1060 nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên hemagglutinin (ha) tái tổ hợp của virus cúm ah5h1 và đánh giá tinh sinh miễn dịch trên gà luận văn tốt nghiệp

1 MỞĐẦU Viruscúm thểđộclựccao(Highly pathogenicavianinfluenza-H P A I ) H5N1 thuộc type A, họOrthomyxoviridae, chủng có khả gây tử vong caotrên 50% gia cầm bị nhiễm Dịch cúm gia cầm H5N1 xuất nhiều quốc giachâu Á, châu Âu, châu Phi thực mối đe dọa nghiêm trọng tồncầu.Từkhi dịchcúmgiacầmH5N1xuấthiệntớinay,thếgiớiđãcóhơn250triệugia cầm bị tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nề kinh tế cho ngành chăn nuôi Đặc biệt,không gây bệnh gia cầm, virus cúm A/H5N1 cịn có khả lây truyền từgia cầm sang người Theo thống kê Tổ chức Y tế Thế gới, từ tháng 01/2003 đếntháng12/2016đãcó856trườnghợpmắccúmA/H5N1,trong 452 trường hợp tửvong,chiếm52,8% ( w w w w p r o w h o.int/emerging_diseases/AvianInfluenza/en).Với độc lực mạnh, khả năngđộtbiếnlớn,sốlượngcácvậtchủkhôngngừngtănglên, virus H5N1 trở thành mối đe dọa đại dịch xảy toàn cầu Do đó,việcn g h i ê n c ứ u t ì m r a b i ệ n p h p d ự p h ò n g v đ i ề u t r ị v i r u s c ú m A / H N l v ô cùngcấp bách Dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát Việt Nam vào cuối năm 2003 cáctỉnhphíaBắc,sauđóđãnhanhchónglantớihầuhếtcáctỉnh/thànhtrongcảnướcchỉ thời gian ngắn, hàng triệu gia cầm bị chết tiêu hủy gây thiệt hại rấtlớn mặt kinh tế cho ngành chăn nuôi Sử dụng vắc xin cho gia cầm xem làmột biện pháp hữu hiệu để ngăn chặn lan truyền virus cúmvà giảm thiểu thiệt hại virus cúm gây ngành chăn nuôi Hai loạivắc xin thương mại sử dụng rộng rãi giới để tiêm phòng cho giacầm vắc xin bất hoạt vắc xin sống nhược độc sử dụng vector virus làm dẫntruyền Cúm A/H5N1 vấn đề có tính thời Việt Nam, vắc xin phòngcúm A/H5N1 ứng dụng 10 năm, năm dịch bệnh xảy ravàhiệnnaycónguycơcácphântypemới (H5N6,H5N2,H7N9)xâmnhập.Viruscúm gia cầm biến đổi liên tục tạo nên clade nên việc tiếp tục nghiên cứuđểcóđượccơngnghệsảnxuấtvắcxinhiệuquảhơn,dễtựđộnghóahơn,chophép thích ứng nhanh với biến thể virus cần thiết Các nhà khoa học đangnỗ lực nghiên cứu tạo loại vắc xin khác vắc xin đơn vị, vắc xinDNA, vắc xinsống nhược độc để đáp ứngyêucầu phòng chốngd ị c h c ú m g i a cầm cách triệt để Việc nghiên cứu sản xuất kháng nguyên HA để tạo vắc xindưới đơn vị góp phần đa dạng hóa cơng nghệ sản xuất vắc xin; khơng phụ thuộc vàonguồncungcấpphơitrứnggà;chophépphânbiệtgiacầmtiêmvắcxinvàgiacầmnhiễm bệnh ngồi mơi trường giám sát huyết thanh; sản xuất trongmộtthờigianngắn,đápứngucầuphịng chốngdịchbệnhkhicóbiếnchủngxảyra Xuất phát từ u cầu sở khoa học trên, thực đề tài:“Nghiêncứubiểuhiệnkhángnguyênhemagglutinin(HA)táitổhợpcủaviruscúmA/ H5N1vàđánhgiátínhsinhmiễndịchtrêngà”vớicácmụctiêu: - Biểuhiệnkháng ngunHAtáitổhợpcủaviruscúmA/H5N1 - ĐánhgiátínhsinhmiễndịchtrêngàcủaproteinHAtáitổhợp,làmcơsởđểtạo vắcxin phịngcúmA/H5N1 Nộidungnghiêncứu củađềtài (1) Nghiên cứubiểuhiệnkhángnguyênHAtronghệbiểuhiệnE.coliBL21 - Biểuhiện genha1,ha1-2trongtế bàoE.coliBL21 - Nghiêncứuảnhhưởngcủamộtsốyếutốnhiệtđộ,IPTGđếnbiểu hiệngen - Tinhchếvàkiểmtratínhkhángnguncủa proteintáitổhợp (2) Nghiên cứubiểuhiệnkhángngunHAtrongtếbàonấmmenP.pastoris - NghiêncứubiểuhiệnkhángngunHAdướidạngdunghợpvớiTrxcóvịtríc ắtcủathrombin(T)vàenterokinase(E)(Trx-TE-HA) - Nghiênc ứu c ả ib iế n m ã ba v biể u hi ệ n k h n g n gu yê n H A t r o n g nấ m menP.pastoris - Nghiêncứubiểuhiệnk há n g ngunHAdướ i dạngdunghợptrxkhơngcó trìnhtựcắtcủaenterokinasevà thrombin (3) NghiêncứuảnhhưởngcủamộtsốyếutốlênqtrìnhbiểuhiệnproteinHAtáitổhợp;l ênmen vàthu hồiproteinHAtáitổhợp (4) ĐánhgiátínhsinhmiễndịchtrêngàcủaproteinHAtáitổhợp Đónggópmớicủaluậnán Luận án cơng trình Việt Nam nghiên cứu biểu kháng nguyênHA tái tổ hợp virus cúm A/H5N1 trongE colivà nấm menP pastoris, làm cơsở để tạo vắc xin phòng cúm A/H5N1 Từ cấu trúc thiết kế biểu gen khácnhau,v i n h i ề u c h ủ n g b i ể u h i ệ n v đ i ề u k i ệ n b i ể u h i ệ n k h c n h a u c h ú n g t ô i đ ã chọn chủng nấm menP p a s t o r i s SMD1168 biểu TrxHA1 Sản lượngHA tổng hợp nồi lên men đạt 84 mg/l Hiệu giá HI trung bình huyếtthanh gà sau tuần gây miễn dịch nhắc lại với 100g TrxHA1 tái tổ hợp quađường tiêm da cổđ t - , l o g , h i ệ u g i H I s a u tuần gây miễn d ị c h n h ắ c lạibằ n g đ n g n h ỏ m ắ t m ũ i đ t , - , l o g H i ệ u g i H I h u y ế t t h a n h g g â y miễndịchvớiproteinHAtáitổhợptươngđươngvớihiệugiá HIhuyếtthanhgàtiêmvắcxin bấthoạt Re-1 Chương1 TỔNGQUANTÀILIỆU 1.1 TỔNGQUANVỀVIRUSCÚMA/H5N1 1.1.1 CấutrúcviruscúmA Virus cúm thuộc họOrthomyxoviridae, gồm type A, B, C viruscúm type A có nhiều type huyết khác chủ yếu gây bệnh cho người,động vật chim, gia cầm, lợn Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hoặchình khối đa diện, đường kính 80 -120 nm, đơi có dạng hình sợi, khốilượng phân tử khoảng 250 triệu Da (Hình 1.1A) Kết phân tích thành phần hóahọc virion cho thấy RNA chiếm khoảng 0,8 - 1,1%, protein chiếm khoảng 70 -74%; lipid - 8% lại carbonhydrate Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm vỏ(capsid),vỏbọcngồi(envelope)vàlõilàRNAsợiđơnâm.HệgenviruscúmA,Bcó8sợiRNA âm(PA,PB1,PB2,HA,NA,M,NPvàNS) tổngkíchthướckhoảng9kbmãhóacho15loạiproteinkhácnhau(Hình1.1B) (Palese,2007;Amorij,2008) A B Hình1.1:Hình tháivàcấutrúcviruscúmA (Nguồn:WHO; Amorij,2008) Các đoạn PA, PB1, PB2 mã hóa enzyme phức hợp polymerase(RNA transcriptase) virus, có độ dài ổn định có tính bảo tồn cao Phân đoạnHA NA (neuraminidase) mã hóa cho protein bề mặt virus Hai protein cótínhkhá ng n gu yê n đặ c t r n g cho t ừn g chủng v ir us cúm A.Đ oạ n N P mã h óa c ho nucleoprotein( N P ) t h n h p h ầ n c ủ a p h ứ c h ệ p h i ê n m ã , c h ị u t r c h n h i ệ m v ậ n chuyển RNA giữanhânvàbàotươngtếbàochủ.PhânđoạnMmãhóachoproteinđệm - matrix protein virus gồm hai tiểu phần M1 M2 tạo nhữngkhung đọc mở khác phân đoạn RNA Protein M1 proteinnền, thành phần virus có chức bao bọc RNA tạo nên phức hợpribonucleoprotein tham gia vào trình “nảy chồi” virus Protein M2 làchuỗi polypeptide ngắn, có khối lượng phân tử khoảng 11 kDa, protein M2 đâmxun nhơ khỏi vỏ ngồi, chịu trách nhiệm tháo vỏ virus giải phóng hệ genvirus vào bào tương tế bào chủ trình xâm nhiễm (Palese, 2007; Bouvier,2008;Neumann,2009) Hiện nay, nhà khoa học phát 18 loại kháng nguyên HA (H1H18) 11 loại kháng nguyên NA (N1-N11) (Tong, 2013) Trong lịch sử ghi nhậnchỉphântypeH1,H2,H3vàN1,N2gâybệnhchongười.GầnđâyphântypeH5,H7,H9cũngg âybệnhchongườivớimứcđộnguyhiểmhơn(Li,2015;Bui,2016).BệnhdịchdochủngH5N1gâyracó khả lây lan cao động vật lơng vũ, gâychếthàngloạtởchimvàgiacầm(Webster,2002;Schrauwen,2014;Webster,2014) 1.1.2 Chutrình táibảncủaviruscúmA Quá trình xâm nhiễm nhân lên virus xảy chủ yếu tế bào biểumô đường hơ hấp, đường tiêu hóa thể vật chủ (Nicholson, 2003; Palese,2007; Neumann, 2009; de Graaf, 2014) Các giai đoạn trình xâm nhiễm nhưsau(Hình1.2): Giai đoạn - giai đoạn hấp phụ:các hạt virus gắn với tế bào chủ thông qualiên kết phân tử HA với thụ thể có chứa nhóm sialic acid bề mặt tếbào chủ Virus cúm gia cầm gắn đặc hiệu với thụ thể sialic acid α 2-3 galactose(SAα2-3Gal)cịnviruscúmngườigắnđặchiệuvớithụthểsialicacidα2-6galactose (SAα2-6Gal)(deGraaf,2014).Docótínhđặchiệuvớithụthểnênviruscúm gia cầm dễ dàng lây nhiễm sang người ngược lại, hình thành ràocảnlồi,thuhẹpkhảnănglâynhiễmcủavirustrênmộthoặcmộtsốvậtchủnhấ t định.Ởmộtsốđộngvật(nhưlợn,gà )cócảhailoạithụthểnêncóthểbịnhiễmcảviruscú m gia cầmvà viruscúm người(Schrauwen,2014;Neumann,2015) Hình1.2:ChutrìnhxâmnhiễmvàsaochépcủaviruscúmA (Nguồn:Neumann,2009) Trong thể vật chủ cảm nhiễm, khả bám gắn gây bệnh viruscúm cịn tùy thuộc vào từngmơ cơquan Nhìn chung, virusc ú m A c ó t í n h t h í c h ứng lây nhiễm với biểu mô đường hô hấp gây bệnh chủ yếu đường hô hấp (deGraaf, 2014) Tuy nhiên, khả liên kết virus cúm với tế bào chủ phụthuộc vào hoạt tính neuraminidase niêm mạc đường hơ hấp có lớpmucin bao phủ, tạo nên hàng rào mà virus phải xuyên qua để gắn với tế bào.Lớp mucin chứa nhiều sialic acid hình thành mạng lưới có tác dụng ngăncản virus bám vào bề mặt tế bào (Sanders, 2010) Nhờ hoạt tính sialidase phân cắtcác nhóm sialic acid mà neuraminidase giúp cho virus tiếp cận với tế bàocảmnhiễmbên đường hô hấp Giai đoạn - xâm nhập tế bào: virus xâm nhập vào tế bào chủ yếu conđường ẩm bào Sau virus gắn vào tế bào, màng tế bào lõm lại hình thành túi baobọc virus Túi khép kín lại, sau tách khỏi màng tế bào tạo thành túinội bào (endosome) Để tránh bị phân hủy môi trường pH thấp endosome,proteinM2hoạtđộng mạnh,bơmionH+vàotronghạtvirus Giaiđoạn3 -tháov ỏvirus :dòng chảycủacácionH +từlòngtúi ẩ m bàovào hạtviruslàmlớpproteinnềnM1bịphávỡvàtáchkhỏiphứchợpRNP.Hoạtđộng kênh ion H+làm thay đổi cấu trúc không gian HA bộc lộ cácpeptide chịu trách nhiệm hịa tan vỏ, nhờ vỏ virus dung hợp với màngendosomevàgiảiphóngcácphứchợp RNPvàotrongbàotươngtế bào Giai đoạn 4-tổng hợp RNA protein virus: Phức hợp RNP vậnchuyển vào nhân tế bào để phiên mã tạo mRNA Phân tử mRNA phiên mãtrong nhân từ chuỗi RNA sợi đơn (-) virus sử dụng mồi đoạn 10-13nucleotide cắt từ đầu 5’ mRNA có gắn mũ vật chủ, sau gắn đipolyA lấy từ mRNA tế bào chủ Enzyme cắt mồi endonuclease virusmang theo mRNA hoàn thiện virus khỏi nhân, vào bào tương để tiếnhành tổng hợp protein Kết trình phiên mã từ đoạn RNA hệ gen tạo rađược15phântửprotein Trong nhân tế bào, RNA hệ gen virus tổng hợp nên sợi dương từkhuôn sợi âm hệ gen virus, từ sợi dương chúng tổng hợp nên RNA hệgen virusmới nhờ RNA polymerase.C c s ợ i n y k h ô n g đ ợ c a d e n i n e h ó a (gắn thêm adenine) gắn mũ đầu 5’ 3’, chúng kết hợp với nucleoprotein(NP)t o t h n h p h ứ c h ợ p r i b o n u c l e o p r o t e i n h o n c h ỉ n h v đ ợ c v ậ n c h u y ể n r a t ế bàoc h ấ t Đ â y đ ặ c đ i ể m k h c b i ệ t s o v i c c v i r u s k h c ( q u t r ì n h n y xả y r a tế bào chấtcủavật chủ).Các proteinP B , PB2, PA, N P c ủ a v i r u s s a u k h i tổng hợp đưa vào nhân tế bào kết hợp với RNA virus hình thànhcác phức hợp RNP, sau phức hợp lại đưa trở lại bào tương Các proteinkhác (HA, NA, M2) glycosyl hóa mạng lưới nội chất phức hệ Golgicủatế bào Giai đoạn - lắp ráp giải phóng virus khỏi tế bào: sau trải qua cảibiến sau dịch mã, protein HA, NA M2 đưa đến màng tế bào chủ gắnvới lớp lipid kép Khi mật độ protein màng đủ lớn phức hợp RNP vàproteinM2cũngtậphợplạitrênmàngtếbào.Saukhicả8phânđoạnRNAcủahệ gen thành phần khác tập hợp đầy đủ phức hợp RNP, protein vỏvirus protein M1 lắp ráp lại với để hình thành hạt virus hệmới Các virus hình thành gắn vào màng tế bào liên kết HA vớinhóm sialic acid màng tế bào Các hạt virus sau giải phóng theo chế nảychồikhỏi màngtếbàonhờtácdụngcắtnhóm axitsialiccủaneuraminidase 1.1.3 KhángnguyêncủaviruscúmA/H5N1 1.1.3.1 Khángnguyên HA HA kháng nguyên bề mặt quan trọng virus cúm A phân đoạngenhamã hóa Ở virus cúm A/H5N1 phân đoạnhacó kích thước 1776 bp, đóvùngmãhóachoproteinH5khoảng1698-1710bptùythuộcvàotừngchủngvirus(Xiong,2013;NguyễnThị Bích Nga, 2011) Về cấutạo,phântửHA cód n g trimer, gồm phân tử protein HA0 (Hình 1.3) Khối lượng phân tử HA0 là70- 75kDa.HA0đượcchiathànhhaitiểu đơnvịHA1(36kDa)vàHA2(27kDa) Vị trí liên kết thụ thể Peptid dung hợp Vỏ virus Hình1.3:Mơhìnhcấutrúcbậc3vàbậc4củahemagglutinin (Nguồn:Amorij,2008) Tiểu phần HA1 kết thúc nhóm amino, chứa số vị trí gắng ố c đường, vị trí gắn thụ thể tế bào chủ vị trí định kháng nguyên (Amorij,2008) Phần lớn cấu trúc bậc hai HA1 phiến β cuộn xoắn lại tạo thànhvùnghìnhcầucủaphântửHA.TiểuphầnHA2kếtthúcbằngnhómcarboxyl,chứa phần xun màng peptit dung hợp màng Cấu trúc bậc hai HA2 đoạnxoắnkết hợp với tạo thành vùng dạng sợi, gắn với vỏ virus Cấu trúc HA0được bền vững nhờ cầu nối disulfide tiểu phần HA1 HA2 Protein HA đượctổng hợp dạng polypeptide HA0 mạngl i n ộ i c h ấ t , t i đ â y c h ú n g tập h ợ p lạithànhdạngtrimer.Sauđó,chúngđượcvậnchuyểntớibềmặttếbàothơngq uabộ máy Golgi Tại bề mặt tế bào enzym protease tế bào chủ phân cắt HA0thànhHA1vàHA2 (Sriwilaijaroen,2012) Vùng nối HA1 HA2 có chứa amino acid kiềm tínhchính vùng phân cắt hai tiểu đơn vị protein HA0 tác dụng protease.Trình tự amino acid vùng phân cắt HA có vai trị định độc lực virus(Velkov, 2013) Ở chủng virus, điển hình H5N1 thể độc lực cao, chuỗi aminoacid kiềm tính vùng phân cắt HA nhận biết protease nội bào phổbiến, giúp virus lây nhiễm tái nhiều mô quan khác cơthể vật chủ gây nên triệu chứng toàn thân nặng nề (Perdue, 2000; Luczo,2015) Ngược lại, vị trí phân cắt hai tiểu phần HA1, HA2 chủng virus thểđộc lực thấp có amino acid kiềm Arg số amino acid kiềm vị trí -3hoặc4nênchỉchịutácdụngcủacácproteasengoạibào(trypsinl i k e ) D o đ ó , virusH5N1thểđộclựcthấpchỉcóthể nhân lên cácm c q u a n c ó c c e n z y m nàynhư ởđườngtiêuhóavàđườnghơhấp(Steinhauer,1999;Gambotto,2008) Có khoảng 400 phân tử HA bề mặt capsid virus HA có vai trịquantr ọn gt ro ng qu t r ì n h n hậ n d i ệ n , g ắ n v o t ế bà o c h ủ v k h i đ ộ n g q uá t r ì n h xâmnhiễmcủavirusvàotếbàochủ(Bender,1999).Sựxâmnhiễmcủavirusđượckhởi đầu kết hợp đặc hiệu HA virus với thụ thể bề mặt tế bàovật chủ, sau vỏ virus hịa với màng tế bào giải phóng RNA hệ gen vào tế bàovật chủ Quá trình kết hợp phụ thuộc vào phù hợp cấu hình khơng gian thụthể chứa sialicacid tế bào đích vớivị trígắn vớithụ thển y t r ê n p h â n t H A củaviruscúm,quyếtđịnhsự xâm nhiễm dễ dàng virus lồi vật chủ khác.Vị trí amino acid 226(aa226) tiểu đơnv ị H A đ ợ c x c đ ị n h l v ị t r í q u y ế t định phùhợpgắnHAvới thụthể đặchiệu củanó Ởhầuhếtcácchủng viruscúmA lưu hành tự nhiên vị trí glycine, thích ứng với thụ thể Gal α-2,3 sialicacid(chứas i a l i c a c i d liênk ế t v i n h ó m h y d r o x y l ( O H ) c ủ a g a l a c t o s e g ó c quayα-2,3)củatếbàobiểumơđườnghơhấpcủachimvàgiacầm(vậtchủtự nhiêncủaviruscúmA)(Gamblin,2010).Ngồira,mộtsốvịtríaminoacidkhácnhưglutamine 222, glycine 224, hay cấu trúc SGVSS NGQSGR có liên quanchặtchẽđếnkhảnăngthíchứngvớithụthểchứa sialicacidbềmặtmàngtếbàochủ(Schrauwen,2014;Luczo,2015) 1.1.3.2 Khángnguyên NA Neuraminidase (sialidase), enzyme có chất glycoprotein gắntrênbềmặtcapsidcủaviruscúmA.GenmãhóachoproteinNAcóchiềudàithayđổi theo phân type virus cúm A Ở virus cúm H5N1, gennacó kích thước thayđổitrongkhoảng1350– 1410bp(Baigent,2001;Wagner,2002;K e a w c h a r o e n , 2005;N g u y ễ n T h ị B í c h N g a , 1 ; X i o n g , ) N A c ó k h ố i l ợ n g p h â n t khoảng53kDa,có cấutrúchìnhnấm,baogồmmộtđầuchứa4tiểuđơnvịvàcóđoạn peptide kị nước cắm sâu vào vỏ virus, tiểu đơn vị tạo thành trung tâm hoạtđộng enzyme NA chứa chuỗi polypeptide đơn hướng phía đối diệnvới kháng nguyên HA Chuỗi gồm amino acid có tính bảo thủ cao, chứa cácaminoacid ưanước(Castrucci,1993;Shtyrya,2009) Enzyme NA cắt đứt liên kết gốc sialic acid màng tế bào nhiễm vớiphân tử carbohydrate protein HA, giải phóng hạt virus khỏi màng tế bàonhiễm, đẩy nhanh lây nhiễm virus thể vật chủ ngăn cản tậphợp hạt virus màng tế bào Mặt khác, NA tham gia vào phân cắtliên kết giai đoạn “hòa màng”, đẩy nhanh q trình “cởi áo” (uncoating)giải phóng hệ gen virus vào bào tương tế bào nhiễm, giúp cho trìnhnhân lên virus diễn nhanh (Wagner, 2002) Ngồi ra, NA cịn phân cắtcác liên kết glycoside, giải phóng neuraminic acid làm tan, lỗng màng nhầy bề mặtbiểumơđườnghơhấptạođiềukiệnchovirusnhanhchóngtiếpcậntếbàobiểumơvà khỏi chất ức chế khơng đặc hiệu Cùng với vai trò kháng nguyênHA,cả3khâutácđộngtrêncủaNAđềuthamgialàmgiatăngđộclựcgâyb ệnh