Xác định độc tố của vi khuẩn vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận trên cá biển nuôi

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu khoa học riêng tơi hướng dẫn TS Trịnh Thị Thu Hằng Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Học viên Nguyễn Thị Kim Oanh LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình hồn thành đề tài này, nhận hướng dẫn giúp đỡ tận tình từ thầy anh chị làm việc phịng Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Trịnh Thị Thu Hằng trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ thực hồn thành luận văn Tơi xin trân trọng cảm ơn PGS TS Phạm Thị Tâm tạo điều kiện cho thực đề tài phịngVi sinh khoa Cơng nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội Tôi xin chân thành cảm ơn anh chị cán bộ, bạn sinh viên phịng Vi sinh khoa Cơng nghệ sinh học chia sẻ khó khăn giúp đỡ tơi hồn thành đề tài Cuối cùng, xin chân thành gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè anh chị đồng nghiệp luôn bên cạnh động viên, ủng hộ tơi suốt khoảng q trình thực hồn thành khóa học Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 26/11/2015 Học viên thực Nguyễn Thị Kim Oanh MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH BẢNG CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Tình hình ni trồng thủy sản giới Việt Nam 1.2 Một số bệnh thường gặp đối tượng cá biển nuôi 10 1.2.1 Bệnh virus 10 1.2.1.1 Bệnh hoại tử thần kinh (Viral Nervous Necrosis - VNN) 10 1.2.1.2 Bệnh Iridovirus 11 1.2.2 Bệnh vi khuẩn 12 1.2.2.1 Bệnh vi khuẩn hình sợi (bệnh hình trụ) 12 1.2.2.2 Bệnh vi khuẩn Pseudomonas 13 1.2.2.3 Bệnh Streptococcus 14 1.3 Tổng quan bệnh hoại tử gan thận cá biển nuôi 15 1.4 Tổng quan vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 16 1.4.1 Đặc điểm hình thái cấu tạo vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 16 1.4.2 Đặc điểm sinh lý 17 1.4.3 Đặc điểm sinh hóa 18 1.5 Gen độc tố chế gây bệnh cá biển vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 19 1.5.1 Gen độc tố 19 1.5.2 Cơ chế gây bệnh 21 1.6 Triệu chứng mắc bệnh hoại tử gan thận V parahaemolyticus gây cá biển 22 1.7 Một số kỹ thuật xác định bệnh hoại tử gan thận 23 1.7.1 Kỹ thuật chẩn đoán lâm sàng 23 1.7.2 Kỹ thuật mô bệnh học 23 1.7.3 Kỹ thuật PCR 24 1.8 Các phương pháp kiểm tra có mặt vi khuẩn V parahaemolyticus Error! Bookmark not defined CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU25 2.1 Vật liệu nghiên cứu 25 2.1.1 Mẫu nghiên cứu 25 2.1.2 Thiết bị nghiên cứu 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu 27 2.2.1 Phương pháp thu mẫu xử lý mẫu cá 27 2.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn Vibrio 28 2.2.3 Phương pháp thực phản ứng sinh hóa 30 2.2.3.1 Thử nghiệm khả sinh enzym catalase 30 2.2.3.2 Thử nghiệm KIA 30 2.2.3.3 Thử nghiệm khả sinh Indol 31 2.2.3.4 Thử nghiệm tính di động 32 2.2.3.5 Thử khả dung huyết 32 2.2.4 Xác định ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả sinh trưởng khả gây dung huyết vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 33 2.2.4.1 Xác định ảnh hưởng nhiệt độ thời gian nuôi cấy 33 2.2.4.2 Xác định ảnh hưởng pH 34 2.2.4.3 Xác định ảnh hưởng độ mặn môi trường nuôi cấy 34 2.2.5 Phương pháp tách ADN tổng số 35 2.2.6 Khuếch đại gen độc tố gây bệnh hoại tử gan thận kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 36 2.2.7 Phương pháp điện di ADN gel agarose 37 2.2.8 Phương pháp nghiên cứu tính kháng kháng sinh số chủng vi khuẩn V parahaemolyticus phân lập 38 2.2.9 Phương pháp gây nhiễm động vật thí nghiệm 39 CHƯƠNG III KẾT QUẢ 41 3.1 Kết phân lập tuyển chọn chủng Vibrio 41 3.2 Kết xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa chủng Vibrio sp tuyển chọn 44 3.3 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả sinh trưởng khả gây dung huyết chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus tuyển chọn 46 3.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian nuôi cấy 46 3.3.2 Kết xác định ảnh hưởng pH 47 3.3.3 Kết xác định ảnh hưởng độ mặn 49 3.4 Kết tách ADN tổng số vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus tuyển chọn 50 3.5 Kết xác định gen độc tố chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus tuyển chọn 51 3.6 Kết đánh giá tính kháng kháng sinh chủng vi khuẩn tuyển chọn 54 3.7 Kết đánh giá khả gây bệnh cho cá chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticustuyển chọn 55 KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ MỞ ĐẦU Việt Nam quốc gia ven biển có lợi đường bờ biển dài 3260km trải dài từ Bắc chí Nam, điều kiện thuận lợi cho việc phát triển ngành Thủy sản Hoạt động nuôi trồng thủy sản nước ta bắt đầu khởi sắc từ năm 1990 có xu hướng phát triển mạnh mẽ diện tích đối tượng ni trồng năm 2000- 2002.Hiện nay, ngành nuôi trồng thủy sản nước ta trở thành số ngành kinh tế mũi nhọn quốc gia với nhiều thành tựu đáng kể Theo số liệu Tổng cục Thống kê, sản lượng thuỷ sản năm 2014 ước tính đạt 6332,5 nghìn tấn, tăng 5,2% so với năm trước, cá đạt 4571 nghìn tấn, tăng 4,5%; tơm đạt 790,5 nghìn tấn, tăng 9,3% Thủy sản ngành có tốc độ tăng trưởng xuất cao tháng đầu năm 2014 [36] Theo bình chọn Tạp chí Seafood International năm 2014, 10 quốc gia có lượng thủy sản lớn Trung Quốc, Indonesia, Ấn Độ, Nhật, Mỹ, Nga,Peru, Việt Nam, Na Uy, Ai Cập Trong đó, Việt Nam đứng vị trí thứ 8[35] Như vậy, ngành ni trồng thủy sản Việt Nam phát triển có tiềm vô to lớn phát triển kinh tế biển Trong năm gần đây, ngồi việc ni loại thủy sản truyền thống loài cá nước ngọt, nước lợ, tôm, cua, ghẹ,… ngành thủy sản tập trung ni trồng loại cá biển có giá trị dinh dưỡng cao Những địa phương nuôi cá biển lớn nước ta kể đến như: Quảng Ninh, Hải Phịng khu vực phía Bắc; Khánh Hòa, Phú Yên khu vực duyên hải Nam Trung Bộ; Kiên Giang,Trà Vinh, Bạc Liêu khu vực Nam Bộ Theo Quy hoạch phát triển nuôi cá biển đến năm 2015, định hướng đến 2020 (Quyết định 1523/QĐ-BNN-TCTS ngày 08/7/2011 Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn), mục tiêu đặt đến năm 2015: Tổng sản lượng cá biển nuôi năm 2015 đạt 160.000 tấn, giá trị tương đương 1,04 tỷ USD, nuôi cá biển ao đạt 61.000 tấn, nuôi hệ thống lồng nhỏ 44.000 tấn, nuôi công nghiệp tập trung 55.000 Dự kiến đến năm 2020 tổng sản lượng cá biển đạt 200.000 - 260.000 tấn, giá trị 1,8 tỷ USD Như vậy, đẩy mạnh nuôi cá biển hướng phát triển Chính phủ quan tâm đầu tư năm tới Ở Việt Nam, mơ hình ni lồng mang lại nhiều giá trị thương mại cho ngư dân Tuy nhiên, với mơ hình cá biển ni phải chịu nhiều stress phải thích nghi mơi trường sống, tập qn kiếm ăn sinh sản bị thay đổi dẫn đến suy giảm sức đề kháng Điều tạo hội cho loài vi sinh vật phát triển, gây nhiều dịch bệnh cho ngành Thủy sản làm giảm suất chất lượng nuôi trồng thủy sản, gây thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi Các nghiên cứu vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus nguyên nhân gây nhiều loại bệnh nghiêm trọng đối tượng thủy sản EMS – bệnh tôm chết sớm, hay gây bệnh cá nuôi Đáng lưu ý bệnh hoại tử quan gan, thận cá biển nuôi vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây Vi khuẩn gây bệnh cá biển nuôi giai đoạn phát triển cá, gây thiệt hại nặng nề cho ngành nuôi cá biển Vì vậy, việc tìm cách phịng hạn chế bệnh vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus cần thiết Trên thực tế, ngư dân nuôi cá biển áp dụng phương pháp sử dụng kháng sinh chất diệt khuẩn để làm hạn chế bệnh cho cá nuôi Tuy nhiên, phương pháp không thực hiệu vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus có khả tạo lớp màng sinh học (biofilm) để kháng lại chất kháng sinh diệt khuẩn Hơn nữa, sử dụng kháng sinh, với lượng chất kháng sinh tồn dư thể loài thủy sản ảnh hưởng đến chất lượng thủy sản sức khỏe người sử dụng Do đó, cần phải có phương pháp khác phòng hạn chế bệnh hoại tử gan, thận cá biển việc sử dụng vắc- xin, tơi lựa chọn đề tài “Xác định gen độc tố vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận cá biển nuôi” làm sở cho nghiên cứu sau nhằm đưa hướng phòng trị bệnh cho cá biển nuôi CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Tình hình ni trồng thủy sản giới Việt Nam Nuôi trồng thủy sản coi ngành sản xuất thực phẩm có tốc độ phát triển nhanh giới, cung cấp phần lớn protein động vật cho người ngày chiếm tỷ trọng lớn tổng sản lượng thủy sản tồn cầu Các đối tượng ni bao gồm cá có vẩy, động vật giáp xác, động vật thân mềm, ếch, bị sát (khơng tính cá sấu) lồi thủy sản khác phục vụ cho nhu cầu tiêu dùng người[41] Sản lượng nuôi trồng thủy sản chiếm tỷ trọng ngày tăng tổng sản lượng thủy sản toàn cầu: từ 20,9% năm 1995 lên 32,4% năm 2005 40,3% năm 2010 mức cao kỷ lục 42,2% năm 2012 Châu Á chiếm tỷ trọng cao tổng sản lượng ni tồn cầu 54%, châu Âu chiếm 18% châu lục lại