0794 nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng vi sinh vật của nấm isaria japonica và phellinus pini ở vùng bắc trung bộ luận văn tốt nghiệp

1 BỘGIÁODỤCVÀĐÀOTẠOTR ƢỜNGĐẠIHỌCVINH NGHIÊNCỨU THÀNHPHẦNHĨAHỌC VÀHOẠTTÍNHKHÁNGVISINHVẬTCỦANẤM IsariajaponicaVÀPhellinuspiniỞBẮCTRUNGBỘ CHUN NGÀNH: HĨA HỮU CƠMÃSỐCHUNNGÀNH:62.44.01.14 TĨMTẮTUẬNÁNTIN SH Ĩ A HỌC NGHỆAN–2017 Cơngtrìnhđvợchồnthànhtại: Phịng thí nghiệm Chun đe Hũu cơ, khoa Hóa học,Trvờng ÐạihọcVinh Ngvờihvớngdȁnkhoahọc: Phãnbiện : Phãnbiện2: Phãnbiện : LunánđvợcbãovệtạiHiđongđánhgiálunáncapTrvờnghọptại: vào hoi8giờ00phút,ngày tháng Cóthetìm hieulunán tạithv viện: năm2017 MỞ ÐẦU Lý dochọnđetài Nấm sinh vật thiếu đời sống, khơng có nấm, chu trìnhtuần hồn vật chất bị mắt xích quan trọng việc phân hủy chấtbã hữu Nấm nguồn thực phẩm giàu đạm, đầy đủ axit amin thiết yếu,hàm lƣợng chất béo chủ yếu axit béo chƣa bão hịa, giá trị nănglƣợng cao, giàu khống chất vitamin có tác dụng tốt cho sức khỏe conngƣời.Ngồira,trongnấmcịnchứanhiềuhoạtchấtcóhoạttínhsinhhọc,gópphầnng ăn ngừavàđiều trịbệnh chocon ngƣời Ngày nay, ngày nhiều nhà khoa học tập trung nghiên cứu thànhphần hóa học hoạt tính sinh học lồi nấm nhằm phát hoạtchất có dƣợc tính mạnh bệnh nan y nhƣ viêm gan, kháng viêmungthƣ,HIV…Việcđƣavàosửdụngrộngrãicácchếphẩmđƣợctáchchiếttừnấm giúpconngƣờikhỏemạnh,phòngchốngđƣợcnhiềucănbệnhtiềmẩn,nguyhiểm[1],[2],[5],[6],[13] Việt Nam quốc gia có đa dạng sinh học cao giớivớicấutrúcđịachấtđộcđáo,địalýthủyvănđadạng,khíhậunhiệtđớigiómùa, kiểu sinhthái khác nhau… góp phầntạo nêns ự đ a d n g c ủ a khu hệ nấm Việt Nam Đến năm 2010, có khoảng 2500 loài nấm đƣợc ghinhận cho lãnh thổ Việt Nam, số khoảng 1400 lồi thuộc 120 chi lànhữnglồi nấmlớn[3],[4],[9] Các lồi nấm lớn Việt Nam có giá trị tài nguyên đáng kể nhiềumặt, có khoảng 50 loài nấm ăn quý nhƣ: loài mộc nhĩ, ngân nhĩ, nấmhƣơng (Lentinula edodes), nấm rơm, nấm mối, nấm thông (Boletus edulisBull.), nấm chàm (Boletus aff felleusBull.), nấm bào ngƣ (Pleurotusspp.),nấmmàogà(CantherelluscibariusFr.),nấmngọcchâm(Hypsizigu smarmoreus), nấm kim châm (Flammulina velutipes) [4], [6] Có khoảnghơn 200 lồi nấm dùng làm dƣợc liệu, có nhiều lồi dƣợc liệuqnhƣ:linhchi(G.lucidum),linhchisị(G.capense),cổlinhchi(G.applanatum ),vânchi(Trametesversicolor),phiếnchi(Schizophyllumcommune),nấmhƣơng(L entinulaedode),nấmkimchâm(Flammulinavelutipes),mộcnhĩ,ngânnhĩ,đôngtrùn ghạthảo(Cordyceps i n e n s i s ,Cordycep militaris)…[8], [20], [21].Những nghiên cứu bƣớc đầu hợpchất có hoạt tính sinh học số nấm lớn Việt Nam cho thấy chúng rấtgiàu hợp chất có khối lƣợng phân tử lớn nhƣ polysaccharit, polysaccharit-peptit, lectin… chất có khối lƣợng phân tử nhỏ nhƣ flavonoit,steroit, terpenoit… có tác dụng chống viêm, tăng cƣờng đáp ứng miễn dịch, hỗtrợđiềutrịcácbệnhhiểmnghèonhƣungthƣ,suygiảmmiễndịch,tiếtniệu, tim mạch… Khoảng 50 loài nấm có khả sinh enzym số hoạt chấtqcóthểđƣợcứngdụngtrongcơngnghệsinhhọcvàbảovệmơitrƣờng Bắc Trung khu vực có nhiều vƣờn Quốc gia, khu bảo tồn thiên nhiênnhƣ Phong Nha - Kẻ Bàng, Vũ Quang, Hồ Kẻ Gỗ, Pù Mát, Pù Huống, Pù HoạtvàBếnEn.Đâylànhữngvùngđƣợcđánhgiálàcótínhđadạngsinhhọcrấtcao, có chứa đựng nguồn lợi lớn đa dạng sinh học, cónguồn lợi lớn nấm sử dụng chúng làm nguyên liệu tốt cho cácngànhcôngnghiệpthựcphẩm,dƣợcphẩm… [15],[16],[37],[212],[213] Các nghiên cứu nấm Việt Nam nói chung khu vực Bắc Trung nóiriêngvẫncịnlàmộtvấnđềkhámới,chƣanhậnđƣợcsựquantâmđúngmứccủa nhà khoa học Do vậy, việc nghiên cứu nấm vùng Bắc Trung làmộtucầubứcthiết,cóýnghĩalýluậnvà thựctiễn,gópphầnquantrọngtrong việc tìm hiểu nguồn tài ngun thiên nhiên, giá trị kinh tế tầm quantrọngcủanguồndƣợcliệuthiênnhiêncủanƣớctanóichungvàtỉnhvùngBắcTrungbộnói riêng Vì lý chúng tơi chọn đề tài:“Nghiên cứu thànhphan hóa học hoạt tính kháng vi sinh vt namIsaria japonicavàPhellinuspiniởvùngBac TrungB” Ðoitvợngnghiêncứu Đối tƣợng nghiên cứu luận án sợi nấmIsaria japonicaYasuda quảthể nấmPhellinus pini(Brot.) Bondartsev & Singer đƣợc thu hái vùng BắcTrungBộViệtNam Nhiệmvụnghiêncứu - ChiếthỗnhợpcáchợpchấttừsợinấmIsariajaponicaYasudavàquảthểnấm Phellinuspini(Brot.)Bondartsev&Singer; - Sửdụngcácphƣơngphápsắckýđểphânlập cáchợpchấttừdịchchiếtcủ ahai loại nấmtrên; - Xácđịnhcấutrúccủanhữnghợpchấtphânlậpđƣợc; - Thửhoạttínhsinhhọccủamộtsốhợpchấtphânlậpđƣợc Phvơngphápnghiêncứu - Phƣơng pháp lấy mẫu: mẫu sau lấy đƣợc rửa sạch, phân lập, nicấy bảo quản nhiệt độ thích hợp Việc xử lý tiếp mẫu phƣơngpháp chiết chọn lọc với dung mơi thích hợp để thu đƣợc hỗn hợp hợpchấtdùngchonghiên cứu đƣợcnêu ởphầnthựcnghiệm - Phƣơng pháp phân tích, tách hỗn hợp phân lập chất: sử dụngcác phƣơng pháp sắc ký cột thƣờng (CC), sắc ký lớp mỏng phân tích điềuchế, sắc ký cột nhanh (FC) với pha tĩnh khác nhƣ silica gel, sắc kýlỏnghiệunăngcao(HPLC)phântích trêncác phađảo,phasilicagel - Phƣơng pháp khảo sát cấu trúc hợp chất: cấu trúc hoá học hợp chấtđƣợcphânlậpđƣợcxácđịnhbằngcácphƣơngphápvậtlýhiệnđạinhƣphổtửngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lƣợng phun mù electron (ESI-MS),phổkhốilƣợngphângiảicao(HRMS),phổcộnghƣởngtừhạtnhânmộtchiều(1D-NMR)vàhaichiều(2D-NMR)vớicáckỹthuậtkhácnhau nhƣ1H-NMR,13C-NMR,DEPT,1H-1H COSY,HSQCvàHMBC - Cấu trúc lập thể tƣơng đối hợp chất đƣợc xác định cácphƣơngphápphổNMR - Thămdịcác hoạttínhhoạt tínhkhángvisinhvậtvà khángnấm Nhũngđónggópmớicủalunán - Đây nghiên cứu có hệ thống Việt Nam thành phần hóa họccủaloài nấmIsariajaponicavànấmPhellinuspiniởkhu vực Bắc TrungBộ - Từ dịch chiết nấmIsaria japonicathu đƣợc 15 hợp chất Trong đó, hợpchấtIJM-1làisarinlàhợpchấtmới.Đồngthời,hợpchất11,22dihydroxyhopane( IJM-3) lần phân lập đƣợc xác định cấu trúcbằng phổ 1D- 2D-NMR chƣa đƣợc công bố cơng trình Ngồira, 06 hợp chất bao gồm: beauveriolide I (IJM-2), (17R)-17methylincisterol(IJM-4),fungisterol((3,5α,22E)-ergosta-6,8,22-trien-3-ol) (IJM-5),4,4-dimethyl-5α-ergosta-8,24(28)-dien-3-ol(IJM-6),3-Oferulylcycloartenol(IJM-7),tricin(IJM-10)lần đầu tiênphânlậpđƣợctừloàinấmnày - Từ dịch chiết thể nấmPhellinus piniphân lập đƣợc 05 hợp chấtbao gồm: 02 hợp chất triterpenoid: gilvsin A (PPH-1) gilvsin B (PPE-1).Hai triterpenoidPHH-1vàPPE-1lần phân lập đƣợc từ loài nấm này;03 hợp chất steroit: ergosta-7,22-dien-3-ol (PPE-2), ergosterol (PPH-2) vàergosterol peroxide (PPE-3) Hợp chấtPPE-2là hợp chất lần đầu tiênđƣợcphânlậptừlồi nấmnày - Lần thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định khángnấm 12 hợp chất (IJM-1,IJM-2,IJM-3,IJM-5,IJM-6,IJM-10,IJM11,IJM-13,PPH-1,PPE-1,PPE-2,PPE-3) Kết cho thầy có 06 hợp chất(IJM-1,IJM-2,IJM-6,IJM-13,PPH-1vàPPE-2) có khả kháng vớichủng vi sinh vật kiểm định Gr (+) (Staphylococcus aureus subsp AureusATCC11632) vớinồngđộức chế tốithiểu(MIC) 50g/ml Cautrúccủalun án Luận án bao gồm 125 trang với 22 bảng số liệu, 64 hình sơ đồ với249 tài liệu tham khảo Kết cấu luận án gồm: mở đầu (4 trang), tổng quan(33 trang), phƣơng pháp thực nghiệm (24 trang), kết thảo luận (63trang), kết luận (1 trang), danh mục công trình cơng bố (1 trang), tài liệu thamkhảo (24 trang) Ngồi cịn có phần phụ lục gồm 140 phổ số hợpchấtchọnlọc CHNG1:TNGQUAN Luậnánđãtiếnhànhtổngquantàiliệucácnộidung: Cáchợpchấtchuyểnhóabậchai phânlậptừnấmkí sinhcơntrùng - Giới thiệu hợp chất chuyển hóa bậc hai: polyketide, polyketidekhông bị khử, polyketide bị khử khơng hồn tồn bị khử hồn tồn, cácnonribosomalpeptide,nonribosomalpeptidemạchthẳng,nonribosomal(depsi)pepti de dạng vịng, cyclooligomer (depsi)peptide, hợp chất chuyểnhóakết hợppolyketide– nonribosomalpeptide,terpenoid… NấmIsariajaponicaYasuda - Giớithiệuvề đặc điểmvà sựphânbốlồi nấmIsariajaponica - ThànhphầnhóahọccủanấmkýsinhcơntrùngIsariajaponica - Hoạt tínhsinhhọc củanấmkísinhcơntrùngIsariajaponica Cáchợpchấtchuyểnhóabậchai phânlậptừnấmthuộcchiPhellinus - Giới thiệu hợp chất chuyển hóa bậc hai: polysaccharide proteinpolysaccharide, steroid, terpenoid, sesquiterpenoid, diterpenoid, triterpenoid,flavone,styrylpyrone,furanone,polychlorinat… NấmPhellinuspini(Brot.)Bondartsev&Singer - Giớithiệuvề đặcđiểmvà sựphânbốlồinấmPhellinuspini - Thành phầnhóahọccủaPhellinuspini CHNG2:PHNGPHÁPVÀTHCNGHIỆM 2.1 Phvơngphápnghiêncứu 2.1.1 Phvơngpháplaymȁu: Mẫunấmđƣợcthuháivàothờiđiểmthíchhợptrongnăm.Mẫutƣơisaukhilấyvềđƣợcrửa sạch,đểnơithốngmát,tiếnhànhphânlậpvànicấy,bảoquảnởđiềukiệnthíchhợpdùngđể thínghiệm 2.1.2 Phvơngphápchiếtxuat,phânlp,xácđịnhcautrúccácchatphânlpđvợc: Sắckýlớpmỏng(TLC);sắckýcộtthƣờng(CC);sắckýcột nhanh(FC); sắckýlỏnghiệunăngcao(HPLC);cácphƣơngphápkếttinh 2.1.3 Phvơngpháp khãosátcau trúccáchợp chat: Phổ tử ngoại (UV); phổ hồng ngoại (IR); phổ khối lƣợng (ESI-MS),(HRESI-MS); phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR; phổ cộng hƣởng từ hạtnhân13C-NMR; phổ cộng hƣởng từ hạt nhân DEPT, HMBC, HSQC; cấu trúclậpthểtƣơngcủacáchợpchấtnàyđƣợcxácđịnhcácphƣơngphápphổNMR 2.1.4 Phuơngphápthửhoạt tínhsinhhọc Q trình thử hoạt tính Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên đƣợcthực theo phƣơng pháp Skehan, Likhitwitayawuid, Vander, Vlietlinck,McKane 2.2 Hóachatvà thiết bị 2.2.1 Hố chat:Các dung mơi để ngâm chiết mẫu nấm dùng loại tinhkhiết (pure), dùng cho loại sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột nhanh sử dụngloạitinhkhiếtphântích(PA) 2.2.2 Thiết bị: sắc ký lớp mỏng (TLC); sắc ký cột (CC); sắc ký lỏng hiệunăngcao(HPLC);phổtửngoại(UV);phổhồngngoại(FT-IR);phổkhối lƣợng(MS);phổcộnghƣởngtừhạt nhân(NMR);điểmnóngchảy;độquaycựcriêng 2.3 Nghiêncứucáchợpchattừsợinamkísinhcơntrùng(Isariajaponica Yasuda) 2.3.1 Quy trìnhnghiêncứu Nộidungquytrình Thuthậpmẫu - Phƣơngpháplẫymẫu,phânlập - CáchnuốicấytrênmơitrƣờngPDA Địnhloại - Cáchnuôicấytrênmôitrƣờnglỏng - Cáchc h i ế t d ị c h n u ô i c ấ y v Nhân giốngtrênPDA s ợ i nấm Sơđo2.1:Quytrìnhnghiêncứunấmkýsinhtrêncơntrùng - Phƣơng pháp sắc ký cột Nhângiốngtrênmôitrƣờnglỏng vàphƣơngp h p sắckýbảnmỏng 2.3.2 Phvơngpháplaymȁu - Phƣơngphápxácđịnhcấutạohợpchất Mẫu nấm kí sinh cơng trùng đƣợc thu thập vào tháng 11 năm 2013 Caochiết - Phƣơngp h p đ n h g i h o t t í tạiVƣờnQuốcgiaPùMát,đƣợcPGS.TSTrầnNgọcLângiámđịnhtênkhoahọcvàlƣug n h sinhhọc iữt i khoaHóahọc,trƣờngĐạihọcVinh Phântíchthànhphần Mẫu đƣợc xem xét đánh giá dƣới kính hiển vi điện tử theo phƣơngpháp Lacey Brooks, phân lập sử dụng theo phƣơng pháp Đánhgiáhoạt tínhsinhhọc Goettel vàInglis, phân lập bào tử đơn dựa theo phƣơng pháp Choi, cấy chuyểnsangmôitrƣờngPotatoDextroseAgar(PDA)theophƣơngphápcủaSams on Đặc điểm hình thái bào tử, sợi nấm, cấu trúc qủa thể số đặc điểmsinh học khác đƣợc đánh giá, nhận dạng loài nấm ký sinh trùng theophƣơngphápcủaLuangsaard 2.3.2 Phvơngphápphânlp Mẫu nấm kí sinh trùng (Isaria japonicaYasuda) sau đƣa vềphịng thí nghiệm khoa Hóa học, thuộc trƣờng Đại học Vinh, Nghệ Anđƣợc tiến hành nghiên cứu nhân nuôi Tiếp đến,Isaria japonicaYasudađƣợc đƣa phân tích thành phần hố học, đƣợc ni cấy mơi trƣờngPDAvàsau đónhânnisốlƣợnglớntrongmơitrƣờngl ỏ n g 2.3.3 Phânlpcáchợpchat Nấm kí sinh trùng (Isaria japonicaYasuda) đƣợc nuôi cấy môitrƣờng PDA, nhiệt độ 240C 15 ngày, cấy chuyền sang mơi trƣờng lỏng(đƣờngglucose,nƣớcdừa,dịchtríchtừcủkhoaitây,dứa,giá,tằm)trongvịng7 ngày, nhiệt độ 250C, đƣợc lọc, rửa phễu lọc chân không Phần sợinấmsau khilọcchiếtvớimethanol,quaycấtchân khôngthuđƣợcdịchdầuthô(25g) 10,7 lit môi trƣờng - Phân bố nƣớc, lọc 12 lit dịch nƣớc Ngâmchiết với5litetylacetat Dịchchiết ethylacetate Chƣngcấtthuhồidungmôi 530 gam sợi nấm Ngâmtrong5litmethanol,7ngày Dịchchiết Chƣngcấtthuhồidungmôi Cao ethyl Cao acetate12ga methanol2 m Sơđo2.3:Chiếtcáchợpchấttừmôitrƣờngnuôicấy 5gam Cao methanol đƣơc hòa tan nƣớc, chiết phân bố với dung môi ethylacetate, cất thu hồi dung môi thu đƣợc cao ethyl acetate (15 g) dịch nƣớc(10g) Tiến hành phân tích định tính thành phần hóa học của cao ethyl acetatebằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC/UV) chọn điều kiện chạymáy là: dung dịchpha động MeOH:ACN(85:15v/v ), thểtíchb m m ẫ u : μl, nhiệtl, nhiệtđộ cộtRP 18: 300C, detector UV(VWD): λ=210 nm, tốcđ ộ d ò n g : 1,0ml/minvà ápsuất cột:71bar Cao methanol(25g) ethylacetate,nvớc Cao ethyl acetatedịchnuôica y(12g) Cao ethylacetate Cao dịch nvớc (10g) CC,Silicagel Hexane:acetone(100:0,25:1,15:1,10:1,7:1,5:1) CHCl3-MeOH(10:1,6:1,3:1,2:1,1:1) IJM11,6(g) CC,SilicagelHexane:a cetone(15:1) IJM8(123m g)(1g) IJM3(1,2g) IJM2(2,4g) IJM-10 (15mg) CC,SilicagelHex ane:etylaxetat(100: 1-1:1) CC,Silica gelHexane:acet one(7:3) IJM-4 (9,5mg) CC, Silica gelCHCl3:MeO H (100:0, 50:1,10:1, 2:1,1:1) IJM32 IJM22 IJM4(1,4g) IJM33 CC, Silica gelCHCl3:Me OH(30:1) IJM34 IJM-13 (13mg) CC, Silica gelCHCl3:MeO H (100:0,50:1,10:1,2:1,1:11:1) CC,SilicagelHexane:acet one(9:1-2:1) IJM41 IJM43 CC, Silica CC, Silica CC,Silica gelCHCl3:Me gelCHCl3:Me gelHexane:acet one(9:1) OH(10:1) OH(15:1,9:1) IJM-11 (38mg) IJM5(1,8g) IJM42 IJM51 CC,Silica CC,Silica gelHexane:acet gelHexane:acet one(7:3) one(4:1) IJM-7 (7mg) IJM-9 (31mg) IJM53 IJM52 CC,Silica gelHexane:acet one(7:3) CC, Silica gelCHCl3:Me OH(30:1,25:1) IJM-15 (14,5mg ) IJM-3 (6,4mg) IJM-1 (13mg) IJM-2 (25mg) IJM5(5,7m g) IJM6(8.0m g) Sơđo2.4:P h â n lậpcáchợpchấttừnấmkísinhcơntrùng(Isaria japonicaYasuda) CC, Silica gelCHCl3:MeO H(15:1) IJM-12 (30mg) IJM14(16,5 mg) 2.4 NghiêncứucáchợpchattừquãthenamPhellinuspini(Brot.)Bondartsev& Singer 2.4.1 Mȁunam Mẫu nấmPhellinus pini(Brot.) Bondartsev & Singer đƣợc thu hái VƣờnQuốc gia Pù Mát, Nghệ An vào tháng 10 năm 2013 Mẫu đƣợc định danh bởiPGS.TS Ngô Anh (Khoa Sinh học, trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Huế),tiêubảnđƣợclƣugiữtạikhoaHóahọc,trƣờngĐạihọcVinh 2.4.2 Phânlpcáchợpchat Mẫu nấmPhellinus pini(Brot.) Bondartsev & Singer (5,0 kg) phơi khô,nghiền nhỏ ngâm chiết với methanol nhiệt độ phòng, thu dịch chiết cấtthu hồi dung môi dƣới áp suất thấp đƣợc cao methanol (580,0 g) Phân bố dịchchiếtvàonƣớcvàchiếtbằnghexane,ethylacetate,sauđócấtthuhồidungmơithuđƣợccaohexanePPH(54,0 g), cao ethyl acetatePPE(170,0 g) dịchnƣớc Tiến hànhphân tích địnhtínhthànhp h ầ n h ó a h ọ c c ủ a c ủ a c a o h e x a n e v cao ethyl acetate hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC/UV) chọncác điều kiện chạy máy là: dung dịch pha động MeOH:ACN (85:15 v/v ), thểtích bơm mẫu: 20 μl, nhiệtl, nhiệt độ cột RP 18 : 30 0C, detector UV (VWD) : λ = 205nm,tốc độdòng:1,0ml/minvàápsuất cột:71bar 2.5 Thửhoạttínhkhángvisinhvtvàkhángnamcủa cáchợpchat Hợp chất Isarin (IJM-1)và hợp chấtIJM-2,IJM-3,IJM-5,IJM6,IJM-10,IJM-11,IJM-13,PPH-1,PPE-1,PPE-2,PPE3đƣợctiến hành thửhoạttínhkhángvisinhvậtvớicácdịngvikhuẩn:khuẩnGr(-)(EscherichiacoliATCC25922;Pseudomonasaeruginosa-ATCC25923);khuẩn Gr (+) (Bacillus subtillis-ATCC11774;Staphylococcus aureus subsp.Aureus-ATCC 11632) Hoạt tính kháng nấm với chủng nấm: nấm sợi (Aspergillus nige439;Fusariumoxysporum-M42);nấmmen(CadidaalbicansATCC7754;Saccharomycescerevisiae-SH 20) Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định đƣợc tiến hành để đánh giá hoạt tínhkhángsinhcủamẫuchấtsạchđƣợcthựchiệntrênphiếnvilƣợng96giếngtheophƣơng pháphiệnđạicủaVanderBergher,VlietlinckvàMcKane Giống nấm men nấm sợi đƣợc trì bảo tồn môi trƣờng tiêuchuẩn: Saboraud Dextrose Broth (SDB-Sigma), vi khuẩn đƣợc trì bảotồntrongmơitrƣờngTrypcaseSoyaBroth (TSB-Sigma) Phổ13C-NMR DEPT (hình 3.4 3.5) cho thấy hợp chấtIJM-1có chứa29c a r b o n , t r o n g đ ó b a o g m b ố n c a r b o n c a r b o n y l ( C1 , , 71,1,169,8, 169,3p p m ) , t m c a r b o n t h m ( C1 , , , , 1 , , 1 , , , , 18,0, 136,0, 123,2 ppm), carbon oxygenat (C75,5 ppm), năm carbon nhómmethine, sáu carbon nhóm methylene năm carbon nhóm methyl Hơn nữa,độ dịch chuyển hóa học tín hiệu bốn carbon carbonyl cho thấy tồn tạicủa ba liênkết peptide mộtnhómester Hình3.4.Phổ13C-NMRcủahợpchấtIJM-1 Hình3.5.PhổDEPTcủahợpchấtIJM-1 Phố COSY (hình 3.6 3.7) hợp chấtIJM-1cho phép xác định đƣợcsáuphầncấutrúc IđếnVI Hình3.6.CácphầncấutrúcIđếnVIcủahợpchấtIJM-1 Hình3.7.PhổCOSYcủahợpchấtIJM-1 Phổ HSQC (hình 3.11) hợp chấtIJM-1cho thấy tín hiệu proton tạiH1 [H4,41(1H,dt,J= 7,0, 7,0 Hz)] tƣơng quan với C-1 (C52 ppm), lànhóm methine liên kết trực tiếp NH [H8,24 (1H,d,J= 7,0 Hz)]; tín hiệu H-2[H1,46 (2H,m)] tƣơng quanvới C-2 (C40,8 ppm); tín hiệu H-3[ H1,53(1H,m)] tƣơng quan với C-3 (C40,8 ppm); tín hiệu H-4, H-5 [H0,88 (6H,m)]tƣơngquanlầnlƣợtvớiC-4(C15,2ppm)vàC-5(C15,1ppm).Ngồira,phổ HMBC (hình 3.9 3.10) cho thấy tín hiệu tƣơng tác xa H-1 với C-2/C-6(C169,3ppm);H2vớiC-1/C-3/C-5/C-6;H-3vớiC-1/C-4;H-4vớiC2/C-3/C-5; H-5 với C-4, kết luận phần cấu trúc I phầncủa cấu trúc axit amin leucine có hợp chấtIJM-1 Mặt khác, từ sốliệu phổ so sánh tài liệu axit amin leucine [105], [155] cho thấytronghợpchấtIJM-1cóchứaphầncấutrúcaxitaminleucine(hình3.8) Hình3.8.PhầncấutrúcaxitaminleucinecủahợpchấtIJM-1 Hình3.9.PhổHMBC củahợpchấtIJM-1 Hình3.10.PhổHMBC củahợpchấtIJM-1 Hình3.11.PhổHSQC củahợpchấtIJM-1 Phổ H-NMR (hình 3.3) hợp chấtIJM-1xuất tín hiệu proton đặctrƣng cho nhóm amide 25-NH [H10,69 (1H,br s)] tín hiệu protonthơm H-25 [H7,10 (1H, s)] ghép cặp với 16-NH (H7,08 ppm) Thêm vào đó,phổ HSQC (hình 3.11) hợp chấtIJM-1xuất tín hiệu H-20 [H7,51(1H,d ,J=8,0 Hz)], H - 21 [H6,97(1H, t,J=7,5 H z ) ] , H - 22 [H7,05 (1H,d,J=7,5Hz)],H-23[H7,33(1H,d,J=8,0Hz)],làtínhiệuprotoncủa4 nhóm methinethuộcvịngthơmbịthếởvịtrí1,2tƣơngquanlầnlƣợtvớiC-20(H118,0ppm), C-21(H118,1ppm), C-22(H120,7ppm),C-23(H111,1 ppm) Ngồi ra, phổ HMBC (hình 3.9) cho thấy tƣơng tác xa H-17 vớiC-18/C-19/C-25/C-26;H-20vớiC-22/C-24;H-21vớiC-23/C-19;H-22vớiC21/C-24; H-23 với C-21/C-19, chứng tỏ phần cấu trúc V diện trongphần cấu trúc axit amin tryptophan hợp chấtIJM-1 Từ số liệu kếthợp so sánh với số liệu phổ tryptophan [160], kết luận cấu trúccủahợpchấtIJM1cóchứamộtphầncấutrúc củaaxitamintryptophan Hình3.12.Phầncấutrúc axitamintritophancủahợpchấtIJM-1 Phổ1H-NMR hợp chấtIJM-1xuất tín hiệu đặc trƣng nhóm27NH [H8,11 (1H,d,J= 7,0 Hz)] Theo phổ13C-NMR hợp chấtIJM-1xuất tín hiệu C-29 (C170,5 ppm) tín hiệu carbon carbonyl.Kếthợpvớip h ổ HSQCxuất t í n hiệu t ƣ n g quan g i ữ a p r o t o n H - [H 3,94(1H,t,J=7,0Hz)], H-28[H1,16(3H,d,J=7,5Hz)]lầnlƣợt vớiC27(C48,2 ppm), C-28 (C15,1 ppm) Thêm vào đó, phổ HMBC hợp chấtIJM-1cho phép xác định tƣơng tác xa H-28 với C-27/C-29; H27với C-29, chứng tỏ phần cấu trúc VI thuộc phần cấu trúc alanine.SosánhsốliệuphổtrêncủaIJM1vớitàiliệucủaaxitaminalanine[46]cóthểkết luậnmộtphầncấu trúc củaaxitaminalaninecótronghợpchấtIJM-1 Hình3.13.Phầncấutrúc axitaminalaninecủahợpchấtIJM-1 Ngồi 3carboncarbonyl của3axit amintrên, phổ C-NMR,DEPT hợp chấtIJM-1cịn xuất tín hiệu C-15 (C171,1 ppm) tínhiệucarboncarbonylvàC-7(C75,5ppm)làtínhiệucủamộtc a r b o n oxygenat Các tƣơng tác xa khác phổ HMBC bao gồm H-14 với C-7/C-15;H-8vớiC-7; H-9vớiC-7/C-8/C-10;H-10vớiC-9chophépxácđịnhphầncấutrúc II gắn trực tiếp với phần cấu trúc III Hơn nữa, tƣơng tác xa H-11 vớiC-12/C-13; H-12 với C-13; H-13 với C-12/C-11 xác nhận liên kết củaphần cấu trúc III liên kết trực tiếp với phần cấu trúc IV Do đó, phần cấutrúc liên kết với theo trật tự II-IIIIV hình thành cấu trúc 3-hydroxy-4-methyl-octanoyl Từ phân tích liệu phổ kết hợp với sosánh với tài liệu [46] phần cấu trúc 3-hydroxyl-4-methylheptanoyltrongphântửhợpchấtIJM-1 Hình3.14.Phầncấutrúc3-hydroxyl-4-methyloctanoylcủa hợpchấtIJM-1 Mặt khác, phổ HMBC hợp chấtIJM-1cho thấy tƣơng tác xa H-1với C-29 độ chuyển dịch hóa học C-1 chứng tỏ tồn liên kếtamide ester alanyl-leucinyl Tƣơng tác xa H-1 H-7 với C-6 độchuyển dịch hóa học C-7 cho thấy phần cấu trúc leucine lại liên kết vớiaxit3hydroxy-4-methyl-octanoylicdƣớidạngliên kếtester Dựa vào độ dịch chuyển hóa học hai nguyên tử carbon C-16 C27chứng tỏ hai nguyên tử carbon liên kết với liên kếtamide ester.Dođó,cấutrúc củahợpchấtIJM-1cókhungcarbondạngvịng Nhƣvậy,phầncấutrúcaxitamintryptophannằmgiữaalaninevà3-hydroxy-4-methyloctanoyl,cấutrúcdạngvịngnàycũngđápứngđƣợcđộbấtbãohịarútra từcơngthức phântử Cấuh ì n h t ƣ n g đ ố i c ủ a h ợ p c h ấ t I J M - g i ố n g n h ƣ c ấ u h ì n h c ủ a I J M - (BeauveriolideI)[159] Phancautrúc Leucine 3-hidroxyl-4methyloctanoic Tryptophan Bãng3.2:Số liệuphổNMRcủaIJM-1 Carbon C(ppm) H(ppm) 1-NH 8,24(1H,d,J=7,0Hz) C-1 52,0 4,41(1H,dt,J= 7,0,7,0 Hz) C-2 40,8 1,46(2H,m) C-3 C-4 C-5 C-6 C-7 24,2 15,2 15,1 169,3 75,5 C-8 C-9 34,7 15,2 C-10 30,5 C-11 C-12 C-13 C-14 28,5 22,1 13,5 35,5 C-15 16-NH C-16 171,1 C-17 25,5 7,05(1H,m) 4,23(1H,dd,J=9,5,7,0 Hz) 3,15(1H,dd,J=14,0, 6,5Hz) 3,06(1H,dd,J=14,5, 7,5Hz) C-18 C-19 C-20 C-21 C-22 C-23 C-24 109,7 127,0 118,0 118,1 120,7 111,1 136,0 7,05(1H,t,J= 8,0Hz) 7,51(1H,d,J=8,0Hz) 6,97(1H,t,J=7,5Hz) 7,05(1H,d,J=7,5Hz) 7,33(1H,d,J=8,0Hz) 55,7 1,53(1H,m) 0,88(3H,m) 0,88(3H,m) 4,87(1H,ddd,J=10,0, 4,5,4,0Hz) 2,09(1H,m) 0,81(3H,d,J=7,0Hz) 1,06(1H,m) 1,40(1H,m) 1,23(1H,m) 1,30(2H,m) 0,87(3H,t,J=6,5Hz) 2,46(1H,dd,J=18,5, 4,0Hz) 2,36(1H,dd,J=14,0, 8,0Hz) HMBC C-2,C-6 C-1,C-3, C-5,C-6 C-4 C-3,C-5 C-7 C-7,C-8 C-10 C-12,C-13 C-13 C-12 C-7,C-15 C-18, C-19, C-25,C-26 C-24,C-22 C-19,C-23 25-NH 10,69(1H,br s) C-25 123,2 7,10(1H,s) C-26 169,8 27-NH 8,11(1H,d,J=7,0Hz) C-27 48,2 3,94(1H,t,J=7,0Hz) C-29 Alanine C-28 15,1 1,16(3H,d,J=7,5Hz) C-27,C-29 C-29 170,5 H(Đoở500MHzt r o n g DMSO-d6),C(Đoở125 MHztrongDMSO-d6) H-1H COSY ,HMBC:H C Hình3.15.TƣơngquanvàtƣơngtácxacủahợpchấtIJM-1 Bãng3.3:Tínhchất lýhóa củaIJM-1,IJM-2,beauveriolidesI Trạngthái CTPT ESI-MS(m/z) HR-ESI-MS (m/z) Thực tế Tínhtốn Đ.n.c [α]2D (c 0,4, CHCl3-MeOH) UVmax(MeOH)nm IJM-1 IJM-2 Chất bột không màu C29H42N4O5 549[M+Na]+ Chấtbộtmàutrắng 549,3023 [M+Na]+ 486,2940[M-H]- 549,3053 [M+Na]+ 486,2968[M-H]- 250-2510C -250 248-2490C -210 488,3112 [M+H]+ 488,3124 [M+H]+ 248-2500C -210 207,258,290 215 3674, 3650, 3628, 3567, 1722, 1681, 1641,1538 EtOH, CH3CN, CH3OH, CHCI3, 3298, 1724, 1684, 1641, 1535 EtOH, CH3CN, CH3OH,CHCI3, max 3383, 3316, 3298, 1723, 1677, 1534, 1532 Tan dung EtOH, CH3CN, môi CH3OH, CHCI3, IR (KBr) (cm-1) C27H42N3O5 510[M+Na]+ BeauveriolideI [159] Chất bột màu trắng C27H42N3O5 510[M+Na]+