0137 tinh sạch và nghiên cứu đặc tính của cellulase tự nhiên và tạo cellulase tái tổ hợp từ nấm sợi tại việt nam luận văn tốt nghiệp

BỘGIÁODỤCVÀĐÀOTẠO ĐẠIHỌCTHÁINGUN TRỊNHĐÌNHKHÁ TINH SẠCH VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH CỦACELLULASE TỰ NHIÊN VÀ TẠO CELLULASE TÁITỔHỢPTỪNẤMSỢI TẠI VIỆTNAM Chuyên ngành: Hóa sinh họcMãsố:62.42.01.16 TĨMTẮTLUẬN ÁNTIẾNSĨSINHHỌC THÁINGUN-2015 Cơngtrìnhđược hồnthànhtại: TRƢỜNGĐẠIHỌCKHOAHỌC-ĐẠIHỌCTHÁINGUNVIỆN CƠNGNGHỆSINHHỌC-VIỆNHÀNLÂM KHOAHỌCVÀCƠNGNGHỆVIỆTNAM Ngƣờihƣớngdẫnkhoahọc: 1.PGS.TS.QuyềnĐìnhThi 2.PGS.TS Nghiêm NgọcMinh Ngƣờiphảnbiện1:…………………………………… …………………………………… Ngƣờiphảnbiện2:…………………………………… …………………………………… Ngƣờiphảnbiện3:…………………………………… …………………………………… LuậnánsẽđƣợcbảovệtrƣớcHộiđồngchấmluậnáncấpĐạihọcHọptại:TR ƢỜNGĐẠIHỌCKHOAHỌC-ĐẠIHỌCTHÁINGUYÊN Vào hồi ngày tháng năm2015 Có thể tìm hiểu luận án tại:ThƣviệnQuốcgia Trung tâm học liệu Đại học Thái NgunThƣviệnTrƣờngĐạihọcKhoahọcTháiNgu n DANHMỤCCÁCCƠNGTRÌNHCĨLIÊNQUANĐẾNĐỀTÀI Dinh Kha Trinh, Dinh Thi Quyen, Thi Tuyen Do, Thi Thu HuongNguyen,NgocMinh Nghiem (2013),“Optimization ofcultureconditions and medium components for Carboxymethyl Cellulase(CMCase) production by a novel basidiomycete strainPeniophorasp.NDVN01”,IranianJournalofBiotechnolo gy,11(4),pp.251259.(SCI-E) Dinh Kha Trinh, Dinh Thi Quyen, Thi Tuyen Do, Ngoc MinhNghiem(2013),“Purificationandcharacterizationofanoveldet ergentand organic solvent-resistant endo-beta-1,4glucanasefrom a newly isolated basidiomycetePeniophorasp NDVN01”,TurkJ Biol, 37, pp 377-384.(SCI-E) Trịnh Đình Khá, Quyền Đình Thi, Nghiêm Ngọc Minh (2012),“Nhân dịng phân tích trình tự gene 28S rRNA chủng nấmđảm sinh tổng hợp cellulase”,Tạp chí Khoa học Công nghệ -Đại học TháiNguyên,Tập96, Số 8, pp.115-118 Trinh Dinh Kha, Quyen Dinh Thi, Nghiem Ngoc Minh (2012),“OptimizationofcarboxymethylcellulaseproductionbyBasi diomycetePeniophorasp.NDVN01undersolidstatefermentation”, Proceedings The Second Academic conference onNatural Science for Master and PhD Students from Cambodia -Laos - Malaysia – Vietnam, Publishing House for Science andTechnology,pp 445450 Trịnh Đình Khá, Quyền Đình Thi, Nghiêm Ngọc Minh (2011),“Tối ưu sinh tổng hợp carboxymethyl cellulase từ chủng nấm đảmPeniophorasp NDVN01 điều kiện lên men rắn”,Tạp chíCơngnghệ Sinhhọc,Tập 9,Số 4, pp 845-852 Trìnhtự gen đăngkýtrênGenBank:mã sốJF925333 MỞĐẦU Cellulaseđượcứngdụngtrongcôngnghiệpthựcphẩm,sảnxuấtthức ăn chăn nuôi,sảnxuấtbia,bộtgiấy,ngànhcôngnghiệpchấttẩyrửa, ngành công nghiệp dệt may, nhiên liệu hóa chất, quản lý chấtthảivàxửlýơnhiễmmơitrường Việc khai thác ứng dụng cellulase từ nguồn tự nhiên gặp nhiềuhạn chế lực sinh tổng hợp chủng giống, không chủ động,khó can thiệp thay đổi tính chất động học enzyme, độ bền nhiệt độvàpH,khảnănghoạtđộngtrongnhữngđiềukiệnnồngđộcaochấttẩyrửavàdung mơihữucơ Trênthếgiới,đãcónhiềuphươngphápđượcđưarađểnângcaonăngsuấtcel lulasenhưlàtuyểnchọncácchủngcókhảnăngsinhtổnghợp cellulase cao, tối ưu hóa điều kiện lên men nhằm thu đượclượng lớn enzyme Đặc biệt với phát triển cơng nghệ, mộtsố gen mã hóa cellulase vi sinh vật thực vật tách dòngvàđưavàobiểuhiệnmứcđộlớnởcáchệbiểuhiệnkhácnhau (biểuhiện E coli, nấm men, nấm mốc) Ở Việt Nam, việcnghiên cứu cellulase chủ yếu dừng việc phân lập tuyển chọn cácchủngvisinhvậtsảnxuấtenzymecaovàđánhgiámộtsốtínhchấtcủaenzyme để ứng dụng cơng nghệ sinh học xử lý mơi trường.Việcnghiêncứutạochếphẩmcellulasetáitổhợpvàứngdụngcácchếphẩmnà ycịnhạnchế Xuất phát từ lý tiến hành thực đềtài luận án:“Tinh nghiên cứu đặc tính cellulase tựnhiênvàtạocellulasetáitổhợptừnấmsợitạiViệtNam” Mụctiêunghiêncứu (i) Tinhsạchvàđánhgiáđượcđặctínhcủacellulasetựnhiêntừchủngnấmt uyểnchọnlàmcơsởứngdụngvàtạocellulasetáitổhợp (ii) Tạo endoglucanase tái tổ hợp không chứa peptide tínhiệu từ nguồn gen phân lập từ chủng nấm sợi tuyển chọntạiViệt Nam Nộidungnghiêncứu 3.1 Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm có khả sinh tổng hợpcellulasemạnh trongbộ sưutậptừ nhiều nguồn khácnhau; 3.2 Nghiên cứu tốiưu thành phầnmơitrường,điềukiện lênm e n quym p h ị n g t h í n g h i ệ m p hù h ợ p v i c h ủ n g n ấ m t uy ể n c h ọ n l m cơsởsảnxuấtcellulasetựnhiên; 3.3 Tinh phân tích tính chất lý hóa cellulase tinh từchủngnấmchọn lọctạiViệtNam; 3.4 Nghiên cứu biểu gen mã hóa endoglucanase khơng chứapeptide tín hiệu từ chủng nấmAspergillus nigerVTCC-F021 trongPichia pastorisGS115 tối ưu môi trường lên men phù hợp để sảnxuấtendoglucanase táitổ hợp khơngchứapeptidetínhiệu; 3.5 Tinh phân tích tính chất lý hóa endoglucanase tái tổhợp khơngchứa peptidetínhiệu Nhữngđónggópmớicủaluậnán (i) EndoglucanasetừchủngnấmPeniophorasp.NDVN01tuyểnchọn tạiViệtNamlầnđầutiênđượctinhsạchcókíchthướckhoảng 32 kDa Endoglucanase có độ bền cao khoảng nhiệt độ30-37°C pH 4,0-7,0 Enzyme bền dung môi acetone ởnồng độ 1-20%; ethanol butanol-1 nồng độ 1-5%; isopropanol ởnồng độ 1-15% độ bền cao chất tẩy rửa Tween 20, Tween80,TritonX-100vàtritonX114 (ii) Gen mã hóa endoglucanase A khơng chứa peptide tín hiệu(meglA)từc h ủ n g A.nigerVTCCF021đãđư ợ cbiểuhiệnthànhcơngtrongP.pastorisGS115.Endoglucan aseAtáitổhợp(rmEglA) tinh có kích thước khoảng 32 kDa Enzyme hoạt động tối ưu nhiệtđộ 50°C, pH 3,5, bền 30-37°C bền khoảng pH 3,0-8,0.Enzyme độ bền cao chất tẩy rửa Tween 20, Tween 80, TritonX-100vàtritonX-114 Ýnghĩakhoahọcthựctiễncủaluậnán 5.1 Ýnghĩakhoahọc Kếtquảnghiêncứugópphầnlàmsángtỏđặcđiểmhóasinhcủaendoglucanase có nguồn gốc từ nấm thuộc chiPeniophoravà gópphầnlàmsángtỏảnhhưởngcủapeptidetínhiệuđếntínhchấtendoglucanase củachủngA nigerVTCC-F021 biểu nấmmenPichiapastoris Kết tạo endoglucanase tái tổ hợp khơng chứa peptide tínhiệuđãcủngcốthêmcơsởkhoahọctronghướngcảibiếnhoạttínhvàtínhchấte nzymetáitổhợpbằngcáchcắtbỏđoạnpeptidetínhiệu Các báo khoa học cơng bố tạp chí khoa học chuyênngành quốc tế nước với trình tự gen công bố sởdữ liệu Ngân hàng gen Quốc tế tài liệu có giá trị tham khảotrongnghiêncứuvàgiảngdạy 5.2 Ýnghĩathựctiễn EndoglucanasetừchủngnấmPeniophorasp.NDVN01vàendogluc anasetáitổhợpkhơngchứapeptidetínhiệucótínhchấtphùhợpvớihướngứngd ụngsảnxuấtchếphẩmbổ sungvàothứcănchănniđểchuyểnhóahợpchấtglucannângcaohiệuquảsửdụng thứcănvàtăngtrọngvậtni.Đồngthời,haienzymenàycóthểsửdụngtrongchuyểnh óasinhhọcngunliệu,chấtthảinơngnghiệpgiàucellulosethànhđườngsửdụn gtrongcơngnghiệplênmen Thànhphầnmơitrườngvàđiềukiệnlênmentốiưuđốivớichủng Peniophorasp.NDVN01vàchủngP.pastoristáitổhợpcóthểđượcsử dụngđểlênmenlượnglớn,phùhợpđểsảnxuấtchếphẩmendoglucanasetựnhiê nvàtáitổhợptrongđiềukiệnthựctiễntạiViệtNam *BốcụccủaLuậnán Luậnángồm126trang(khơngkểphụlục),mởđầu4trang,tổngquantàiliệu27 trang;vậtliệuvàphươngphápnghiêncứu13trang;kết 46 trang; thảo luận 11 trang; kết luận đề nghị trang Luậnáncó18bảngthểhiệnkếtquảnghiêncứu,31hìnhảnhminhhọa,189tài liệu thamkhảo,trongđócó24tàiliệutiếngViệtvà161tàiliệutiếngAnhvà04địachỉtrangweb Chƣơng1.TỔNGQUANTÀILIỆU Luận án tham khảo 24 tài liệu tiếng Việt 161 tài liệu tiếngAnhvà04địachỉtrangwebchuyênngànhđểtổngkếtcácnộidungcóliên quan baogồm:(1)Cellulase;(2)Ứngdụngcủacellulase;(3)Nghiên cứu tạo cellulase tái tổ hợp; (4) Nấm sợiPeniophorasp.,Aspergillusniger Cellulase nhóm enzyme thủy phân có khả cắt mối liênkết-1,4-Oglycosidetrongphântửcellulose,oligosaccharide,disaccharide số chất tương tự khác (Saranraj đtg, 2012).Cáccellulaseđượcứngdụng rộngrãitrongnhiềungànhcôngnghiệpnhư: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc,công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ, sản xuất chất tẩy rửa, côngnghiệp giấy bột giấy, đặc biệt công nghệ xử lý rác thải sảnxuất phânbónvisinh(Kuhadvà đtg,2011; Sharada vàđtg,2013) Cho đến nay, giới có nhiều tác giả nghiên cứu vềbiểuhiện cellulase nhiều hệthống biểuhiện Yang vàđtg(2010)đãnhândòngvàbiểuhiệncellulasebềnnhiệttừchủngBacillu s subtilis15 trongE coliB L (DE3) Năm 2011, P e n g v đtgđãbiểuhiệnthànhcơnggenmãhóacellulasebềnnhiệttừ Clostridium thermocellumtrongE coli.Năm 2001, Hong đtg đãphân lập gen mã hóa β-glucanase từA nigerIF031125 biểu hiệntrong nấm men Zhao đtg sử dụng phương pháp tối ưu hóacodon geneng1từA nigerIFO31125 thu gensyn-eglbị thayđổi1 93 n u c l e o t i d e , nh phầnG + C giảmtừ5 4% x uố ng 44 %.S a u đóđượcchènvàovectorpPIC9K,đặttronghệbiểuhiệnP pastorisGS115 Rashid CS (2008) biểu F1-CMCase (24 kDa, 221aa) từA aculeatustrongA oryzaeniaD300 Hoạt tính enzyme tái tổhợp đạt cao (18,3 U/ml) sau 120 biểu môi trườngchứa nguồntinhbột Ở Việt Nam, hầu hết nghiên cứu quan tâm đếnglucanase tự nhiên, có nghiên cứu đề cập đến-glucanase tái tổhợp.Năm2010,Nguyenvàđtgđãnhândịnggenmãhóa-glucosidase từA nigerPBC biể u hiệ n nh công P.pastorisSMD1168 vớ i hệvectorbiể u hiệ n làpPIC Trần Đình Mấnvà đtg (2010) dựa kỹ thuật megaprimer, gắn thành cơng đoạngen mã hóa exoglucanase (1450 bp) từCellulomonas fimiATCC484và promoter (180 bp) từB subtilisvà biểu trongE colicó hoạttính 0,25 U/ml Năm 2011, Phạm Thị Hịa đtg nhân dịng vàbiểu thành cơng gen eglA mã hóa endoglucanase thuộc họ 12 từchủngA nigerVTCC-F021 nấm menP pastorisGS115 Tuynhiên, suất biểu chủng tái tổ hợp thấp tính chất chưaphùhợpđịnh hướngứngdụngtrongchăn ni Chƣơng2.VẬTLIỆUVÀPHƢƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 2.1 Vậtliệu,hóachấtvàđịađiểmnghiêncứu 2.1.1 Vậtliệu Bộsưutập42chủngnấmdophịngCơngnghệsinhhọcenzyme -Việncơngnghệsinhhọc-ViệnHànlâmKhoahọcvàCơngnghệ Việt Nam, phịng thí nghiệm sinh học - Khoa Khoa học Sự sống TrườngĐạihọcKhoahọc-ĐạihọcTháiNguncungcấp 2.1.2 Hóachất Hóachấtsửdụngtrongthí nghiệmđều ởdạngtinhkhiếtdocáchãnguytínchuncungcấphóachấtphântíchcủaMỹ,Đức ,TâyBanNhacungcấp 2.1.3 Địađiểmnghiêncứu Các thí nghiệm thực từ tháng năm 2009 PhịngCơng nghệ sinh học enzyme Phịng thí nghiệm trọng điểm Côngnghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa họcvàCơngnghệ ViệtNam Cơng trình hoàn thành Khoa Khoa học Sự sống TrườngĐạihọcKhoa học -ĐạihọcTháiNguyên 2.2 Thiếtbịthínghiệm Các thiết bị sử dụng làm thí nghiệm mới, đại vàcó độ xác cao thuộc phịng Cơng nghệ sinh học Enzyme vàPhịng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinhhọc,ViệnKhoahọcvàCôngnghệViệtNam 2.3 Phƣơngphápnghiêncứu 2.3.1 Cácphươngphápvisinhvật Ni cấy hoạt hóa nấm mốc; Nuôi cấy nấm thu enzyme; NuôicấyE.coli;NuôibiểuhiệnChủngP.pastoristáitổhợp 2.3.2 Cácphươngphápsinhhọcphântử 2.3.2.1 TáchchiếtDNAtổngsốcủanấmmốc 2.3.2.2 TáchchiếtDNAtổngsốnấmmen 2.3.2.3 TáchDNAplasmidtheoSambrookvàRusel 2.3.2.4 Cắtplasmidbằngenzymegiớihạn 2.3.2.5 TinhsạchphânđoạnDNA 2.3.2.6 NhânbảngenbằngPCR 2.3.2.7 Phảnứngnốighépgen 2.3.2.8 Biếnnạpbằngsốcnhiệt 2.3.2.9 Biếnnạpbằngxungđiện 2.3.2.10 Giảitrìnhtựnucleotidetheophươngphápgiảitrìnhtựtựđộng 2.3.3 Cácphươngpháphóasinh 2.3.3.1 Xácđịnhhoạttínhcellulasetheođườngkínhthủyphântrênđ ĩathạch 2.3.3.2 XácđịnhhoạtđộcellulasetheophươngphápcủaMiller1959 2.3.3.3 Tinhsạchcellulasetựnhiênbằngsắckýlọcgel 2.3.3.4 Tinhsạchproteintáitổhợpbằngsắckýáilực 2.3.3.5 Điệndigelpolyacrylamide(SDS-PAGE)theoLemmli1970 2.3.3.6 ĐiệndiSDS-PAGEnhuộmhoạttính 2.3.3.7 XácđịnhhàmlượngproteintổngsốtheoBradford1976 2.3.3.8 Nghiêncứuảnhhưởngcủamộtsốyếutốlýhóalênhoạttínhvàđộbề ncủacellulasetựnhiênvàtáitổhợp ĐộnghọccủaphảnứngenzymeNhiệ tđộvàpHtốiưu ĐộbềnnhiệtvàđộbềnpH Ảnhhưởngcủaionkimloại,chấttẩyrửavàdungmôihữucơ 2.3.3.9 XácđịnhsảnphẩmthủyphânbằngkỹthuậtTLC 2.4 Xửlýsốliệu Phần mềm Microsoft Excel sử dụng để xử lý số liệu thu đượctrong trình thực nghiệm tính giá trị tham số thống kêsinh học (Chu Văn Mẫn 2001) Chương trình Blast, DNAstar đượcdùng để phân tích, so sánh trình tự nucleotide xây dựng phânloại chủng nấm nghiên cứu Chương trình SignalP 4.1 Server dùng đểphântíchsignalpeptide,NetOGlyc4.0ServerdùngđểphântíchđiểmOglycosylhóa,NetNGlyc1.0ServerdùngđểphântíchđiểmN-glycosylhóa Kết tối ưu cho thấy, suất sinh tổng hợp cellulase đạt24,65U/ml,caohơn8,6lầnsovớimơitrườngcơbảnbanđầuchưatốiưu.Nhưvậy, thành phần mơi trường tối ưu có chứa 80% (v/v) củatruyền khoai tây, 0,6% rơm lúa; 0,2% (w/v) (NH4)2HPO4và 0,5%(w/v) bột giấy làm chất cảm ứng Điều kiện lên men thích hợp ở28°C,pHbanđầucủamơitrườngbằng7,0,thờigianlênmen120giờ 3.1.3 TinhsạchvàđánhgiátínhchấtcellulasecủachủngPeniophoras p.NDVN01 3.1.3.1 Tinhsạchcellulase Hình 3.10 Sắc ký đồtinh cellulase cột Biogel-P100 (A) vàhìnhảnhđiệndiproteinsảnphẩmtinhsạch(B),điệndihoạttính(C) M: marker protein (Fermentas); 1: phổ điện di dịch enzyme thô; 2:phổ điện di dịch enzyme qua cột Sephadex-G75; 3: phổ điện di dịchenzymequacộtBiogel-P100(dịchtinhsạch);4:Phổđiệndinhuộmhoạttínhđặc hiệu Tinh tủa ammonium sulfate, qua cột sắc ký lọc gelSephadexG75vàcộtBiogelP100thuđượcmộtbăngproteinduynhấtcókhốilượngphântửkhoảng32kDa.Kết quảđiệndihoạttínhkhẳngđịnhbăngtinhsạchthuđượclàmộtcellulase(hình3.10) Cellulasecóđộsạch2,34lầnsovớidịchenzymethơbanđầu,hoạttínhriê ngđạt146,42U/mgnhưnghiệusuấtthuhồithấpchỉđạt4,33% 3.1.3.2 Độnghọccơchấtcủacellulase Động học chất β-glucan lúa mạch cellulase từchủngPeniophorasp NDVN01 có Km thấp hơn, K catvà Kcat/ Kmcaohơn so với chất CMC Vận tốc cực đại phản ứng cellulasexúc tác chất CMC đạt 1825 U/mg, chất β-glucanlúamạchđạt9804U/mg 3.1.3.3 Đặchiệucơchấtcủacellulase Kết cho thấy, cellulase có tính đặc hiệu cao chấtβ-glucanlúamạchvàCMC,trongđómạnhnhấtđốivới β-glucanlúamạch với hoạt tính tương đối đạt 456% so với chất CMC Đối vớicơ chất xylan, LBG avicel, cellulase chủngPeniophorasp.NDVN01khơngcótácdụngthủyphân 3.1.3.4 Sảnphẩmthủyphâncơchấtcủacellulase Kết cho thấy, sản phẩm thủy phân chủ yếu CMC làcellobiose (G2) cellotriose (G3), cellotetrose (G4) vàcác oligomer lớn G4 Glucose (G1) sản phẩm thu nhất(hình 3.12) Như vậy, kết hợp với kết phân tích động học chất,đặc hiệu chất khẳng định cellulase tinh từPeniophorasp.NDVN01làmộtendo1,4-glucanase Hình3.12 Hìnhảnhphổchạysắc ký TLCsảnphẩm thủyphâncơchấtCMCcủa cellulasetinhsạchtừchủngPeniophorasp.NDVN0 G1 1: Phổ chạy chất chuẩn; 2: phổ chạy G2 G3 G4 dịchcellulasetinhsạch;3:phổchạydịchthủyphân;4:p hổchạycơchấtCMC;G1:glucose:G2:cellobiose; G3:cellotriose, G4:cellotetrose 1234 3.1.3.5 Nhiệtđ ộ p h ả n ứ n g t ố i u v đ ộ b ề n n h i ệ t đ ộ c ủ a endoglucanase Kết cho thấy hoạt tính endoglucanase tăng dần từ 32% ởnhiệtđộ30°Clêncựcđạiở60°C(100%).Sauđókhităngnhiệtđộthìhoạttínhcủ aenzymegiảmdầnchỉcịn51%ở85°C(hình3.13A) Hình3.13.Đồthịảnhhƣởngcủanhiệtđộphảnứng(A)vàđộbềnnhiệtđộ (B) endoglucanase từ chủngPeniophorasp NDVN01Endoglucanasec ủ a c h ủ n g P e n i o p h o r a s p N D V N 01vẫngiữ đượchoạttínhởnhiệtđộ45°C,hoạttínhtươngđốicịnlạitrongkhoảng62-76% sau 24 xử lý 30-45°C Tuy nhiên, xử lý nhiệt độcao5055°Cthìhoạttínhcủaenzymegiảmmạnh(hình3.13B) 3.1.3.6 pHphảnứngtốiưuvàđộbềnpHcủaendoglucnanase pHphảnứngtốiưucủaendoglucanasecủachủngPeniophorasp.NDVN01 trongkhoảng4,5-5,0.EndoglucanasetừPeniophorasp.NDVN01 có độ bền cao khoảng pH từ 4,0-5,5 với hoạt tínhtươngđốicịnlạitrên90%sau24hủtrongđệmởnhiệtđộ37°C Hình3.14.ĐồthịảnhhƣởngcủapHphảnứng(A)vàđộbềnpHcủaendog lucanasetừchủngPeniophorasp NDVN01 3.1.3.7 Ảnhhưởngcủaionkimloạiđếnhoạttínhendoglucanase Bảng3.4.Ảnhhƣởngcủaionkimloạivàmộtsốthuốcthửđếnhoạttínhendo glucanasecủachủngPeniophorasp.NDVN01 Ionkimloạivà sốthuốcthử(mM) + 2mM Hoạttínhtươngđối(%) 4mM 6mM 8mM 10mM K Na+ 91,53,0 93,82,6 92,83,1 93,73,3 91,53,0 86,45,8 85,51,8 80,83,5 94,22,8 97,43,0 Ag+ 71,82,0 0 00 Fe2+ Ni2+ 69,92,8 76,93,2 91,82,4 93,32,6 101,32,5 168,51,6 147,31,4 108,53,1 105,33,1 104,32,6 Mn2+ 65,13,2 84,42,4 95,52,6 94,83,2 97,03,2 2+ 102,32,3 100,42,9 98,82,0 91,72,4 86,32,8 Zn2+ 105,92,8 97,42,5 99,22,9 98,81,8 98,71,2 97,64,8 115,41,4 93,43,5 91,93,2 90,62,1 52,82,2 0 Ca 2+ Ba Cu2+ Mg 2+ EDTA 2-Mercaptoethanol 0 00 00 0 00 78,62,8 73,93,4 78,52,3 80,12,5 78,73,1 61,31,1 64,62,4 65,83,0 71,02,2 67,13,1 114,62,6 108,13,2 103,12,3 100,22,5 93,71,2 Đốichứng 1006,9 Kết cho thấy hoạt tính enzyme tăng cườngvới diện Ni2+trong khoảng 2-10 mM, Ca2+ở nồng độ 2mM,Zn2+ởnồngđộ2mM,Ba2+ởnồngđộ4mMvàmercaptoethanoltrongkhoảng nồngđộ2-6mM.Trongđó,ionNi2+tăng cường mạnhmẽ hoạt động enzyme, làm tăng hoạt tính tương đối lên 168% ởnồng độ mM Tuy nhiên, hoạt tính cellulase hồn tồn bị ức chếbởiviệcbổsungcácionAg+vàCu2+ởnồngđộ4-10mM 3.1.3.8 Ảnhhưởngcủadungmơihữucơvàchấttẩyrửađếnhoạttínhendoglucanas e Việc bổ sung dung mơi methanol (1% v/v), ethanol (15%),isopropanol(1-10%),butanol-1(1-5%)vàacetone(115%)tăngcườngh o t đ ộ n g c ủ a e n z y m e , n h n g k h i n n g đ ộ c a odungmôi methanol(5-20%),ethanol(10-20%),isopropanol(15-20%)vàbutanol-1 (10-20%) ức chế hoạt động enzyme Trong đó, dungmơi acetone nồng độ 15% (v/v) làm tăng hoạt tính cellulase mạnhnhất với hoạt tính tương đối đạt 121% so với đối chứng không bổsung dung môi Dung môi butanol-1 với nồng độ từ 10-20% (v/v) ứcchếm nh h o t t ính e n z y m e , h o t t í n h tư ơngđối c ò n l ại 3941% s o vớiđốichứng(hình 3.15A) Hình3.15.Biểuđồsosánhảnhhƣởngcủadungmơihữucơ(A)vàchấttẩyrửa(B) đếnhoạttínhendoglucanasecủachủngPeniophorasp NDVN01 Met: Methanol; Eth: Ethanol; Ipro: Isopropanol; n-But:nButanol;Ace:Acetone;T20:Tween20;T80:Tween80;TX-100:TritonX100;TX-114:TritonX-114;ĐC:Đốichứng Bổ sung Triton X-114 nồng độ 1% (v/v) tăng cườngmạnhnhấthoạtđộngcủaenzyme,nhưngởnồngđột % TritonX-114ứcchếhoạtđộngenzyme.SDSứcchếhồntồnhoạttínhcủaenzyme 3.2 Nhândịngvàbiểuhiện genmeglAtừchủngAspergillusniger VTCC-F021trongPichiapastoris 3.2.1 NhândịnggenmeglA 34 bp bp M5 3000 3.2.1.1 750 500 A 720 750 672bp B C 672 Hình 3.17 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân genmeglA(A),plasmidtáitổhợppJmeglA(B) sản phẩm cắt pJmeglAbằngEcoRI/XbaI(C) dc: sản phẩm PCR đối chứng âm (khơng có khn DNA); 2: sảnphẩmPCRnhângeneglA(đốichứngdương);3:sảnphẩmPCRnhângenmeglA;3:plasmid pJmeglA;4:plasmidpJET1.2(đốichứng);5:sản phẩmcắtpJmeglAbằng EcoRI/XbaI TrìnhtựgenmeglAđượcnhândịngvàgiảitrìnhtựvớichiềudài672n ucleotide cagacaatgtgctctcagtatgacagtgcctcgagccccccatactcagtgaaccagaac QTMCSQYDSASSPPYSVNQN ctctggggcgagtaccaaggcaccggcagccagtgtgcatatgtcgacaaactctccagc LWGEYQGTGSQCAYVDKLSS agtggtgcatcctggcacaccgaatggacctggagcggtggtgagggaacagtgaaaagc SGASWHTEWTWSGGEGTVKS tactctaactctggcgttacatttaacaagaagctcgtgagtgatgtatcaagcatcccc YSNSGVTFNKKLVSDVSSIP acctcggtggaatggaagcaggacaacaccaacgtcaacgccgatgtcgcgtatgatctt TSVEWKQDNTNVNADVAYDL ttcaccgcggcgaatgtggaccatgccacttctagcggcgactatgaactgatgatttgg FTAANVDHATSSGDYELMIW cttgcccgctacggcaacatccagcccattggcaagcaaattgccacggccacagtggga LARYGNIQPIGKQIATATVG ggcaagtcctgggaggtgtggtatggcagcaccacccaggccggtgcggagcagaggaca GKSWEVWYGSTTQAGAEQRT tacagctttgtgtcggaaagccctatcaactcatacagtggggacatcaatgcatttttc YSFVSESPINSYSGDINAFF agctatctcactcagaaccaaggctttcccgccagctctcagtacttgatcaatctgcag SYLTQNQGFPASSQYLINLQ tttggaactgaggcgttcaccgggggcccggcaaccttcacggttgacaactggaccgcc FGTEAFTGGPATFTVDNWT *A agtgtcaactag SVN- Hình 3.18 Trình tự genmeglAvà trình tự amino acid suy diễncủamEglAtừchủngA nigerVTCC-F021 T*:vịtríThreoninecóthểxảyraglycosylhóa 60 20 120 40 180 60 240 80 300 100 360 120 420 140 480 160 540 180 600 200 660 220 672 223 Phân tích phần mềm DNAstar cho thấy trình tự amino axít suy diễn rmEglA dài 223 amino acid Trong có aminoacid mang tính ba zơ mạnh (K, R), 19 amino acid mang tính a xítmạnh (D, E), 68 amino a xít kỵ nước (A, I, L, F, W, V) 96 amino axít phân cực (N, C, Q, S, T,Y) Enzyme rmEglA có khối lượng tínhtốntheolý thuyếtkhoảng 24,24kDavớipI bằng4,24.S o v i rEglA, thành phần amino acid thay đổi: giảm amino a xít có tính bazơ mạnh (K, R), giảm amino a xít kỵ nước (A, I, L, F, W, V) vàgiảm amino a xít phân cực (N, C, Q, S, T,Y) Enzyme rmEglA cókhối lượng giảmkhoảng 1,5 kDa pI giảm 0,129 so với rEglA Sửdụng phần mềm trực tuyến NetOGlyc 4.0 Server phân tích điểmglycosylhóa(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)xácđịnh chuỗipolypeptide củamrEglA cóthể xảy raO g l y c o s y l hóa vị trí amino a xít Threonine-219 (T *) (hình 3.18) Tuynhiên, phân tích băng phần mềm trực tuyến NetNGlyc 1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/) khơng phát vịtrí cóthể xảyra qtrình N-glycosylhóa 3.2.2 ThiếtkếvectorbiểuhiệnmeglA Plasmid pJmeglAmang genmeglAvà vector pPICZA cùngđược cắt EcoRI XbaI Sau đó, nối với T4ligase tạo plasmid tái tổ hợp pPmeglA Plasmid có đoạn chèn có kíchthước lớn hơn, nên nằm cao so với vector khơng có đoạn chèn(hình3.19A) Plasmidtái tổ hợp pPmeglAtinh cắt bằngEcoRI vàXbaIchohaibănglàpPICZαA(A(3,6kb)genmeglA(672bp)(hình3.19B) pPmeglAđược đọc trình tự để kiểm tra cấu trúc biểu trướckhibiếnnạpvàbiểuhiệnởP.pastorisGS115.Cấutrúcbiểuhiệnđúngkhungđọc ,meglAđượcchènvàođúngvịtrímongmuốn,đủđiềukiệnđểđưavàobiểuhiệntro ngP.pastorisGS115 bp12Mbp bp56Mbp bpM 6000 3000 3600 672 3000 750 4272bp 3600 A 3000 C 1000 672 750 D Hình 3.19 Hình ảnh điện di sản phẩm gel (A), plasmidpPmeglA(B), sản phẩm cắt pPmeglAbằngEcoRI vàXbaI (C),sảnphẩmcắtpPmeglAbằngSacI(D) 1:pPICZAmởvòng;2:genmeglA;3:pPmeglA;4:pPICZA(đối chứng);5:pPmeglAcắt bằngEcoRIvàXbaI;6:pPICZAbằngEcoRIvà XbaI(đốichứng);7: pPmeglAcắtbằngSacI 3.2.3 BiểuhiệnrmEglAtrongP.pastorisGS115 3.2.3.1 XâydựnghệthốngbiểuhiệnP.pastorisGS115/pPmeglA 10 kDa9M* 1112116 66 kb1 M2 4567 8kb 3,0 2,2 1,0 0,6 2,2 45 1,2 35 25 18 A B 13 kDaM * 11 6 66 rmEglA 45 32kDa 25 35 rmEgllA 18 14 C Hình 3.21 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu3´5´AOX1(A);điệndiproteintổngsốdịchlênmenchủngP.pastorisGS115/pPmeglA(B); điện di nhuộm hoạt tính dịch lênmenchủngP pastorisGS115/pPmeglA(C) 1: PCR genome P pastoris GS115/pPicZα (đối chứng); 2-8: PCRgenome P pastoris GS115/pPmeglA; 9: dịch lên men dòng P.pastoris GS115/pPICzA (đối chứng); 10-12: dịch lên men sốdịngP.pastorisGS115/pPmeglA;13:nhuộmhoạttínhrmEglA ĐểbiểuhiệngenmeglA,plasmidtáitổhợppPmeglAđượccắtmởv ị n g b ằ n g S a c I( h ì n h D ) v đ ợ c b i ế n n p v o t ế b o P