các chủng vi khuẩn trên một số chủng loại cây ăn quả có múi ở các vùng sinh thái khác nhau

Xác định được phương thức truyền bệnh và các yếu tố ảnh hưởng làm cơ

sở khoa học đề xuất các biện pháp phòng chống có hiệu quả bệnh vàng lá greening

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Cung cấp bổ sung các dẫn liệu khoa học và thực tiễn về bệnh vàng lá greening, phương thức truyền bệnh, các yếu tố ảnh hưởng và các giải pháp phòng chống bệnh có hiệu quả

- Xác định được phương pháp chẩn đoán nhanh bệnh vàng lá greening trên đồng ruộng Từ đó, góp phần đưa ra các giải pháp phòng trừ kịp thời và có hiệu quả cao

- Các kết quả của đề tài đóng góp dẫn liệu khoa học làm cơ sở khoa học và thực tiễn để xây dựng hệ thống phòng chống bệnh có hiệu quả, góp phần duy trì, bảo tồn và phát triển bền vững ngành trồng cây ăn quả có múi ở Việt Nam

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài

4.1 Đối tượng nghiên cứu

- Vi khuẩn Liberibacter asiaticus gây bệnh vàng lá greening trên cây có múi

và môi giới truyền bệnh rầy chổng cánh Diaphorina citri Kuwayama

- Một số loài cây ăn quả có múi bản địa và nhập nội được trồng ở một số tỉnh

phía Bắc Việt Nam, các cây thuộc họ Rutaceae là ký chủ của vi khuẩn L

asiaticus gây bệnh vàng lá greening trên cây có múi

4.2 Phạm vi nghiên cứu

Đề tài nghiên cứu phương thức lan truyền bệnh, các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát sinh gây hại của bệnh trong điều kiện sinh thái ở các tỉnh phía Bắc

Xác định các chủng vi khuẩn L.asiaticus gây bệnh trên cây có múi, sự phân

bố các chủng vi khuẩn Nghiên cứu một số giải pháp có hiệu quả để phòng chống bệnh vàng lá greening trên cây ăn quả có múi ở một số tỉnh phía Bắc

5 Những đóng góp mới của luận án

- Cung cấp bổ sung dẫn liệu khoa học về mức độ phổ biến, triệu chứng, ký chủ của bệnh vàng lá greening trên cây ăn quả có múi ở phía Bắc

- Lần đầu tiên xác định được vi khuẩn gây bệnh vàng lá greening thuộc chủng

I và II trên các giống cây ăn quả có múi hiện đang trồng trong sản xuất ở phía Bắc Việt Nam

- Đã hoàn thiện được kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trưởng làm sạch bệnh vàng lá greening và các bệnh vi rút khác, góp phần hoàn thiện quy trình sản xuất cây giống sạch bệnh

- Đánh giá tính chống chịu của một số loại gốc ghép bản địa và nhập nội với bệnh vàng lá greening và đề xuất các giải pháp chống tái nhiễm bệnh vàng lá greening

CHƯƠNG I

CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cơ sở khoa học của đề tài

Các nhà khoa học đều xác định bệnh vàng lá greening là bệnh hại quan trọng nhất trên cây ăn quả có múi ở các vùng trên thế giới Tuy nhiên, trên đồng ruộng, triệu chúng bệnh biểu hiện với mức độ khác nhau tuỳ thuộc vào từng chủng loại cây có múi, nguồn gốc cây giống, môi giới truyền bệnh, tuổi cây khi bị nhiễm bệnh, chủng vi khuẩn gây bệnh cũng như phụ thuộc vào kỹ thuật trồng trọt, đốn tỉa, chăm sóc, bảo vệ vườn cây Song triệu chứng chung nhất của bệnh là gân lá bị xanh, những mô lá liền kề sau đó bị vàng hoặc đốm vàng, đôi khi gân lá bị hoá bần

Nhiều nhà khoa học đã khẳng định để phòng chống bệnh VLG có hiệu quả, trước hết phải đi sâu nghiên cứu dịch tễ học của tác nhân gây bệnh, các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng phát triển, lan truyền bệnh trên đồng ruộng (Matsumoto và cs., 1961; Aubert và cs., 1988; Su, 1998; Bové, 2006)[113][40][135][48] Các nhà khoa học trên thế giới cũng đã phát triển và ứng dụng nhiều phương pháp khác nhau trong nghiên cứu bệnh vàng lá greening, như: phương pháp quan sát mô cây bị bệnh dưới kính hiển vi điện

tử, giải mã trình tự gen bằng việc ứng dụng các phương pháp sinh học phân tử với các cặp mồi đặc hiệu, giải mã trình tự gen, sử dụng các cây chỉ thị, v.v Các nghiên cứu trong nước và trên thế giới chỉ rõ bệnh VLG có khả năng lan truyền nhanh và mức độ tàn phá rất cao nếu sử dụng cây giống đã nhiễm bệnh, kỹ thuật canh tác không được quan tâm Theo tác giả Aubert và Lê Thị Thu Hồng (1996)[1]; Su (1998)[135]; Bové (2006)[48]; Lê Thị Thu Hồng, (2000) [11]; Hà Minh Trung và cs (2008)[149] thì kỹ thuật sản xuất và sử dụng cây giống sạch bệnh, phát hiện sớm những cây giống bị nhiễm bệnh để loại bỏ khi trồng được coi là khâu đầu tiên và hết sức quan trọng trong việc đề xuất giải pháp phòng chống bệnh đạt hiệu quả

Như vậy, việc nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh, phương pháp nhận biết sớm cây bị bệnh, phương thức lan truyền và sự thay đổi độc tính của các

chủng vi khuẩn gây bệnh trên từng chủng loại cây ăn quả có múi là những vấn

đề quan trọng Từ đó, làm cơ sở để xây dựng hệ thống các giải pháp phòng chống tổng hợp bệnh VLG có hiệu quả kinh tế, kỹ thuật cao và bền vững

1.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

1.2.1 Nguôn gốc và phân loại cây ăn quả có múi

Là những loại cây trồng có sự phân bố rộng, nguồn gốc của các loại cây ăn quả có múi khó có thể xác định một cách chính xác Tuy nhiên nhiều kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng cam quýt có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Đông Nam châu Á Tanaka (1979)[140] đã cho rằng các giống

thuộc chi Citrus có xuất xứ từ chân dãy núi Hymalaya phía đông Ấn Độ trải

dài qua miền Nam Trung Quốc, Nhật Bản và được chia ra làm bốn nhóm chính theo các đặc điểm thực vật học:

Nhóm cam (orange group): gồm các loài Citrus sinensis và Citrus

aurantium

Nhóm quýt (mandarine group): gồm các loài Citrus reticulate, Citrus

unshiu, Citrus deliciosa và Citrus nobilis…

Nhóm bưởi (pummelo-grapefruit group): gồm các loài Citrus grandis

và Citrus paradise

Nhóm chanh (acid group): gồm các loài Citrus limon, Citrus jambhiri,

Citrus aurantifolia, Citrus limettoides, Citrus medica, Citrus karma và Citrus lemonia…

1.2.2 Nghiên cứu về bệnh vàng lá greening

1.2.2.1 Triệu chứng, lịch sử phát hiện, phân bố của bệnh vàng lá

greening

Khi cây bị bệnh vàng lá greening vi khuẩn không gây hại mạch gỗ nhưng gây các vết chết hoại trong mạch libe, sự vận chuyển đường đến các bộ phận của cây bị cản trở Lá nhỏ, bị biến vàng hay lốm đốm vàng, tuổi thọ của lá bị rút ngắn, sự phân chia tế bào luôn xảy ra khiến gân lá bị sưng Vi khuẩn cũng hiện diện nhiều ở cuống quả và làm quả bị lệch tâm, quả nhỏ, khối lượng quả giảm và hàm lượng đường trong quả thấp dẫn đến chất lượng của quả giảm

(Aubert, 1987)[39] Rễ cây bị bệnh làm nghẽn mạch dẫn, rễ bị hoại tử nhiều,

rễ tơ không hút được dinh dưỡng để nuôi cây Cây bị rụng quả cùng với sự phát triển của bệnh, cây sẽ chết sau 2-5 năm tuỳ mức độ nhiễm (Aubert và cs., 1988)[40]

Trên cơ sở kết quả nghiên cứu sự lan truyền của bệnh qua mắt ghép,

cành chiết và qua côn trùng môi giới là rầy chổng cánh Diaphorina citri vào

năm 1967 nguyên nhân gây bệnh đã được kết luận là do vi rút gây ra Các tác giả còn cho rằng vi rút gây bệnh “greening” cùng loài với vi rút gây bệnh

“stubborn” nhưng là các dòng khác nhau (Fraser và cs., 1966; Salibe và Cortez, 1968)[56][128] Sau khi đã xác định được triệu chứng stubborn do

một loài mycoplasma có tên là Spiroplasma citri gây ra (Saglio và cs.,

1973)[126], các tác giả cũng đã cho rằng mycoplasma là tác nhân gây bệnh vàng lá greening Trong những nghiên cứu tiếp theo Garnier và các tác giả khác (1984a, 1984b)[60][61] đã phát hiện được lớp vách dày bao quanh tế bào, màng tế bào chất dày hơn từ 7-10 nm Từ các đặc điểm cơ bản này đã cho phép các tác giả xác định tác nhân gây bệnh vàng lá greening (VLG) là vi khuẩn

Vi khuẩn gây bệnh VLG có gram âm Vi khuẩn không định hình, có

vách dầy, không có nhân, không nuôi cấy được trên môi trường nhân tạo, vi

khuẩn di chuyển theo dòng nhựa trong cây

Vi khuẩn gây bệnh greening là Candidatus Liberibacter thuộc α-

Proteobacteria, họ Eubacteria (Jagoueix và cs., 1994; 1996)[98][99] Căn cứ vào khả năng chịu nhiệt độ nên vi khuẩn được chia làm dòng châu Á và châu

Phi Vi khuẩn dòng châu Á có tên “Candidatus Liberibacter asiaticus” chịu

được nhiệt từ 27 – 32°C Dòng châu Phi có tên “Candidatus Liberibacter

africanus” mẫn cảm với nhiệt độ 22 – 24°C Nghiên cứu về khả năng chịu nhiệt của dòng vi khuẩn gây bệnh ở Braxin và ở Hoa kỳ, Teixeira và cs., (2005c)[142], Halbert và cs., (2008)[74] đã đề nghị dòng vi khuẩn gây bệnh ở Braxin và dòng vi khuẩn gây bệnh ở Hoa Kỳ là những dòng chịu nhiệt Vi

khuẩn được lan truyền qua mắt ghép, cành chiết và qua côn trùng môi giới là

rầy chổng cánh Diaphorina citri ở châu Á và rầy Trioza erytrea ở châu Phi

Bệnh có nhiều tên gọi ở các nước khác nhau như Hoàng Long Binh, chồi vàng, greening, thoái hóa mạch dẫn, v.v Tại các hội thảo quốc tế về bệnh ở Đài Loan năm 2011 và ở Florida, Hoa kỳ năm 2012 tên bệnh đã được thống nhất và được gọi là Huanglongbing

Trung Quốc Bệnh vàng lá greening đã được ghi nhận lần đầu tiên vào

năm 1929 với các tên gọi Huanglongbing hay chồi vàng (yellow shoot) ở Nam Trung Quốc và bệnh đã được tài liệu hóa năm 1943 Bệnh VLG đã trở thành một vấn đề nghiêm trọng ảnh hưởng đến ngành trồng cây ăn quả có múi

ở Trung Quốc Nghiên cứu về bệnh VLG đã được tiến hành ở miền Nam Trung Quốc từ 1941-1955 Các nghiên cứu về nguyên nhân gây bệnh đã chứng minh các triệu chứng vàng lá gân xanh, lốm đốm vàng trên lá cam quýt không phải là do rối loạn sinh lý, thiếu hụt khoáng, cũng không phải bệnh

truyền qua đất do tuyến trùng hoặc nhiễm nấm Fusarium Bệnh VLG được

xác nhận là một bệnh truyền nhiễm lan truyền qua mắt ghép (Lin, 1956)[105] Tại Đài Loan vào năm 1951 bệnh được phát hiện ở Đài Loan với tên gọi Likubin

Nam Phi Một dạng triệu chứng bệnh tương tự như triệu chứng VLG,

đã được quan sát vào năm 1928 ở Nam Phi với tên gọi "chồi vàng" hay còn gọi là "greening" (Oberholzer và cs., 1965)[120] Thời gian đầu bản chất truyền nhiễm của bệnh đã không xác định được, trong các báo cáo đầu tiên

về bệnh greening vào năm 1937, các tác giả cho rằng các nguyên tố độc hại trong đất đã là nguyên nhân gây ra triệu chứng greening Khi giải phẫu chồi cây bị vàng trên cây cam ngọt ở Nam Phi, Schneider (1968)[129] đã phát hiện mạch libe có những đốm hoại tử trong hệ thống mạch dẫn của lá trưởng thành, mạch trở nên tắc nghẽn và ngăn cản sự vận chuyển của các chất dinh dưỡng Nghiên cứu về bệnh trong những năm tiếp theo người ta đã chứng minh được bệnh greening ở Nam Phi được truyền qua mắt ghép (McClean và Schwarz, 1970)[114]

Philippines Bệnh được phát hiện lần đầu ở Philippine vào năm 1921,

và được cho rằng sự thiếu hụt kẽm là nguyên nhân gây ra bệnh (Lee, 1921)[104] Bệnh gây hại nghiêm trọng trên cây có múi ở Philippine trong thập niên 1950 Tới năm 1967 các nghiên cứu đã chứng minh được rầy chổng

cánh D citri là môi giới truyền bệnh ở Philippine (Martinez và Wallace,

1967, 1968)[111][112] Salibe và Cortez (1968)[128] đã nhận thấy sự tương đồng của triệu chứng bệnh ở Philippine với các triệu chứng "lá vàng lốm đốm" ở Trung Quốc, Đài Loan và triệu chứng bệnh “greening" ở Nam Phi

Ấn Độ Bệnh VLG đã được phát hiện và gây hại trên cây có múi ở Ấn

Độ trong thời gian dài Các vườn cây có múi ở Ấn Độ cho sản lượng thấp, cành bị khô chết, cây chết chậm nhưng cũng có thể bị héo đột ngột Thuật ngữ

“dieback” đã được sử dụng để gọi chung cho những triệu chứng này, khi lần đầu tiên chúng được quan sát bởi Roghoji Bhonsale ở các tỉnh miền Trung Ấn

Độ vào thế kỷ 18 (Capoor, 1963)[51] Xuất phát từ thực tiễn trong sản xuất

“Dieback” là thuật ngữ chỉ các triệu chứng bệnh gây ra bởi nhiều yếu tố như kết cấu đất, thiếu hụt dinh dưỡng, nấm gây bệnh trên cành và vi-rút Asana (1958)[37] đã ghi nhận được triệu chứng rõ rệt nhất của bệnh là những vết lá vàng lốm đốm Trong một số trường hợp, nguyên nhân chủ yếu gây ra triệu chứng “dieback” là vi-rút gây bệnh tristeza (CTV) (Vasudeva và Capoor, 1958; Capoor, 1963)[153][51]

Năm 1966 bệnh tiếp tục được nghiên cứu (Fraser và cs., 1966; Fraser

và Singh, 1968)[56][57] Ứng dụng phương pháp lai (dot-blot) người ta đã phát hiện được sự có mặt của vi khuẩn gây bệnh VLG trong những lá có triệu chứng vàng lốm đốm Các tác giả cũng chỉ ra rằng không phải lúc nào vi-rút gây bệnh CTV cũng hiện diện trong cây có triệu chứng bệnh dạng “dieback” Các biểu hiện triệu chứng ở lá thường bị gây ra bởi một hoặc một vài tác nhân khác Triệu chứng bệnh được mô tả cũng tương tự như triệu chứng bệnh

"greening" tại Nam Phi của Oberholzer và cộng sự (1965)[120], và

"Huanglongbing" của Lin (1956)[105] tại Trung Quốc Với nhiều thí nghiệm theo các hướng khác nhau Capoor và đồng nghiệp đã thành công trong việc

xác định sự lan truyền của bệnh bằng rầy chổng cánh D citri (Capoor và cs.,

1967)[52] Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy triệu chứng chết cây luôn cho kết quả dương tính với vi khuẩn gây bệnh VLG Trong số những cây dương tính với vi khuẩn gây bệnh VLG, đã không phát hiện được vi-rút gây bệnh CTV Đến năm 1971, Bové và đồng nghiệp đã phát hiện được vi khuẩn VLG trong cây cam ngọt và đồng thời lây nhiễm bệnh thành công bằng rầy môi giới CTV đã được loại khỏi triệu chứng “dieback” dựa trên các kết quả nghiên cứu của Capoor năm 1969 (Bové và Saglio, 1974)[44]

In-đô-nê-xi-a Tại In-đô-nê-xi-a bệnh được gọi là "thoái hóa mạch

dẫn" (Tirtawidjaja et al, 1965)[143]

Thái Lan Bệnh VLG xuất hiện gây hại ở Thái Lan vào những năm

1960, bệnh gây hại rất nghiêm trọng và ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của toàn bộ cây Schwarz và cs., (1973)[130] Roistacher (1996)[124] đã xác định được mức độ bệnh và sự phá huỷ của bệnh với cây có múi ở Thái Lan Hàng năm VLG đã phá hủy 10 đến 15% cây trong vườn cam; nhiều vùng ở phía Bắc Thái Lan đã không sản xuất được cây có múi Ngoài việc bị lây lan qua rầy môi giới châu Á, bệnh còn lan truyền từ vườm ươm sản xuất cây giống bị bệnh

Myanmar Bệnh VLG đã xuất hiện cách đây hơn 40 năm Bệnh được

phát hiện ở các tỉnh Chin và Shan vào năm 1960 Đến nay bệnh đã lan rộng khắp các vùng trồng cam của Myanmar (Yi, Thein 2012)[164]

Hoa Kỳ (Florida) Rầy chổng cánh D citri, đã ghi nhận được ở Florida

vào tháng sáu năm 1998 trên cây Murraya paniculata (Halbert, 1998, 2005;

Halbert và cs., 2003, Halbert và Manjunath,2004)[69][73][70][71] Các nhà khoa học cho rằng rầy chổng cánh đã có mặt ở phía Nam Florida từ 6 đến 12 tháng trước khi chúng được phát hiện ra và đã không thể diệt trừ rầy ở thời điểm phát hiện Đến nay, loài côn trùng môi giới này đã truyền vi khuẩn gây bệnh VLG trên cây ăn quả có múi ở Hoa Kỳ Bệnh đã được phát hiện trên cây

bưởi [Citrus grandis (L.) OSB.] ở Miami -Dade, Florida Cây được phát hiện

triệu chứng sau 7 năm ở những vùng đã xuất hiện rầy chổng cánh (Halbert,

2005)[73] Bệnh VLG đã được tìm thấy trong nhiều trang trại trồng cây có múi thuộc khu dân cư phía Bắc kéo dài hơn 250 km từ Miami-Dade đến St Lucie County Một số trang trại cam quýt thương mại đã bị bệnh gây hại và các chủ vườn đã không thể phòng trừ bệnh tận gốc

Tại Nhật Bản bệnh VLG đã được phát hiện tại Iriomote, Okinawa năm

1994, ở Tokunoshima, Kagoshima, năm 2003 Năm 2004 bệnh VLG được phát hiện ở São Paulo, Brazil Cho đến nay bệnh chưa ghi nhận được ở Ôt-xtrây-li-a, Hàn Quốc

1.2.2.2 Chẩn đoán và giám định bệnh vàng lá greening

Bệnh có thể được chẩn đoán dựa theo các dạng triệu chứng trên đồng ruộng Tuy nhiên các dạng triệu chứng bệnh sẽ thay đổi trên từng giống khác nhau (Hajivand và cs., 2009)[68] Mặt khác sự thể hiện của triệu chứng bệnh còn phụ thuộc vào số lượng của vi khuẩn có trong cây Khi số lượng vi khuẩn trong cây thấp, mặc dù đã bị nhiễm bệnh cây vẫn không biểu hiện triệu chứng, nên không phát hiện được bệnh

Số lượng vi khuẩn gây bệnh được xác định cao nhất ở quýt Ponkan, sau đó là Tankan tangor, và số lượng vi khuẩn tìm thấy thấp nhất ở cam ngọt Liucheng và bưởi Wentan Ngoài ra số lượng vi khuẩn cũng đã được đánh giá trên bưởi chùm, chanh Tahitan, Chanh Eureka, quýt Satsuma, Kumquat với triệu chứng likubin

Xác định tác nhân gây bệnh bằng kính hiển vi điện tử: Dưới kính

hiển vi điện tử quan sát được vi khuẩn có lông cứng, kích thước 350 – 550 nm

× 600 – 1500 nm, vách tế bào có 2 lớp, độ dầy từ 20 – 25 nm Hình dạng của

vi khuẩn thường có hình gậy, thon dài và được thay đổi từ tế bào non cho đến lúc thành thục (Huang, 1987)[89] Màng tế bào chất thành thục có xu hướng bao bọc tế bào chất Chu kỳ của vi khuẩn gây bệnh gồm (i) bắt đầu nhân lên

về số lượng, (ii) phân hạch nhị phân, (iii) tạo thành chuỗi, (iv) phân tách thành nhiều đoạn và (v) sinh sản bằng cách phân đôi

Cho đến năm 1992, kính hiển vi điện tử đã được sử dụng rộng rãi để xác định nguyên nhân gây bệnh (Garnier và Bové, 1996)[62] Tuy nhiên, sử

dụng kính hiển vi điện tử không thể phân biệt được các dòng vi khuẩn châu

Á và vi khuẩn châu Phi

Xác định tác nhân gây bệnh bằng phương pháp sinh học phân tử

Phương pháp PCR đã được ứng dụng cho kỹ thuật chẩn đoán tác nhân gây bệnh Đầu tiên dựa trên sự khuếch đại của đoạn 16S rDNA với sản phẩm thu được ở 1160 bp Các cặp mồi OI1/OI2c có khả năng nhận biết được cả dòng châu Á và châu Phi, cặp mồi OA1/OI2c ưu tiên cho dòng châu Phi Để nhận biết được dòng châu Á và châu Phi trên cùng một phản ứng được sử dụng mồi xuôi là OI1 + OA1, và mồi OI2c là mồi ngược trong phản ứng PCR Bằng sản phẩm đặc hiệu nên dễ dàng nhận biết dòng châu Á hoặc châu Phi (Jagoueix

Hung và các tác giả khác (1999a)[91] đã sử dụng cặp mồi đặc hiệu để chẩn đoán bệnh vàng lá greening, sản phẩm thu được ở 226 bp

Các nghiên cứu đã sử dụng đoạn 16S rDNA của dòng vi khuẩn châu Á gây bệnh trên cây dừa cạn để xác định vị trí phát sinh loài của vi khuẩn gây

bệnh greening, bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR), với đoạn mồi P1 để khuếch đại của 16S rDNA prokaryote (Weisburg và cs., 1991)[156]

f-D1/r-Phương pháp PCR cũng được sử dụng để phát hiện Ca L asiaticus trong cơ thể rầy chổng cánh (Diaphorina citri Kuwayama) Bằng kỹ thuật này năm 2004 người ta đã phát hiện được dòng vi khuẩn châu Mỹ, Ca L

americanus đã có mặt tại 46 điểm của bang Sao Paulo (SPS), và chỉ một năm sau đã nhanh chóng tăng lên 79 điểm Kết quả này cho thấy sự lan truyền nhanh chóng vi khuẩn Liberibacter thông qua loài côn trùng môi giới

Diaphorina citri

Lai DNA là phương pháp cho độ chính xác cao đối với Liberibacter

asiaticus, đặc biệt để phát hiện vi khuẩn trong côn trùng môi giới (Bové và cs.,

1993)[45] Hocquellet và cs., 1997[85] đã phát triển phương pháp này mà không dùng chất phóng xạ

Nghiên cứu các chủng gây bệnh vàng lá greening: Su, (2008)[136]

đã xác định được các chủng vi khuẩn gây bệnh VLG ở Đài Loan bằng phương pháp sử dụng cây chỉ thị, kết hợp với công nghệ sinh học Từ các mẫu bệnh thu thập, vi-rút được làm sạch Các nguồn vi-rút này được sử dụng để lây bệnh trên các giống cây có múi khác nhau được dùng làm cây chỉ thị như Quýt Ponkan, cam Liucheng, bưởi Wentan và chanh Eureka Cho đến nay đã xác định được 4 chủng vi khuẩn gây bệnh khác nhau

Chủng I gây bệnh trên cam ngọt và quýt

Chủng II có độ độc cao nên đã gây bệnh ở cả bốn giống chanh, cam, quýt và bưởi

Chủng III gây hại ở mức trung bình nên triệu chứng bệnh biểu hiện ở cam ngọt, quýt và biểu hiện nhẹ trên bưởi

Chủng IV gây bệnh trên cam ngọt và quýt nhưng triệu chứng ẩn và phải sử dụng đến phương pháp PCR để phát hiện bệnh, tuy nhiên chủng này bắt gặp rất ít trên đồng ruộng

Ở Đài Loan đã xác định được bưởi đã bị nhiễm chủng II của vi khuẩn gây bệnh VLG từ năm 1970 và chủng II cũng được phát hiện ở Đông Nam Á năm 1980

Tomimura và cs., (2009, 2010)[144][145] đã báo cáo về sự đa dạng của các chủng vi khuẩn gây bệnh VLG và mối quan hệ giữa chúng với sự phát sinh hình thành chủng mới gây bệnh ở Đảo Okinawa (Nhật Bản), Đài Loan, các nước Đông Nam Á Từ kết quả giải trình tự gen, các mẫu vi khuẩn được phát hiện thuộc ba nhóm Ở Đài Loan chủng I thuộc nhóm A, chủng II thuộc

nhóm B Kết quả phân tích trình tự gen cũng cho thấy vi khuẩn Liberibacter

asiaticus là tác nhân gây bệnh VLG ở các nước Đông Nam Á Chủng I và II

cũng đã được tìm thấy ở Okinawa, nhưng ở Đài Loan thuộc chủng I (Tomimura, 2012)[146]

1.2.3 Nghiên cứu về dịch tễ và sinh thái học của bệnh vàng lá greening 1.2.3.1 Nghiên cứu sự lan truyền bệnh vàng lá greening

Bệnh có thể lây lan rất nhanh đạt tỷ lệ trên 95% trong khoảng thời gian

từ 3 đến 9 năm sau khi xuất hiện triệu chứng đầu tiên (Matsumoto và cs., 1961; Aubert và cs., 1988, Bové và cs., 2000b; và Gottwald, 2005) [113][40] [47][64]

Bệnh VLG được lan truyền qua con đường nhân giống và lan truyền

bởi côn trùng môi giới (Diaphorina citri) theo kiểu bền vững (Halbert và

Manjunath, 2004; Habert và Nusnez, 2004; Hung và cs., 2000; Pluke và cs., 2008)[71][72][93][121] Bệnh còn được lan truyền qua phương thức xuất nhập khẩu quả tươi (Halbert và cs., 2010)[75]; người ta đã thu thập và xác định được tỷ lệ môi giới đi theo các lô hàng (Halbert và cs., 2012)[76]

Để hạn chế sự lây lan của bệnh, sản xuất và trồng bằng giống sạch bệnh

đã được đề cập từ năm 1983 và đã chứng minh bệnh VLG bằng cách lây

nhiễm lên dây tơ hồng và cây dừa cạn Periwinkle Trồng bằng cây khỏe đã

được chứng minh trên đồng ruộng, bị nhiễm VLG là do môi giới (Garnier và Bové, 1983)[59]

1.2.3.2 Đặc điểm sinh học, sinh thái của rầy chổng cánh Diaphorina citri

Kuwayama

Rầy chổng cánh phân bố rộng ở phương Đông và Nam Á (Pakistan, và

Ấn Độ), Nam Trung Quốc, Đông Nam Á (Myanmar, Malaysia, Indonesia, Philippine), Đài Loan, Saudi, Arabla, Mauritilus và Reunion và gây thành dịch ở Braxin, Nam Mỹ Rầy chổng cánh ít được phát hiện ở những vùng có

độ cao trên 400 mét so với mực nước biển Loài côn trùng này đã được phát hiện cách đây hơn 85 năm (Halbert và Manjunath, 2004; Bové, 2006; Hall, 2008a; Hall và cs., 2008b, Hall và Hentz 2010; Gottwald, 2010) [71][48][77] [78][79][65]

Rầy chổng cánh Diaphorina citri có kích thước nhỏ, (dài từ 2,7 – 3,3

mm), cánh lốm đốm màu nâu Sự khác nhau có ý nghĩa ở phần bụng của trưởng thành không biết đã xuất hiện từ khi nào mà chúng có 3 mối quan hệ chặt chẽ về màu sắc (xám/nâu, xanh/xanh lá cây, cam/vàng) (Wenninger và Hall, 2008a)[158] Tỷ lệ đực cái là xấp xỉ tương đương nhau (Aubert và cs., 1988; Hung, 2006)[40][90] Khi trưởng thành chích hút vào cây hoặc ngừng

ăn, chúng đều đậu trên lá, chồi non, cơ thể tạo thành một góc 45° so với bề mặt của cây Môi giới truyền bệnh greening ở châu Phi có tên khoa học là

Trioza erytrea, nhiệt độ thích hợp cho môi giới phát triển ở 22 – 25°C

Trưởng thành đực và cái thường ở cạnh nhau và chúng phát ra tín hiệu trước khi đẻ trứng (Wenninger và cs., 2009a)[161] Tập tính sống của trưởng thành cái tiết ra pheromone giới tính (Wenninger và cs., 2008)[160] Trưởng thành đực và cái giao phối nhiều lần (Wenninger và Hall, 2008b)[159] Vị trí

đẻ trứng và sự vận động của chúng bị giới hạn bởi số giờ nắng trong ngày (Wenninger và Hall, 2007)[157] Con cái có thể đẻ trứng trong suốt chu kỳ sống nếu đủ nguồn thức ăn Trưởng thành cái có thể đẻ được 500 – 800 trứng trong suốt 2 tháng, tối đa 900 trứng trong 1 vòng đời (Husain và Nath, 1927; Tsai & Liu, 2000; Nava và cs., 2007)[96][150][117] Nhiệt độ thấp và cao hơn ngưỡng nhiệt độ đẻ trứng là dưới 16°C và trên 41,6°C, nhiệt độ thích hợp nhất cho đẻ trứng ở 29,6°C (Hall và McCollum, 2011)[82] Ẩm độ ảnh hưởng

đến vị trí đẻ trứng, ẩm độ dưới 40 % làm cho trứng không nở được (Skelley

và Hoy, 2004)[132]

Trứng thuôn dài, hình quả hạnh nhân, thành mỏng Trứng ban đầu vàng nhạt, sau chuyển dần thành màu cam Giai đoạn trứng kéo dài 3-6 ngày, chiều dài trứng 0,038mm, trứng từ 10 – 12 ngày và được tìm thấy nhiều trên chồi non Rầy có 5 tuổi Vào mùa đông, trưởng thành có thể sống hơn 6 tháng Hàng năm rầy chổng cánh hoàn thành 9-10 lứa, thậm chí gối 16 lứa trong 1 năm (Husain và Nath, 1927)[96] Trưởng thành tuổi năm ít di chuyển, chỉ di chuyển khi có tác động vào chúng (Tsai và Liu, 2000)[150], trong khi đó ở các tuổi khác chúng thường xuyên di chuyển

Thời gian phát triển của trứng và rầy non phụ thuộc rất chặt vào nhiệt

độ Từ trứng đến trưởng thành ở nhiệt độ 28°C là 14,1 ngày; ở 15°C lên tới 49,3 ngày (Tsai và cs., 2002)[151] Trưởng thành sau khi vũ hóa được 2 – 3 ngày bắt đầu giao phối và sau giao phối 1 – 2 ngày bắt đầu đẻ trứng (Wenninger & Hall, 2007)[157] Nhiệt độ tối ưu ở 24 – 28°C, mỗi thế hệ từ 20 – 22 ngày ở 25°C (Tsai và Liu, 2000; Fung & Chen, 2006)[150][58] Nava và cs., (2007)[117] vòng đời con đực sống trung bình từ 21 – 25 ngày, con cái sống trung bình 31 – 32 ngày ở 24°C Liu và Tsai (2000)[107] cho rằng tối đa chúng có thể sống 117 ngày ở 15°C và 51 ngày ở 30°C; đã chứng minh được một con cái nếu không qua đẻ trứng sống được trên cây ký chủ ưa thích lên tới 188 ngày (trung bình 90 ngày) ở 27°C (Richardson và Hall, 2012)[122] Một số yếu tố tạo nên sự sống sót của rầy chổng cánh là mối quan hệ giữa ẩm

độ, ký chủ và tình trạng chống chịu của chúng (McFarlan & Hoy, 2001; Nava

ảnh hưởng đến hoa, quả và giá trị sản phẩm trên thị trường, sự gây hại có thể lên đến 83-95% (Anomynous 1996)[35]

Theo Husain và Nath (1927)[96], rầy chổng cánh tiết ra một số độc chất trong nước bọt, mật độ cao có thể gây chết cành Tuy nhiên, đây không phải là nguyên nhân duy nhất gây ra hiện tượng “dieback” Các vườn cây có múi ở Assam và Punjab bị thiệt hại nặng nề do bệnh VLG Rầy chổng cánh hoạt động mạnh vào mùa xuân, sau mùa hè và giảm nhẹ hơn vào mùa đông (Wenninger và cs., 2009b)[162]

Husain and Nath, 1927[96]; Sakamaki, 2005[127] cho rằng rầy chổng cánh không thể bay xa và không tồn tại được trong thời gian dài, do kích

thước và cánh rất yếu Thực tế D citri có thể bay trong suốt thời gian 47 phút

đối với con cái, 49 phút đối với con đực; khoảng cách mà chúng di chuyển được với con cái là 978m, con đực 1.241m Từ số liệu ngoại suy của (Arakawa and Mivamolo, 2007)[36], tốc độ bay trung bình 1,4km/giờ trong điều kiện không có gió và trung bình mỗi con bay được 25,4 phút Trưởng thành hoạt động trong ánh sáng ban ngày, nhưng hoạt động linh hoạt vào buổi chiều (Sétamou và cs., 2011)[131] Mỗi cá thể rầy có thể bay từ 30-100 mét/tháng ở Florida, hoạt động mạnh nhất vào mùa xuân (Hall and Hentz, 2011)[81] Chúng cũng thường xuyên bay 60 - 100 m giữa các cặp được đánh dấu và không đánh dấu, hướng về các khu rừng rậm (Boina và cs., 2009)[43]

Khoảng cách di chuyển dài được thí nghiệm lặp lại bằng khoảng cách ngắn (Arakawa and Mivamolo, 2007)[36] Giả thuyết cho rằng, khoảng cách bay dài được di chuyển ở các đảo của Nhật Bản như Yoron và Kyushu nhưng phụ thuộc vào gió (Sakamaki, 2005)[127] Về mặt lý thuyết chúng có thể di chuyển được 0,5 – 1 km bởi gió, tùy thuộc vào tốc độ gió duy trì trong suốt thời gian bay Bằng chứng chi tiết đã chỉ ra rằng, chúng có thể di chuyển ít nhất 51 km theo hướng Đông Bắc ngang qua Everglades, Florida và ở lại trên cây ký chủ (Halbert và cs., 2008)[74] Đây là khoảng cách ngắn nhất giữa Everglades đến vùng biển phía nam Florida

Diaphorina citri khi không đẻ trứng, trở nên thích nghi hơn trong mùa

đông thông qua tiếp xúc với nhiệt độ thấp hơn Tuy nhiên, cả ba giai đoạn trong vòng đời có thể tồn tại trong thời gian lạnh ngắn: hầu hết trưởng thành

và ấu trùng sống sót sau khi được tiếp xúc nhiều giờ ở nhiệt độ âm 6°C và hầu hết trứng nở sau khi tiếp xúc nhiều giờ với nhiệt độ âm 8°C (Hall and Hentz., 2011)[81] Sự giá lạnh từ nhẹ đến trung bình thường không nguy hiểm đến trưởng thành ngay cả khi chúng không thích nghi với điều kiện lạnh, nhưng lạnh đã làm chết các chồi cây trước nên môi giới cũng bị chết theo

Sự lan truyền của bệnh VLG trên đồng ruộng do rầy chổng cánh

Diaphorina citri Kuwayama

Sự lan truyền bệnh VLG bởi rầy chổng cánh trên đồng ruộng là rất phổ biến (Su, 1998, 2008)[135][136] Bệnh VLG sẽ bị tái nhiễm khi mật độ quần thể RCC cao Lan truyền tự nhiên của bệnh sẽ xảy ra trong suốt giai đoạn sinh trưởng của chồi, nguồn thức ăn dồi dào cho RCC sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc lan truyền bệnh (Hung và cs., 2004)[94] Cây khỏe gần cây bị bệnh

sẽ bị nhiễm trước, đồng thời bệnh sẽ lan truyền theo đường zíc zắc Tỷ lệ cây

bị nhiễm bệnh cao nhất khoảng giai đoạn 1,5 tháng sau lây nhiễm (từ cuối tháng 3 cho đến giữa tháng 4), khi đó tỷ lệ rầy chổng cánh mang vi khuẩn gây bệnh là nhiều nhất đồng thời khả năng phân tán của chúng cũng là lớn nhất Đây là khoảng thời gian cần tiến hành phun phòng trừ môi giới Tỷ lệ bệnh sẽ tích lũy tăng dần đạt khoảng 70% sau hai năm nếu không phun thuốc

và không hủy bỏ cây bệnh Ở phía Nam Đài Loan đã có cuộc điều tra về bệnh VLG sau trồng 5 năm (1999 – 2004) Tỷ lệ tích lũy bệnh VLG ở công thức phun thuốc trừ rầy môi giới là 17%, công thức không phun thuốc trừ rầy chổng cánh tỷ lệ bệnh VLG là 57% (Hung và cs., 2004)[94]

Ở Đài Loan khi nghiên cứu về khả năng truyền bệnh bằng rầy chổng cánh, kết quả cho thấy RCC trưởng thành sau khi chích hút vào cây một ngày cho tỷ lệ nhiễm dưới 5%, trong khi đó RCC ở tuổi non cho tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh VLG cao hơn

Rầy chổng cánh D citri thường tấn công vào thân chính của cây, đặc

biệt là chồi non Thả 50 rầy trưởng thành/cây và cho chúng chích hút 2 ngày (cây gieo từ hạt được 20 ngày tuổi), ở điều kiện nhiệt độ từ 26 – 28°C, dưới điều kiện ánh sáng 5.000lux trong 14gờ/ngày, giữ 3 tuần Sau lẫy nhiễm vài ngày đã có 16 cây bị chết héo do rầy tấn công, một số cây đã biểu hiện triệu chứng lá vàng lốm đốm, vàng toàn lá và chết (11 cây); 4 cây cho triệu chứng cây bị thấp lùn, vàng lốm đốm, 19 cây không cho triệu chứng Bộ rễ cây bị bệnh phát triển rất kém (Koizumi và cs., 1997)[101]

Các thí nghiệm lây bệnh nhân tạo cũng chỉ ra rằng D citri đã lan truyền

bệnh vàng lá greening trên đồng ruộng ở Florida (Teixeira và cs., 2005b)[141] Thí nghiệm khác cũng chỉ ra mức độ lan truyền bệnh trên 50%

1.2.3.3 Nghiên cứu về ký chủ của rầy chổng cánh Diaphorina citri

và vi khuẩn Liberibacter asiaticus

Skelley and Hoy (2004)[132] đã sử dụng phương pháp nhân nuôi rầy

chổng cánh trên cây nguyệt quế (Murraya paniculata L.), cây không bị nhiễm

bệnh do môi giới hoặc ghép lây bệnh Hall and Richardson (2012)[83] đã nuôi

RCC trên cây nguyệt quế và cây Citrus macrophylla Wester Một số loài là

ký chủ tốt cho D citri bao gồm: Citrus reticulata Blanco, Bergera koenigii L.,

Citrus maxima (Burm.) Merr., Citrus medica L., Citrus taiwanica Tanaka and

Y Shimada, and Citrus aurantiifolia (Christm.) Swingle

Su và cs., (2012)[138] đã nghiên cứu với bốn loài cây ký chủ khác nhau, các cây ký chủ được lây bệnh nhân tạo bằng cách ghép mắt ghép nhiễm bệnh

và bằng côn trùng môi giới rầy D citri Sự nhân lên của vi khuẩn gây bệnh

trong cây được kiểm tra bằng PCR Kết quả đã chứng minh được, vi khuẩn

gây bệnh VLG đã phát triển và tồn tại lâu dài trên cây Severinia buxifolia, chanh dại (Atalantia citroides) từ Căm-pu-chia Vi khuẩn gây bệnh đã không được nhân lên trong 2 loài Murraya paniculata var paniculata và M

exocortica và cây Murraya koengii ở Malaysia Vi khuẩn đã không phát hiện

được trong cây theo phương pháp PCR Bệnh vàng lá greening có thể phát

hiện được trên cây Limonia acidissine ở Thái Lan sau ghép lây nhiễm từ 6

đến 10 tháng nhưng cây lại được hồi phục và không bị bệnh sau một năm Do

vậy cây Limonia acidissine là cây ký chủ tạm thời của bệnh VLG Cây

Severinia buxifolia là cây ký chủ của bệnh VLG, tác nhân gây bệnh được

nhân lên nhanh như với cây có múi Triệu chứng vàng lá lốm đốm xuất hiện

trên cây được cho là loài thực vật phù hợp của D citri truyền bệnh cho cam

Valencia Tuy nhiên, ở Braxin lại ghi nhận được tác nhân gây bệnh VLG trên cây nguyệt quế (Lopes, 2006)[108]

1.2.4 Nghiên cứu các giải pháp quản lý bệnh vàng lá greening

1.2.4.1 Mối quan hệ giữa phân bón với sinh trưởng và năng suất

Tổng diện tích tán lá của một cây ăn quả có múi được tính theo công thức: V = W2 × H × 0,7 ( W: đường kính tán; H: Chiều cao cây) Thể tích và tán lá cam Tangelo trong năm 1992 là 40m3; 80kg/cây; năm 1993 (30m3; 30kg/cây) Tương tự trên cây bưởi là 90m3; 115kg/cây và giảm mạnh trong các năm tiếp theo

Cây có múi là loại cây ưa thâm canh, có khoảng 15 nguyên tố dinh dưỡng có vai trò quan trọng đối với sự sinh trưởng, phát triển của cây Những nguyên tố đa lượng là N, P, K, Mg và S, nguyên tố vi lượng là Zn, Cu, Fe, B, Việc bổ sung đầy đủ các nguyên tố trên là rất cần thiết để cây sinh trưởng

ở cam quýt Trường hợp thiếu kali sẽ làm quả nhỏ nhưng lá vẫn không có triệu chứng, thiếu trong thời gian dài lá mới bị dày và nhăn nheo, vùng giữa các gân lá bị mất diệp lục và sau đó có các vết chết khô, khi thiếu trầm trọng đầu đọt bị rụng, lá bị chết khô, cây thường bị chảy gôm, quả thô, phẩm chất kém (Lu, 2012)[109]

Theo Koizumi và cs., (1997)[101] ở Chiềng Mai và Nan (Thái Lan), cây

giống cam, bưởi sạch bệnh được trồng từ năm 1989, đến năm 1992 bệnh bắt đầu xuất hiện triệu chứng trên chồi mới, năm 1993 bệnh đã biểu hiện trên cành

Các nhà vườn thường dựa vào sự sinh trưởng phát triển của cây, vào năng suất vụ trước, và năng suất dự kiến thu hoạch trong năm … để bổ sung dinh dưỡng cho cây có múi (Gottwald và cs., 2012)[66]

1.2.4.2 Sử dụng cây giống sạch bệnh

Hệ thống vườn ươm cây con giống sạch bệnh vàng lá greening

Bệnh VLG là tác nhân chính gây thiệt hại năng suất cây có múi ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Bệnh lan truyền nhanh chóng trên đồng ruộng qua

rầy chổng cánh D citri Công tác quản lý bệnh VLG được thực hiện bằng

cách sử dụng cây giống sạch bệnh, loại bỏ nguồn bệnh VLG và ngăn ngừa sự lây nhiễm từ côn trùng môi giới Tạo cây giống sạch bệnh được thực hiện qua

vi ghép đỉnh sinh trưởng Cây giống cần được cấp chứng chỉ sạch bệnh (Su và cs., 2012)[138]

là chồi (ii) Chồi được ghép theo kiểu ghép mắt bên vào cây gốc ghép khỏe và được bọc kín bởi lớp giấy parafilm Cây sau ghép lần hai được phủ bằng túi dính nilon, cây được giữ trong nhà kính (iii) Túi nilon được tháo bỏ sau ghép

từ 3 – 4 tuần; sau ghép lần 2 khoảng 3 tháng, chồi mới bắt đầu mọc lên từ đỉnh sinh trưởng và sẵn sang cho việc nhân giống (iv) Kiểm tra sự sạch vi khuẩn gây bệnh VLG và các vi rút gây bệnh trước khi sử dụng cây vi ghép để nhân giống Để tăng khả năng nhân nhanh cây giống sạch bệnh, các chồi ghép được thu ở cây ghép lần 2 cách nhau 3 – 4 tháng

Thiết lập nhà lưới lưu giữ cây sạch bệnh

Theo Su và cs., (2012)[138], cây vi ghép được lưu giữ trong nhà lưới sau khi đã được xác định là sạch bệnh vi rút và vi khuẩn gây bệnh VLG Nhà lưới để lưu giữ cây sạch bệnh phải đảm bảo chống được côn trùng, phải có hai cửa, giữa hai cửa được ngăn bằng bức tường màu đen, xung quanh nhà lưới phải có rãnh nước để chống kiến và nhện Phòng cách ly có quạt thổi gió ngay ở cửa đầu tiên Các bệ đặt cây giống được đổ bằng bê tông, cách mặt đất

30 cm Mắt lưới dùng để xây dựng nhà lưới đảm bảo 30 ô/cm2

Cây gốc ghép để tạo ra cây đầu dòng thường là Troyer hoặc Carrizo citrange, các cây gốc ghép này cũng phải sạch bệnh Mỗi giống cần duy trì từ

2 đến 4 cây, được cắt tỉa hàng năm để mỗi cây đều cho trái, từ đó kiểm tra chặt chẽ và so sánh đặc tính nông học của cây ban đầu, nếu có sai khác cần loại bỏ ngay Lưu giữ cây sạch bệnh cần được thực hiện bởi cơ quan nhà nước

có chức năng quản lý và chuyên môn (Su và cs., 2012)[138]

Sản xuất cây giống sạch bệnh vàng lá greening

Trong hệ thống vườn ươm cần ngăn ngừa và phòng trị các tác nhân

như: Phytophthora spp., tuyến trùng, bệnh loét do vi khuẩn Công đoạn này

cần được kiểm soát chặt chẽ, đảm bảo sạch bệnh đồng thời đã loại bỏ được sự đột biến giống Cây giống cần phải được kiểm tra bệnh định kỳ và trước khi cây giống được xuất vườn cần phải được kiểm tra để cấp chứng chỉ cây giống sạch bệnh (Su, 1998)[135]

Hạt gốc ghép được gieo trong ống nhựa (đường kính 5cm, cao 18cm) hoặc gieo theo băng, hỗn hợp được khử trùng Cây gốc ghép được trồng trong bầu nhựa có đường kính 10cm, cao 30 - 40cm Một số giống gốc ghép phù

hợp cho từng loại cây có múi như: Gốc ghép Sunkit và quýt Cleopatra dùng cho các giống quýt Gốc ghép Troyer và Carrizo citrange dùng cho cam ngọt