Nghiên cứu tác nhân gây bệnh hoại tử gan thận ở cá biển nuôi

MỞ ĐẦU Với lợi đường bờ biển dài 3260km, nay, ngành nuôi trồng thủy sản nước ta trở thành số ngành kinh tế mũi nhọn quốc gia với nhiều thành tựu đáng kể Theo số liệu Tổng cục Thống kê, sản lượng thuỷ sản năm 2014 ước tính đạt 6332,5 nghìn tấn, tăng 5,2% so với năm 2013 Thủy sản ngành có tốc độ tăng trưởng xuất cao tháng đầu năm 2014 [36] Việt Nam có tiềm vơ to lớn phát triển kinh tế biển Ngoài loại thủy sản truyền thống loài cá nước ngọt, nước lợ, tôm, cua, ghẹ… năm gần đây, Việt Nam phát triển mạnh ngành nuôi trồng cá biển (cá chẽm, cá mú, cá bớp… ) Những địa phương nuôi cá biển lớn nước ta kể đến như: Quảng Ninh, Hải Phòng khu vực phía Bắc; Khánh Hịa, Phú n, khu vực duyên hải Nam Trung Bộ; Kiên Giang,Trà Vinh, Bạc Liêu khu vực Nam Bộ [32] Theo Quy hoạch phát triển nuôi cá biển đến năm 2015, định hướng đến 2020 (Quyết định 1523/QĐ-BNN-TCTS ngày 08/7/2011 Bộ Nông nghiệp PTNT), mục tiêu đặt đến năm 2015: Tổng sản lượng cá biển nuôi năm 2015 đạt 160.000 tấn, giá trị tương đương 1,04 tỷ USD Như vậy, nuôi cá biển hướng phát triển Chính phủ quan tâm đầu tư năm tới Ở Việt Nam, mơ hình ni lồng mang lại nhiều giá trị thương mại cho ngư dân Tuy nhiên, với mơ hình cá biển ni phải chịu nhiều stress phải thích nghi mơi trường sống, tập quán kiếm ăn sinh sản bị thay đổi dẫn đến suy giảm sức đề kháng Điều tạo hội cho loài vi sinh vật phát triển, gây nhiều dịch bệnh cho ngành Thủy sản làm giảm suất chất lượng nuôi trồng thủy sản, gây thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi Các nghiên cứu nhiều tác nhân làm lây lan dịch bệnh đối tượng thủy sản Trong đó, vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus xác định nguyên nhân gây nhiều loại bệnh nghiêm trọng tôm, loại cá nước cá biển nuôi Đáng lưu ý bệnh hoại tử quan gan, thận cá biển nuôi vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây Vi khuẩn gây bệnh cá biển nuôi giai đoạn phát triển cá, Page gây thiệt hại nặng nề cho ngành ni cá biển Vì vậy, việc tìm cách phịng hạn chế bệnh vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus cần thiết [2] Trên thực tế, ngư dân nuôi cá biển áp dụng phương pháp sử dụng kháng sinh chất diệt khuẩn để làm hạn chế bệnh cho cá nuôi Tuy nhiên, phương pháp không hiệu vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus có khả tạo lớp màng sinh học (biofilm) để kháng lại chất kháng sinh diệt khuẩn Hơn nữa, sử dụng kháng sinh, lượng chất kháng sinh tồn dư thể loài thủy sản làm ảnh hưởng đến chất lượng thủy sản sức khỏe người tiêu dùng Đứng trước tình hình chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tác nhân gây bệnh hoại tử gan thận cá biển ni” Mục đích nghiên cứu: Xác định tác nhân yếu tố gây bệnh cá biển ni để làm sở định hướng giải pháp phịng trị bệnh Nội dung nghiên cứu: - Xác định chủng vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan, thận cá biển ni - Xác định đặc tính sinh học chủng gây bệnh: tính gây bệnh, tính kháng kháng sinh (mức độ kháng, gen kháng) - Xác định yếu tố độc lực chủng gây bệnh cho cá biển nuôi Việt Nam Page CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 SƠ LƯỢC VỀ BỆNH HOẠI TỬ GAN THẬN Ở CÁ BIỂN 1.1.1 Cá biển Cá mú hay cá song (Epinephelus) giống cá thuộc họ cá mú (Serranidase), cá vược (Perciformes), lớp cá vây tia (Actinopterygii), ngành Chordata [65] Hình 1.1 Một số lồi cá mú nuôi chủ yếu Cá mú loại cá nước mặn, sống vùng nước ấm, phân bố chủ yếu vùng biển nhiệt đới nhiệt đới, tập trung nhiều lồi vùng biển Thái Bình Dương Chúng thường sống hốc đá, áng, vùng ven bờ quanh đảo có rạn đá san hơ, nơi có độ sâu từ 10 - 30 m, chịu đựng độ mặn rộng từ 11 - 41‰ Cá mú có giá trị kinh tế cao, giá thị trường loài cá mú đen cá mú hoa nâu 200.000 - 300.000 đồng/kg (kích cỡ từ 800 g - kg) Với cá mú chấm đỏ loại có giá 400.000 - 500.000 đồng/kg [32] Vì vậy, ngồi việc đánh bắt tự nhiên, phong trào nuôi cá mú lồng bè phát triển Cá mú ni lồng tre, bè gỗ có phủ lưới, đặt cố định hay thả vùng biển gió bão, Page sóng nhẹ vịnh, đầm phá Tuy nhiên, cá mú thường gặp số bệnh vi sinh vật gây như: bệnh đốm đỏ, bệnh hoại sơ, bệnh đường ruột, bệnh nhiễm trùng máu xuất huyết [3] Cá hồng (Lutjanus campechanus) loài cá xương sốngở biển phân bố vùng biển Ấn Độ (Ấn Độ Dương) phía Tây Thái Bình Dương Đây lồi cá có giá trị kinh tế, Việt Nam, loài cá chiếm 10 - 12% sản lượng cá đáy vịnh Bắc Bộ Trên thể cá hồng thường xuyên có nhiều loại vi khuẩn cư trú, lớp nhớt da, mang ruột Khi cá hồng cịn sống, có khả bảo vệ miễn dịch, vi khuẩn không phát triển Chỉ cá chết, sức đề kháng khơng cịn, vi sinh vật phát triển mạnh làm cá hỏng nhanh chóng đồng thời q trình phân huỷ, chất đạm cá tạo thành axit hữu có mùi khó chịu, làm biến đổi màu sắc tạo chất độc [7] Ở Việt Nam, gặp vùng đáy bùn cát sâu 40 – 50 m, phân bố vịnh Bắc Bộ số tỉnh vùng Trung Nam Phú Yên,Thừa Thiên Huế, Nha Trang Tại đây, cá hồng nguồn lợi quý báu ngư dân tỉnh để khai thác với giá phải Tại Phú Yên, giá cá giống từ 5.000-7.000 đồng/con, thu nhập ngày người khai thác cá hồng giống đạt bình qn từ 150.000 - 200.000 đồng/ngày Cá chẽm hay cá vược [31] (Lates calcarifer) loài cá sống nước mặn lẫn nước ngọt, thuộc phân họ Cá chẽm (Latinae) họ Centropomidae Thân hình thoi, dẹt bên Chiều dài thân 2,7 -3,6 lần chiều cao, tới 1,8 m thông thường 19–25 cm Đầu to, mõm nhọn, chiều dài hàm kéo dài đến ngang mắt Hai vây lưng liền nhau, lõm,vây trịn lồi,thân màu xám, bụng trắng bạc Khu vực sinh sống địa vùng bắc đông Australia tới eo biển Torres New Guinea nuôi nhiều nơi giới Australia, Malaysia, Indonesia, Ấn Độ, Thái Lan, Việt Nam, Anh, Hoa Kỳ Hà Lan Cá chẽm gọi cá vược Chúng thường sống hang đá vùng đáy có cỏ biển Chúng thích nghi với đáy rạn san hơ Lồi cá có phân bố vùng nước lợ Chúng thuộc lồi cá điển hình cửa sơng, chúng có số lượng đông kênh rạch, đầm phá đầm nuôi tôm Page Cá giị (Rachycentron canadum) lồi cá biển đại diện chi Rachycentron họRachycentridae Họ Rachycentridaetrước xếp cá Vược (Perciformes) [32], gần lại xếp vào cá khế (Carangiformes) Cá giò thường đơn độc, ngoại trừ quy tụ để sinh sản hàng năm, đơi tụ tập rạn san hô, xác tàu, bến cảng, phao, ốc đảo Nó cá nổi, vào cửa sơng rừng ngập mặn để tìm kiếm mồi Nó tìm thấy vùng biển nhiệt đới ấm Tây Đông Đại Tây Dương, khắp Caribe, Thái Bình Dương trừ Ấn Độ, Úc Nhật Bản Nó sinh vật rộng nhiệt (eurythermal), tức chịu đựng phạm vi nhiệt độ rộng, từ 1,6-32,2 °C Nó sinh vật rộng muối (euryhaline), sống độ mặn tới 44,5 ppt Hình 1.2 Một số loài cá biển (cá hồng, cá chẽm, cá giò) 1.1.2 Bệnh hoại tử gan thận cá biển Vi khuẩn V parahaemolyticus kí sinh nhiều lồi cá biển có giá trị kinh tế phân bố vùng biển khác loài cá vùng biển ấm: cá chẽm (Lates calcarifer), cá hồng (Lutjanus spp.), cá giò (Rachycentron canadum), cá mú (Epinephelus spp) Bệnh vi khuẩn V parahaemolyticus gây báo cáo gây thiệt hại kinh tế cho nghề nuôi cá biển nhiều nước giới 0, 0, 0, Bệnh vi khuẩn V parahaemolyticus gây đặc trưng xuất đốm đỏ, xuất huyết (bên nội quan bên trong) Vẩy cá bị tróc, rụng, tạo nên vết loét ngày lan rộng sâu Vây cá bị mòn cụt, xơ xác Giải phẫu Page mẫu cá bệnh cho thấy tượng xuất huyết nội tạng (đặc biệt gan thận) xuất huyết cá Cá bị bệnh chết hàng loạt bị cấp tính, chết rải rác thể khơng cấp tính Đặc điểm bệnh hoại tử cá mú chấm cam với triệu chứng ban đầu cá thường bơi gần mặt nước bơi sát vào lưới, da cá sẫm màu, xuất đốm đỏ thân Sau đó, đốm tạo thành vết loét rộng xung quanh, kèm theo biểu xuất huyết vây, miệng, hậu môn, đuôi Giải phẫu nội quan thường thấy gan nhợt nhạt, thận đen bầm, đơi tích dịch xoang bụng số trường hợp bệnh nặng Bệnh hoại tử gan thận xảy khắp nơi có nghề ni động vật thủy sản nước lợ nước mặn Bệnh lây lan nhanh, khơng phát kịp thời có khả gây chết cao Bệnh thường xuất vào mùa nóng đầu mùa mưa, mơi trường thay đổi đột ngột, làm cá dễ bị sốc Hơn nữa, vi khuẩn tổng số nước có xu hướng tăng nhiệt độ tăng Đây điều kiện tốt cho vi khuẩn xâm nhập gây bệnh đặc biệt chết nhiều giống thả nuôi Vi khuẩn V Parahaemolyticuscó ảnh hưởng nghiêm trọng đến nghề ni thủy sản 14 nước gây bệnh khoảng 48 loài cá biển Bệnh vi khuẩn V parahaemolyticus gây chẩn đoán dựa vào dấu hiệu bệnh lý đặc trưng mô tả Nuôi cấy phân lập Vibrio môi trường chọn lọc phân tích đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa Ngồi ra, nhận biết V parahaemolyticus phương pháp sinh học phân tử phân tích trình tự gen 16S ribosomal DNA (rDNA) gen độc tố đặc trưng [5] Để điều trị bệnh hoại tử gan thận cá biển, số nghiên cứu đề xuất biện pháp trị bệnh Vibriosis cho cá biển cách cho ăn, tắm tiêm kháng sinh Biệnpháp trộn kháng sinh vào thức ăn trộn tetracyline 75-100 mg/kg cá, streptomycine 50-75 mg/kg cá, oxolinic acid 10 mg/kg cá cho ăn liên tục đến 10 ngày cải thiện tình trạng nhiễm bệnh vi khuẩn Vibrio0 Nhìn chung, kháng sinh phương pháp chọn lựa dùng trị bệnh vi khuẩn Mặc dù kháng sinh đem lại hiệu điều trị định số trường hợp, việc lạm dụng kháng sinh tạo chủng vi khuẩn kháng thuốc gây khó khăn cho trình điều trị Nghiên cứu Shyne cộng (2008) khả nhạy cảm với Page kháng sinh vi khuẩn V parahaemolyticus phân lập từ cá mú bệnh Kết cho thấy hầu hết chủng kháng lại sulphadiazine amoxicillin, 87% kháng lại gentamycine, 89% kháng lại kanamycine oxytetracycline Ngoài ra, tồn dư kháng sinh sản phẩm thủy sản ảnh hưởng đến an toàn vệ sinh thực phẩm mơi trường Vì vậy, việc sử dụng kháng sinh để trị bệnh cho thủy sản khơng nên khuyến khích cần cân nhắc thận trọng trường hợp Chính mặt trái sử dụng kháng sinh, việc phịng bệnh cho cá ni ln ý suốt q trình ni Phương pháp phịng bệnh tổng hợp thường trại nuôi áp dụng sát trùng bể, ao dụng cụ trước đợt sản xuất, xử lý nguồn nước trước đưa vào sử dụng Thả cá ni với mật độ thích hợp, tránh làm cá bị tổn thương trình vận chuyển, tắm định kỳ để phòng loại bệnh ký sinh trùng ý chất lượng thức ăn Tuy nhiên, biện pháp phòng bệnh đơn giản với mục đích giảm thiểu nguy nhiễm bệnh, thiệt hại bệnh tiếp tục diễn gây ảnh hưởng lớn cho nghề nuôi cá biển Hiện nay, giải pháp nâng cao sức đề kháng cho vật nuôi cách sử dụng chất gây kích thích miễn dịch vắcxin phịng bệnh phương pháp phòng bệnh chủ động mang lại hiệu cao, tập trung nghiên cứu nhiều nước giới Song, để chế tạo loại vắc-xin đặc hiệu hay chọn lựa hoạt chất kích thích miễn dịch đem lại hiệu bảo hộ cao cho vật nuôi thử thách khơng nhỏ khoa học 1.1.3.Tình hình nuôi trồng thủy hải sản 1.1.3.1.Trên giới Ngành nuôi trồng thủy hải sản giới có từ lâu ngành nuôi trồng thủy hải sản theo hướng đại thực đời từ năm 1930, thật bùng nổ từ năm 80 tôm giống sản xuất với số lượng lớn cung cấp cho người nuôi Hiện giới ngành ni trồng thủy sản phát triển, kể đến nước đứng đầu sản lượng nuôi trồng thủy sản theo thứ tự gồm: Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam, Thái Lan, Indonesia, Bangladesh, Chile, Nhật Bản, Na Uy Philippines Tuy nhiên, ngành nuôi trồng thủy hải sản bị gây trở ngại nạn dịch bệnh lây lan khắp nơi Các dịch bệnh thường xảy thủy hải sản bệnh Page đốm trắng, bệnh đầu vàng, bệnh cịi,… tơm nuôi, bệnh xuất huyết virus, bệnh Indivirus… cá, bệnh nhóm Vibrio sp., nấm…gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành nuôi trồng thủy hải sản Một tác nhân gây bệnh đáng quan tâm bệnh nhóm vi khuẩn Vibriosp gây cho động vật thủy hải sản (tơm, cá) Chúng gây bệnh qua tất giai đoạn động vật thủy sản xem nguồn gốc gây thiệt hại nghiêm trọng giống thủy hải sản Nhiều trường hợp nhiễm bệnh phát Australia, Ấn Độ, Indonesia, Philippines, Đài Loan, Thái Lan nhiều loài thủy hải sản khác Các giảm sút gần ngành nuôi trồng thủy hải sản Việt Nam, Ấn Độ, Bangladesh, Philippines Trung Quốc chủ yếu tác động nhóm vi khuẩn Vibriosp Theo dự báo Trung tâm Thuỷ sản Thế giới, đến năm 2020, nước phát triển chiếm tới 77% tổng tiêu thụ thuỷ sản toàn cầu 79% tổng sản lượng thuỷ sản giới Như là, từ năm 1997 đến năm 2020, tiêu thụ thuỷ sản nước phát triển tăng từ 62,7 triệu lên 98,6 triệu (57%), nước phát triển tăng 4%, từ 28,1 triệu lên 29,2 triệu 1.1.3.2.Ở Việt Nam Việt Nam quốc gia giới có nghề nuôi thủy sản phát triển nước có lịch sử ni trồng thủy hải sản lâu đời Nghề nuôi thủy sản truyền thống thập niên 1960, nhiên vòng 10 năm nay, nghề ni thủy sản có tốc độ phát triển nhanh chóng Trong năm qua, ngành thủy sản ln khẳng định ngành kinh tế mũi nhọn có đóng góp quan trọng cho phát triển kinh tế - xã hội nước nhà Tạo công ăn việc làm cho hàng trăm ngàn lao động, cung cấp thực phẩm thủy sản cho đời sống người dân, phấn đấu trở thành ngành sản xuất hàng hóa lớn, sản phẩm thủy sản có sức cạnh tranh cao thị trường để tiếp tục phát triển nhanh, ổn định bền vững Thực phẩm thuỷ hải sản giữ vai trò an ninh lương thực quốc gia góp phần xố đói giảm nghèo Thực phẩm thuỷ hải sản đánh giá nguồn cung cấp đạm động vật cho người dân Việt Nam Page 1.1.3.3 Một số khó khăn ni trồng thủy hải sản Vai trị nuôi trồng thủy sản to lớn việc cung cấp thực phẩm, y học, công nghiệp, nông nghiệp hay giúp xố đói, giảm nghèo phát triển kinh tế - xã hội nói chung nhiều quốc gia Tuy nhiên, với thâm canh hoá ngày cao độ, nghề nuôi trồng thuỷ sản đối mặt với nhiều thách thức lớn ô nhiễm môi trường, suy thối nguồn lợi, dịch bệnh thủy sản, an tồn vệ sinh thực phẩm, phân cách mâu thuẫn xã hội Các mơ hình chiến lược phát triển thời gian tới gồm: Ni thâm canh với hệ thống hồn chỉnh; ni tuần hồn, ni kết hợp nuôi lồng biển khơi Nhằm phát triển bền vững nghề nuôi thủy sản, nay, nhiều tổ chức nỗ lực lớn việc phát triển phương thức – qui tắc quản lý tổng hợp nghề nuôi thủy sản bước đầu ứng dụng nhiều nơi như: nuôi sạch, thực hành quản lý tốt hơn, ni có trách nhiệm 1.2 CÁC KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN BỆNH HOẠI TỬ GAN THẬN 1.2.1 Kỹ thuật chẩn đoán lâm sàng Là kỹ thuật dựa vào triệu chứng bên bệnh xuất cá để kết luận Dấu hiệu bệnh lý điển hình cá nhiễm bệnh biểu gan, thận, da… như: bơi lội không bình thường (bơi vịng trịn, bơi gần mặt nước, bơi hỗn loạn không định hướng…), bỏ ăn, da lở loét, vây cá bị ăn mòn, xuất huyết nội tạng (gan thận)và tỷ lệ chết lớn Phương pháp tiến hành cá mắc bệnh cá bị chết, kết luận tác nhân gây bệnh vi khuẩn loại Muốn khẳng định vi khuẩn gây bệnh xác V parahaemolyticus phải tiến hành phương pháp chẩn đốn phịng thí nghiệm 1.2.2 Kỹ thuật mơ bệnh học Mơ bệnh học phương pháp xác định tổn thương mô tế bào dựa thủ thuật nhuộm tế bào quan sát kính hiển vi Những quan sát tổn thương thông thường nhiều cho chẩn đốn đắn hình thái tổn thương vài bệnh giống Page Kỹ thuật quan sát mô bệnh học phát hình thái màu sắc khuẩn lạc tạo mơ đích, kỹ thuật đơn giản cho phép nhận biết có mặt V parahaemolyticus Thơng thường, có kích cỡ lớn giải phẫu lấy gan, thận, mang, nước nuôi cá biển… Mẫu tăng sinh mơi trường BHI sau cấy trang môi trường TCBS Chọn khuẩn lạc riêng rẽ làm tiêu sau nhuộm Gential, Lugol Safranin quan sát kính hiển vi quang học Tuy nhiên, khơng trường hợp kết kiểm tra mẫu cho dương tính với bệnh hoại tử gan thận kỹ thuật PCR lại khơng phát vi khuẩn V parahaemolyticus Có thể lý giải tất chủng vi khuẩn V parahaemolyticus phân lập từ mẫu lâm sàng (mẫu bệnh phẩm) có 100% gen độc tố tdh có 1-5% chủng từ mơi trường có mang gen Đáng ý loài V mimicus, V cholera V hollisae có gen độc tố tương tự gen tdh Như vậy, phương pháp áp dụng cho trường hợp phát bệnh, không áp dụng cho trường hợp vi khuẩn dạng tiềm ẩn gen tế bào chủ 1.2.3 Kỹ thuật PCR Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase chain reaction - PCR) Kary Mullis phát minh năm 1985 Đây phương pháp invitro tương đối đơn giản để nhân nhanh đoạn ADN định khoảng thời gian ngắn, nhờ xúc tác ADN polymerase Tất ADN polymerase hoạt động tổng hợp đoạn ADN từ mạch khn cần có mặt mồi đặc hiệu Mồi đoạn ADN ngắn có khả bắt cặp bổ sung với đầu mạch khuôn ADN polymerase nối dài mồi để hình thành mạch Ðây phương pháp in vitro sử dụng cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn từ trình tự DNA đặc biệt dựa hoạt động enzyme polymerase Hiện sử dụng kỹ thuật khuếch đại DNA để chuẩn đoán nhanh bệnh Vibriosp vài mà không nhiều thời gian để phân lập vi khuẩn Nguyên tắc phương pháp phát đoạn DNA đặc hiệu cho Vibrio sp Page 10 Gen tdh (250 bp) Gen trh (251 bp) Hình 3.10.Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi gen độc tố tdh trh của7 chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus phân lập (M: marker 100bp;1-8: B20M2, N9.2, HH3.34, B13M1 B5M3, N13.1.1, B5M2) Gen tdh trh mã hóa độc tố haemolysin bền nhiệt Đoạn gen tdh (250 bp) gen trh (251 bp) có mặt chủng V parahaemolyticus gây độc cho người Theo Takeda cộng (1978) tất chủng vi khuẩn V parahaemolyticus phân lập từ mẫu lâm sàng (mơ bệnh phẩm) có gen độc tố tdh 1-5% chủng từ môi trường có mang gen Từ kết ghi nhận gel agarose cho thấy, chủng phân lập khơng có xuất gen tdh gen trh Như vậy, chủng phân lập không mang hai gen độc tố yếu tố độc lực chủng thấp phản ứng PCR không đặc hiệu kỹ thuật tách DNA làm đứt gãy gen Đây nguyên nhân dẫn đến thiếu vắng băng vạch gel agarose Page 38 Hình 3.11.Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi gen tlh từ DNA tổng số chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus phân lập (M: marker 100bp;1-8: B20M2, N9.2, HH3.34, B13M1 B5M3, N13.1.1, B5M2) Tlh protein không bền nhiệt, bất hoạt 600C 10 phút, enzyme có hoạt tính phospholipase A2/lysophospholipasecó nhiều chủng thuộc lồi Vibrio parahaemolyticus Tính độc hemolysin vi khuẩn gây người chưa nghiên cứu kĩ có nhiều nghiên cứu động vật tính độc hemolysin Kết điện di đồ (Hình 3.11) cho thấy 6/7 mẫu xuất băng vạch vị trí kích thước 450bp tương ứng với đoạn gen tlh có kích thước khoảng 451bp Tuy nhiên, giếng cho thấy xuất nhiều băng vạch phản ứng PCR không đặc hiệu DNA bị đứt gãy thao tác 3.6 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM GÂY NHIỄM TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM Qua kết phân lập định danh vi khuẩn cho thấy cá biển bị bệnh bị nhiễm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, nhiên để kiểm tra xem vi khuẩn có phải tác nhân gây bệnh cho cá biển hay không tiến hành cảm nhiễm gây bệnh chủng vi khuẩn phân lập B20M2, N9.2 cho cá mú ni phịng thí nghiệm với phương pháp gây nhiễm vi khuẩn trang 23, 24 Page 39 Kết tất liều thí nghiệm có cá chết (Hình 3.12), ngoại trừ lơ đối chứng khơng gây chết cá thí nghiệm (Bảng 3.7) Bảng 3.7.Kết gây nhiễm vi khuẩn Tên chủng Tỷ lệ gây Tỷ lệ gây chết Tỷ lệ gây Tỷ lệ gây chết chết cá cá mú sau chết cá cá mú sau mú sau 24h 48h (20 con) 96h (20 con) (20con) mú sau 72h (20 con) B20M2 25% 50% 50% 75% N9.2 50% 50% 75% 100% 0 0 Lô đối chứng Sau 24h gây nhiễm cá, cá xuất triệu chứng cá biếng ăn, hoạt động bơi bị rối loạn da, vây sưng lên bị lở loét, mang nhợt nhạt, mắt cá lồi đục, có tượng lở loét lớp biểu bì Lá lách, gan, thận bị hoại tử, vết hoại tử lan nhanh, hoá lỏng lách có màu đỏ anh đào, dần hình dạng ban đầu nó, gan chuyển từ màu xám nâu thành màu vàng Các quan bên khoang bụng xuất mạch máu rõ lên Tim cá bị bệnh xuất vết nâu đen Tuy nhiên, chủng sử dụng để gây nhiễm mức độ gây chết khác chủng N9.2 gây chết 100% sau ngày, chủng B20M2gây chết 75% sau ngày Page 40 Cá khỏe mạnh bình ình th thường Dấu hiệu cá nhiễm ễm bệ bệnh Hình 3.12 Cá trước sau gây nhiễm Tiến hành phân lập ập mẫu m cá chết sau gây nhiễm, m, ta thu đđược kết khuẩn lạc có màu sắc vàà hình thái gi giống với khuẩn lạc vi khuẩn ẩn phân llập từ mẫu cá biển lúc thu mẫu, khuẩn ẩn lạc lạ có màu xanh đậm, trịn bóng Vi khu khuẩn tái phân lập từ cá bệnh nh khoảng khoả 48 – 96 sau gây nhiễm ợc xác định có tiêu hình thái, sinh hố gi giống chủng vi khuẩn cảm ảm nhi nhiễm Vibrio parahaemolyticus phẩy ẩy khuẩn khu gram (-), có khả ng sinh enzyme catalase, kh khả sinh Indol, lên men đường ờng glucose, có khả kh di động vàà gây dung huyết huy dạng β (Hình 3.13) Page 41 Hình 3.13: Kết phân lập vi khuẩn từ cá sau gây nhiễm (a) Hình thái khuẩn lạc mơi trường TCBS (b) Hình thái vi khuẩn soi kính hiển vi (c) Kết thử khả sinh Indol (d) Kết lên men đường môi trường KIA (e) Kết thử khả sinh enzyme catalase Kết cảm nhiễm cho thấy vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus tác nhân gây bệnh hoại tử gan, thận cho cá biển nuôi Page 42 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ mẫu bệnh phẩm dựa vào đặc điểm hình thái phân lập chủng vi khuẩn Vibrio sp Sau tiếp tục tiến hành phản ứng sinh lý, sinh hoá tạm thời kết luận chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus Từ nghiên cứu chủng nhận thấy chủng vi khuẩn có khả kháng vài loại kháng sinh penicillin, gentamycin erythromycin Nhưng chúng tương đối mẫn cảm với enrofloxacin norfloxacin Chúng tơi tiến hành tách dịng gen độc tố vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus nhận thấy chủng có gen ToxR tlh khơng có gen tdh trh Tới kết luận chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus Sau lây nhiễm trở lại động thí nghiệm kết luận chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticusđều có khả nhiễm bệnh cao tất lồi cá biển ni Page 43 KIẾN NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu xác định gen độc tố chủng vi khuẩn V parahaemolyticus phân lập số lượng mẫu bệnh phẩm nhiều khu vực rộng lớn để sàng lọc chủng có tính đại diện kháng ngun làm sở cho việc tạo chủng có khả tạo kháng thể bảo hộ
Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình phát nhanh chủng vi khuẩn V parahaemolyticus cá biển kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen độc tố, có gen toxR
Nghiên cứu gây đột biến chủng vi khuẩn mang gen độc tố tạo vi khuẩn nhược độc, phục vụ mục đích chế tạo vaccine phòng ngừa bệnh hoại tử gan, thận cá nuôi lồng bè Page 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1.Ranier Froese Daniel Pauly (2014)."Rachycentridae" FishBase Phiên tháng 11 năm 2014 Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Huy Dũng, Nguyễn Thị Muội (2004) Bệnh học thủy sản NXB Nông Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Văn Hảo, Nguyễn Ngọc Du (2008) Bài giảngTổng quan bệnh nguy hiểm thường gặp động vật nuôi biển, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II, TP Hồ Chí Minh Thái Thanh Dương (2007) Các loài cá thường gặp Việt Nam, Bộ Thủy sản, Hà Nội, Tr.16 5.Từ Thanh Dung (2011) Thử nghiệm văcxin phòng bệnh gan thận mủ cho cá tra ni thâm canh, Tạp chí thương mại thủy sản 6.Trần Linh Thước(2005).Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, Nxb Giáo dục, Thành phố Hồ Chí Minh 7.Vũ Thị Thanh Hương, Bùi Thị Thanh Tịnh Nguyễn Quốc Bình (2011), Tạo chủng Edwardsilla ictaluri nhược độc cách chọn môi trường kháng sinh Rifampicin nhằm ngăn ngừa bệnh gan thận mủ cá tra, Kỷ yếu Hội nghị công nghệ sinh học tồn quốc, Khu vực phía Nam lần II, tiểu ban 5: Công nghệ sinh học Thủy sản, tr.108 Tài liệu tiếng Anh Page 45 8.Austin B and Austin DA (2007) Vibrios, bacterial fish pathogens: diseases in farmed and wild fish, Praxis Publishing Ltd, Chichester, UK, p 594 9.Alsina M and Blanch AR (1994) Improvement and Update of A Set of Keys for Biochemical-Identification of Vibrio Species, Journal of Applied Bacteriology 77: 719-721 10.Chao G, Jiao X, Zhou X, Yang Z, Huang J, Zhou L and Qian X (2009) Distribution, prevalence, molecular typing, and virulence of Vibrio parahaemolyticus isolated from different sources in coastal province Jiangsu, China, Food Control 20: 907-912 11.Chistiakov AD, Hellemans B and Volckaert FAM (2007) Review on the immunology of European sea bass Dicentrarchus labrax Vet Immunol Immunopathol 117: 1-16 12.Christopher AB, Thomas JC and Kim O (2011).Vibrio parahaemolyticus cell biology and pathogenicity determinants", Microbes and Infection 13: 992-1001 13.Daniels NA, MacKinnon L, Bishop R, Altekruse S, Ray B, Hammond RM, Thompson S, Wilson S, Bean NH, Griffin PM, Slutsker L (2000).Vibrio parahaemolyticus infections in the United States 1973–1998.J Infect Dis 181: 1661 – 1666 14.Duff D C B (1942) The oral immunization of trout against Bacterium salmonicida, Journal Immunology 44: 87-94 15.Joseph SW, Colwell RR, Kaper JB (1983).Vibrio parahaemolyticus and related halophilic vibrios.Critical Rev Microbiol 10: 77-123 16.Harris KA and Hartley JC (2003) Development of broad-range 16S rDNA PCR for use in the routine diagnostic clinical microbiology service", Journal of Medical Microbiology 52: 685-691 17.Harikrishnan R, Balasundaram C and Heo MS (2010) Molecular studies, disease status and prophylactic measures in grouper aquaculture: Economic importance, diseases and immunology, Aquaculture 309: 1-14 18.Harikrishnan R, Kim JS, Balasundaram C and Heo MS (2012) Vaccination effect of liposomes entrapped whole cell bacterial vaccine on immune response and disease Page 46 protection in Epinephelus bruneus against Vibrio harveyi, Aquaculture 342-343: 6974 19.Honda T, Iida T (1993).The pathogenicity ofVibrio parahaemolyticus & the role of thermostable direct hemolysin & related hemolysins.Rev Med Microbiol 4: 106–113 20.Kaneko T and Colwell RR (1973).Ecology of Vibrio parahaemolyticus in Chesapeake Bay", Journal of Bacteriology 113: 24-32 21.Kazuyuki K, Shigeko T and Hiroo I (1979).Effect of Mediumon Flagellation of Vibrio parahaemolyticus", Appl Environ Microbiol 37: 1248-1249 22.Kondo H, Tinwongger S, Proespraiwong P, Mavichak R, Unajak S, Nozaki R, Hirono I (2014) Draft genome sequences of six strains of Vibrio parahaemolyticus isolated from early mortality syndrome/acute hepatopancreatic necrosis disease shrimp in Thailand Genome Announc 2(2):e00221-14 doi:10.1128/genomeA.00221-14 23.Nash G, Anderson I G, Shariff M and Shamsudin MN (1987) Bacteriosis associated with epizootic in the giant sea perch, Lates calcarifer, and the estuarine grouper, Epinephelus tauvina, cage cultured in Malaysia, Aquaculture 67:105-111 24.Nishibuchi M, Kaper JB (1995) Thermostable direct hemolysin gene of Vibrio parahaemolyticus a virulence gene acquired by a marine bacterium Infection and immunity 63(6): 2093–2099 25.Nishibuchi M, Kumagai K, Kaper JB (1991).Contribution of the tdh1 gene of Kanagawa phenomenon-positive Vibrio parahaemolyticus to production of extracellular thermostable direct hemolysin.Microb Pathog 11: 453–460 26.Tuyet DT, Thiem VD, Von SL, Chowdhury A, Park E, Canh DG, Chien BT, Van TT, Naficy A, Rao MR, Ali M, Lee H, Sy TH, Nichibuchi M, Clemens J and Trach DD (2006) Clinical, epidemiological, and socioeconomic analysis of an outbreak of Vibrio parahaemolyticus in Khanh Hoa Province, Vietnam Infect Dis 186(11): 1615– 1620 27.Shyne A P S, Sobbhana, K S, George, K C and Paul R R (2008) Phenotypic characteristics and antibiotic sensitivity of Vibrio parahaemolyticus strains isolated from diseases grouper (Epinephelus spp.), J Mar Biol Ass 50: 1-6 28.Uribe C, Folch H, Enriquez R and Moran G (2011) Innate and adaptive immunity in teleost fish: a review, Veterinarni Medicina 56(10):486–503 Page 47 29.Van WB (2008).A history of fish immunology and vaccination The early days, Fish Shellfish Immunol 25: 397-408 30.Zhang XH and Austin B (2005) A review haemolysins in Vibrio species, Journal of Applied Microbiology 98: 1011–1019 31.Zulkifli Y, Alitheen N B, Son R, Yeap S K, Lesley M B and Raha A R (2009) Identification of Vibrio parahaemolyticus isolates by PCR targeted to the toxR gene and detection of virulence genes International Food Research Journal 16: 289-296 PHỤ LỤC Môi trường LB (Luria Betarni) lỏng: Trypton 1% Cao nấm men 0.5 % NaCl 0.5 % Môi trường BHI (Brain Heart Infusion): Dịch não dê 200 g Dịch tim bò 250 g Polypeptone 10 g NaCl 5g Na2HPO4 2,5 g Dextrose 2g Nước cất 1000 ml Môi trường TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Salts): Peptone 10 g Cao men 5g Natri citrat 10 g Natri thiosulfat 10 g Mật bị khơ 5g Natri clorid 10 g Page 48 Natri cholat 3g Feric citrat 1g Saccharose 20 g Dung dịch xanh thymol 1% ml Dung dịch xanh bromothymol 0,2% 20 ml Thạch sợi 15 g Nước cất vừa đủ 1000ml Môi trường Indole: Tryptone 2% Cao nấm men 0.5 % NaCl 0.5 % Peptone 1% Môi trường KIA (Kligler Iron Agar): Cao thịt 3g Cao nấm men 3g Peptone 20 g NaCl tinh khiết 5g Lactose 10 g Feric citrat 0.5 g Glucose 1g Natri thiosulfat 0.5 g Dung dịch phenol đỏ 0.5% ml Thạch 12 g Nước cất 1000 ml Môi trường thạch máu: Peptone NaCl 10 g 5g Page 49 Cao thịt 4g Thạch 20 g Nước cất 1000 ml Máu thỏ máu cừu 50ml (Máu 5%) Môi trường thử khả di động vi khuẩn V parahaemolyticus: Tryptone 1–2% Cao nấm men 0.5 % NaCl Agar 0.5 % 0.5 – 08 % Hình thái vi khuẩn Vibrio sp quan sát kính hiển vi Kết thử catalase Page 50 Kết thử Indole Kết phản ứng KIA Kết thử khả di động Page 51 Kếết thử khả dung huyết Page 52