Đánh giá vai trò bệnh tồn lưu tối thiểu trên bệnh nhân đa u tuỷ bằng phương pháp tế bào dòng chảy tại bệnh viện truyền máu huyết học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH -o0o - ĐẶNG NGUYỄN BẢO TRÂM ĐÁNH GIÁ VAI TRÒ BỆNH TỒN LƯU TỐI THIỂU TRÊN BỆNH NHÂN ĐA U TỦY BẰNG PHƯƠNG PHÁP TẾ BÀO DÒNG CHẢY TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH -o0o - ĐẶNG NGUYỄN BẢO TRÂM ĐÁNH GIÁ VAI TRÒ BỆNH TỒN LƯU TỐI THIỂU TRÊN BỆNH NHÂN ĐA U TỦY BẰNG PHƯƠNG PHÁP TẾ BÀO DÒNG CHẢY TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC NGÀNH: NỘI KHOA (HUYẾT HỌC VÀ TRUYỀN MÁU) MÃ SỐ: 8720107 LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN PHƯƠNG LIÊN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan báo cáo cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết luận văn hoàn tồn trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Tác giả luận văn ĐẶNG NGUYỄN BẢO TRÂM MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC VIẾT TẮT TIẾNG VIỆT i DANH MỤC ĐỐI CHIẾU ANH - VIỆT ii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC BIỂU ĐỒ viii DANH MỤC SƠ ĐỒ ix DANH MỤC HÌNH x MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Đa u tủy Phương pháp tế bào dòng chảy 16 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 Đối tượng nghiên cứu 29 Phương pháp nghiên cứu 30 Phương pháp thu thập xử lý số liệu 37 Vấn đề y đức 40 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 41 Đặc điểm chung người bệnh 42 Đặc điểm tương bào 47 Đánh giá đáp ứng điều trị 51 Một số mối tương quan 53 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 58 Đặc điểm người bệnh lúc chẩn đoán 58 Đặc điểm tương bào 63 Đánh giá đáp ứng điều trị 65 Một số mối tương quan 70 HẠN CHẾ 75 KẾT LUẬN 76 KIẾN NGHỊ 77 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC i DANH MỤC VIẾT TẮT TIẾNG VIỆT TÊN VIẾT TẮT TÊN ĐẦY ĐỦ BTLTT Bệnh tồn lưu tối thiểu BV Bệnh viện BV TMHH Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học DAMD Dấu ấn miễn dịch DTHPT Di truyền học phân tử ĐUT Đa u tuỷ TBDC Tế bào dòng chảy TBG Tế bào gốc ii DANH MỤC ĐỐI CHIẾU ANH - VIỆT TÊN TÊN ĐẦY ĐỦ VIẾT Ý NGHĨA TẮT ASCT Autologous Stem Cell Transplant Ghép tự thân B2M Beta-2-microglobulin CD Cluster of differentiation Cụm biệt hóa CR Complete response Đáp ứng hoàn toàn CT Computed tomography Chụp cắt lớp vi tính CyK Cytoplasmic kappa Kappa nội bào CyL Cytoplasmic lambda Lambda nội bào DFS Disease free survival Thời gian sống không bệnh FASC Flourescence activated cell sorters Phân loại tế bào kích hoạt huỳnh quang FC Flow cytometry Tế bào dòng chảy FLC Free light chain Chuỗi nhẹ tự FSC Forward scatter Tán xạ trước Hb Hemoglobin Ig Immunoglobulin Globulin miễn dịch iii TÊN TÊN ĐẦY ĐỦ VIẾT Ý NGHĨA TẮT IgH Immunoglobulin heavy Globulin miễn dịch chuỗi nặng IMF International Myeloma Hiệp hội ĐUT giới Foundation IMWG ISS International Myeloma Working Hiệp hội quốc tế nghiên cứu Group đa u tủy International Staging System Hệ thống đánh giá giai đoạn quốc tế LDH Lactate dehydrogenase LDWBCT Low dose whole body computed CT toàn thân liều thấp tomography MGUS Monoclonal gammopathy undetermined significance of Bệnh gamma globulin đơn dịng có ý nghĩa khơng xác định MM Multiple myeloma Đa u tuỷ MR Minimal response Đáp ứng tối thiểu MRD Minimal residual disease Bệnh tồn lưu tối thiểu MRI Magnetic resonance imaging Chụp cộng hưởng từ iv TÊN TÊN ĐẦY ĐỦ Ý NGHĨA National Comprehensive Cancer Mạng lưới ung thư toàn Network diện quốc gia nCR Near complete response Đáp ứng gần hoàn toàn NGF Next generation flowcytometry Đếm tế bào dòng chảy VIẾT TẮT NCCN hệ NGS Next generation sequencing Giải trình tự gen hệ OS Overall survival Thời gian sống cịn tồn PCD Plasma Cell Disorders Xác định rối loạn tăng sinh tương bào PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase PCST Plasma Cell Screening Tube Sàng lọc tương bào PD Progresssive disease Bệnh tiến triển PET Positron emission tomography Chụp cắt lớp phát xạ positron PFS Progression free survival Thời gian sống không tiến triển bệnh PLT Platelet Tiểu cầu PR Partial response Đáp ứng phần v TÊN TÊN ĐẦY ĐỦ VIẾT Ý NGHĨA TẮT R-ISS Revised International Staging Hệ thống đánh giá giai đoạn System quốc tế cải tiến SD Stable disease Bệnh ổn định SDP Shaft hole diameter Tổng đường kính SMM Smoldering multiple myeloma Đa u tủy tiềm tàng SSC Side scatter Tán xạ bên SUV Standardized uptake value Giá trị hấp thu tiêu chuẩn hóa TCR T cell receptor TdT Terminal Thụ thể tế bào T deoxynucleotidyl transferase TP53 Tumor protein p53 VCD Velcade – Cyclophosphamide – Dexamethason VGPR Very good partial response Đáp ứng phần tốt WHO World Health Organization Tổ chức y tế giới Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHIẾU THU THẬP SỐ LIỆU ĐA U TỦY I Hành Số hồ sơ:………………………………….Số NV:……………………….…… Họ tên (viết tắt):………………………… Năm sinh (Tuổi):……… Địa (tỉnh, thành phố):……………………………………… ………… … Nghề nghiệp:…………………………… Điện thoại:……………………… … Giới: Nam Nữ Ngày NV:……/…… /202……….… Lý NV: ………………………………………………………………….…… Tiền Khơng THA ĐTĐ  Bệnh lí xương, khớp II Bệnh thận mạn Bệnh lí huyết học Khác:………… Lâm sàng Cân nặng (kg): LÂM SÀNG Thiếu máu Xuất huyết Chiều cao (m): CHẨN ĐOÁN SAU ĐỢT BMI(kg/m2): TRƯỚC DUY TRÌ Khơng Khơng Khơng Có Có Có Khơng Khơng Khơng Có Có Có Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh LÂM SÀNG Nhiễm trùng CHẨN ĐỐN SAU ĐỢT TRƯỚC DUY TRÌ Khơng Khơng Khơng Có Có Có Khơng Khơng Khơng Có Có Có Khơng Khơng Khơng Có Có Có Khơng Khơng Khơng Có Có Có Khơng Khơng Khơng Có Có Có Khơng Khơng Khơng Có Có Có Khơng Khơng Khơng Có Có Có 10 Triệu chứng thần Khơng kinh Có Khơng Khơng Có Có 11 Phù Khơng Khơng Khơng Có Có Có Gãy xương Đau xương U tương bào Gan to Lách to Triệu chứng B Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh LÂM SÀNG 12 Tiểu 13 Khác: ………… III CHẨN ĐỐN SAU ĐỢT TRƯỚC DUY TRÌ Khơng Khơng Khơng Có Có Có Khơng Khơng Khơng Có Có Có Cận lâm sàng CẬN LÂM SÀNG CHẨN ĐOÁN SAU ĐỢT TRƯỚC DUY TRÌ Hb (g/dl) PLT (k/uL) WBC (k/uL) Neu (k/uL) HC hình chuỗi tiền LDH (U/L) B2M (mg/l) Creatinin (umol/l) Ca TP (mmol/l) 10 Albumin (g/l) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh CẬN LÂM SÀNG CHẨN ĐỐN SAU ĐỢT TRƯỚC DUY TRÌ 11 Protein TP (g/l) 12 IgA 13 IgG 14 IgM 15 Free Kappa huyết (mg/L) 16 Free Lambda huyết (mg/L) 17 Điện di protein huyết (%) 18 Điện di miễn dịch cố định huyết Albumin Albumin Albumin Alpha1 Alpha1 Alpha1 Alpha2 Alpha2 Alpha2 Beta Beta Beta Gamma Gamma Gamma A/G A/G A/G IgG IgG IgG IgA IgA IgA IgM IgM IgM Kappa Kappa Kappa Lambda Lambda Lambda Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh CẬN LÂM SÀNG CHẨN ĐỐN SAU ĐỢT TRƯỚC DUY TRÌ 19 Free Kappa nước tiểu (mg/L) 20 Free Lambda nước tiểu (mg/L) 21 Protein niệu (g/24 giờ) 22 Protein Bence jones 24 Tổn thương Xương sọ xương Cột sống Xương sườn Xương tứ chi Khung chậu 25 % tương bào tủy đồ Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh CẬN LÂM SÀNG CHẨN ĐỐN SAU ĐỢT TRƯỚC DUY TRÌ 26 Bất thường nhiễm sắc thể t(4;14) t(4;14) t(4;14) t(11;14) t(11;14) t(11;14) t(14;16) t(14;16) t(14;16) t(6;14) t(6;14) t(6;14) t(14;20) t(14;20) t(14;20) del(17p) del(17p) del(17p) del(13q) del(13q) del(13q) 1q21 1q21 1q21 Khác:…… 9.Khác:……… 9.Khác:…… FISH IV 27 Nhóm nguy  Chuẩn 28 Giai đoạn RISS 29 % tương bào 30 Kiểu hình miễn dịch I Cao II III Đánh giá đáp ứng VGPR Sau chu kì Trước trì Khác: Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PR BTLTT+ BTLTT- Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh V Đánh giá diễn tiến bệnh Sống Chết Tái phát Tiến (Tuỷ/Mô triển xương/Mơ mềm) Ngày chẩn đốn Mốc diễn tiến bệnh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Mất dấu Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC PHÁC ĐỒ ĐIỀU TRỊ ĐA U TỦY TẠI BV TMHH Tên thuốc Liều lượng Thời gian dùng Đường dùng Phác đồ VCD, chu kì 21 ngày Bortezomib 1,3 mg/m2/ngày Ngày 1, 4, 8, 11 Tiêm da/Tiêm mạch nhanh Cyclophosphamide 500 mg/ngày Ngày 1, 8, 15 Uống Dexamethasone 40 mg/ngày Ngày – 4, – 11 Uống Phác đồ VRD, chu kì 21 ngày Tiêm da/Tiêm mạch nhanh Bortezomib 1,3 mg/m2/ngày Ngày 1, 4, 8, 11 Lenalidomide 15 mg/m2/ngày Ngày – 14 Uống Dexamethasone 40 mg/ngày Ngày 1, 8, 15 Uống Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC KỸ THUẬT TẾ BÀO DÒNG CHẢY KHẢO SÁT CÁC KIỂU HÌNH TƯƠNG BÀ O ÁC TÍ NH Hố chất Bộ kit BD OneFlow cung cấp ống thuốc thử dạng đơng khơ chứa kháng thể đơn dịng phối màu với quy trình chuẩn hoá để xử lý nhuộm mẫu người bệnh cho phép thu thập phân tích mẫu người bệnh để phân biệt quần thể tương bào bình thường quần thể tương bào ác tính xác theo chuẩn EuroFlow Bộ kit BD OneFlow sử dụng để chẩn đoán bệnh lý dòng tương bào gồm ống thuốc thử:  Ống sàng lọc tương bào (PCST)  Ống xác định rối loạn tăng sinh tương bào (PCD) Bảng: Bộ kháng thể đơn dịng có gắn màu huỳnh quang theo tiêu chuẩn Euroflow Các kháng thể đươc lựa chọn có khả phân biệt quần thể tương bào bình thường ác tính: • CD38, CD138, CD45 CD19  dấu ấn khung (backbone) • CD38bright, CD138+  xác định tương bào • CD38bright, CD56-, CD19+  tương bào bình thường • CD38bright, CD56+, CD19  tương bào bất thường • β2-microglobulin  dấu ấn tiên lượng Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh • CyIgK CyIgL  xác định tính chất đơn dịng hay đa dịng tương bào • CD27 CD81  giảm khơng có tương bào bất thường • CD28 CD117  liên quan tới biến đổi gen cụ thể kết bệnh (có biểu tăng tương bào bất thường) Thu thập xử lí mẫu Bệnh phẩm mẫu tủy xương lưu trữ ống nghiệm chống đông EDTA (tối thiểu mL/mẫu) Sau lấy mẫu, chuyển mẫu đến phòng xét nghiệm, thời gian từ lúc lấy mẫu đến xử lý mẫu vịng tiếng Quy trình nhuộm tế bào với KT kit BD OneFlow thực theo bước sau: Rửa mẫu: Với mẫu tủy xương người bệnh (chứa số lượng lượng bạch cầu từ x 105 đến x 107 tế bào/ml), chuẩn bị ống 15ml falcon Trộn ống máu người bệnh cách đảo ống 10 lần Hút 300ul máu vào ống 15ml Cho 10ml dung dịch đệm rửa (đệm PBS + 0.5% BSA + 0.1% sodium azide) Đóng nắp ống 15ml đảo ống 3-5 lần để trộn Ly tâm với tốc độ 540g phút 20°C–25°C Loại bỏ dịch nổi, tránh ảnh hưởng đến cặn tế bào Vortex nhẹ 3-5 giây Lặp lại bước 4-8 thêm lần (đảm bảo tổng số lần rửa lần) 10 Hòa tế bào vào 200ul dung dịch đệm rửa Lưu ý: nên ủ mẫu khoảng 30 phút từ lần rửa cuối Để mẫu rửa 20°C–25°C nhuộm mẫu Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Ủ mẫu: Mở túi nhôm chứa ống BD OneFlow PCST PCD, lấy số ống tương ứng với số mẫu người bệnh, tránh ánh sáng Hút 50 μL dung dịch đệm rửa (đệm PBS + 0,5% BSA + 0,1% sodium azide) 50 μL dung dịch mẫu người bệnh rửa cho vào ống PCST (S) PCD, vortex mạnh 3–5 giây Ủ 30 phút 20°C–25°C, tránh ánh sáng Thêm 100 μL dung dịch Reagent A vào ống, vortex ủ phút 20°C– 25°C Thêm mLdung dịch BD FACS lysing 1x vào ống, vortex 3–5 giây Ủ 10 phút 20°C–25°C, tránh ánh sáng Ly tâm với tốc độ 540g phút 20°C–25°C Loại bỏ dịch nổi, tránh ảnh hưởng đến cặn tế bào, để lại khoảng 50 μL dung dịch Thêm 50 μL dung dịch Reagent B vào ống, vortex nhẹ Lưu ý: nhuộm ống PCST PCD lúc nên để ống PCD xử lý sau bước 15 10 Lấy số lượng ống BD OneFlow PCST (C) tương ứng số mẫu người bệnh 11 Chuyển 100 μL dung dịch mẫu từ ống BD OneFlow PCST (S) sang ống BD OneFlow PCST (C) 12 Vortex 3-5 giây, ủ 15 phút 20°C–25°C, tránh ánh sang 13 Thêm 1,5 mL dung dịch đệm rửa (đệm PBS + 0,5% BSA + 0,1% sodium azide), vortex 3-5 giây, sau thêm 1,5 mL dung dịch đệm rửa, vortex 3-5 giây 14 Ly tâm với tốc độ 540g phút 20°C–25°C Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 15 Loại bỏ dịch nổi, tránh ảnh hưởng đến cặn tế bào, để lại khoảng 50 μL dung dịch ống 16 Vortex 3-5 giây để trộn tế bào 17 Thêm 200 μL dung dịch BD CellFIX dung dịch 1% paraformaldehyde vào ống, vortex 3-5 giây để trộn tế bào Lưu ý: Phân tích mẫu khoảng sau nhuộm Bảo quản mẫu nhuộm -80oC tối phân tích mẫu máy, vortex kỹ trước hút mẫu Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC CÁC KIỂU HÌNH DẤU ẤN MIỄN DỊCH XUẤT HIỆN TRONG NGHIÊN CỨU Hình 1: Kiểu hình miễn dịch tương bào: CD45-CD38BrightCD138+CD19-CD56+ (Kiểu hình số 1) (Quần thể tương bào ác tính màu đỏ chiếm tỷ lệ 35% có CD45 âm tính (A), dương tính với CD38 CD138 (B), dương tính với CD56 âm tính với CD19 (C)) Hình 2: Kiểu hình miễn dịch tương bào: CD45-CD38BrightCD138+CD19+CD56+ (Kiểu hình số 2) (Quần thể tương bào ác tính màu đỏ chiếm tỷ lệ 6% có CD45 âm tính (A), dương tính với CD38 CD138 (B), dương tính với CD56 dương tính với CD19 (C)) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Hình 3: Kiểu hình miễn dịch tương bào: CD45-CD38BrightCD138+CD19+CD56(Kiểu hình số 3) (Quần thể tương bào ác tính màu đỏ chiếm tỷ lệ 45% có CD45 âm tính (A), dương tính với CD38 CD138 (B), âm tính với CD56 dương tính với CD19 (C)) Hình 4: Kiểu hình miễn dịch tương bào: CD45-CD38BrightCD138-CD19+CD56(Kiểu hình số 4) (Quần thể tương bào ác tính màu đỏ chiếm tỷ lệ 0,3% có CD45 âm tính (A), dương tính với CD38 âm tính với CD138 (B), âm tính với CD56 dương tính với CD19 (C)) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Hình 5: Kiểu hình miễn dịch tương bào: CD45+CD38BrightCD138+CD19-CD56+ (Kiểu hình số 5) (Quần thể tương bào ác tính màu đỏ chiếm tỷ lệ 29% có CD45 dương tính (A), dương tính với CD38 CD138 (B), dương tính với CD56 âm tính với CD19 (C)) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn