Phát hiện nhanh bệnh Greening trên cây có múi ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. (Khóa luận tốt nghiệp)

Phát hiện nhanh bệnh Greening trên cây có múi ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. (Khóa luận tốt nghiệp)Phát hiện nhanh bệnh Greening trên cây có múi ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. (Khóa luận tốt nghiệp)Phát hiện nhanh bệnh Greening trên cây có múi ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. (Khóa luận tốt nghiệp)Phát hiện nhanh bệnh Greening trên cây có múi ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. (Khóa luận tốt nghiệp)Phát hiện nhanh bệnh Greening trên cây có múi ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. (Khóa luận tốt nghiệp)Phát hiện nhanh bệnh Greening trên cây có múi ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. (Khóa luận tốt nghiệp)Phát hiện nhanh bệnh Greening trên cây có múi ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. (Khóa luận tốt nghiệp)Phát hiện nhanh bệnh Greening trên cây có múi ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. (Khóa luận tốt nghiệp)Phát hiện nhanh bệnh Greening trên cây có múi ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. (Khóa luận tốt nghiệp)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - LÊ THỊ SINH Tên đề tài: PHÁT HIỆN NHANH BỆNH GREENING TRÊN CÂY CÓ MÚI Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chun ngành : Cơng nghệ Sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2012 – 2016 THÁI NGUYÊN - 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - LÊ THỊ SINH Tên đề tài: PHÁT HIỆN NHANH BỆNH GREENING TRÊN CÂY CÓ MÚI Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chun ngành : Cơng nghệ Sinh học Lớp : K44 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2012 – 2016 Giảng viên : ThS Bùi Đình Lãm Khoa CNSH-CNTP, Trƣờng ĐH Nơng Lâm Thái Ngun THÁI NGUYÊN - 2016 i LỜI CẢM ƠN Đƣợc đồng ý Khoa CNSH - CNTP, trƣờng Đại học Nơng Lâm Thái Ngun Em đƣợc thực tập phòng thí nghiệm Khoa CNSH – CNTP, trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên với đề tài: „„Phát nhanh bệnh greening có múi số tỉnh phía Bắc Việt Nam’’ để hồn thành khóa luận ngồi nỗ lực thân em nhận đƣợc nhiều giúp đỡ Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa CNSH - CNTP, thầy cô giáo tận tình giảng dạy cho em suốt năm học Trƣớc hết em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa CNSH - CNTP, thầy giáo tận tình giảng dạy cho em suốt năm học vừa qua để em hồn thành khóa luận Đặc biệt, em xin đƣợc bày tỏ lòng kính trọng, lòng biết ơn sâu sắc tới ThS Bùi Đình Lãm ngƣời tận tình hƣớng dẫn em suốt trình thực đề tài Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến KS Lã Văn Hiền dành nhiều thời gian quý báu trực tiếp hƣớng dẫn em thực nghiên cứu đề tài Cuối em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, ngƣời thân bạn bè quan tâm, ủng hộ động viên em suốt trình học tập nghiên cứu giúp em hồn thành tốt khóa luận Do điều kiện thời gian có hạn nên đề tài khó tránh khỏi thiếu sót Kính mong thầy giáo bạn sinh viên đóng góp ý kiến xây dựng để đề tài em đƣợc hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn ! Thái Nguyên, ngày 20 tháng năm 2016 Sinh Viên Lê Thị Sinh ii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Các loài cam, quýt có ý nghĩa thực tiễn sản xuất Bảng 2.2: Tình hình sản xuất có múi châu lục giới giai đoạn 2011 - 2013 14 Bảng 2.3: Diện tích, suất sản lƣợng có múi giới giai đoạn 2005 – 20013 .16 Bảng 2.4: Tình hình sản xuất có múi nƣớc ta giai đoạn 2005 – 2013 .16 Bảng 2.5: Tình hình sản xuất cam, quýt vùng nƣớc ta năm 2009 .17 Bảng 3.1: Trình tự cặp mồi để phát tác nhân gây bệnh greening (Hung cs, 1999b), (Hung cs, 2004) [34], [35] 28 Bảng 3.2: Các trang thiết bị máy móc dùng thí nghiệm .29 Bảng 3.3: Bảng thu thập mẫu địa phƣơng 30 Bảng 3.4: Chu trình nhiệt phản ứng PCR .32 Bảng 4.1: Kết thu thập mẫu vật liệu .36 Bảng 4.2: Kết đánh giá mẫu cam sành tỉnh Hà Giang 38 Bảng 4.3: Kết đánh giá mẫu cam vinh Thái Nguyên 39 Bảng 4.4: Kết giám định bệnh vàng greening 42 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Rầy chổng cánh Diaphorina citri 19 Hình 2.2 Triệu trứng nhiễm bệnh vàng greening có múi 21 Hình 4.1 Mẫu có múi thu thập để giám định bệnh vàng greening 37 Hình 4.2 Kết tách chiết DNA tổng số 40 Hình 4.3 Điện di sản phẩm PCR mẫu giám định bệnh greening 41 Hình 4.4 Kết tinh mẫu cam .44 Hình 4.5 Kết giải trình tự gen sản phẩm PCR với mồi GR - F từ mẫu DNA tách từ cam Vinh (Xã Quyết Thắng – Thái Nguyên,tỉnh Thái Nguyên) 45 Hình 4.6 Kết giải trình tự gen sản phẩm PCR với mồi GR – F từ mẫu DNA tách từ cam sành (Quang Bình – Hà Giang) 45 Hình 4.7 Kết giải trình tự gen sản phẩm PCR với mồi GR – F từ mẫu DNA tách từ cam Vinh (Xã Vô Chanh, huyện Phú Lƣơng, Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên) 45 Hình 4.8 Kết so sánh trình tự gen sản phẩm PCR BLAST với mồi GR - F từ mẫu DNA tách từ cam Vinh (Xã Quyết Thắng – Thái Nguyên,tỉnh Thái Nguyên) .46 Hình 4.9 Kết so sánh trình tự gen sản phẩm PCR BLAST với mồi GR - F từ mẫu DNA tách từ cam Sành (Quang Bình – Hà Giang) 47 Hình 4.10 Kết so sánh trình tự gen sản phẩm PCR BLAST với mồi GR - F từ mẫu DNA tách từ cam Vinh (Xã Vô Chanh, huyện Phú Lƣơng, Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên) .47 iv DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT BVTV : Bảo vệ Thực vật Cs : Cộng CTAB : Cetyl trimethyl ammonium bromide DNA : Deoxyribonucleic Acid ĐC : Đối chứng dNTP : Deoxyribo-nucleotide triphosphate EDTA : Ethylene diamine tetraacetate FAO : Food and Agriculture Organization NN&PTNT : Nông nghiệp Phát triển Nông thôn PCR : Polymerase Chain Reaction RNA : Ribonucleic Acid v MỤC LỤC Trang Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Yêu cầu nghiên cứu 1.4 Mục tiêu nghiên cứu 1.5 Ý nghĩa đề tài 1.5.1 Ý nghĩa khoa học 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn .3 Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan có múi .4 2.1.1 Nguồn gốc phân loại 2.1.1.1 Nguồn gốc 2.1.2 Đặc điểm sinh học có múi 2.1.3 Giá trị có múi .9 2.1.4 Yêu cầu sinh thái có múi 10 2.1.5 Một số sâu bệnh hại có múi .12 2.1.6 Tình hình sản xuất có múi 14 2.2 Bệnh vàng Greening có múi .18 2.2.1 Lịch sử bệnh .18 2.2.2 Nguyên nhân triệu chứng bệnh 18 2.2.3 Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh vàng greening 21 2.2.4 Một số biện pháp phòng tránh 23 2.3 Tình hình nghiên cứu phát bệnh greening có múi 23 2.3.1 Các nghiên cứu phát bệnh giới 23 2.3.2 Các nghiên cứu phát bệnh Việt Nam 26 Phần 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 3.1 Vật liệu nghiên cứu 28 3.1.1 Vật liệu thực vật 28 3.1.2 Hóa chất dụng cụ thí nghiệm 28 vi 3.2 Phạm vi, địa điểm thời gian nghiên cứu 29 3.2.1 Phạm vi nghiên cứu 29 3.2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 29 3.3 Nội dung nghiên cứu 30 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 30 3.4.1 Phƣơng pháp thu thập mẫu vật liệu 30 3.4.2 Phƣơng pháp xác định biểu bệnh greening thơng qua biểu bên ngồi 31 3.4.3 Phƣơng pháp phát bệnh greening có múi kỹ thuật PCR 31 3.4.4 Giải trình tự gene sản phẩm PCR .33 3.4.5 Phƣơng pháp sử lý số liệu .35 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .36 4.1 Kết thu thập mẫu vật liệu 36 4.2 Kết xác định mức độ biểu bệnh .37 4.2.1 Kết xác định biểu bệnh thông qua triệu chứng bên 37 4.3 Kết giám định bệnh vàng greening kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu 40 4.3.1 Tách chiết DNA tổng số mẫu 40 4.3.2 Kết nhân đoạn gen 16s rDNA 40 4.4 Kết giải trình tự gen sản phẩm PCR từ mẫu bị bệnh greening 44 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .48 5.1 Kết luận 48 5.2 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 I Tiếng Việt 50 II Tiếng Anh .52 III Tài liệu Internet 55 PHỤ LỤC Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây ăn có múi (cam, quýt, chanh, bƣởi, v.v.) nhóm ăn quan trọng sản xuất nông nghiệp nƣớc ta Năm 2011, diện tích ăn có múi Việt Nam đạt 124.057 ha, diện tích trồng cam qt chiếm tới 70.300 ha, bƣởi 45.000 chanh 18.000 (FAO, 2015) [52] Cây có múi loại trồng mang lại giá trị dinh dƣỡng, giá trị kinh tế cao Trong 100g thịt tƣơi có chứa 6-12% đƣờng, vitamin C từ 40-90 mg, Các acid hữu từ 0,4-1,2%, chất khoáng dầu thơm Sản phẩm có múi đƣợc sử dụng với nhiều mục đích khác nhƣ làm thực phẩm ăn hàng ngày, làm mứt, nƣớc giải khát Tinh dầu đƣợc cất từ vỏ quả, lá, hoa đƣợc dùng nhiều Công nghệ Thực phẩm Mỹ phẩm Vỏ dùng làm thuốc, hƣơng liệu (Đỗ Đình Đức, 1991) [7] Bệnh greening nguyên nhân ảnh hƣởng trực tiếp đến suất chất lƣợng (Lê Mai Nhất, 2014) [11] Bệnh lan truyền với tốc độ nhanh gây hại nghiêm trọng cho nhiều vùng trồng cam quýt giới Sản lƣợng bị giảm từ 30% đến 100% (Bassanezi R.B cs, 2005) [25] Ở Việt Nam, bệnh greening đƣợc ghi nhận gây hại ăn có múi từ năm 1960 Bệnh greening gây hại lớn vào năm 1970 1990 nông trƣờng trồng cam Mức độ thiệt hại bƣởi từ 17% – 25% cam quýt từ 54% – 70% (Vien N.V cs,2009) [50] Bệnh vàng greening bệnh hại quan trọng nhất, khốc liệt nhất, nguy hiểm nhất, nghiêm trọng nhất, hủy diệt tàn phá nặng nề nghề trồng ăn có múi giới (Su cs., 2012) [44] Đặc trƣng bệnh Greening có thời gian ủ bệnh dài, nên khó phát bệnh giai đoạn đầu thƣờng hay nhầm lẫn với bệnh khác nhƣ bị thiếu kẽm (Zn) (Lê Mai Nhất, 2014) [11] Đến bệnh biểu rõ ràng bệnh tàn phá nặng biện pháp chữa trị gần nhƣ vô nghĩa lúc này, nhiều biện pháp đƣợc thực nhƣng không mang lại hiệu Hơn nữa, vi khuẩn gây bệnh vàng đến xuất chủng mới, có độc tính nặng (Hung cs, 199a) [33].Chính vậy, việc phát nhanh bệnh greening giai đoạn đầu vô quan trọng việc phòng điều trị bệnh Ngày việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử cho phép chẩn đoán bệnh có múi mang lại hiệu cao với nhiều ƣu điểm nhƣ: độ nhạy cao, xác thời gian Có thể kể đến số kỹ thuật: PCR, real-time PCR, kỹ thuật lai phân tử, southern blot Kết thu đƣợc từ nghiên cứu chẩn đoán sinh học phân tử sở để sớm đƣa giải pháp phòng tránh Đến có nhiều nghiên cứu sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phát bệnh greening có múi Xác định tác nhân gây bệnh vàng greening phƣơng pháp sinh học phân tử Phân lập vi khuẩn Candidatus Liberibacter asiaticus gây bệnh greening từ rầy chổng cánh kỹ thuật PCR (Hung cs, 199a) [33] Xuất phát từ thực tiễn nghiên cứu đó, chúng tơi tiến hành thực đề tài: „„Phát nhanh bệnh greening có múi số tỉnh phía Bắc Việt Nam’’ 1.2 Mục đích nghiên cứu Phát nhanh bệnh greening có múi kỹ thuật PCR 1.3 Yêu cầu nghiên cứu - Thu thập nguồn vật liệu số đối tƣợng có múi nhƣ: Cam, chanh, bƣởi, quýt số tỉnh miền Bắc Việt Nam - Xác định biểu bệnh greening mẫu vật liệu thu thập đƣợc - Giám định bệnh vàng greening có múi phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu - Giải trình tự gene sản phẩm PCR từ mẫu bị bệnh greening (từ 2-3 mẫu) 1.4 Mục tiêu nghiên cứu - Thu thập đƣợc mẫu vật liệu số đối tƣợng có múi nhƣ: Cam, chanh, quýt, bƣởi, địa phƣơng khác ... HỌC NÔNG LÂM - - LÊ THỊ SINH Tên đề tài: PHÁT HIỆN NHANH BỆNH GREENING TRÊN CÂY CÓ MÚI Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chun ngành... Phát nhanh bệnh greening có múi kỹ thuật PCR 1.3 Yêu cầu nghiên cứu - Thu thập nguồn vật liệu số đối tƣợng có múi nhƣ: Cam, chanh, bƣởi, quýt số tỉnh miền Bắc Việt Nam - Xác định biểu bệnh greening. .. gây bệnh greening từ rầy chổng cánh kỹ thuật PCR (Hung cs, 199a) [33] Xuất phát từ thực tiễn nghiên cứu đó, chúng tơi tiến hành thực đề tài: „ Phát nhanh bệnh greening có múi số tỉnh phía Bắc Việt