Nghiên cứu chọn chủng virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (prrsv) tại việt nam để làm nguồn sản xuất vacxin nhược độc

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM CAO THỊ BÍCH PHƯỢNG NGHIÊN CỨU CHỌN CHỦNG VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN (PRRSV) TẠI VIỆT NAM ĐỂ LÀM NGUỒN SẢN XUẤT VACXIN NHƯỢC ĐỘC Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Bá Hiên NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan rằng: - Đây cơng trình nghiên cứu riêng - Các kết nghiên cứu luận văn trung thực, khách quan chưa sử dụng để bảo vệ học vị - Mọi giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Cao Thị Bích Phƣợng i LỜI CẢM ƠN Trong suốt năm học tập hoàn thành luận văn, ngồi sựnỗ lực thân, tơi nhận giúp đỡ, hướng dẫn tận tình nhiều cá nhân tập thể, cho phép tỏ lòng biết ơn cảm ơn chân thành tới: Ban Giám đốc Học Viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban quản lý đào tạo, Ban Chủ nhiệm Khoa Thú Y, thầy cô giáo khoa Thú y, môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm giúp đỡ, tạo điều kiện để tơi học tập, thực hồn thành luận văn Đặc biệt tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới thầy hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Bá Hiên tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân bạn bè đồng nghiệp động viên giúp đỡ tơi vượt qua khó khăn suốt trình học tập, nghiên cứu thực đề tài Một lần nữa, xin bày tỏ lòng biết ơn lời cảm ơn chân thành tới tập thể, cá nhân tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành chương trình học tập Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Cao Thị Bích Phƣợng ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh sách chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Trích yếu luận văn ix Thesis abtract x Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp (PRRS) 2.1.1 Tình hình nghiên cứu nước ngồi 2.1.2 Tình hình nghiên cứu nước 2.1.3 Đặc điểm dịch tễ học 2.1.4 Triệu chứng bệnh 10 2.1.5 Bệnh tích 11 2.1.6 Chẩn đốn lâm sàng 12 2.1.7 Chẩn đốn phi lâm sàng 12 2.1.8 Phịng bệnh 13 2.1.9 Điều trị 14 2.2 Tác nhân gây bệnh 14 2.2.1 Phân loại 14 2.2.2 Hình thái học 15 2.2.3 Cấu trúc 16 2.2.4 Đặc điểm nuôi cấy 18 2.2.5 Sức đề kháng 18 Phần Vật liệu phƣơng pháp nghiên cứu 3.1 Thời gian địa điểm 19 19 iii 3.2 Đối tượng nghiên cứu 19 3.3 Nội dung nghiên cứu 19 3.4 Vật liệu nghiên cứu 19 3.4.1 Sinh phẩm, hóa chất dùng cho tách chiết RNA 19 3.4.2 Cặp mồi kit PCR 19 3.4.3 Hoá chất thực phản ứng huyết học 20 3.4.4 Tế bào, hóa chất dùng cho ni cấy tế bào phân lập virus 20 3.4.5 Lợn thí nghiệm 20 3.5 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 20 3.5.1 Dụng cụ 20 3.5.2 Trang thiết bị 21 3.6 Phương pháp nghiên cứu 21 3.6.1 Phương pháp tách chiết RNA 21 3.6.2 Phản ứng RT-PCR 22 3.6.3 Chạy điện di kiểm tra có mặt virus PRRS 23 3.6.4 Phương pháp phân lập virus PRRS tế bào 23 3.6.5 Nghiên cứu tính thích ứng PRRSV tế bào Marc-145 24 3.6.6 Phương pháp xác định hiệu giá virus môi trường tế bào 24 3.6.7 Phương pháp phát kháng thể kháng PRRS 26 3.6.8 Phương pháp gây miễn dịch cho động vật thí nghiệm 27 3.6.9 Phương pháp giải trình tự gen 28 3.6.10 Phương pháp xử lý số liệu 29 Phần Kết thảo luận 29 4.1 Kết thu thập mẫu triệu chứng bệnh tích 4.2 Khả gây bệnh tích môi trường tế bào MARC-145 chủng VIRUS KTY-PRRS-06 4.3 33 Kết so sánh khả gây bệnh tích tế bào chủng VIRUS KTYPRRS-06 cường độc sau cấy truyền qua 90 đời 4.4 35 Kết xác định hiệu giá Virus (TCID50) chủng VIRUS KTYPRRS-06 qua 90 đời cấy truyền 4.5 30 36 Kết xác định quy luật nhân lên chủng VIRUS KTY-PRRS-06 qua 90 đời cấy truyền 37 iv 4.6 Kiểm tra ổn định di truyền đời VIRUS KTY-PRRS-06 4.6.1 Kết so sánh tương đồng nucleotide gen ORF5 chủng virus KTY-PRRS-06 đời cấy truyền khác 4.6.2 4.7.2 47 Kết xác định khả nhược độc hoá VIRUS KTY-PRRS-06 sau 90 đời cấy truyền 4.7.1 41 Kết so sánh tương đồng axit amin gen ORF5 chủng virus KTY-PRRS-06 qua đời cấy truyền khác 4.7 40 51 Kết đo thân nhiệt lợn sau gây nhiễm virus KTY-PRRS-06 sau 90 đời cấy truyền 51 Kết nghiên cứu đáp ứng miễn dịch lợn phản ứng ELISA 51 Phần Kết luận đề nghị 53 5.1 Kết luận 54 5.2 Đề nghị 54 Tài liệu tham khảo 55 v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ đầy đủ µl Microlit cDNA Complement Deoxynucleotide Acid CPE Cytophathogenic Effect CRFK Crandall Rees Feline Kidney ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay FA Flourescent Antibody Staining FBS Fetal Bovine Serum IFA Indirect Flourescent Assay IHC Immunohistochemistry staining IPMA Immuno Peroxidase Monolayer Assay MOI Multiplicity Of Infection MSD Mystery Swine Disease ORF Open Reading Frame PAM Porcine Alveolar Macrophage PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus RNA Ribonucleotide Acid RT-nPCR Reverse Transcription-nested PCR SN Serum Neutralizing TBE Tris Borate EDTA α MEM α Minimum Essential Medium Eagle α MEM α Minimum Essential Medium Eagle vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Chức ORF virus PRRS 17 Bảng 3.1 Trình tự cặp mồi 20 Bảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR phát PRRS 23 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR 28 Bảng 3.4 Chu trình PCR giải trình tự 29 Bảng 4.1 Khả gây bệnh tích tế bào chủng virus KTY-PRRS-06 phân lập 33 Bảng 4.2 Khả gây bệnh tích qua 90 đời cấy truyền chủngKTYPRRS-06 35 Bảng 4.3 Kết xác định hiệu giá virus KTY-PRRS-06 phân lập qua 90 đời cấy truyền 36 Bảng 4.4 Vị trí sai khác nucleotide chủng KTY-PRRS-06 sau đời cấy truyền khác tế bào Marc-145 44 Bảng 4.5 So sánh tương đồng nucleotide đoạn gene ORF5 chủng KTYPRRS-06 46 Bảng 4.6 Vị trí sai khác amino acid chủng KTY-PRRS-06 sau đời cấy chu chuyển khác tế bào Marc-145 49 Bảng 4.7 So sánh tương đồng axit amin đoạn gene ORF5 chủng KTYPRRS-06 50 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Dịch PRRS Việt Nam – 2007 Hình 2.2 Hình ảnh xâm nhiễm phá huỷ đại thực bào PRRSV Hình 2.3 Hình thái virus PRRS 15 Hình 2.4 Cấu trúc hệ gen virus PRRS 16 Hình 4.1 Một số biểu lâm sàng lợn mắc PRRS 30 Hình 4.2 Biến đổi bệnh tích đại thể lợn nghi mắc PRRS 31 Hình 4.3 Biến đổi bệnh tích vi thể lợn mắc PRRS 32 Hình 4.4 Kết RT-PCR với cặp mồi N22-N24 (349 bp) 33 Hình 4.5 Khả gây bệnh tích tế bào chủng KTY-PRRS-06 môi trường Marc-145 sau thời gian gây nhiễm 34 Hình 4.6 Đường cong sinh trưởng chủng virus KTY-PRRS-06 qua đời cấy truyền 38 Hình 4.7 Kết phản ứng RT-PCR với mồi Go3F Go5R (720bp) 40 Hình 4.8 Kết so sánh trình tự gen chủng KTY-PRRS-06 44 Hình 4.9 Kết so sánh trinh tự amino acid chủng KTY-PRRS-06 nghiên cứu 48 Hình 4.10.Thân nhiệt lợn sau tiêm virus KTY-PRRS-06 P#90 51 Hình 4.11.Biến động hiệu giá kháng thể lợn sau gây nhiễm với chủng KTY – PRRS-06 P#90 52 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tác giả:Cao Thị Bích Phượng Tên luận văn: Nghiên cứu chọn chủng virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (PRRSV) Việt Nam để làm nguồn sản xuất vacxin nhược độc Chuyên ngành : Thú y Mã số : 60 64 01 01 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam NỘI DUNG Mục đích Tạo chủng virus nhược độc có tính kháng ngunvà ổn định để sản xuất vacxin phịng hội chứng rối loạn sinh sản hơ hấp lợn Phƣơng pháp - Phương pháp tách chiết RNA - Phản ứng RT-PCR - Chạy điện di kiểm tra có mặt virus PRRS - Phương pháp phân lập virus PRRS tế bào - Nghiên cứu tính thích ứng PRRSV tế bào Marc-145 - Phương pháp xác định hiệu giá virus môi trường tế bào - Phương pháp phát kháng thể kháng PRRS - Phương pháp gây miễn dịch cho động vật thí nghiệm - Phương pháp giải trình tự gen - Phương pháp xử lý số liệu Kết kết luận đề tài - Khả gây bệnh tích tế bào chủng virus KTY-PRRS-06 nhanh, mạnh ổn định qua 90 đời cấy truyền, bệnh tích tế bào xuất sớm sau 24 gây nhiễm Đến thời điểm 72 sau gây nhiễm, toàn tế bào bị phá huỷ bong tróc khỏi đáy chai ni cấy - Hiệu giá virus (TCID50/25l) có xu hướng tăng ổn định từ đời cấy truyền 50 - Đường cong sinh trưởng KTY-PRRS-06 qua đời cấy truyền khác có khác biệt, ổn định từ đời 50 đến 90 - Đã giải trình tự gen ORF5 chủng KTY-PRRS-06 đời cấy truyền khác Kết phân tích trình tự nucleotide axit amin cho thấy chủng virus KTYPRRS-06 có ổn định di truyền kháng nguyên sau 90 đời cấy truyền với mức độ tương đồng cao từ 98.44% đến 100% nucleotide từ 97.33% đến 100% axit amin - Ở đời cấy truyền thứ 90, chủng virus KTY-PRRS-06 nhược độc lựa chọn chủng virus để sản xuất vacxin nhược độc phòng PRRS ix Hình 4.8 K EQ Hình_4 \* ARABIC nghiên cứu, ch ng tơi Bảng 4.4 Vị trí sai khác nucleotide chủng KTY-PRRS-06 sau đời cấy truyền khác tế bào Marc-145 KTY-PRRS06 Vị trí sai khác 97 135 168 177 195 297 351 456 488 497 519 587 P#1 A A G A G C G T A G G T P#10 A A G A G C G T A G G T P#20 A A G A G C G T A G G T P#30 A A A A G C A C C A C A P#40 A A G A T T G C A A G T P#50 G A G T G C G C A A G T P#60 G G G T G C G C A A G T P#70 G G G T G C G C A A G T P#80 G G G T G C G C A A G T P#90 G G G T G C G C A A G T Qua hình 4.8và bảng 4.4, chúng tơi nhận thấy mức độ tương đồng chủng KTY-PRRS-06 qua đời cấy truyển cao với có 12 điểm sai khác, 44 vị trí 97, 135, 168,177, 195, 297, 351, 456, 488, 497, 519 587 Có thể thấy chủng virus KTY-PRRS-06 ổn định từ đời 50 đến 90 45 Bảng 4.5 So sánh tƣơng đồng nucleotide đoạn gene ORF5 chủng KTY-PRRS-06 Chủng ATCCVR2332 KTY-PRRS-06 Lelystad JXA1 P0 P10 P20 P30 P40 P50 P60 P70 P80 P90 ATCCVR2332_ORF5 100.00 Lelystad_ORF5 30.91 100.00 JXA1_ORF5 86.69 27.36 100.00 KTY-PRRS-06-P1 86.72 27.96 99.32 100.00 KTY-PRRS-06-P10 86.17 27.36 99.66 98.97 100.00 KTY-PRRS-06-P20 86.17 27.36 99.66 98.97 100.00 100.00 KTY-PRRS-06-P30 86.17 27.36 99.66 98.97 100.00 100.00 100.00 KTY-PRRS-06-P40 86.46 27.17 99.14 98.44 98.80 98.80 98.80 100.00 KTY-PRRS-06-P50 86.46 25.94 99.49 99.14 99.14 99.14 99.14 98.62 100.00 KTY-PRRS-06-P60 86.72 27.96 99.32 99.44 98.97 98.97 98.97 98.44 99.14 100.00 KTY-PRRS-06-P70 86.72 27.96 99.32 99.14 98.97 98.97 98.97 98.44 99.14 100.00 100.00 KTY-PRRS-06-P80 86.72 27.96 99.32 99.32 98.97 98.97 98.97 98.44 99.14 100.00 100.00 100.00 KTY-PRRS-06-P90 86.72 27.96 99.32 99.14 98.97 98.97 98.97 98.44 99.14 100.00 100.00 100.00 100.00 46 Cũng giống virus RNA khác, virus PRRS có khả biến chủng cao Mỗi biến chủng có “dấu ấn” kháng nguyên riêng GP5 (glycoprotein) protein vỏ capsid virus PRRS, mã hóa gen ORF5 GP5 cho protein cấu trúc hay biến đổi có liên quan đến độc lực virus, biến đổi GP5 dẫn đến xuất biến chủng virus PRRS (Y Feng et al., 2008) Vì nghiên cứu dịch tễ học phân tử virus PRRS thường tập trung vào gen ORF5 (C Wang et al., 2008, L Zhu et al., 2011) Trong nghiên cứu này, gen ORF5 virus KTY-PRRS-06 giải trình tự, phân tích so sánh với chủng virus PRRS tham chiếu khác Qua bảng hình cho thấy chủng KTY-PRRS-06 qua đời cấy truyền có tương đồng với chủng Bắc Mỹ (ATCC-VR2332-ORF5) chiếm tỉ lệ từ 86,17% đến 86,72% KTY-PRRS-06 qua đời cấy truyền có tương đồng thấp với chủng châu Âu (Lelystad_ORF5) với tỉ lệ tương đồng từ 25,94% đến 27,96% Đặc biệt với tỉ lệ tương đồng cao từ 99,14% đến 99,66%, thấy KTY-PRRS-06 có quan hệ gần gũi với chủng vacxin độc lực cao JXA1_ORF5 Trung Quốc Qua đời cấy truyền tỷ lệ tương đồng (%) trình tự gen ORF5 chủng KTY-PRRS-06 ổn định, từ 98,44% đến 100% 4.6.2 Kết so sánh tƣơng đồng axit amin gen ORF5 chủng virus KTY-PRRS-06 qua đời cấy truyền khác Từ trình tự nucleotide đoạn gen ORF5 thu được, tiến hành xác định trình tự axit amin chuỗi gene dựa phần mềm Bio Edit Version 7.2.5, so sánh sai khác thành phần axit amin chủng virus KTY-PRRS-06 nghiên cứu đời cấy truyền khác (đời thứ 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 90) 47 Hình 4.9 Kết so sánh trinh tự amino acid chủng KTY-PRRS-06 nghiên cứu 48 Bảng 4.6 Vị trí sai khác amino acid chủng KTY-PRRS-06 sau đời cấy chu chuyển khác tế bào Marc-145 KTY-PRRS-06 Vị trí sai khác 33 59 65 99 163 164 166 196 P#1 N K E A K G R L P#10 N K E A K G R L P#20 N K E A K G R L P#30 N K E A T G K Q P#40 N K D V K G K L P#50 D N E A K R K L P#60 D N E A K R K L P#70 D N E A K R K L P#80 D N E A K R K L P#90 D N E A K R K L Qua kết so sánh hình 4.5 bảng 4.6cho thấy gen ORF5 chủng KTY-PRRS-06 phân lập mã hóa capsid protein gồm 201 axit amin Qua lần chuyển tiếp đời, tiến hành giải trình tự khơng phát thay đổi lớn trình tự axit amin đời nghiên cứu Trình tự axit amin chủng KTY-PRRS06 có sai khác, 33, 59, 65, 99, 163, 164, 166 196 Những kết nghiên cứu cho thấy chủng KTY-PRRS-06 có tính ổn định di truyền đời khảo sát, đặc biệt từ đời cấy truyền 50 đến 90 49 Bảng 4.7 So sánh tƣơng đồng axit amin đoạn gene ORF5 chủng KTY-PRRS-06 KTY-PRRS-06 Chủng ATCC-VR2332 Lelystad JXA1 P0 P10 P20 P30 P40 P50 P60 P70 P80 P90 ATCC-VR2332_ORF5 100.00 Lelystad_ORF5 41.10 100.00 JXA1_ORF5 87.14 41.70 100.00 KTY-PRRS-06-P0 86.58 41.67 98.40 100.00 KTY-PRRS-06-P10 86.56 40.92 99.47 97.87 100.00 KTY-PRRS-06-P20 86.56 40.92 99.47 97.87 100.00 100.00 KTY-PRRS-06-P30 86.56 40.92 99.47 97.87 100.00 100.00 100.00 KTY-PRRS-06-P40 87.15 41.79 98.93 97.33 98.40 98.40 98.40 100.00 KTY-PRRS-06-P50 86.58 40.40 98.40 97.87 97.87 97.87 97.87 97.33 100.00 KTY-PRRS-06-P60 86.58 41.67 98.40 97.33 97.87 97.87 97.87 97.33 97.87 100.00 KTY-PRRS-06-P70 86.58 41.67 98.40 97.47 97.87 97.87 97.87 97.33 97.87 100.00 100.00 KTY-PRRS-06-P80 86.58 41.67 98.40 97.33 97.87 97.87 97.87 97.33 97.87 100.00 100.00 100.00 KTY-PRRS-06-P90 86.58 41.67 98.40 97.47 97.87 97.87 97.87 97.33 97.87 100.00 100.00 100.00 100.00 50 4.7 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG NHƢỢC ĐỘC HOÁ CỦA VIRUS KTY-PRRS-06 SAU 90 ĐỜI CẤY TRUYỀN 4.7.1 Kết đo thân nhiệt lợn sau gây nhiễm virus KTYPRRS-06 sau 90 đời cấy truyền Một chủng virus lựa chọn làm giống sản xuất vacxin nhược độc cần phải có tính sinh miễn dịch độc lực virus thấp nghĩa không gây phản ứng bệnh lý bất thường tiêm vào thể động vật Toàn lợn trước gây miễn dịch sàng lọc phản ứng PCR ELISA để phát cá thể dương tính với PRRS có kháng thể kháng PRRS Các xét nghiệm cho thấy kết âm tính Như vậy, tồn lợn đạt tiêu chuẩn thí nghiệm Tiến hành theo dõi biểu lâm sàng lợn nhằm đánh giá ảnh hưởng virus đến khả sinh trưởng, phát triển lợn hay mức độ an toàn virus đủ điều kiện lựa chọn để làm giống sản xuất vacxin nhược độc Nếu virus nhược độc, lợn thí nghiệm khơng có phản ứng sốt Trong suốt trình theo dõi này, không phát dấu hiệu bất thường lợn thí nghiệm vị trí tiêm phản ứng tồn thân Kết chứng tỏ tính an tồn chủng virus KTY-PRRS-06 sau 90 đời cấy truyền Thân nhiệt lợn thí nghiệm mơ tả hình 4.10 41 40 Nhiệt độ (oC) 39 38 37 36 35 34 33 10 11 Ngày Hình 4.10 Thân nhiệt lợn sau tiêm virus KTY-PRRS-06 P#90 51 Toàn lợn thí nghiệm theo dõi thân nhiệt hàng ngày sau tiêm đến ngày thứ 11 Kết theo dõi trình bày hình 4.10 cho thấy thân nhiệt trung bình lợn thí nghiệm dao động khoảng từ 37,90C đến 39,30C đảm bảo nằm phạm vi sinh lý bình thường Lợn khơng có biểu sốt, hoạt động sinh lý khác không thay đổi Như vậy, chủng KTYPRRS-06 sau 90 đời cấy truyền chọn an tồn, khơng gây sốc q trình tiêm, khơng gây phản ứng sau tiêm 4.7.2 Kết nghiên cứu đáp ứng miễn dịch lợn phản ứng ELISA Song song với việc theo dõi thân nhiệt lợn thí nghiệm, thực phản ứng ELISA với mẫu huyết gây nhiễm chủng KTYPRRS-06 P#90 Để đánh giá hàm lượng kháng thể, định kỳ lấy máu vào ngày 3, 5, 7, 9, 11, 21, 28, 35, 42 tháng sau gây nhiễm virus với lợn thí nghiệm Kết trình bày hình 4.11 S/N 1,2 0,8 0,6 0,4 0,2 D0 D3 D5 D7 D9 D14 D21 D28 D35 D42 D49 D56 D63 D70 D77 D84 D91 Đ.c KTY-PRRS-06 P#90 Hình 4.11 Biến động hiệu giá kháng thể lợn sau gây nhiễm với chủng KTY –PRRS-06 P#90 Kết cho thấy với giá trị ngưỡng dương tính/âm tính 0,4 Tại thời điểm ngày sau gây nhiễm, mẫu xét nghiệm âm tính huyết học với kháng thể kháng PRRS Ở mẫu đối chứng (không tiêm virus KTY-PRRS-06) tất thời điểm xét nghiệm cho kết âm tính 52 huyết học với kháng thể kháng PRRS (S/N0.4 Kết cho thấy tượng chuyển dương tính huyết học lợn thí nghiệm diễn khoảng - ngày kể từ thời điểm gây miễn dịch Giá trị S/N tăng dần, đạtcực đại khoảng 28 – 35 ngày sau gây nhiễm với giá trị S/N > Sau giá trị ổn định độ dài miễn dịch 90 ngày (thời điểm dừng thí nghiệm) Kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu Nguyễn Thị Lan cs., 2012 cho biết sau thời điểm tiêm virus ngày bắt đầu phát kháng thể đặc hiệu kháng PRRS tượng chuyển dương tính xảy đến 14 ngày sau gây miễn dịch lợn chủng virus PRRS Kết nghiên cứu cho thấy chủng virus KTY-PRRS-06 P#90 có khả kích thích động vật sản sinh đáp ứng miễn dịch đặc hiệu Như vậy, KTY-PRRS-06 P#90 đạt tiêu ổn định tính kháng nguyên chủng virus vacxin nhược độc 53 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Khả gây bệnh tích tế bào chủng virus KTY-PRRS-06 nhanh, mạnh ổn định qua 90 đời cấy truyền, bệnh tích tế bào xuất sớm sau 24 gây nhiễm Đến thời điểm 72 sau gây nhiễm, toàn tế bào bị phá huỷ bong tróc khỏi đáy chai ni cấy Hiệu giá virus (TCID50/25l) có xu hướng tăng ổn định từ đời cấy truyền 50 Đường cong sinh trưởng KTY-PRRS-06 qua đời cấy truyền khác có khác biệt, ổn định từ đời 50 đến 90 Đã giải trình tự gen ORF5 chủng KTY-PRRS-06 đời cấy truyền khác Kết phân tích trình tự nucleotide axit amin cho thấy chủng virus KTY-PRRS-06 có ổn định di truyền kháng nguyên sau 90 đời cấy truyền với mức độ tương đồng cao từ 98.44% đến 100% nucleotide từ 97.33% đến 100% axit amin Ở đời cấy truyền thứ 90, chủng virus KTY-PRRS-06 nhược độc lựa chọn chủng virus để sản xuất vacxin nhược độc phòng PRRS 5.2 ĐỀ NGHỊ Nghiên cứu xây dựng quy trình bảo quản sử dụng giống virus PRRS tuyển chọn để sản xuất vacxin nhược độc phòng PRRS 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Bùi Quang Anh Nguyễn Văn Long, (2007) Một số đặc điểm dịch tễ Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (bệnh tai xanh) tình hình dịch Việt Nam Diễn đàn khuyến nông công nghệ - Bộ Nông Nghiệp phát triển Nông thôn, tháng 8/2007 Cục Thú Y (2007) Báo cáo Hội thảo khoa học phịng chống hội chứng Rối loạn hơ hấp sinh sản lợn, ngày 21 tháng năm 2008, Hà Nội Đậu Ngọc Hào, Văn Đăng Kỳ, Nguyễn Văn Long Tiêu Quang An, (2008) Một số đặc điểm dịch tễ hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp (PRRS) lợn từ cuối tháng đến đầu tháng 7/2008 số tỉnh nước Khoa học Kỹ thuật Thú y tập XV, số 5/2008, tr 14 – 20 Lê Thanh Hoà, (2002) Bài giảng Sinh học phân tử: nguyên lý ứng dụng Viện Công nghệ sinh học - Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Lê Thanh Hồ, Lê Thị Kim Xuyến, Đoàn Thị Thanh Hương, Trần Quang Vui, Phạm Cơng Hoạt Nguyễn Bá Hiên, (2008) Phân tích gen M mã hoá protein màng virus gây bệnhTai xanh Việt Nam so sánh với chủng Trung Quốc giới Tạp chí Khoa học Phát triển tập 7, số 3/2009, tr 282 – 290 Nguyễn Bá Hiên Trần Thị Lan Hương (2009) Giáo trình Miễn dịch học thú y, Nhà xuất Nông nghiệp Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Lê Văn Lãnh, Đỗ Ngọc Thúy (2012) Giáo trình Bệnh truyền nhiễm Thú y, Nhà xuất Đại học Nông nghiệp Nguyễn Bá Hiên, Nguyễn Quốc Doanh, Phạm Sỹ Lăng, Nguyễn Thị Kim Thành, Chu Đình Tới (2009) Vi sinh vật - Bệnh truyền nhiễm vật nuôi, Nhà xuất Giáo dục Việt Nam 157-165 Nguyễn Hữu Nam, Nguyễn Thị Lan (2007) Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản, Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp - sinh sản bệnh liên cầu khuẩn lợn, ngày 11/10/2007, ĐH Nông Nghiệp Hà Nội 10 Nguyễn Ngọc Hải, Trần Thị Bích Liên, Trần Thị Dân Nguyễn Ngọc Tuân, (2007) Chẩn đoán virut gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo (PRRS) kỹ thuật RT-PCR Khoa học Kỹ thuật Thú y tập XIV, số 5/2007, 55 tr – 12 11 Nguyễn Thị Lan, Lương Quốc Hưng (2012) Nghiên cứu số đặc tính sinh học virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp (PRRS) phân lập đàn lợn nuôi số tỉnh phía Bắc, Việt Nam Tạp chí Khoa học phát triển nông thôn, kỳ 2, tháng năm 2012, trang 82-87 12 Nguyễn Văn Thanh (2007) Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (PRRS), Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp - sinh sản bệnh liên cầu khuẩn lợn, ngày 11/10/2007, ĐH Nông Nghiệp Hà Nội 13 Phạm Ngọc Thạch, Đàm Văn Phải (2007) Một số tiêu lâm sàng, tiêu máu lợn mắc hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (bệnh tai xanh) số đàn lợn tỉnh Hải Dương Hưng Yên, Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp - sinh sản bệnh liên cầu khuẩn lợn, ngày 11/10/2007, ĐH Nông Nghiệp Hà Nội 14 Phạm Sỹ Lăng Văn Đăng Kỳ, (2007) Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn Diễn đàn khuyến nông công nghệ - Bộ Nông nghiệp phát triển Nông thôn, tháng 8/2007 15 Phạm Văn Ty (2005) Virus học Nhà xuất Giáo dục, 334 trang 16 Tô Long Thành, Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn Khoa học Kỹ thuật Thú y tập XIV, số 3/2007, tr 81 – 88 Tài liệu Tiếng Anh 17 Ausvetplan (2004), Disease stratery porcine reproductive and respiratory syndrome 18 Cinta Prieto, 2010; PRRS vaccine development, EuroPRRS2010, COST Action FA0902, Understanding and combating porcine reproductive and respiratory syndrome in Europe 19 FAO (2011), Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virulence jumps and persistent circulation in Southeast Asia, Empres No – 2011 20 Feng Y., Zhao T., Nguyen T., Inui K., Ma Y., Nguyen T.H., Nguyen V.C., Liu D., Bui Q.A., To L.T., C Wang, Tian K., Gao G.F (2008), Porcine respiratory and reproductive syndrome virus variants, Vietnam and China, 2007, Emerg Infect Dis số 14, 1774-1776 21 Goldberg, T.L., Hahn, E.C., Weigel, R.M., Scherba, G (2000) Genetic, geographic and temporal variation of porcine reproductive and respiratory 56 syndrome viruses in Illinois J Gen Virol 81, 171-179 22 Han-Kook Chung, Changsun Choi, Junghyun Kim, Chanhee Chae (2002), Detection and differentiation of North American and European genotypes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in formalin-fixed, paraffinembedded tissues by multiplex reverse transcription-nested PCR, p59 23 HanW., J J Wu, X Y Deng, Z Cao, X L Yu, C B Wang, T Z Zhao, N H Chen, H H Hu, W Bin, L L Hou, L L Wang, K G Tian, Z Q Zhang (2009), Molecular mutations associated with the in vitro passage of virulent porcine reproductive and respiratory syndrome virus, Virus Genes, số 38(2), tr 276-84 24 Kapur, V., Elam, M R., Pawlovich, T M & Murtaugh, M P (1996).Genetic variation in porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in the midwestern United States Journal of General Virology 77, 1271–1276 25 Keffaber K.K (1989), Presented at the American Swine Practioner 26 Kono Y, Kanno T, Shimizu M, Yamada S, Ohashi S, Nakamine M, Shirai J, Nested PCR for detection and typing of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in pigs J Vet Med Sci 1996, 58:941–946 27 M.Y Chia, H.T Chan, Y.Y Do, P.L Huang, H.W Chang, Y.C Tsai, C.M Lin, V.F Pang, C.R Jeng, 2010 Immunogienicity of an orally inoculated transgienic banana plant expressing the recombinant GP5 protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) in pigs Vet Immunol Immunopathol 135, 234-242 28 Neumann E J., J B Kliebenstein, C D Johnson, J W Mabry, E J Bush, A H Seitzinger, A L Green, J J Zimmerman (2005), Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome on swine production in the United States, J Am Vet Med Assoc, số 227:385-92 29 OIE (2008), PRRS: the disease, its diagnosis, prevention and control, Paris, 11 June 2008 30 Prieto C Castro J.M (2000), Pathogennesis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) in gestating sows, Vet.Res, số 31:56-57 31 WangC., F Lee, T S Huang, C H Pan, M H Jong, P H Chao (2008), Genetic variation in open reading frame gene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in Taiwan, Vet Microbiol, số 131(3-4), tr 339-47 57 32 Wang X., Eaton M., Mayer M., Li H., He D., Nelson E., ChristopherHennings J (2007), Porcine reproductive and respiratory syndrome virus productively infects monocyte-derived dendritic cells and compromises their antigene-presenting ability, Arch Virol (2007), số 152: 289–303 33 Wensvoort G., C Terpstra, J M Pol, E A ter Laak, E P M Bloemraad, de Kluyver, C Kragten, L van Buiten, A den Besten, F Wagenaar, and et al (1991), Mystery swine disease in The Netherlands: the isolation of Lelystad virus, Vet Q, số 13:121-30 34 William L Mengeling, Kelly M Lager, Ann C Vorwald and Deborah F Clouser, 2003 Comparative safety and efficacy of attenuated single-strain and multi-strain vaccines for porcine reproductive and respiratory syndrome Virus and Prion Diseases of Livestock Research Unit, National Animal Disease Center, P.O Box 70, USDA, Agricultural Research Service, Ames, IA 50010, USA; Available online 14 January 2003 35 Yoon K.J Stevenson G (1999), Porcine reproductive and respiratory syndrome, Trends in emerging viral infection of swine, số Iowa State Press p347-354 36 ZhuL., G Zhang, J Ma, X He, Q Xie, Y Bee, S Z Gong (2011), Complete genomic characterization of a Chinese isolate of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, Vet Microbiol, số 147(3-4), tr 274-82 Tài liệu Internet 37 http://www.cucthuy.gov.vn/ 38 http://www.macvector.com/index.html 39 http://www.megasoftware.net/ 40 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 41 http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/ 42 http://www.oie.int/eng/en_index.htm 43 http://www.pigprogress.net/news/prrs-white-paper-issued-id833 44 http://www.porcilis-prrs.com/microbiology-prrsv-structure 45 http://aleffgroup.com/avisfmd/A010-fmd/mod2/0550-karber.html 46 http://www.aahc.com.au/ausvetplan/index.htm 58 ... đề tài ? ?Nghiên cứu chọn chủng virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (PRRSV) Việt Nam để làm nguồn sản xuất vacxin nhược độc? ?? Đây bước đầu quan trọng cho việc lựa chọn sản xuất giống... để sản xuất vacxin phịng hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn PHẦN2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP (PRRS) Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp( Porcine Reproductive... hô hấp lợn (PRRSV) Việt Nam để làm nguồn sản xuất vacxin nhược độc Chuyên ngành : Thú y Mã số : 60 64 01 01 Tên sở đào tạo: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam NỘI DUNG Mục đích Tạo chủng virus nhược