0915 nghiên cứu hoạt tính sinh học một số hợp chất ngoại bào của xạ khuẩn phân lập từ vùng biển đông bắc bộ và miền trung việt nam luận văn tốt nghiệp

MỞĐẦU ViệtNamlàquốcgiavenbiểnnằmbênbờTâycủaBiểnĐơng,cóđịachínhtrịvàđịakinhtếrấtqua ntrọngkhơngphảibấtkỳquốcgianàocũngcó.Vớibờbiểndàitrên 3.260 km trải dài từ Bắc xuống Nam, đứng thứ 27 số 157 quốc gia ven biển, cácquốcđảovàcáclãnhthổtrênthếgiới.Chỉsốchiềudàibờbiểntrêndiệntíchđấtliềncủanướctalàxấp xỉ0,01(nghĩalàcứ100km2đấtliềncó1kmbờbiển).Trong63tỉnh,thànhphốcủacảnướcthì28tỉnh,thànhphốcóbiển vàgầnmộtnửadânsốsinhsốngtạicáctỉnh, thành ven biển Các nghiên cứu trước cho thấy, vùng biển nước ta mộttrongsốcácvùngbiểncóhệđadạngsinhhọcphongphúnhất.Đồngthời,VSVbiểncósựphânbốrấtdồi dàovàđadạng,tuynhiênchotớinay,ởnướctachưacónhiềucơngtrìnhnghiêncứucáchợpchấtthứcấpđượ csinhtổnghợptừcácVSVbiển Ngược lại, việc nghiên cứu hoạt chất thứ cấp có hoạt tính sinh học sảnsinh từ VSV biển giới thu nhiều thành tựu đáng kể, nhiều hợp chất thứcấp với cấu trúc hóa học hoạt tính sinh học lý thú phát Đồng thời nhiềuhợpchấttrongsốnàyđãvàđangđượcthửnghiệmsâuhơnnhằmứngdụngtrongydược.Nhiều loại khángsinhđượcchiếtxuấttừnấm,vikhuẩn,xạkhuẩn,màxạkhuẩnchiếmphần lớn có xạ khuẩn biển Do đại dương chiếm 70% diện tích bề mặt tráiđất,lànơicósựđadạngvềsinhhọclớnnhấttrêntráiđất.Vìmơitrườngbiểnđãđượcbiếtđếnnhưmộtnguồ nphongphúcungcấpcáchợpchấtthiênnhiên,nhưmộtkhodượcliệukhổnglồđangchờđượckhaithácvàkhámphá Đặcthùmơitrườngsốngkhắcnghiệtdưới biển sâu điều kiện để hình thành hợp chất hữu với đặc điểmcấutrúchóahọcđộcđáovàhoạttínhsinhhọcqgiá Hơnnữa, ngàycàngnhiề uc c VSVg â y bệnht r on g đócó vikhuẩnlaok h n g vớ icáckhángsinhhiệncóvàcácbệnhungthư.Dođó,cơngcuộctìmkiếmcácloạithuốc chống lao, ung thư bệnh truyền nhi m khác v n vấn đềmangtínhcấpbáchtrêntồncầu Vì chúng tơi thực luận án với mục đích: “Nghiên cứu hoạt tính sinhhọcmộtsốhợpchấtngoạibàocủaxạkhuẩnphânlậptừvùngbiểnĐơngBắcbộvàmiền TrungViệt Nam” Mụctiêunghiêncứucủaluận án: - Nghiên cứu hoạt tính sinh học số hợp chất ngoại bào xạ khuẩn phânlập từvùngbiểnĐơngBắcbộvàmiềnTrungViệt Nam - Tìmkiếmcácchấtthứcấpcóhoạttínhsinhhọccaotừnguồnxạkhuẩnbiểnthơngquađánh giásànglọchoạttínhkhángvisinhvậtkiểmđịnh,khánglaovàgâyđộctếbào Nhữngđónggópmớicủaluậnán - Từ 140 m u vật thu thập từ số vùng biển Việt Nam, 130 chủng vi sinhvật đãđượcphânlập - SànglọchoạttínhkhángVSVKĐ(6chủngvikhuẩnvà1chủngnấm)vàkhánglao(H37Rv )củacặnchiếtcácchủngxạkhuẩnphânlậpđượcchothấy105/130chủngthểhiệnhoạttínhkhángítn hất1chủngVSVKĐ,3chủngthểhiệnhoạttínhkhánglao - Đã lựa chọn xác định tên khoa học mười chủng có hoạt tính caobằng giải trình tự gen 16S rRNA Trong chủng G017, G019, G043, G044, G047,G068, G120 thuộc chiMicromonospora, chủng G039, G065 thuộc chiStretomyces,chủngG057thuộcchiNocardiopsis - Dịchl ê nm e n c 5c h ủn g cóhoạ t t í n h c a o đãđượcnghiêncứuthành phần hóahọcbằngcácphươngphápsắcký.Đãxácđịnhđược44hợpchất Trong số 44 hợpc h ấ t đ ợ c t c h c h i ế t v x c đ ị n h c ấ u t r ú c h ó a h ọ c , đ ã x c địnhđược3hợpchấtmớilà3,4-dihydroxy-6,7-dimethyl-quinoline-2carboxylic(G019-1),2-[(5-methyl-1,4-dioxan-2-yl)methoxy]ethanol(G019-2),2-[(2Rhydroxypropanoyl)amino]benzamide(G0571),v c h ấ t m i l ầ n đ ầ u t i ê n đ ợ c tách chiết từ tự nhiên 3,3’-bis-indole (G057-2), 3-acetyl-4-hydroxycinnoline (G057-3)và1 h oạ t c hấ t làbis(2-ethylhexyl) adipate(G043-12)cóhoạt tínhkhánglao CHƢƠNG1:TỔNGQUAN Phầntổngquant ại liệutổnghợpcácnghiêncứ ut rong nướcvàngồinước đềcập đếncácvấnđềchínhsau: 1.1 Đadạngvisinhvậtbiển 1.2 Sựhìnhthànhchất khángsinhởxạkhuẩn 1.3 Xạkhuẩnbiển 1.3.1 HọStreptomycetaceae: 1.3.2 HọMicromonosporaceae: 1.3.3 Cáchọ kháccủa xạkhuẩnbiển 1.4 Hoạthínhsinhhọccủaxạkhuẩnbiển 1.4.1 Tìnhhìnhnghiêncứungồinước Hoạt tính kháng laoHoạt tính kháng sinhHoạttínhchốngungth 1.4.2 Tìnhhìnhnghiêncứutrong nước CHƢƠNG2:VẬTLIỆUVÀPHƢƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 2.1 Vậtliệunghiêncứu 2.1.1 Vậtliệu - Tổng số m u thu thập 140 m u, có: 76 m u Vịnh Bái TửLong, 29 m u Đảo Cô Tô – Thanh Lân , m u trầm tích Hạ Long - Cát Bà, 10 m uHải miên Hải Vân – Sơn Chà 16 m u Vịnh Vân Phong – Khánh Hòa lưu giữtiêubảntạiViệnHóasinhbiển,ViệnTàingunvàmơitrườngbiểnHảiPhịngdoPGS.TSĐỗCơ ngThungđịnhtên - Cặpmồidùngđểkhuếchđạigen 16srARNcủa xạkhuẩn - Các chủng vi sinh vật kiểm định chuẩn quốc tế: chủng vi khuẩn Gram – (EscherichiacoliATCC25922,PseudomonasaeruginosaATCC27853,S.entericaATCC122 28),3chủngGram+(E.faecalisATCC13124,StapphylococusaureusATCC25923,Bacillus cereusATCC 13245),1 chủng Nấm menCandida albicansATCC10231 cungcấpbởiviệnKiểmnghiệmvệsinhantồnthựcphẩmquốcgia - Các dịng tế bào ung thư người cung cấp ATCC gồm:KB- ung thưbiểumô(CCL–17TM);HepG2-ungthưgan(HB–8065TM);MCF-7-ungthưvú(HTB –22TM)vàLU-1-ungthưphổi(HTB-57TM)đượccungcấpbởiđạihọcUIC–HoaKỳ - Chủng vi khuẩn lao H37Rv (ATCC 27294, American Type Culture Colection,Rockville,MD)đ ợ c cungcấpbởi đạihọcUIC–HoaKỳ 2.1.2 Hóa chất:Các hóa chất dùng cho nghiên cứu vi sinh vật biển tách chiết cáchợpchất thứ cấpđ ợ c muacủacáchãnguytín củaĐức, Ý,Ấnđộ 2.1.3 Thiết bị:Máy móc thiết bị sử dụng nghiên cứu vi sinh bao gồm : Máy sốcnhiệt;máyvortex;máykhuấytừ;tủcấyantồnsinhhọcClassII;tủnicấy;máyly tâm Centrifuge 5430; cân phân tích; máy PCR Mygenie 96 Thermal Block; máy điện di;máylắc;tủlạnh-80oC -20oC; máy khửtrùng; thiết bị lặnScuba, thuyềnđánhc loạivừa,thiếtbị lấymuthôngthườngnhưc u ố c , t i , m y đ o t ọ a đ ộ , m y đ o đ ộ sâu;kính hiển vi điện tử quét SEM; máy quang phổ Hewlett Packard; máy đo phổ hồngngoại FTIRImpact-410; máy đo phổ khối Quardrupole LC MS- Agilent Technologestheo kiểu phun mù điện tử (ESI); máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Brucker Avance500 (500 MHz), sử dụng TMS làm chất chuẩn; máy độ quay cực Tasco P-2000; máy đođiểmnóngchảyMel Temp3.0củacácnướcMỹvàChâuÂu Các dụng cụ dùng nghiên cứu vi sinh thông thường như: que cấy (Đức);đĩa pepri(Đức,Ý); bìnht a m g i c ; q u e r i a ; q u e t r a n g ( Đ ứ c ) ; Ố n g e p p e n d o f m l ; ml; 15 ml; 50 ml; đầu típ loại: 10, 100, 200, 1000 µl; Bình tam giác loại dungtíchtừ125ml–5000ml 2.2 Phƣơngphápnghiêncứu 2.2.1 Phươngphápthuthậpmẫu 2.2.2 Phươngpháp phânlập chủngxạkhuẩnbiển 2.2.3 Phươngpháplàmsạchcácchủngbằngquecấyvòng 2.2.4 Phươngphápgiữgiốngxạkhuẩn sauphânlập 2.2.5 Phươngpháphoạthốvànicấy 2.2.6 Phươngpháptạocặnchiếttừdịchnicấyđểsànglọchoạttínhsinhhọc 2.2.7 Phươngphápđịnhdanhchủngxạkhuẩnnghiêncứu 2.2.8 Phươngphápsinhkhốilượnglớn 2.2.9 Phươngpháptáchchiếtcáchợp chấtthứcấp,địnhlượngcáchợpchất 2.2.10 Phươngphápxácđịnhcấutrúchóahọccủacáchợpchấtsạchtáchchiếtđược 2.2.11 PhươngphápthửhoạttínhkhángVSVKĐ 2.2.12 Phươngpháp thửhoạttínhgâyđộctếbào 2.2.13 Phươngphápthửhoạttínhkhánglao CHƢƠNG3.KẾTQUẢNGHIÊNCỨU 3.1 Kết thu mẫu:Thu thập 140 m u, có: 76 m u Vịnh Bái TửLong, 29 m u Đảo Cô Tơ – Thanh Lân , m u trầm tích Hạ Long - Cát Bà, 10 m uHải miên Hải Vân – Sơn Chà 16 m u Vịnh Vân Phong – Khánh Hòa Các m u đượclấyở cáctọađộvàđộsâukhácnhau 3.2 Kết phân lập chủng xạ khuẩn:Từ 140 m u ni cấy mơitrườngkhácnhau(M1,NZSG,ISP1,ISP2,A1,SWA),chúngtơiđãchọnđược130chủngxạkhuẩn ĐasốcácchủngđềumọctrênmơitrườngA1vàM1.CácchủngđềupháttriểntốttrênmơitrườngA1.Vì vậychúngtơichọn mơitrườngA1đểnicấygiữchủngtrongA1+10%glycerolở–80oC 3.3 Khảosáthoạttínhsinhhọccácchủngphânlậpđƣợc KếtquảthửhoạttínhkhángVSVKĐvớicặnthơthuđược105130chủngphânlậpcótínhkhángcá cchủngVSVKĐ80,8%,trongđócó29130chủngphânlậpcóhoạttínhkháng từ chủng VSV kiểm định trở lên, chiếm 22,3% 59 130 chủng có hoạt tínhkháng nấm chiếm 45,4%.Ngồi ra, có 11 130 chủng phân lập có hoạt tính khángVSVKĐ Gram âm, chiếm 8,5% Đặc biệt, chủng G002, G004, G026, G057, G119,G120, G124, G126,G039,G065, LC09 LC19 thể hoạt tính phổ rộng vikhuẩnvi khuẩnGram(+),vikhuẩnGram(-) vànấm Các cặn chiết chủng xạ khuẩn phân lập được khảo sát sànglọchoạttínhkháng lao.Kếtquảkhảosátchothấytrongsốcácchủng đượcthử nghiệm, có3chủngG017,G019vàG043thểhiện hoạttínhđốivớiMycobacteriumtuberculosis H37Rvvớigiátrị MIClần lượtlà21,25 và18μg/ml.g/ml Từ kết sàng lọc hoạt tính kháng VSVKĐ hoạt tính kháng lao,trong luận án lựa chọn 10 chủng xạ khuẩn có hoạt tính tốt để thực hiệncácnghiêncứutiếptheo 3.4 Kếtquảđịnh danh10 chủngxạkhuẩncóhoạttính 3.4.1 Quansátđặcđiểm hìnhtháicác chủngnghiêncứu Cácchủngnghiêncứuđượcnicấytrong14ngàyở30ºCtrênmơitrườngthạch(ISP2).Kếtquảqua nsáthìnhtháichothấysợikhuẩntycơchấtpháttriểntốttrênnềncơchấtcủamơitrường,nhưngsợikhuẩntykhísinhthì mọc yếu Màu sắc sợikhísinhrấtphongphú,làmàuvàng,trắngsangmàucamsốngđộnghoặctừnâuđensangmàuđensaukhih ìnhthànhbàotử(Hình3.13).ThêmvàođóviệcquansátdướikínhhiểnviđiệntửSEM,bàotửđượcsinhrađơn lẻvàcóđườngkínhkhoảng0,5-1µm.Cácbàotửlàdạngnốtvàmịntrênbềmặtvàkhơngdichuyểnđược(xemHình3.13).Các hìnhtháibàotửđượccoilàmộttrongnhữngđặcđiểmquantrọngtrongviệcđịnhlồixạkhuẩn Hình 3.13.Hình ảnh khuẩn lạc đĩa thạch bào tử kính hiển vi điện tử qt(SEM)tươngứngcủa10chủngnghiêncứu 3.4.2 Nhângen16SrRNA TừDNAgenomcủa10chủngnghiêncứu,sửdụngcặpmồi16SF,16SR,chúngtơitiến hànhPCR nhânđoạngen16SrRNA, vớichutrìnhnhiệt: Nhiệtđộ Thờigian(phút) 94oC 94oC (30cycles) 46oC 72oC 1,5 72oC 4oC Vớicặpmồiđượcthiếtkếdựatrêntrìnhtựbảothủcủagen16SrRNAxạkhuẩnvàkhnlàDNAgen omthìtheolýthuyếtsảnphẩmPCRcóđộdàixấpxỉ1500bp(Hình3.14) M 10 Ghi chú: Giếng M: thang DNA chuẩn Thermo 250bp; Giếng 1- 10 sản phẩm PCR theo thứ tự chủngG017,G019,G039,G043,G044,G047,G057,G065,G068vàG120 Hình3.14.ĐiệndiđồsảnphẩmPCRgen16SrRNA 10chủngnghiêncứu 3.4.3 Giảitrìnhtựgenvàdựngcâyphânloạicủa cácchủng 12 HF674982Micromonosporas p S E g y p t JX503 975Micromonospora sp PVA 112-08 17 NorwayKR906525Micromonosporasp.HBUM179191ChinaKF678405 97 Micromonospora sp.NEAU-GLH9 ChinaKF793800 46 22 Micromonosporasp SW3Tunisia G068 COTOTHANHLANVN 55 GU002092 Micromonospora sp FXJ6.144 97 31 ChinaEU437824 Micromonospora sp 206203 ChinaG043COTOTHANHLAN VN GQ339909Micromonosporasp.JSM5- 92 1ThailanG044COTOTHANH LANVN 21 94 AY040625Micromonosporasp.CNH394USA 12 G047COTOTHANH LAN VN 10 GQ339909 Micromonospora sp JSM5-1 ThailandEU714258Micromonosporasp.R1MexicoFJ263420Micr omonosporasp.213425ChinaHF674981Micromo nosporasp.S12EgyptKM456226Micromonospor 99 asp.MSSRFM60IndiaKM456224Micromonospora sp.MSSRFM95IndiaEU437804Micromonosporas 34 p.202203China G019HALONGCATBAVN KP339505Micromonosporasp.S70 SC13ThailandKM456224Micromonosporasp.M SSRFM95IndiaG017HALONGCATBAVN KM456225Micromonosporasp.MSSRFM107IndiaG0 39 Ha LongCatBa VN 100 33 EU214935Streptomycessp.CNQ153SD01USAJQ670764 Streptomyces sp 135001 ChinaHQ873939 Streptomyces sp 97 AML828 MexicoG065VANPHONGVN 100 34 GU808333Streptomycessp.VITTK3IndiaA Y336514Nocardiopsissp.20039ChinaG05 7COTOTHANH LAN VN 100 90 KM886195Nocardiopsissp.13-338ChinaG120BAITU LONGVN Hình3.15.Câyphátsinhlồidựatrêntrìnhtựgen16SrRNAcủacácchủngnghiêncứu Câyphátsinhlồidựatrêntrìnhtựgen16SrRNAh o n chỉnhchothấymốiquanhệ chủng nghiên cứu với thành viên đại diện chiMicromonosporasp.,Stretomycessp.,Nocardiopsissp Nghiên cứu quan hệ chủng phátsinh lồi (Hình 3.15) cho thấy: Chủng G017, G019,G043, G044, G047, G068, G120 cómối quan hệ gần gũi với chủng thuộc chiMicromonosporasp., chủng G039, G065thuộcchiStretomycessp.,chủngG057thuộcchiNocardiopsissp Trong số chủng thể hoạt tính kháng VSVKĐ kháng lao, chủng(G019, G043, G057, G065 G120) lựa chọn sinh khối lượng lớn (30 l) vàtiến hànhnghiêncứucáchợpchấtthứcấp 3.5 Kếtquảsinhkhốilƣợnglớncácchủngcóhoạttínhcaonhất Tiến hành thao tác nêu phần phương pháp, đĩa cấy nuôi tủ ấm28oC,sau7ngàykiểmtrađộthuầnkhiếtcủacáckhuẩnlạc.Khuẩn lạccủa5chủngđượclựachọncómàusắc,bềmặt,hìnhdạngđặctrưng,khơngcócácmàusắcvàsắctốlạ.Tiến hànhnhângiốngcấp1:Dùngquecấylấymộtsốkhuẩnlạcriêngrẽcấyvàobìnhtamgiác125mlchứa10mlm ơitrườngA1.Nilắc(200vịng/phút)ở28oCtrong7ngày,sauđónhângiốngcấp2:Chuyển10mldịchnigiốngcấp 1vàomỗibìnhtamgiác1000mlchứa 500 ml mơi trường A1 (với tỉ lệ bổ sung giống 2%), chế độ ni tương tự nhưnhângiốngcấp1(Hình3.16) Hình3.16.Hìnhảnhhoạthốvànhângiốngcấp1củacácchủngnghiêncứu Tiến hành lên men 30 lít cho chủng: Chuẩn bị 30 bình tam giác 2800 ml cóchứa sẵn 1000 ml mơi trường A1+, khử trùng để nguội Bổ sung bình 20ml dịchnhân giống cấp (với tỉ lệ bổ sung giống 2%) Sinh khối với điều kiện trình bày ở(Bảng3.10), sau7-14ngàythuhồi sảnphẩm(Hình3.17) Hình3.17.Hìnhảnhnhângiốngcấp2vàsinhkhối30lít/1chủng Bảng3.10.Điềukiệnnicấylượnglớncủa5 chủngnghiêncứu STT Ký hiệu Tênđịnhdanh Điềukiệnnicấy Thờigianlên men7ngày,nhiệtđộ28 o Ct ố c độlắc200vòng/phút Thờigianlênmen7ngày,nhiệtđộ28oCG043 Micromonosporasp.G043 30oC,tốcđộlắc200vòng/phút Thờigian lênmen7ngày,nhiệtđộ28 G057 Nocardiopsissp.G057 o Ctốcđộ lắc200vòng/phút Thờigianlênmen10ngày,nhiệtđộ28oCG065 Streptomycessp.G065 30oC,tốcđộlắc200vịng/phút Thờigianlênmen14ngày,nhiệtđộ28oCG120 Micromonosporasp.G120 30oC,tốcđộlắc200vịng/phút 3.6 Táchchiếtvàxácđịnhcấutrúchóahọccáchợpchấtthứcấp 36.1.Cáchợp chấtthứcấp từ chủngxạkhuẩnMicromonosporasp G019 Quá trình chiết xuất tách chiết hợp chất thứ cấptừ chủngMicromonosporasp.G019đãđượcthựchiệnbằngcácphươngphápsắcký Từcáccặnchiếttừdịchlênmen,10hợpchấtkýhiệutừG019-1đếnG01910đãthuđược.Cấutrúchóahọccủacáchợpchấtnàyđượcxácđịnhbằngcácphươngphápphổ,đặcbiệtp hổMSvàNMR Hợpchất3,4-Dihydroxy-6,7-dimethyl-quinolin-2-carboxylic(G019-1) Hợp chấtG019-1thu dạng chất rắn màu vàng Phổ khối phân giải caoHRESI-MSchopicionphântửprotonhóaởm/z234,0761 [M+H]+(tính tốn cho CTPTC12H11NO4làm/ z234,0766), cho phépxác định công thức phân tử C 16H11NO4 Trênphổ1H- NMR cho tínhiệu nhóm metin vịng thơm dạng singlet δ H7,89 (1H, s,H-5)và7,68(1H,s,H8),2nhómmetylởδH2,45(3H,s,CH3-10)và2,48(3H,s,CH3-11) Dựavàophổ13C-NMR,DEPTvàHSQCchophépxácđịnhhợpchấtG019-1có12 nguyên tử cacbon có nhóm metyl δ C19,4 (CH3-10) 20,0 (CH3-11), 1nhómcacbonylởδC160,5(COOH)và9cacbonvịngthơmởδC125,8(C-8),128,6(C-5),129,8(C4a),138,5(C-8a),144,8(C-7),146,3(C-2)và149,9(C-3).Độchuyểndịchhóa họccủa4cacbonbậc4vềphíatrườngthấplàC-8a,C-2,C-3vàC-4chophépxácđịnh4cacbonnàyliênkếtvớidị tố (nitơ oxy) Các cacbon tương đồng hợpchất3,4-dihydroxy-quinolin-2carboxylicđượctáchchiếttừmộtsốloàihảimiên(JayatilakeGSetal.,1996;WangLetal.,2012) (xemBảng3.1) Bảng 3.1.DữliệuphổN M R củahợp chất(G019-1)(DMSO, H:500.13MHz,13C:125.76MHz) C H,mult.J(Hz) C H,mult.J(Hz) C C 149,9 4a 129,8 146,3 8a 138,5 128,7 7,89 (s,1H) CH3-10 19,4 2,46 (s,3H) 144,8 CH3-11 20,0 2,48 (s,3H) 139,0 COOH 160,5 125,8 7,68 (s,1H) G019 Micromonosporasp.G019 Phổ HMBC (hình 3.20-3.21 bảng 2.1 phụ lục 3) cho tương tác xa protoncủanhómCH 3ởδ H2, 45 (CH 3-10)với C - 6, C -5, C- 7c ho phépxá c đ ị n h nhómmetylnàygắnvớicacbonC6.TươngtácxagiữaprotoncủanhómCH 3ởδ H2,48(CH 3-11) với C-6, C-7, C-8 cho phép xác định nhóm metyl gắn với cacbon C-7 Ngoài ratương tác H5 với C-4 C-8a cho phép xác định liên kết C-4a với C-4, C-5 vàC-8a.Kết hợp kiện phổ MS, 1D- NMR 2D- NMR cho phép xác định chấtG019-1là3,4-dihydroxy-6,7-dimethylquinolin-2-carboxylic.Đâylàmộthợpchấtmới CấutrúchóahọccủahợpchấtG019-1 Hợpchất2-((-5-methyl-1,4-dioxan-2-yl)methoxy)ethanol(G019-2) ChấtG019-2thu dạng chất dầu không màu Phổ khối phân giải caoHRESI-MS cho pic ion hóa giả phân tử ởm/z199,0946 [M+Na]+(theo tính tốn lýthuyếtc ho C T P T C 8H16NaO4l m/z199,0941), chophépxá cđ ịn h công thức phântử củalàC8H16O4 Phổ13C- NMR DEPT cho thấy phân tử có nguyên tử cacbon, trongđócó2 nhóm metin lai hóa sp3ở δC71,2 (C-2); 75,5 (C-5), nhóm metylen 69,2 (C-3),71,2(C10),71,4(C-9),71.5(C-7)và75,7(C-6) và1 nhómmetyl ởδC17,7 Phổ1H- NMR xuất tín hiệu nhóm metyl δ H1,10 (d,J= 6,5 Hz, 3H,CH311)và12protonnằmtrongkhoảngδ H3,35–3,63.Độchuyểndịchhóahọccủacác nhóm metinvàmetylentrênphổ1H- NMR và13C- NMR cho phép xác định tất cảcácnhómnàyđềugắnvới oxy (xemBảng3.2) Bảng 3.2.DữliệuphổN M R củahợpchấtG019-2(CD3)2CO, H:500.13MHz,13C:125.76MHz) Cno C(ppm) 71,2 69,2 75,5 75,7 1’ 71,5 3’ 4’ CH3-5 71.4 71,2 17,7 H(ppm),J(Hz) 3,59(m,1H) 3,63(m,2H) 3,62(m,1H) 3,35(dd,J=5,0;10,0Hz,1H) 3,47(dd,J=6,0;10,0Hz,1H) 3,56(m,1H) 3,58(m,1H) 3,59(m,2H) 3,59(m,2H) 1,10(d,J=6,5Hz,3H) Phổ HMBC cho tương tác xa proton δ H3,35 and 3,47 (CH2-6) với C-2 tương tác proton nhóm CH 2-3 3,63 với C-5 cho phép xác định vòng 1,4dioxane Tương tác xa nhóm metylv i C - v C - v t n g t c g i ữ a n h ó m metylen CH2-9 với C-7, tương tác CH2-7 với C-3 cho phép xác định nhóm metylgắn vịtrí C-5 vànhómetylenglycolgắnvớiC-7quanguntửoxy Hai proton nhóm CH2-6 cho tương tác lớn (J=10,0 Hz) tương tác nhỏhơn (J= 5,0 6,0 Hz) Tương tác lớnJ=10,0 Hz xác định tương tác germinalgiữa proton CH2-6 Hai tương tác nhỏ khơng đặc trưng cho tương tácantihaygauche.Mặtkhác,docáctínhiệuchồnglấpnêncấuhìnhtươngđốicủaC-2vàC-5khơngxác địnhđược1cáchrõràng.Từcácdữliệuphổ 1H- NMR,13C- NMR, HSQC, HMBC,chophépxácđịnhchấtG019-2là 2-((-5-methyl-1,4-dioxan-2-yl)methoxy)ethanol Hợpchấtnàylầnđầutiênđượccôngbố thứ với nhân indol C-3’ C-3” nhân indol phụ lục 14 Từ phân tích kết hợp với phổ khối thiết lập nên cấu trúc hợp chất G0574nhưởhìnhvẽxácđịnhđượchợpchấtG057-4là3,3-(2,3-dihydroxypropyl)diindole Cấu trúchóahọchợpchấtG057-4 Hợp chất 2-hydroxy-1-(1H-indol-3-yl)-1-propanone (G057-5), Hợp chất 3hydroxyacetylindole(G057-6), Hợp chấtacid3-indolylacetic(G057-7) vàHợpchất3-indolecarbadehyde(G057-8) HợpchấtG57-5thuđượcdướidạngchấtrắnmàuvàng,độquaycực[α]]2 D 42o(c0,21;CDCl3).PhổkhốiESI-MSxuấthiệnpicởm/z188,07[M+H]+.Trênphổ1HNMRởvùngtrườngthấpxuấthiệncáctínhiệucủa5protonthuộcvùngaromaticởδH7,36(2H,m,H5’,6’);7,45(1H,m,H-7’);7,91(1H,d,J=3,0Hz,H-2’);8,34(1H,m,H-4’),cịnởvùng trườngcaocótínhiệucủamộtnhómmetylởδH1,54(3H,d,J=7,0Hz,H3),ngồiraphổprotoncũngchobiếtsựcómặtcủamộtnhómmetincóliênkếtvớioxiở4,96(1H,q,J=7, 0Hz,H-2).Phổ13C- NMR DEPT củaG57-5xuất tín hiệu 11 nguyên tửcacbon bao gồm nhóm CH có CH thuộc vùng aromatic δ C111,5; 122,3;123,1;124,2;131,5;1nhómCHcóliênkếtvớioxiởδC69,8;mộtnhómmetylởδC23,6và4cacbo n bậc có nhóm C=O δ C197,1 Phân tích phổ COSY hợp chấtG575nhậnthấyhợpchấtG57-5có2hệspin.HệthứnhấtlàởvùngaromaticbắtđầutừH-4’(δH8,34)quaH5’,H-6’(δH7,33-7,46)vàkếtthúcở H-7’(δH7,45).Hệspin thứ2thểhiệntươngtácliềnkềgiữa2nhómCH3vànhómoximetin(hình3.13phụlục3).TrênphổHM BC, tín hiệu proton δH7,91 (1H, d,J=3,0 Hz, H-2’) δH7,45 (1H, m, H-7’); δH8,34(1H, m, H-4’)đều có tương tác với C-3’a C-7’a, tương tác H-2’ (δ H7,91) H4’a(δH8,34)vớiC-3’(δC113,9)chứngtỏsựcómặtcủanhânindoltrongphântửcủahợpchấtG575.Ngồira,protonthuộcnhómmetylởδH1,54vàprotonH2’thuộcnhânindol(δH7,91)cùngcótươngtácvớinhómC=OtrênphổHMBCthiếtlậpnêncấutrúccủ ahợpchấtG57-5.Nhưvậy,bằngcáchphântíchkếthợpcácphổMS,1Dvà2D-NMRvàsosánhvớitài liệuthamkhảochophépxácđịnhđượccấutrúccủachấtG57-5là 2-hydroxy-1-(1H-indol-3-yl)-1-propanone Cấu trúchóahọccáchợpchấtG057-5đếnG057-8 Hợp chấtG57-6thu dạng chất rắn màu vàng Trên phổ 1H- NMR, ởvùng aromatic xuất tín hiệu tương tự hợp chấtG57-5đó δH7,31 (2H,m,H5,6);7,45(1H,m,H-7);7,92(1H,brs,H-2);8,24(1H,m,H-4).Sựkhácnhau phổ proton hai hợp chấtG57-5vàG57-6đó tín hiệu singlet nhómmetylen có liên kết với oxi δ H4,76 phổ củaG57-6thay tín hiệu doublet củanhóm metyl tín hiệu quartet nhóm oximetin phổ hợp chất G575.Từnhững phân tích kết hợp với tham khảo tài liệu xác định hợp chấtG57-6là dn xuất củahợpchấtG57-5có tênlà3-hydroxyacetylindol(phụ lục16) HợpchấtG57-7thuđượcdướidạngchấtrắnmàuhồng,độquaycực[α]]2 D o 72 (c0,42;C DC l 3).Ph ổ k h ố i E SI -M S x u ấ t h i ệ n c c t í n h i ệ uở m / z 176, 07 [ M + H ] + ,1 98, 05 [M+Na]+.Phổ1H-NMRcủahợpchấtG577ởvùngaromaticxuấthiệncáctínhiệutươngtựnhưcủahợpchấtG57-5vàG576đólàδH6,93(1H,t,J=7,5Hz,H-5);7,03(1H,t,J=7,5Hz,H-6);7,16(1H,brd,H2);7,30(1H,d,J=7,5Hz,H-7);7,50(1H,d,J=8,0Hz,H-4) Tuynhiên,ởvùngtrườngthấpxuấthiệnthêmtínhiệusingletởδH10,75cịnởvùngtrườngcaoxuấthiện tínhiệusingletởδH3,48.Phổ13C-NMRvàDEPTcủahợpchấtG577chobiếtphântửcó10nguntửcacbonbaogồm:5nhómmetinthuộcvùngaromaticởδC111,0;117,9;11 8,8;120,6;123,4;3cacbonbậc4cũngthuộcvùngaromaticởδ C110,0;127,6 ;136,0;1nhómcacbonylởδC174,0vàcuốicùnglà1nhómmetylenởδC33,0.Từnhữngphântíchtrênphổ 1D-NMRkếthợpsosánhvớicácphổcủaG57-5vàG57-6cóthểthấysơbộphântửcủaG577baogồm1nhânindol,1nhómmetylenvà1nhómcacbonyl.Phântíchphổ HMBC cho thấy tín hiệusinglet nhóm metylen δH3,48 mặt có tương tác vớiC-2(δC123,4),C-3(110,0),C4 (118,0)củanhânindol,mặtkháclạicótươngtácvớinhómcacbonyl,từđókếthợpvớiphổkhốicóthểthiếtlập nêncấutrúccủahợpchấtG577nhưhìnhvẽ.TừnhữngphântíchtrênphổNMR,MSkếthợpvớithamkhảotàiliệucóthểxácđịnhđượchợ pchấtG057-7làacid3-indolylacetic(G057-7) HợpchấtG057-8thuđượcdướidạngtinhthểhìnhkimmàuvàngnhạt.Trênphổ1HNMRởvùngaromaticxuấthiệncáctínhiệutươngtựnhưcủahợpchấtG0577đólàδH(ppm)7,32(1H,m,H-5);7,33(1H,m,H-6);7,45(1H,m,H-7);7,85(1H,d,J=3,0Hz, H-2); 8,32 (1H, m, H-4); cịn vùng trường thấp có tín hiệu δ H10,1 Phổ13C-NMR DEPT xuất tín hiệu tương ứng với nguyên tử cacbon thuộc nhânindolởδC111,4(C-7);120,1(C-7a);122,0(C-4);123,1(C-5);124,0(C-3);124,5(C-6); 135,1(C-2).TuynhiênkhácvớihợpchấtG57-7,trênphổ13C-NMRcủahợpchấtG57-8xuất tín hiệu nhóm andehit δC185,1 thay nhóm cacbonyl δC174,0 ởhợpchấtG577.PhântíchphổHMBCchothấytínhiệuprotonởδH10,1tươngtácvớiC3củanhânindolởδC124,0.Nhưvậy,kếthợpphổkhối,phổNMR1chiềuvàhaichiềuvàthamkhảotàiliệuđiđế nkếtluậnhợpchấtG057-8là3-indolecarbadehyde Hợpchấtacid1-hydroxy-4-methoxy-2-naphthoic(G057-9),Hợpchất7-hydroxy-6metoxycoumarin(G057-10) vàHợp chấtXanthone(G057-11) Trên phổ1H- NMR xuất tín hiệu proton thuộc vùng aromatic δH7,29(1H,s,H-7);7,51(1H,dt,J=1,5;8,0Hz,H-3);7,56(1H,dt,J=1,5;8,0Hz,H-2);8,15 (1H,brd,J=8,0Hz,H-1);8,29(1H,brd,J=8,0Hz,H-4),cịnởvùngtrườngcaocótínhiệucủa1 nhómmetoxyở δH3,98(3H,s,CH3O-8).Phổ13C-NMRcủaG0579xuấthiệncáctínhiệucủa12nguntửcacbonbaogồm5nhómmetinvùngaromatic,1nhómmetoxyở δC56,1(8-OCH3);1nhómcacbonylởδC169,8;mộtnhómmetylởδC23,6và4cacbonbậc4trong đócó mộtnhóm C=O δC176,3 (C=O) cacbon bậc Phổ HMBC cho thấytươngtácgiữaprotoncủanhómmetoxyvớiC-8,chophépxácđịnhnhómmetoxygắnvớiC8.Từcácdữliệuphổ1D-NMRvà2DNMRvàsosánhvớitàiliệuthamkhảochophépxácđịnhchấtG057-9làacid1-hydroxy-4-methoxy2-naphthoic Cấu trúchóahọccáchợp chấtG057-9đếnG057-11 Hợp chấtG057-10thu dạng chất rắn màu trắng Phổ 13C- NMR vàDEPT hợp chấtG057-10xuất tín hiệu cộng hưởng 10 nguyên tử cacbongồmcó:mộtnhómmetoxy(OCH 3)đặctrưngbằngtínhiệuδ C56,4;4nhómmetinsp và5cacbonbậc4trongđócómộtnhómcacbonyl(δ C164,4).Trênphổ H-NMRcủa hợp chấtG057-10cho thấy: vùng nhân thơm xuất tín hiệu proton δ H6,85(s,H5),δH6,92 (s, H-8), tín hiệu singlet hai proton chứng tỏ chúng vị trí paraso với vịng benzen, từ cho biết vịng benzen bị vị trí Ngồira, phổ proton cịn xuất proton δ H6,27 (d,J= 9,5 Hz), δH7,60 (d,J= 9,5Hz), số tương tácJ= 9,5 Hz chứng tỏ hai proton vị trí cis so với trênnối đơi Trên phổ HMBC, hai proton thuộc liên kết đôi ởδ H6,27; 7,60 có tươngtác với nhóm cacbonyl (δC161,4), proton H-4 (δ H7,60) có tương tácvới C-5 (δC107,5), C-8a (δC150,3), độ chuyển dịch hóa học δC150,3 chứng tỏ C-8a cóliên kết với oxi, độ chuyển dịch hóa học C-7 (δ C150,3) chứng tỏ C-7 có liênkết với oxi Sự gắn kết nhóm metoxy C-6 vòng benzen nhờ sựxuất tương tác C-6 (δC144,0) với nhóm metoxy (δH3,96) phổ HMBC(hình 3.17 phụ lục 3) Từ phân tích phổ 1D 2D- NMR chứng tỏ hợp chấtG57-10thuộc khung coumarin có nhóm metoxy liên kết với C-6, nhóm hydroxy liênkết với C-7 vòng benzen thuộc khung coumarin So sánh với tài liệu tham kếtluậnđượchợpchấtG57-10là7-hydroxy6-metoxycoumarin Hợp chấtG057-11thu dạng chất rắn màu trắng, điểm nóng chảy174oC Phổ khối ESI-MS cho pic ion phân tử deproton hóa ởm/z194,9 [M-H]- Phổ1H-NMR xuất tín hiệu của4 proton vòng thơm δH6,67 (2H, m, H-2+ H-4); 7,30 (1H,t,J= 7,5 Hz, H-3), 7,92 (1H, d,J= 7,5 Hz, H-1) Trên phổ13C- NMR DEPT xuất hiệntín hiệu nhómcacbonyl δC173,0 (C=O), nhóm metin vịng thơm δ C135,0 (C-3);132,1 (C-1), 116,8 (C-4); 116,5 (C-2) Dựa vào tín hiệu quan sát dựđốn hợp chấtG057-11có cấu trúc đối xứng Phổ HMBC cho thấy tương tác xagiữa H-1 với C-3, C4a C-9, tương tác H-3 với C-1 C-4a, tương tác H-2với C-9a, C-4, C-1, C-3 Từ liệu phổ MS, 1D 2D NMR so sánh với tài liệuthamkhảochophép xácđịnhchất làG057-11là xanthone Hợpc h ấ t C y c l o ( T y r - T r p ) ( G - ) , H ợ p c h ấ t C y c l o - ( P r o T r p ) ( G - ) , HợpchấtCyclo-(Pro-Phe)(G057-15),HợpchấtCyclo-(Pro-Tyr)(G057-16)vàHợpchất Cyclo(Pro-Leu) (G057-17) Hợp chấtG57-13thu dạng chất rắn màu trắng Trên phổ 1H- NMRcủa hợp chấtG57-13, vùng aromatic xuất tín hiệu vịng benzen bị ởvịtrí1,4ở δH6,46 (2H, d,J=7,5 Hz, H-Tyr); 6,63 (2H, d,J=7,5 Hz, H-Tyr) tín hiệucủa nhân indol (bao gồm tín hiệu vịng benzen bị vị trí 1,6 protonsinglet δH7,03-7,60), cịn vùng trường cao xuất tín hiệu proton δH1,48[1H,d d , J =8,5;1 , H z , C H 2a(Tyr)];2 , [ H , dd, J =4,0;1 , Hz, C H 2b(Tyr)];2 , 76 [1H,d d , J =6,0;1 , H z , C H 2a(Trp)];3 , [ H , d d , J =4,0;1 , H z , C H 2b(Trp)].P h ổ 13 C- NMR DEPT cho biết phân tử có 20 nguyên tử cacbon bao gồm: nhóm metylenở δC31,2; 40,6; nhóm metin có liên kết với nitơ ởδ C57,1; 57,9; nhóm cacbonylamit ởδ C169,3; 169,7 14 cacbon thuộc vùng aromatic ởδ C109,6-157,5 Từ cácphântíchvềphổ1D-NMRởtrêngợiý đếnhợpchấtG57-13làmộthợpchấtdicyclopeptide hợp phần acid amin tyrosin tryptophan Kết hợp so sánh vớitàiliệuthamkhảođiđếnkết luậnhợpchấtG57-13làCyclo (Tyr-Trp) Cấu trúchóahọccáchợpchấtG057-13đếnG057-17