1061 nghiên cứu biểu hiện gen gp5 của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (prrs) trên tế bào thuốc lá và hạt đậu tương luận văn tốt nghiệ

1 MỞĐẦU Lýdochọnđềtài Hộichứngrốiloạnsinhsảnvàhôhấpởlợn( P o r c i n e Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS), gọi làbệnh lợn tai xanh, bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, bùngphát thành dịch thường gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôilợn Tuy nhiên chưa có quốc gia cơng bố thanhtốn hồn tồn dịch bệnh Nỗ lực kết hợp biện phápphòngchốngvàtiêmphòngvaccinevẫnlàgiải pháphữuhiệunhấtđể ngănchặnnguycơbùngphátdịchvàhạnchếđếnmứcthấpnhấttổn thất vius PRRS lợn nuôi nước nước ta.Dịch bệnh lợn tai xanh Việt Nam đến giảm đáng kểnhưng lẻ tẻ xảy ra, tiềm ẩn nguy bùng phát dịch trongtương lai Mặc dù có nhiều loại vaccine vơ hoạt nhược độcđược dùng để tiêm phòng bệnh PRRS cho kết phịng bệnh khátốt,nhưngcácvaccinetruyềnthốngnàyđangđặtranhữngvấnđềáingại mức hiệu lực tính an tồn Thêm vào đó, với đặc tính sinhmiễnd ị c h k h c l c ủ a v i r u s P R R S s o v i c c v i r u s g â y b ệ n h t o n thân khác, nên việc nghiên cứu phát triển vaccine mới, làm đadạnghóa cácnguồn vaccine phịngchốngbệnhlàhếtsứccầnthiết Nhiều loại vaccine hệ nghiên cứu pháttriển, dạng vaccine tiểuđơnvịb i ể u hệ thống t h ự c v ậ t nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Đây hệthống sản xuất có nhiều ưu điểm dễ dàng tăng quy mô sảnxuất thu sinh khối, dùng qua đường miệng tiện lợi vàdễ sử dụnghơnsovớicácvaccinethôngthường Glycoprotein GP5 - protein cấu trúc (E, GP3, GP4,GP5, M N) mã hóa genGP5trong hệ gen cuả virusPRRS (Fang Y & Snijder EJ, 2010), có khả kích thích việc sảnsinh kháng thể trung hòa lợn vấn đề then chốt miễndịchd ị c h t h ể , đ ợ c c o i n h m ụ c t i ê u h n g đ ầ u đ ể t hi ế t k ế v a c c i n e tiểu đơn vị chống lạisựx â m nhiễm củavirusPRRSiB, 0 ) Cácn g h i ê n c ứ u b i ể u h i ệ n G P t r o n g t h ự c v ậ t đ ã đ ợ c m ộ t s ốnhà khoa học tiến hành, song mức độ biểu kháng nguyên táitổ hợp thấp, chủ yếu dao động từ 0,01 - 1% protein hòa tantổng số, đặt cần thiết nghiên cứu giải pháp tăng cường mức độbiểu kháng nguyên (Chia MY, 2010, 2011; Chan HT, 2013;Hu J, 2012, Piron R, 2014) Sử dụng promoter điều khiển biểu hiệnprotein mạnh vector dựa virus thực vật giải pháphiệuquả tăngcườngbiểuhiện gen trongnhiềunghiên cứu gần Xuấtpháttừlídotrên,chúngtơitiếnhànhđềtàiluậnán:“Nghiêncứu biểu genGP5củavirusgâyhộichứngrốiloạnsinhsảnvà hơ hấp lợn (PRRS) tế bào thuốc hạt đậu tương”nhằm làm tăng cường biểu kháng nguyên GP5 virus PRRSphụcvụ cho nghiên cứusản xuấtvaccine thựcvậtởnướcta Mụctiêunghiêncứu Nghiên cứu nhằm tăng cường biểu gen mã hóa khángnguyên GP5 gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp virusPRRS phân lập lợn nhiễm bệnh PRRS Việt Nam tế bàothuốc BY-2 hạt đậu tương Mục tiêu cụ thể mà đề tài luậnáncầnđạtđược gồm: 1) Phát triển hệ vector chuyển gen dựa virus thực vậtTMV có khả biểu protein tái tổ hợp ổn định mức caodưới điều khiển promoter cảm ứng nhiệt tế bào dòngthuốclá BY-2 2) Thiết kế vector chuyển gen có khả biểu khángnguyên GP5 đặc hiệu hạt điều khiển promoter β-phaseolin 3) Chuyển thành công hệ vector mang gen chuyển thiết kếtạo dòng tế bào thuốc BY-2, thuốc đậutươngbiến đổigen biểu hiệnkhángnguyên GP5 4) Đánh giá sơ tính sinh miễn dịch động vật thí nghiệmsửdụngproteintáitổhợpGP5 đãbiểu hiệnqua đườngmiệng Nộidungnghiêncứu Nội dung 1.Nghiên cứu biểu kháng nguyên GP5 virusPRRStronghệ thốngtế bào thuốc láBY-2 nicấyhuyền phù: - TốiưuđiềukiệnnicấytếbàothuốcláBY-2quymơphịngthí nghiệm - Thiết kế hệ vector chuyển gen biểu ổn định GP5 dựa trênvirus thực vật TMV điều khiển promoter cảm ứng nhiệtHSP18.2 - Tạo dòngtế bàothuốcláBY-2 chuyển gen biểuhiệnGP5 - ĐánhgiásơbộtínhsinhmiễndịchcủaproteintáitổhợpGP5trê nđộngvậtthínghiệm Nộidu ng NghiêncứubiểuhiệnkhángnguyênGP5củavirusPRRSđ ặc hiệu tronghạtđậu tương - ĐánhgiákhảnăngtáisinhđachồicủamộtsốgiốngđậutươngViệt Nam,tạonguyên liệuin vitrophụcvụ chuyểngen -ThiếtkếvectorbiểuhiệnGP5dướisựđiềukhiểncủapromoterđặchiệuở hạtβ-phaseolin - Biểnhiện genGP5t r o n g câymơ hình - Tạocâyđậu tươngchuyển gen manggenGP5 Đónggópmớicủaluậnán uận án cơng trình Việt Nam giớithiết kế hệ vector chuyển gen biểu protein tái tổ hợp dựatrên yếu tố virus thực vật TMV điều khiển promoter cảmứngnhiệtHSP18.2 sử dụng chuyển gen ổn định vào hệ gennhân Hệ vector pHsp-TMVLTB-GP5này tăng cường mứcđộbi ểuhiệ nGP5 tếbàothuốc BY2 đạt3, 4% pr ote i nhòa tan tổng số Protein GP5 tái tổ hợp sử dụng qua đường miệngđãcókhảnăngkíchthíchtạokháng thểđặchiệukháng GP5ởlợnthí nghiệm.uận án thiết kế hệ vector chuyển gen pDest-phaso-LTB-GP5, biểu kháng nguyên GP5 cùngTB đặc hiệutrongh t d i s ự đ i ề u k h i ể n c ủ a p r o m o t e r β p h a s e o l i n H i ệ u q u ả biểuhiệncủacáchệvectornàytrongtếbàothuốclávàởhạtđậutương cho thấy triển vọng khắc phục hạn chế cho đếnnay vấn đề mức biểu gen chuyển hệ thốngthực vật Các cấu trúc vector ứng dụng để cảithiện mức độ biểu protein tái tổ hợp tế bào loàithực vậtkhácnhau Cấu trúcluậnán Luận án gồm 147 trang, chia thành phần: Phần mở đầu 4trang; Chương1:Tổngquantàiliệu33trang;Chương2:Vậtliệuvàphương pháp nghiên cứu 15 trang; Chương 3: Kết nghiên cứu 44trang;Chương4:Thảoluận22trang;Phầnkếtluậnvàđềnghị 1trang;C c c n g t r ì n h đ ã c ô n g b ố c ủ a t c g i ả t r a n g T ó m t ắ t n ộ i dun gluậnánbằngtiếngAnh6trang;Tàiliệuthamkhảo19trang;Luận án có 18 bảng số liệu, 54 hình 189 tài liệu tham khảo 4phụ lục CHƢƠNG1.TỔNGQUANTÀILIỆU Luận án tham khảo tổng kết vấn đề liên quan (1)Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn virus PRRS( ) c c hệ thống biểu giải pháp tăng cường biểu protein tái tổhợpởthựcvật(3)Tình hìnhnguncứupháttriểnkhángnguntáitổ hợp trongthực vậtphịngchốngPRRS CHƢƠNG2.VẬTLIỆUVÀPHƢƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 2.1 Vậtliệunghiên cứu Vật liệu thực vật: Tế bào thuốc BY-2 (phịng thí nghiệm Hóasinh Thực vật, Trường Đại học Anwept, Vương quốc Bỉ), giống câythuốc láNicotiana tabacumC9-1 (Viện Kinh tế kỹ thuật thuốc lá),các giống đậu tương ĐT12, ĐT22, ĐT26, ĐT51 DT84Trung tâmNghiêncứu Pháttriển Đậu đỗ) Vector chủng vi khuẩn:T/pBT, pBSK chứa genGP5đượcđặt nhân tạo), pSHELP chứa genLTB(Labile toxin B subnit-độc tốkhông chịu nhiệt lấy từE.coli), pBT, pCB-GW-35S pCB-GW-HSP (phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Cơng nghệ sinh học);Vector30B-TMVGFP(TS.W.ODawson,ViệnThựcphẩmv Nông nghiệp, Trường Đại học Florida, Mỹ); Vector pBeta-Phaso-dest (Đại học Vrije Brussel, Vương Quốc Bỉ) Các chủng vi khuẩnE.coliDH5α,Agrobacterium tumefaciensCV58 pGV2260 (PhịngCơngnghệ tế bào thực vật,Viện Côngnghệ sinhhọc) 2.2 Phƣơngphápnghiêncứu 2.2.1 Thiết kế gen GP5đổimãphùhợpbiểu thựcvật 2.2.2 TạođoạngenđađoạnLTB-GP5 2.2.3 Thiếtkếvector chuyểngenbiểuhiệnGP5 Cácbướccầntiếnhànhđểcóđượccácvectorđíchđượcthểhiệnởsơđồ hình 2.1 30B-TMV pBT-LTB-GP5 attB1-TMV-attB2 attB1-LTB-GP5-attB2 pDONR201 PacI-LTB-GP5-XhoI B pDONR-TMV BP pDONR-LTB-GP5 PacI,XhoI pBeta-Phaso-dest pCB-GW35S LR pCB-35S-LTB-GP5 pCB-GWHSP pDONR-TMV-GP5 LR LR pPhaso-LTB-GP5 Ligase pCB-35S-TMV-LTB-GP5 LR pHSP-TMV-LTB-GP5 Hình2.1.Sơđồ phươngphápthiếtkế vector biểuhiện 2.2.4 Tối ưuđiềukiệnnuôi cấytếbàoBY-2 Bao gồm tối ưu nguồn đường, chất kích thích sinh trưởng, cỡmẫu,nhiệtđộ, ánhsáng 2.2.5 Tối ưuđiềukiệnnicấyBY-2tronghệthốnglênmen5lít Q trình lên men bình Bioflo110 L với thể tích lên menđượcthayđổi3-5lít,tỉlệsụckhíđượcđiềuchỉnhtừ0,1;0,3đến0,5vvm (volumepervolumeperm i n u t e , lít/phút), tốc đ ộ k h u ấ y điều chỉnh tốc độ 60, 120 180 rpm (revolutions perminute, vòng/phút) kiểm tra lấy mẫu định kì đo đếm kínhhiểnviquanghọc, xác địnhchỉtiêu sinh khốitươi 2.2.6 Chuyểngen vàotế bào thuốclá BY-2 Cấut r ú c gen35S-TMV-GP5vàHSP-TMV-GP5được chuyểnvàotếbàothuốcláBY-2thôngquavikhuẩnA.tumefaciens theophươngphápNocarova &Fischer(2009) 2.2.7 Chuyểngenvàocâythuốclá Cấutrúcgen35S-LTB-GP5vàpPhaso-LTB-GP5đ ợ c c h u y ể n vào giống thuốc láNicotiana tabacumC9-1 thơng qua vi khuẩnA.tumefacienstheophươngphápcủaToppingcócảitiến(1998) 2.2.8.Phươngpháptáisinhđachồivàchuyểngenvàonáchlámầmđậutương Phương pháp tái sinh chuyển gen qua đa chồi từ nách lámầm hạt chín tiến hành dựa phương pháp Olhoft vàcộngsự (2001) 2.2.9 Phươngphápphântích câyvàtế bàochuyển gen Các phƣơng pháp sử dụng bao gồm:PCR, phiên mã ngược(RT-PCR); real-time PCR; phân tích biểu protein Westernblot ELISA 2.2.10 Phương pháp đánh giá sơ khả đáp ứng miễn dịchvới GP5 động vật thí nghiệm:phương pháp ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay),IPMA (immunoperoxidase monolayerassay)vàWesternblot 2.2.11 Xử lí phân tích thống kê kết thực nghiệm:sử dụngchươngtrìnhExcelvàphầnmềmSPSS CHƢƠNG3.KẾTQUẢNGHIÊNCỨU 3.1 NGHIÊNCỨUBIỂUHIỆNGP5 TRONGTẾBÀOBY-2 3.1.1 Tối ưuđiều kiệnni cấy BY-2quymơphịngthí nghiệm Nghiên cứu tiến hành tối ưu hóa số yếu tố quy trìnhni cấyin vitrotế bào BY-2 Điều kiện tối ưu cho trình pháttriển tế bào bao gồm: Môi trường MS lỏng bổ sung chất kíchthích sinh trưởng 2,4-D (0,2 mg/l) 2,4-D kết hợp với nồng độkinetint h ấ p ( , m g / l ) t h ú c đ ẩ y q u t r ì n h p h â n c h i a n h a n h v t o sinh khối cao cho tế bào BY-2; Sucrose kết hợp glucose vàfructose nguồn cacbon cần thiết; Nhiệt độ 25 - 30oC thích hợpnhất cho phát triển tế bào BY-2 tiến hành nuôi cấy điềukiện tối, lượng mẫu ban đầu đưa vào nuôi cấy theo tỷ lệ 1:20 sau 5ngàynicấy 3.1.2 TốiưuđiềukiệnnicấytếbàoBY2tronghệthốnglênmen5lítB i o f l o 1 Tiến hành tối ưu điều kiện nuôi cấy tế bào BY-2 bình lênmen Bioflo 110, kết luận điều kiện nuôi cấy: Tế bào BY-2 trải quaqtrìnhnhân giốnghaicấpsaochosốlượngtếbàobanđầuthíchhợp cần đạt 1200 mg sinh khối ướt/ml cấy vào bình lên menvới tỉ lệ 5%, tốc độ khuấy 120 rpm, nhiệt độ 27°C, tốc độ cung cấpkhí0,3 vvm, lượng dịch bình lên men4l í t T r o n g đ i ề u k i ệ n này,quá trình tăng sinh khốicủa tếbào BY-2tương đốidài, thờiđiểm ngày tế bào vào pha ổn định sinh khối có xu hướng tăngnhẹdầnđềuvàđạt1245mgsinhkhốiướt/mlvàongàythứ8saukhilênmen 3.1.3 Thiết kế vector virusTMVbiểu hiệnGP5 3.1.3.1.Thiếtkếvectorvirus TMVbiểuhiện GFP Nhằm đánh giá khả hoạt động hiệu sử dụng củavector dựa virus thực vật TMV biểu protein tái tổ hợp trongtếbàoBY-2,haicấutrúc vector TMV biểu GFP điềukhiển promoter cảm ứng nhiệt HSP promoter 35S thiếtkếtheo sơ đồ 3.5 Hình 3.5 Sơ đồ hóa q trình thiết kế cấu trúc vector pCB-35STMV-GFPvà pCB-HSP-TMV-GFP Ghichú:N o s t e r : n o p a l i n e s y n t h a s e t e r m i n a t o r ; N o s p r o : n o p alinesynthase promoter; nptII: neomycin phosphotransferase II; T35S: terminator đoạn trìnhtự 35S; 35S promoter: Promoter định 35S ; CmR:gen khángchloramphenicol;ccdB: gengây chết B; attR1, attR2, attL1, attL2: vị trí tái tổ hợp lai Gateway;RdRp:RNApolymerasephụthuộcRNAcủaTMV;MP:proteinmàng;GFP:proteinhuỳnh quang; 3’UTR: vùng không dịch mã đầu 3’; 5’UTR: vùng không dịch mã đầu5’; AtHSP18.2 promoter: promoter cảm ứng nhiệt 18.2 phân lập từ Arabidopsisthaliana 3.1.3.2 Đánh giá hiệu vector virus TMV biểu GFP trêntếbàoBY-2 HaicấutrúcvectorTMVbiểuhiệnGFPđượcchuyểnvàotếbào thuốcláBY-2thơngquavikhuẩnA.tumefaciensđểđánhgiáhiệuquảcủaviệcsửdụngpromoter cảmứngđặchiệuđểkiểmsốtbiểuhiệnprotein cấu trúc vector biểu dựa virus thực vậtTMV chuyển gen ổn định Kết cho thấy hiệu suấtchuyển gen có khác biệt lớn hai cấu trúc vector sử dụng Sốdòng tế bào chuyển gen mang cấu trúc pCB-HSP-TMV-GFPthuđược gấp khoảng 10 lần số dòng tế bào chuyển gen mang cấu trúcpCB-35STMV-GFP Có dịng tế bào chuyển cấu trúc pCB-35S-TMV-GFPcó khả sống sót mơi trường chọn lọc (Hình3.6) Ở điều kiện ni cấy ban đầu (27oC), dịng 35S-TMV biểuhiệnGFPởmứcđộthấp,cácdịngHSPTMVhầunhưkhơngbiểuhiện.Tuy nhiên, sau kích hoạt (+37oC), mức biểu GFP cácdịngHSP-TMVcaohơnhẳn,gấp5-9lầnmứcđộbiểuhiệnởcácdịng35S-GFPvà35STMV-GFP Hình 3.6.Hiệu quảchuyển gen vào BY-2 sử dụng cấu trúc vector.Ghichú:A:đĩađốichứng;B:đĩachuyểncấutrúcpCB-HSP-TMVGFPtrênmôitrườngchọnlọc;C:đĩachuyểncấutrúcpCB-35S-TMVGFPtrênmôitrườngchọnlọc 27°C -37oC A1 B1 +37oC A2 B2 Hình 3.7.Biểu GFP điều kiện ban đầu (A1, B1) sau ngày cảmứngnhiệtđộ37°C/2h(A2, B2) Ghichú:A:dịng tếbàopCB-35S-TMV-GFP;B:dịngtếbàopCB-HSP-TMV-GFP Hình 3.8.Mức độ biểu GFP dòng BY-2 chuyển cấu trúcGhi chú:35S:GFP: cấu trúc pCB-35S-GFP; 35S:TMV: cấu trúc pCB-35STMV-GFP;HSP:TMV: cấutrúcpCB-HSP-TMV-GFP 3.1.3.2 Đổi mãgenGP5 Căn vào kết phân lập gen mã hóa cho protein GP5 củachủngvirusđộcgâybệnhPRRSởViệtNa mnăm20092010,trìnhtựGP5của chủng 10HuYđăng ký ngân hàng genbank với sốKF523293) trình tự có mức tương đồng cao lựa chọnđể đổi mã phù hợp biểu thực vật, phục vụ thí nghiệm sảnxuất vaccinethực vật GP5-NcoI-cmyc-KDEL-TGA: ATGCTTGGGAAATGCCTTACCGCCTGTTGTTGTTCTAGACTTT TGTTTCTTTGGTGCATAGTCCCATTCTATCTTGCAGTTTTGGCTAA TGCCAGTAACTCAAATTCTTCACATATCCAACTTATCTACAATCT TACCCTTTGCGAACTTAATGGAACAGATTGGCTTGCACAGAAAT TTGATTGGGCAGTTGAGACTTTTGTGATCTTTCCTGTCCTTACACACATCGTCAGT TACGGTGCTCTTACTACATCTCACTTCCTTGATACAGTCGGACTT GCAACCGTTTCAACAGCTGGTTATTACCACGGTAGATACGTATTGTCT TCAATCTATGCTGTGTGCGCATTGGCTGCTTTGATTTGTTTTGTGATCAGACTTGCAAAG AACTGCATGTCATGGAGGTATTCATGTACAAGGTACACCAACTTTCTTTTGGATACCAA AGGCAGGTTGTATAGGTGGCGTTCTCCAGTGATTGTGGAGAAGGG CGGAAAAGTAGAAGTGGAAGGGCATCTTATAGATCTTAAAAGA GTGGTCTTGGATGGGTCAGCAGCAACACCTCTTACCAGAGTTTCAGCCGAGCAATGG GGTCGTCTTCCATGGGAACAGAAGCTTATATCTGAAGAAGACCTTA ATAAAGACGAACTCTGA Hình3.9.TrìnhtựgenGP5đãđổimã GenGP5gốc (KF523293) genGP5được thay đổi có độ tươngđồngnucleotidelà73,6%,cácvịtríthaykhơnglàmảnhhưởngđếntrìnhtựacida mincủaproteinGP5,trìnhtựacidaminsuydiễntừcácgenvẫnđạtđộtươngđồnglà100 %.NhằmmụcđíchkiểmtrasựbiểuhiệncủahệthốngquaphươngpháplaiWestern,trìnht ựđoạnDNAmãhóachoepitpopec-mycvàođầu3’củađoạnDNAtrên.Ngồira,16nucleotidmãhóacho4 aminoacid KDEcũng bổ sung vào để thuận tiệncho thí nghiệm nghiên cứu biểu đậu tương Đoạnnhântạocókíchthước654nucleotid 3.1.3.3 Thiếtkếmồi Bảng3.6.Trìnhtự cáccặpmồithiếtkế sử dụng TT Tênmồii Trìnhtựmồii attB1-TMV GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCA Mồi xi nhâni xuôi nhânđoạnnTMV GGCTGTATTTTTACAACAATTACC TMVrevRib Mồi xuôi nhâni ngược nhân đoạn TMV, trình c nhân đoạnn TMV, trình CGGACTCATCAGACCGGAAAGCACA tựinthường đoạn 3’UTR, trình tự inhoa đoạn đầu nglàđoạnn3’UTR,trìnhtựinhoalàđoạnnđầu u TCCGGTGACAGGGCTCcgaacccctcgct 5’của đoạnađoạnnribozyme ttattacgtg attB2-TMV Mồi xuôi nhâningược nhân đoạn TMV, trình c nhân đoạnn TMV, trình tự ggggaccactttgtacaagaaagctgggtGGACA inthường đoạn 3’UTR, trình tự inhoa đoạn đầu nglàtrìnhtựattB2,trìnhtựinhoal GTCCTGTTTCGTCCTCACGGACTCATC đoạnnđầu u 3’ đoạna đoạnn ribozyme, AGACCGGAAAGC có22 nucleotidelặp lại trình tự p lạni trình tự mồi xi nhâniTMVrevRib LTB-PacI GCTTAATTAAATGGCTCCACAATCC Mồi xi nhânixuôi nhânđoạnnLTB ATCACTG LTB-rev TCCCAAGCATCCCGGGGTTCTCCATG Mồi xuôi nhâningược nhân đoạn TMV, trình c nhânđoạnnLTB CTGA GP5-for CATGGAGAACCCCGGGATGCTTGGG Mồi xuôi nhânixuôi nhânđoạnnGP5 AAATG GP5-XhoI GCCTCGAGTCAATTAAGGTCTTCTT Mồi xuôi nhâningược nhân đoạn TMV, trình c nhânđoạnnGP5 CAG 5’Athsp GGTACCCCCGTCATTTCTTCTG P39 TCGACTAGAATAGTAAATTGTAATG Mồi xi nhâningược nhân đoạn TMV, trình cnhânđoạnnpromoter35S Mụccđích Mồi xi nhâni xi nhân đoạnn promoterHSP18.2 10 P70 GGAGAAGATCTTACCGTC Mồi xuôi nhâni xuôi hệ gen TMV vị gen đoạna TMV vị vị trínucleotide4962 11 P71 GGCACACCGTTTTCG Mồi xi nhâni ngược nhân đoạn TMV, trình c hệ gen TMV vị gen đoạna TMV vị vị trínucleotide1498 3.1.3.4 Thiết kếgenđađoạnLTB-GP5 Trongnghiêncứunày,đoạngenLTBsẽđượcnốivớiđoạngenGP5nhằm tăng cường đáp ứng miễn dịch qua đường miệng GP5 Đểtiến hành phản ứng nối, đoạn genGP5được nhân lên bằngcặp mồiGP5-for vàGP5-XhoI đoạnLTB309 bp) nhân lênbằng cặp mồiLTB-PacI vàLTB-rev Tiếp đó, đoạnGP5và đoạnLTBđượcghépnốivới nhaubằngphảnứngPCRsửdụngcặpmồiLTB-PacI vàGP5-XhoI Năm chu kỳ không bổ sung mồi để tạođiềukiệnchosựbắtc ặ p củahaigen LT B vàGP5 Kếtquả điệndi sảnphẩmPCRđãthuđượcđoạnnốiLTB-GP5cókíchthướcgần1kb, tươngứngkích thước tínhtốn lýthuyết Hình3.11.PCRkiểmtraphảnứngdịnghóađoạngenLTB-GP5vàovectorpBT Ghichú:M:Thang chuẩn DNA1kb;1-10:plasmid 1-10;(-):đốichứng âm 3.1.3.5 Thiết kếvectorchuyển genTMV biểuhiện GP5 * Nhân dònghệ gencủa TMV SửdụngbộbamồiattB1-TMV,TMVrevRibvàa t t B -TMV,nhân đoạn genome TMV kích thước gần 7kb từ vector30B-TMVbằng phảnứng LTPCR(ExpandLong TemplateP C R ) hai lần liên tiếp Đoạn TMV nhân có mang vị tríattB1vàattB2ở hai đầu 5’ 3’ lai vào vector pDONR201 bằngphản ứngBP * ThiếtkếvectorpDONR-TMV-GP5 HaivectorpBT-LTB-GP5vàpDONRTMVđãđượccùngcắtbởi2enzymeXhoIvàPacI.BộkhungvectorpDONRTMVcókíchthước9kbvàđoạngenLTBGP5kíchthướcgần1kbsaukhiđượctinhsạchtừgelagaroseđượcgắnlạivớinhaubằn genzymeT4ligase.VectortáitổhợpđượcnhânlêntrongtếbàoE.coliDH5-α *PháttriểnvectorpHSP-TMV-LTB-GP5vàpCB-35S-TMV-LTB-GP5 Vector chuyển gen pHSP-TMV-LTB-GP5được tạo thành thông quaphảnứngLRgiữavectorpDONR-TMV-LTB-GP5vàpCB-GWHSP TươngtựnhưthiếtkếvectorpHSP-TMV-LTB-GP5,vectorpCB-35S-TMVLTB-GP5được tạo thành thông qua phản ứng lai LR vectorpDONR-TMV-LTB-GP5vàpCB-GW35S Hình3.13.Bản đồvectorpCB-35S-TMV-LTB-GP5vàpHSP-TMV-LTB-GP5 Ghichú:Noster:nopalinesynthaseterminator;Nospro:nopalinesynthasepromoter; nptII: neomycin phosphotransferase II; T35S: terminator đoạn trìnhtự 35S; 35S promoter: Promoter định 35S ; RdRp: RNA polymerase phụ thuộcRNA TMV; MP: protein màng; 3’UTR: vùng không dịch mã đầu 3’; 5’UTR:vùng không dịch mã đầu 5’; AtHSP18.2 promoter: promoter cảm ứng nhiệt 18.2phân lậptừ Arabidopsis thaliana 3.1.4 Biếnnạp cấutrúc gen chuyểnvàotế bàothuốc BY-2 Hai cấu trúc vector chuyển gen pCB-35S-TMV-LTB-GP5(I) vàpHSPTMV-LTB-GP5(II)(Hình 3.13) tiến hành biến nạp vàotếbào thuốclá BY-2thơngqua vikhuẩnA.tumefaciens Các dịng tế bào BY-2 mang cấu trúc (I) phát triển thành cụm tếbào,kíchthướcnhỏhơnsovớicácdịngtếbàoBY-2mangcấutrúc (II) (5 - 10 dòng tế bào/1 đĩa với cấu trúc I, 15 - 25 dòng tế bào/1 đĩa với cấu trúc II) (Hình 3.14) Sau tuần chuyển sang mơi trường mới,85%dịngtế bàotiếptụcpháttriểntốttrongthínghiệmchuyểncấutrúcIInhưngchỉcó 33%dịngtế bàotiếp tục pháttriển ởcấu trúc I 3.1.5 Phân tích đánh giá biểu GP5 dòng tếbào BY-2 3.1.5.1 KiểmtrasựhiệndiệncủagenGP5trongcácdòngBY-2chuyểngen Tiến hành phản ứng PCR dựa cặp mồi đặc hiệuLTB-PacI/GP5XhoI với DNA khn tách từ dịng tế bào BY-2chuyển gen phát triển tốt môi trường chọn lọc sau cấy chuyểnsangmơitrườngmớilần1.ĐốichứngâmlàDNAbộgencủadịngtế bào BY-2 khơng chuyển gen (WT) Theo tính tốn, sản phẩm PCRsửdụngcặpmồitrênsẽcókíchthướcđạtgần1000bp(Hình3.15) Kết PCR cho thấy chúng tơi thu dịng tế bào BY2chuyểng e n S a u l ầ n c ấ y c h u y ể n t r ê n m ô i t r n g c h ọ n l ọ c , t ỉ l ệ s ốngsótcủacácdịngtếbàoBY-2chuyểncấutrúcvectorpHSP-TMV-LTB-GP5là 15%; đó, cấu trúc vector p35S-TMV-LTB-GP5là 5,6 % Các dịng tế bào có phản ứng PCR dương tínhtrong số dịng tế bào phát triển sau lần cấy chuyển khácao, 20 dòng tế bào (chiếm tỉ lệ 87%) mang cấu trúc HSPTMV-LTB-GP5đ n h s ố H S P - T M V - GP51-20) 14 dòng tế bào mangcấu trúc 35S-TMV-LTB-GP5(chiếm tỉ lệ 89%) đánh số 35STMV-GP51-14 Hình3.15.PCRkiểmtrasựcómặtcủagenGP5trongcácdịngtếbàoBY-2 Ghichú:A:cấutrúcHSP-TMV-LTB-GP5;B:cấutrúcpCB-35S-TMV-LTB-GP5 (-):đốichứngâm;M:ThangchuẩnDNA1kb;1-5:DịngtếbàoBY-2chuyểngen1-5 3.1.5.2 ĐánhgiámứcđộphiênmãcủagenchuyểnGP5bằngphươngphápr ealtime PCR Sử dụng phương pháp real time PCRqRT-PCR) để kiểm tra vàđánh giá mức độ biểu gen thông qua RNA Tiến hành phản ứngtổng hợp cDNA với RNA khn tách bảy dịng tế bào BY-2HSP-TMV-LTBGP5có phản ứng PCR dương tínhHSP-TMV-GP51-4;HSP-TMV-GP568);ba dịngtếbào BY-235S-TMV-LTB-GP5 có phản ứng PCR dương tính35S-TMV- GP5 5; 9; 11) dịng tếbào BY-2 khơng chuyển gen (WT) Phản ứng real-time PCR tiếnhành với mồi đặc hiệu genGP5và đối chứng mồi nhân gen actin.Kết quảđượctổnghợpởbảng3.8 Bảng3.8.Tổnghợp kếtquảqRT-PCRcủacácdòngBY-2 chuyểngen Mẫuu HSP-TMV-GP5(1) HSP-TMV-GP5(2) HSP-TMV-GP5(3) HSP-TMV-GP5(4) 35S-TMV-GP5(5) HSP-TMV-GP5(6) HSP-TMV-GP5(7) HSP-TMV-GP5(8) 35S-TMV-GP5(9) 35S-TMV-GP5(11) WT Ctmean 22,92 25,13 29,12 27,24 34,8 26,2 26,42 27,14 29,14 30,79 Ct(gen)Ct(actin) 0,03 2,06 0,76 3,05 10,52 2,13 3,16 2,78 5,82 7,32 ∆CT1-∆CTi 2-∆∆CT1i -2,03 -0,73 -3,02 -10,49 -2,1 -3,13 -2,75 -5,79 -7,29 4,084 1,658 8,111 1438,151 4,287 6,727 8,754 55,33 156,497 Kết Bảng 3.8 cho thấy, dòng tế bào BY-2 HSP-TMV-GP5(1)cóbiểu hiệnmứcđộphiênmãlàcaonhất.TiếptheolàdịngHSP-TMV-GP5(3), thấp dịng 35S-TMV-GP5(5) (bằng 1/1438mứcđộbiểuhiệncủadịngGP5-1).Nhómbiểuhiệncaotậptrung làcác dòng tế bào BY-2 chuyển genGP5điều khiển promoterđiều khiển nhiệt HSP18.2, dòng BY-2 chuyển gen điều khiểnbằngpromoter35S,đều cóbiểu hiệnthấp 3.1.6 Đánhgiásơbộtínhsinh miễndịchcủaGP5tr ênđộngvật t hínghiệm Dịng tế bào BY-2 HSP-TMV-GP5 (1), có mức độ biểu GP5caonhất,đượctiếnhànhnilỏngtrongbìnhlênmenBioFlo1105líttrongđiềukiệnđ ãtốiưuhóađểthusinhkhốichothínghiệmđánhgiátínhsinhmiễndịchcủaproteintáitổh ợpGP5trênlợn.Trướckhitiếnhànhthusinhkhối,dịngtếbàoBY-2nàyđượcnitrongđiềukiệncảm ứng nhiệt độ 37oC Để xác định nồng độ khángnguncầnthiếtchothínghiệmtrênđộngvật,proteintổngsốcủadịngtếbàoB Y-2HSP-TMV-GP51)đượctáchchiết.Tiếpđó,tiếnhànhtinhsạch GP5 dựa vào C-myc Nồng độ GP5 đo theo phương phápsomàucủaBradford.NồngđộcủaGP5thuđượcđạt408mg/kgtếbàokhơtươngđươn g3,4%proteinhịatantổngsố(tổnglượngproteinhịatan12mg/gtếbào) Để đánh giá tính sinh miễn dịch protein tái tổ hợp GP5 củavirus PRRS tế bào BY-2, nhóm lợn thử nghiệm ăntrực tiếp dịng tế bào BY-2 chuyển gen, làm khô nhiệt độ65oCv i n n g đ ộ m g G P , t n g ứ n g v i g t ế b o H u y ế t th anhđượcthunhậnhàngtuầnđểtiếnhànhphântíchbằngELISA,IPMAvà Westernblot Bằng phương pháp Western blot, sử dụng huyết lợnđược cho ăn với tếb o c h u y ể n g e n l m k h n g t h ể t h ứ n h ấ t , chúngtơiđ ã phát hiệ nđượcsựcómặtc ủakhá ng thểtừởnồng độ pha lỗng 1/20 (Hình 3.16) Điều cho thấy lợn ăn tế bào BY2chuyểngenchứaproteintáitổhợpGP5đãsảns i n h k h n g t h ể khánglạiprot einGP5 Hình 3.16.Western blot protein GP5 tách từ dòng BY-2 HSP-TMVGP5(1)Ghi chú:Giếng 1-6: tương ứng vớiđộ pha loãng huyết 1/100;1/50; 1/40;1/20;1/10;1/5 Huyết lợn thí nghiệm thu nhận tiếp tục đánh giábằngphươngphápEISA.ThínghiệmsửdụngkitIDEXXPRRSx3 Switzerland AGREF 99-40959 tiến hành theo quy trìnhhướngdẫncủahãng.Kếtquảchothấyhuyếtthanhcủalợnt h í nghiệmchoăntếbào chuyểngen,tếbàokhơngchuyểngenvàthứcăn bình thườngđềucó chỉsố S/P âmtính Đánh giá phản ứng sinh miễn dịch phương pháp IPMA Thínghiệm tiến hành dịng tế bào MARC 145, lây nhiễm virusPRRS 01796, pha loãng virus PRRS liều 500TCID 50/1ml Tương tựELISA, kết IPMA thực xét nghiệm mẫu huyết 4lầnl ấ y m ẫ u t r ê n l ợ n t h í n g h i ệ m c h o t h ấ y t r o n g c c m ẫ u h u y ế t kiểm tra khơng có mẫu có hình thái tế bào đặc trưng củaphản ứng dương tính tức khơng có mẫu dương tính với phảnứngIPMA Kết sựkhác biệt độ nhạy phương phápWestern blot với phương pháp khác Yếu tố chủ yếu địnhsự thành cơng q trình Western blot chất địnhkháng nguyên nhận kháng thể Kỹ thuật điện di gelbao gồm trình làm cấu trúc bậc cao mẫu kháng nguyên,vì có kháng thể nhận diện định kháng nguyênchống chịu trình duỗi cấu trúc bám vào khángnguyên Tiến hành đánh giá phương pháp E ISA, bước đầu kếtquảthuđượclàâmtính.Điềunàycóthểdocácepitopegiúpnhậnbiếttrong E ISA chưa bắt cặp Trong xét nghiệm ELISA, kháng thểbắttrênpharắnvàkhángthểpháthiệncóthểchốnglạinhữngepitopekhác phức hợpkhángnguyên.Dođó,khicósựkhácbiệtnhỏ kháng nguyên sử dụng với kháng thể phát kháng thểbắtkhácnhau.CóthểcósựkhácbiệtgiữacấutrúcGP5chủngvirusPRRS sử dụng cấu trúc biểu với kit kháng thể thương mại(IDEXXPRRSx3củaSwitzerlandAGR E F 99-40959)củachúngtôisử dụng Nhiều nghiêncứucũngđãchỉrakíchthướcvàmốiquanhệkhơng gian epitope kháng ngun đích quan trọngvàcóthểảnhhưởngmạnhđếnkếtquảthửnghiệm(JohnR,2009).Thínghiệmđánhgiá miễn dịch phương pháp IPMA chưa thuđược mẫu có kết dương tính Điều tương tựnhư phương pháp E ISA Trong phương pháp này, tiến hành lâynhiễm virus PRRS 01796 Điều phần ảnh hưởng đếntính đặchiệu củap h ả n ứ n g , c c e p i t o p e b ắ t c ặ p t r o n g p h ả n ứ n g IPMAchưa đặc hiệu, đóchưathu kếtquảdươngtính 3.2 NGHIÊNCỨUBIỂUHIỆNGP5TRONGHẠTĐẬUTƢƠNG 3.2.1 Chọnlọcgiống đậutương thíchhợpchochuyển gen Nghiêncứulựachọn5giốngđ ậ u t n g V i ệ t N a m Đ T , ĐT22,Đ T26,ĐT51v D T để đánhgiákhả t i s i n h đ a chồiin vitrot n c h lámầm nhằm chọn đ ợ c g i ố n g c ó k h ả n ă n g tái sinh đa chồi cao phục vụ chuyển gen Kết đánh giá so sánhđượcthểhiệntrongBảng3.11 Bảng3.11.ẢnhhưởngcủaBAPđếnkhảnăngtáisinhđachồicủacácgiốngđậutương BAP (mg/l) Giốngng Tỉ lệ mẫu tái lệ mẫu tái mẫuu tái sinh(%) Tỉ lệ mẫu tái lệ mẫu tái mẫuu tạo đa o đa chồii(%) Sống chồii/Mẫuu ĐT12 100±0,0 0,0±0,0 1,0±0,0aA ĐT22 100±0,0 0,0±0,0 1,0±0,0aA ĐT26 100±0,0 0,0±0,0 1,0±0,0aA ĐT51 100±0,0 0,0±0,0 1,0±0,0aA DT84 100±0,0 0,0±0,0 1,0±0,0aA ĐT12 85,0±8,7 50±5,0 1,8±0,7bcA ĐT22 93,3±2,9 76,7±7,6 2,4±0,9bcB ĐT26 90,0±5,0 76,7±2,9 2,3±0,9bBC 0,5 ĐT51 60,0±5,0 46,7±2,9 2,0±0,7bABC DT84 81,7±10,4 71,7±7,6 2,2±0,6bABC ĐT12 86,7±2,9 81,7±2,9 2,3±0,6bcA ĐT22 85,0±5,0 85,0±5,0 2,8±0,8bcB ĐT26 98,3±1,04 98,3±1,04 3,0±1,0c BC 1,0 ĐT51 78,3±15,3 70,0±8,7 2,3±0,7bAD DT84 98,3±2,9 96,7±2,9 3,3±0,6cCE ĐT12 88,3±5,8 86,7±2,9 4,1±1,4defA ĐT22 83,3±5,8 83,3±5,8 3,7±1,1d A dfA ĐT26 98,3±2,9 96,7±2,9 3,8±1,1 1,5 ĐT51 88,3±2,9 88,3±2,9 3,5±1,1cdeA DT84 96,7±5,8d,e 96,7±5,8 3,9±0,7deA ĐT12 95,0±5,0 93,3±5,8 4,2±1,5deA ĐT22 91,7±7,6 91,7±7,6 4,6±1,1eB ĐT26 100±0,0 100±0,0 4,8±1,0eB 2,0 ĐT51 88,3±10,4 88,3±10,4 3,9±0,9cdeA DT84 96,7±5,8 96,7±5,8 4,1±1,0efA ĐT12 78,3±2,9 78,3±2,9 3,5±1,0dfA ĐT22 63,3±2,9 63,3±2,9 3,6±1,0fA dfA ĐT26 91,7±2,9 91,7±2,9 3,6±1,2 3,0 ĐT51 73,3±1,04 73,3±1,04 3,7±1,2cdeA DT84 66,7±7,6 65,0±5,0 4,5±1,7fB Ghi chú:Số liệu biểu diễn kết lần lặp lại giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn,các chữ khác thể cho khác biệt có ý nghĩa (P