ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR GENOTYPING TRONG NGHIÊN cứu tác NHÂN gây BỆNH đốm TRẮNG (WSSV) TRÊN tôm sú

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN CHƯNG THỊ NGHIỄM ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR - GENOTYPING TRONG NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN CHƯNG THỊ NGHIỄM ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR - GENOTYPING TRONG NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TRẦN THỊ TUYẾT HOA 2009 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm tạ Quý Thầy - Cô giảng viên Khoa Thủy Sản, trường Đại học Cần Thơ tận tâm giảng dạy, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu suốt thời gian em học tập trường Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn cô Trần Thị Tuyết Hoa giảng viên Bộ môn Sinh học Bệnh Thủy Sản thuộc khoa Thủy Sản - trường đại học Cần Thơ tận tâm dìu dắt, hướng dẫn em hoàn thành luận văn tốt nghiệp, tạo điều kiện để em có hội học tập thêm kiến thức thực tế Chân thành cảm ơn anh Mai Nam Hưng (lớp cao học khố 14) nhiệt tình hỗ trợ cung cấp mẫu tôm thu Cà Mau năm 2008 Xin cám ơn tập thể bạn lớp Bệnh học thủy sản khóa 31 động viên, giúp đỡ, trao đổi kiến thức suốt thời gian học tập, làm luận văn tốt nghiệp Khoa Thủy Sản Chân thành cảm ơn anh, chị môn Sinh học Bệnh thủy sản nhiệt tình hỗ trợ, giúp đỡ tận tình suốt thời gian thực luận văn Chân thành cảm ơn Ba, Mẹ em gái động viên suốt thời gian làm luận văn khoảng thời gian học Đại học Xin chân thành cảm ơn chúc Quý thầy cô anh, chị, bạn bè lời chúc sức khỏe thành công sống i LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com TÓM TẮT Nghiên cứu thực nhằm tìm hiểu khác kiểu gen WSSV hai thời điểm hai khu vực khác phương pháp PCR Genotyping (ORF94 ORF125) Kết cho thấy có khác kiểu gen WSSV năm 2006 năm 2008 khu vực Cà Mau Bạc Liêu phân tích 231 mẫu 23 ao, thuộc đợt thả giống liên tiếp ao nuôi mơ hình qng canh cải tiến (QCCT) thuộc tỉnh Cà Mau 2008 so sánh kiểu gen dòng virus với nghiên cứu trước (năm 2006) Kết nghiên cứu cho thấy, năm 2008, kiểu gen thuộc ORF94 có 12 nhóm vùng lặp lại (VLL), từ - 16 vùng lặp lại 11-VLL chiếm tỉ lệ cao (35,8%, 43/120 tổng số mẫu), ORF125 có nhóm vùng lặp lại từ 14 vùng lặp lại, 7-VLL chiếm tỉ lệ cao (53,8%, 64/119 tổng số mẫu) Năm 2006 cho thấy có nhóm vùng lặp lại thuộc ORF125, từ - vùng lặp lại (Cà Mau) có nhóm từ - vùng lặp lại (Bạc Liêu), kiểu gen có 6-VLL chiếm tỉ lệ cao hai khu vực (Cà Mau 59,7%, Bạc Liêu 24,1%) Sự nhiễm nhiều kiểu gen (ORF94 ORF125) WSSV ao mơ hình nuôi QCCT năm 2008 phổ biến nhiễm kép nhiều kiểu gen mẫu tôm phong phú so với năm 2006 Nghiên cứu cho thấy, nhiễm bệnh đợt nuôi tôm liên tiếp mơ hình QCCT chủ yếu nguồn tơm giống gây Từ thấy khả ứng dụng tốt phương pháp PCR Genotying nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng (WSSV) tôm sú ii LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ……………………………………….i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH vi Chương I - GIỚI THIỆU Chương II - LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình bệnh đốm trắng tơm 2.1.1 Trên giới 2.1.2 Ở Việt Nam 2.2 Một số vấn đề liên quan đến virus gây đốm trắng - WSSV 2.2.1 Hình thái học WSSV 2.2.2 Cấu trúc protein 2.2.3 Gen phân loai học 2.2.4 Sự biến đổi gen độc lực dòng virus 2.2.5 Vật chủ cảm nhiễm 2.2.6 Một số nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng kỹ thuật PCR - genotyping 2.3 Phương pháp chẩn đoán PCR 2.3.1 Nguyên tắc phản ứng PCR 2.3.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 2.3.3 Úng dụng kỹ thuật PCR 10 Chương III - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 3.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 11 3.2 Vật liệu nghiên cứu 11 3.2.1 Dụng cụ hoá chất 11 3.2.2 Vật liệu nghiên cứu 11 3.3 Phương pháp nghiên cứu 12 3.3.1 Phương pháp Nested - PCR phát WSSV 12 iii LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com 3.3.2 Phương pháp PCR-genotyping 14 Chương IV - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16 4.1 Phân tích mẫu thu năm 2008 16 4.1.1 Kết phân tích PCR-WSSV-IQ2000 16 4.1.2 Kết phân tích PCR-Genotyping 19 4.1.2.1 Kết phân tích PCR-Genotyping thuộc ORF94 19 4.1.2.2 Kết phân tích PCR-Genotyping thuộc ORF125 25 4.2 Kết phân tích mẫu axit nucleic trử năm 2006 với PCR-Genotyping thuộc ORF125 30 4.3 So sánh khác số vùng lặp lại thuộc ORF94 Cà Mau Bạc Liêu vào năm 2006 2008 33 4.4 So sánh khác số vùng lặp lại thuộc ORF125 Cà Mau Bạc Liêu vào năm 2006 2008 35 Chương IV - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38 4.1 Kết luận 38 4.2 Đề xuất 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 PHỤ LỤC I 42 PHỤ LỤC II 43 iv LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com DANH SÁCH BẢNG Bảng 4.1 - Tỉ lệ nhiễm bệnh so với tổng số mẫu phân tích 16 Bảng 4.2 - Các ao có mẫu tơm mẫu cua dương tính phân tích 18 Bảng 4.3 - Số vùng lặp lại thuộc ORF94 mẫu thu tỉnh Cà Mau năm 2008 19 Bảng 4.4 -Số vùng lặp lại ORF94 tương ứng với ao qua đợt thu mẫu 24 Bảng 4.5 - Số vùng lặp lại thuộc ORF125 mẫu thu tỉnh Cà Mau năm 2008 25 Bảng 4.6 - Số vùng lặp lại ORF125 tương ứng với ao qua đợt thu mẫu 29 Bảng 4.7 - Kết phân tích số vùng lặp lại thuộc ORF125 mẫu axit nucleic trử Cà Mau Bạc Liêu năm 2006 32 Bảng 4.8 - Số vùng lặp lại thuộc ORF94 Cà Mau vào năm 2006 năm 2008 33 Bảng 4.9 - Số vùng lặp lại thuộc ORF94 Bạc Liêu vào năm 2006 năm 2008 34 Bảng 4.10 - Số vùng lặp lại thuộc ORF125 Cà Mau vào năm 2006 năm 2008 35 Bảng 4.11 - Số vùng lặp lại thuộc ORF125 Bạc Liêu vào năm 2006 năm 2008 36 v LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1 - Hình thái virion WSSV (Durand et al., 1996) Hình 4.1 - Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 1,5% 17 Hình 4.2 - Các vùng lặp lại thuộc ORF94 mẫu thu Cà Mau năm 2008 20 Hình 4.3 - Tỉ lệ phần trăm số vùng lặp lại thuộc ORF94 đợt tôm thả giống đợt 21 Hình 4.4 - Tỉ lệ phần trăm số vùng lặp lại thuộc ORF94 đợt tôm thả giống đợt 21 Hình 4.5 - Các vùng lặp lại thuộc ORF125 mẫu thu Cà Mau năm 2008 26 Hình 4.6 - Sự nhiễm kép WSSV mẫu thuộc ORF125 mẫu thu Cà Mau năm 2008 26 Hình 4.7 - Tỉ lệ phần trăm số vùng lặp lại thuộc ORF125 đợt tôm nuôi đợt 27 Hình 4.8 - Tỉ lệ phần trăm số vùng lặp lại thuộc ORF125 đợt tôm nuôi đợt 27 Hình 4.9 - Tỉ lệ phần trăm số vùng lặp lại thuộc ORF125 tỉnh Cà Mau Bạc Liêu năm 2006 30 Hình 4.10 - Các vùng lặp lại thuộc ORF125 mẫu thu Bạc Liêu năm 2006 31 Hình 4.11 - Các vùng lặp lại thuộc ORF125 mẫu thu Cà Mau năm 2006 31 vi LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Chương I GIỚI THIỆU Đồng Bằng Sông Cửu Long đó, Cà Mau, Bạc Liêu Sóc Trăng theo thống kế vùng nuôi tôm lớn Miền Nam Việt Nam với nhiều mơ hình ni phong phú đa dạng Tuy nhiên, dịch bệnh xảy (bắt đầu xuất vào năm 1994 kéo dài đến nay) nhiều nguyên nhân khác dẫn đến thiệt hại khơng nhỏ cho người ni Trong đó, bệnh đốm trắng bệnh gây thiệt hại đáng kể đến suất tôm nuôi Bệnh đốm trắng White spot syndrome virus (WSSV) gây tôm xuất sớm Đài Loan năm 1991, sau phân bố rộng khắp nơi khu vực nuôi tôm giới WSSV gây bệnh tôm nước mặn, tôm nước phát nhiễm nhiều đối tượng khác Từ bệnh xuất đến có nhiều nghiên cứu tìm hiểu phương thức lan truyền, vật chủ cảm nhiễm, độc lực, thành phần cấu tạo hoàn thành phân loại học WSSV, vv,…và đặc biệt giải trình tự gen ba dịng WSSV Đài Loan, Trung Quốc Thái Lan Khi so sánh gen với nhau, tìm thấy thay đổi số vùng lặp lại thuộc ORF75, ORF94 ORF125 dòng virus Qua nhiều nghiên cứu cho thấy, vai trị ứng dụng việc tìm hiểu thay đổi kiểu gen thuộc ba vùng mã hoá lớn Theo nghiên cứu Dieu et al., (2004) Hoa et al., (2005) cho thấy dựa vào khác số vùng lặp lại thuộc ORF75, ORF94 ORF125 WSSV xác định nguồn gốc, phạm vi lan truyền bệnh từ nơi phát sinh khác dòng WSSV Do đó, vùng lặp lại thuộc ORF75, ORF94 ORF125 có ý nghĩa quan trọng nghiên cứu dịch tể học WSSV Việt Nam Vì vậy, đề tài “Ứng dụng phương pháp PCR Genotyping nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng (WSSV) tơm sú” thực nhằm mục tiêu: Tìm hiểu vùng lặp lại thuộc ORF94, ORF125 virus gây bệnh đốm trắng tôm sú thu Bạc Liêu Cà Mau vào năm 2006 năm 2008 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Nội dung nghiên cứu - Phân tích dịng WSSV thu Bạc Liêu Cà Mau (năm 2006 2008) với phương pháp PCR genotyping (thuộc ORF94 ORF125) - So sánh khác kiểu gen vùng lặp lại thuộc ORF94 ORF125 Cà Mau Bạc Liêu năm 2006 2008 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Bảng 4.6 - Số vùng lặp lại ORF125 tương ứng với ao qua đợt thu mẫu TT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Kí Hiệu Ao CN08A CN08B CN08C CN08D CN08E CN08F CN08G CN08H CN08L CN08K CN08M CN08N CN08P CN08R CN08S CN08T CN08U CN08W CN08Y TB08B TB08K TB08M Lần 4/7/8 4/7, Số vùng lặp lại thuộc ORF125 Cua 4 Lần 3, 4/7, 5/7 4/8/12, 5/8/11, 12, 7 5, 6/8/12, 6/13, 12 4/7, 3, 7 7, 4/7, 14 5/10/12 5/7 5, 7/8 5 4/7 7, 7, 8 7/8 8, 4/7/8: mẫu nhiễm kép loại kiểu gen 4-, 7- 8-VLL thuộc ORF125 mẫu Tương tự với nghiên cứu kiểu gen thuộc ORF94 kiểu gen thuộc ORF125 ao tồn nhiều kiểu gen khác chiếm 57,9% (11/19 ao) lần chiếm 47,1% (8/17 ao) đợt tôm nuôi lần (gần tương đương so với biến đổi kiểu gen ao thuộc ORF94, lần chiếm 45%, lần chiếm 46,6%) Sự nhiễm kép WSSV có kiểu gen thuộc ORF125 mẫu tơm phong phú so với ORF94 (ở ao CN08C, CN08H, CN08N, TB08B mẫu tôm nhiễm loại kiểu gen khác thuộc ORF125, kiểu gen thuộc ORF94 mẫu tôm tồn loại kiểu gen khác nhau) (Bảng 4.6) 29 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com 4.2 Kết phân tích mẫu axit nucleic trữ năm 2006 với PCRGenotyping (ORF125) Mẫu axít nucleic phân tích gồm 18 ao (9 ao Cà Mau ao thuộc tỉnh Bạc Liêu) Triệu Thanh Tuấn ly trích vào năm 2006 Qua phân tích tổng số 67 mẫu Cà Mau 87 mẫu Bạc Liêu phương pháp PCR- genotyping khuếch đại vùng lặp lại có trình 69 bp thuộc ORF125 cho thấy, mẫu tơm Cà Mau năm 2006 tìm thấy kiểu gen WSSV với 4-, 5-, 6-, 7- 8-VLL Cịn Bạc Liêu có nhóm 3-, 4-, 5-, 6-, 7- 8-VLL (Bảng 4.6) Trong đó, dịng WSSV có kiểu gen 6-VLL thuộc ORF125 chiếm tỉ lệ cao khu vực Cà Mau Bạc Liêu (ở Cà Mau chiếm 59,7% 24,1 % Bạc Liêu) (Hình 4.11) Kết phù hợp với nghiên cứu Tô Vũ An Lý Ngọc Hà phân tích ORF125 mẫu tôm Cà Mau Bạc Liêu năm 2008 cho kết 6-VLL chiếm ưu khu vực Điều cho thấy, nguồn tơm giống mang bệnh có kiểu gen 6-VLL thuộc ORF125 phân bố tỉnh Cà Mau Bạc Liêu năm 2006 năm 2008 lớn Nguồn tơm xuất phát từ nguồn tơm giống miền trung phù hợp với nghiên cứu Dieu el at., 2004 tìm thấy kiểu gen 5-, 6- 7-VLL tôm miền Trung VN 70 59,7 60 Cà Mau Tỉ lệ (%) 50 38,8 40 30 25,4 23 20,7 Bạc Liêu 24,1 20,7 20 10 7,5 4,6 9,2 4,5 Số vùng lặp lại thuộc ORF125 Hình 4.9 - Tỉ lệ phần trăm số vùng lặp lại thuộc ORF125 tỉnh Cà Mau Bạc Liêu năm 2006 30 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com M 10 11 M 12 13 14 15 16 17 18 650 bp 500 bp 6-VLL 4-VLL Hình 4.10 - Các vùng lặp lại thuộc ORF125 mẫu thu Bạc Liêu năm 2006 Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9: mẫu có 6-VLL (thuộc ao BL7) Giếng 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 18: mẫu có 4-VLL (thuộc ao BL8) Giếng M: Thang ADN kbp plus M 6-VLL 4-, 5-VLL 10 650 bp 4-, -6 VLL 500 bp Hình 4.11 - Các vùng lặp lại thuộc ORF125 mẫu thu Cà Mau năm 2006 Giếng 2: mẫu có 4-VLL Giếng 3, 5, 10: mẫu có 4- 6-VLL Giếng 4: mẫu có 4- 5-VLL; Giếng 8: mẫu có 4-, 5- 6-VLL Giếng M: Thang ADN kbp plus 31 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Bảng 4.7 - Kết phân tích số vùng lặp lại thuộc ORF125 mẫu axit nucleic trử Cà Mau Bạc Liêu năm 2006 Khu Vực Ký hiệu Số vùng lặp lại thuộc ORF125 - 2006 Tổng Ao CM1 CM2 CM3 Cà CM4 Mau CM6 CM7 CM8 CM9 CM10 Tổng số mẫu BL1 BL2 BL3 BL4 Bạc Liêu BL5 BL7 BL8 BL9 BL10 Tổng số mẫu 3, 1*,3*, 2* 5* 3* 17 2 6 1* 1*, 2* 1* 1, 6* 26 1* 1, 3* , 2* 5* , 6, 1*, 3* 3, 6* 40 5 8 10 10 10 10 18 20 21 18 6 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 *: Có nhiều kiểu gen khác tồn mẫu tôm Mẫu tôm nhiễm bệnh Cà Mau năm 2006 cho thấy, có nhiều loại kiểu gen khác thuộc ORF125 nhiễm ao chiếm 77,7% (7/9 ao) nhiễm nhiều loại kiểu gen mẫu tôm phổ biến chiếm 32,8% (22/67 mẫu xuất ao CM6, CM7, CM8, CM9 CM10) (Bảng 4.7 Hình 4.11) theo kết nghiên cứu Tô Vũ An 2008 ao thu từ Cà Mau cho thấy, ao mẫu tôm nhiễm chủ yếu kiểu gen chiếm 75% (9/12 ao) có nhiễm kép mẫu tơm chiếm 13,3% (8/60 mẫu) thấp so với nhiễm kép mẫu thu vào năm 2006 Tuy nhiên, khác với Cà Mau, Bạc Liêu tỉ lệ ao có kiểu gen khác ao mức thấp chiếm 33,3% (3/9 ao, gồm có ao BL1, BL2 BL10) nhiễm kép không thấy xuất mẫu thu tỉnh Bạc liêu vào năm 2006 (Bảng 4.7 Hình 4.10) Tương ứng với nghiên cứu Lý Ngọc Hà Bạc Liêu năm 2008 cho thấy, số 11 ao có ao (BL14 BLl6) có mẫu tơm nhiễm loại kiểu gen ao không thấy nhiễm kép 11 ao thu mẫu phân tích 32 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Từ cho thấy, có đa dạng phong phú dịng WSSV xuất Cà Mau qua năm khác Cà Mau so với Bạc Liêu 4.3 So sánh khác số vùng lặp lại thuộc ORF94 Cà Mau Bạc Liêu vào năm 2006 2008 Sử dụng số liệu phân tích từ mẫu thu Cà Mau năm 2008 từ mẫu axit nucleic Cà Mau Bạc Liêu năm 2006 số liệu tổng hợp từ nghiên cứu trước Triệu Thanh Tuấn (2006) Tô Vũ An Lý Ngọc Hà (2008) Ở Cà Mau (Số liệu tổng hợp Bảng 4.7) Bảng 4.8 - Số vùng lặp lại thuộc ORF94 Cà Mau vào năm 2006 năm 2008 Cà Mau 2006 (Tuấn, 2006) Số vùng lặp lại thuộc ORF94 10 11 12 13 14 15 16 Số mẫu Tần số (%) so với tổng số mẫu 60 11 68.4 7.6 14 10 90/10 ao 2008 (An, 2008) 2008 (ở nghiên cứu này) Số mẫu Tần số (%) so với tổng số mẫu Số mẫu 14 16 16 10.8 21.5 24.6 13.8 24.6 1.5 3.1 Tần số (%) sovới tổng số mẫu 0.8 0.8 17 25 43 10 24 12.8 3.8 18.8 32.3 7.5 18 1.5 0.8 65/12 ao 133/22 ao Các nhóm kiểu gen thuộc ORF94 tổng hợp từ nghiên cứu năm 2006 năm 2008 tỉnh Cà Mau có 13 nhóm kiểu gen, từ - 16 vùng lặp lại Ở năm 2006 tìm thấy nhóm kiểu gen 5-, 6-, 7- 9-VLL (nghiên cứu 10 ao, mẫu tôm), đến năm 2008 (An, 2008) tìm thấy nhóm kiểu gen khác (nghiên cứu 12 ao, mẫu tơm) có thêm 4-, 8- 10-VLL so với năm 2006 năm 2008 (ở nghiên cứu này) tìm thấy đến 11 nhóm vùng lặp lại từ - 16 không thấy 5- 7-VLL (nghiên cứu 22 ao, mẫu tôm mẫu cua ao) 33 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Từ kết cho thấy số vùng lặp lại thuộc ORF94 WSSV tồn Cà Mau qua năm có nhóm vùng lặp lại tăng dần Kiểu gen chiếm ưu năm khác Năm 2006 có 5-VLL chiếm ưu thế, đến năm 2008 có 6-, 8- (An,2008) 11-VLL chiếm ưu (năm 2008, nghiên cứu này) Ở Bạc Liêu Số liệu tổng hợp năm 2006 2008 cho thấy, có nhóm vùng lặp lại thuộc ORF94 tìm thấy (ít nhóm vùng lặp lại so với Cà Mau) (Bảng 4.8) Số vùng lặp lại chiếm ưu năm khác nhau, 5-VLL chiếm ưu Bạc Liêu năm 2006 7-VLL chiếm ưu năm 2008 Tuy nhiên nhóm vùng lặp lại ưu 5-, 6-, 7- 8-VLL qua năm khác khác (Cà Mau có 5-, 6-, 8-VLL Bạc Liêu có 5- 7-VLL), số vùng lặp lại chiếm ưu giống với số vùng lặp lại thuộc ORF94 nhiễm tôm bố mẹ tôm giống vào năm 2001 (Hoa et al., 2005, nghiên cứu tôm giống tôm bố mẹ tìm thấy kiểu giống có vùng lặp lại 4-, 5-, 6-, 7-, 8- 9-VLL thuộc ORF94) Chỉ kiểu gen WSSV có 11-VLL chiếm ưu Cà Mau năm 2008 chưa tìm thấy trước Bảng 4.9 - Số vùng lặp lại thuộc ORF94 Bạc Liêu vào năm 2006 năm 2008 Bạc Liêu Số vùng lặp lại thuộc ORF94 10 11 12 13 14 15 16 2006 (Tuấn, 2006) Số mẫu 10 44 20 10 90/10 ao Tần số (%) so với tổng số mẫu 11.1 48.9 1.1 22.2 11.1 5.6 2008 (Hà, 2008) Số mẫu 7 20 12 Tần số (%) so với tổng số mẫu 12.1 12.1 34.5 20.7 12.1 8.6 58/11 ao 34 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com 4.4 So sánh khác số vùng lặp lại thuộc ORF125 Cà Mau Bạc Liêu vào năm 2006 2008 Ở Bạc Liêu (Bảng 4.11) cho thấy, kiểu gen thuộc ORF125 vào năm 2006 tìm thấy nhiều nhóm so với năm 2008 (Lý Ngọc Hà, 2008), năm 2006 2008 thấy 6-VLL chiếm ưu Bên cạnh đó, Cà Mau 2006 2008 (Tơ Vũ An, 2008) tìm thấy 6-VLL chiếm ưu có thêm 7-VLL chiếm ưu vào năm 2008 (ở nghiên cứu tại, 2008) Như kiểu gen thuộc ORF125 Bạc Liêu Cà Mau có nhiều nhóm kiểu gen WSSV gây bệnh khác qua năm kiểu gen có 6- 7-VLL tìm thấy chủ yếu Kết giống với nghiên cứu Dieu et al., 2004, tìm thấy kiểu mẫu tôm số tỉnh miền Trung Việt Nam Bảng 4.10 - Số vùng lặp lại thuộc ORF125 Cà Mau vào năm 2006 năm 2008 Cà Mau Số vùng lặp lại thuộc ORF125 10 11 12 13 14 2006 (mẫu trữ năm 2006) Số mẫu Tần số (%) so với tổng số mẫu 17 26 40 18.7 28.6 44 5.5 3.3 91/9 ao 2008 (An, 2008) Tần số (%) so với tổng Số số mẫu mẫu 13 16 32 68/12 ao 19.1 23.5 47.1 1.5 8.8 2008 (ở nghiên cứu này) Tần số (%) so với tổng Số số mẫu mẫu 1.4 16 11.4 15 10.7 1.4 64 45.7 25 17.9 3.6 1.4 1.4 3.6 0.7 0.7 140/22 ao 35 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Bảng 4.11 - Số vùng lặp lại thuộc ORF125 Bạc Liêu vào năm 2006 năm 2008 Bạc liêu Số vùng lặp lại thuộc ORF125 2006 ( nghiên cứu này, 2008) Tần số (%) so Số mẫu với tổng số mẫu 20 18 21 18 89/9 ao 4.5 22.5 20.2 23.6 20.2 Số mẫu 38 15 2008 (Hà, 2008) Tần số (%) so với tổng số mẫu 5.4 67.9 26.8 56/11 ao Do đó, nói khác số vùng lặp lại chiếm ưu năm khác nguồn tôm giống bị nhiễm WSSV có kiểu gen chiếm ưu phân bố rộng phạm vi khu vực thu mẫu (có thể nhiều hộ ni mua giống trại giống hay trại giống khác mua nguồn tôm bố mẹ bị nhiễm bệnh) Qua nghiên cứu thấy giả thiết đặt Triệu Thanh Tuấn năm 2006 cho có nhiều kiểu gen tồn WSSV khác khu vực địa lý khác thời điểm thu mẫu khác phù hợp với nghiên cứu Bên cạnh đó, Triệu Thanh Tuấn (2006), cịn đặt giả thiết khả gây bệnh độc lực kiểu gen WSSV khu vực địa lý khác thời điểm thu mẫu khác khác Dựa vào kết phân tích mẫu thu kết so sánh trên, cho thấy mơ hình qng canh cải tiến ni tỉnh Cà Mau năm 2008 so với mơ hình ni thâm canh Triêu Thanh Tuấn (2006) cho thấy Kiểu gen mơ hình khác lớn (kiểu gen thuộc ORF94 mơ hình quảng canh cải tiến lần có 14-VLL chiếm ưu lần có 11-VLL chiếm ưu thế, cịn mơ hình ni Thâm Canh (2006) Cà Mau Bạc Liêu 5-VLL chiếm ưu Đối với ORF125, mơ hình ni quảng canh cải tiến lần lần có 7-VLL chiếm ưu có 7-VLL chiếm ưu từ nghiên cứu Tô Vũ An (2008, mẫu thu chủ yếu mơ hình quảng canh cải tiến) mơ hình ni Thâm canh (2006) lại có 6-VLL chiếm ưu khu vực Cà Mau Bạc Liêu) Bên cạnh đó, mức độ biểu kiểu gen mơ hình ni khác (ở quảng canh cải tiến ao có khả nhiễm nhiều loại kiểu gen so với mô hình ni Thâm canh) 36 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Như vậy, có khác biệt mức độ biểu bệnh, tỉ lệ chết mơ hình ni này, mức độ biểu kiểu gen khác số vùng lặp lại thuộc ORF94 ORF125 có khác biệt hai mơ hình hay khơng tùy thuộc vào đồng phân bố nguồn tơm giống có nhiễm dòng WSSV 37 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Chương V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận - Các kiểu gen thuộc ORF94 ORF125 WSSV gây bệnh tôm Cà Mau năm 2006 2008 phong phú đa dạng so với Bạc Liêu - Ở Cà Mau Bạc Liêu số vùng lặp lại chiếm ưu thuộc ORF94 ORF125 năm 2006 2008 có giống (ORF94-5 VLL; ORF125-6 VLL) khác (ORF94-6,-7, -8,-11VLL; ORF125-6, -7VLL) - Các kiểu gen WSSV thuộc ORF94 ao phần lớn giống mơ hình nuôi (Thâm canh, 16/19 ao; quãng canh cải tiến, 11/20 ao) Còn ORF125, phần lớn kiểu gen ao khác (Thâm canh, 10/18 ao; quãng canh c ải tiến, 11/19 ao) - Hiện tượng nhiễm nhiều loại kiểu gen (cả ORF94 ORF125) ao nhiễm kép nhiều loại kiểu gen mẫu mơ hình qng canh cải tiến xảy nhiều so với mơ hình ni tơm thâm canh - Nghiên cứu cho thấy, nhiễm bệnh đợt thả tôm liên tiếp ao chủ yếu nguồn tôm giống gây Từ thấy khả ứng dụng phương pháp PCR - Genotying (ORF94 ORF125) nghiên cứu đặc điểm dịch tể tác nhân gây bệnh đốm trắng (WSSV) nuôi tôm sú 4.2 Đề xuất - Gây cảm nhiễm kiểu gen khác (các kiểu gen chiếm ưu qua đợt nghiêm cứu) thuộc ORF94 ORF125 WSSV để xem xét độc lực dịng WSSV khác - Giải trình tự kiểu gen có số vùng lặp lại giống (các vùng chiếm ưu năm) thuộc ORF94 ORF125 38 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Bui Thi Minh Dieu, Hendrik Marks, Joukje Siebenga, Rob W Goldbach, Dowe Zuidema, Tran Phuoc Duong and Just M Vlak, (2004) Molecular epidemiology of white spot syndrome virus within Vietnam Journal of General Virology, 85, 3607-3618 Caleb McClennen, (2004), white spot syndromeVirus the economic, environmental and technical implications on the development of latin american shrimp farming (http://fletcher.tufts.edu) Chen, L L., Wang, H C., Huang, C J & other authors (2002) Transcriptional analysis of the DNA polymerase gene of shrimp white spot syndrome virus Virology 301, 136–147 Đặng thị Hoàng Oanh, (2007) Nguyên lý kỷ thuật chẩn đoán Bệnh Thuỷ sản Trường Đại học Cần Thơ Flegel TW (1997) Special tropic review: major viral disease of the black tiger prawn Penaeus monodon in Thailand World J Microbiol Biotechnol 13:433 442 Flegel TW, Alday-Sanz V (1998) The crisis in Asian shrimp aquaculture: current status and future needs J Appl Ichthyol 14:269-273 Hendrik Marks, Josyanne J.A van Duijse, Douwe Zuidema, Mariëlle C.W van Hulten and Just M Vlak (2004), Fitness and virulence of an ancestral White Spot Syndrome Virus isolate from shrimp Hoa T T T., Hodgson R A., Oanh D T H., Phuong N T., Preston N J and Walker P K., (2005) Genotypic variations in tandem repeat DNA segments between ribonucleotic reductase subunit gense of white spot syndrome virus (WSSV) isolates from Vietnam In P Walker, R Lester and M G Bondad-Reantaso (eds) Disease in Asian Aquaculture V.pp.339-351 Fish Healrh Section, Asian Fisheries Society, Manila, Philippines http://vietlinh.com.vn/kithuat/benhthuysan/banvebanhtom.htm(câpnhät 25/10/2008) 10 Lan Y., Lu W & Xu X (2002) Genomic instability of prawn white spot bacilliform virus (WSBV) and its association to virus virulence Virus Research 90, 264–274 11 Lê Vân Hải Yến, (2006) Tìm hiểu mối quan hệ kiểu gen WSSV với bệnh đốm trắng tơm sú (P monodon) ni Sóc Trăng Trà Vinh Luận văn tốt nghiệp đại học 12 Liu W.J., Chang Y.S., Wang C.H., Kou G.H & Lo C.F (2005) Microarray and RT-PCR screening for white spot syndrome virus immediate-early genes in cycloheximide-treated shrimp Virology 334, 327–341 13 Lo C.F., Hsu H.C., Tsai M.F., Ho C.H., Peng S.E., Kou G.H & Lightner D.V (1999) Specific genomic DNA fragment analysis of different geographical clinical samples of shrimp white spot syndrome virus Diseases of Aquatic Organisms 35, 175–185 39 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com 14 Lý Ngọc Hà, (2008).Tìm hiểu biến đổi vùng lặp lại thuộc ORF94 ORF125 virút gây bệnh đốm trắng (WSSV) tôm Bạc Liêu Luận văn tốt nghiệp đại học 15 Marks H (2003) Genetic variation among isolates of White spot syndrome virus, Goldbach, J M Vlak, and M C.W van Hulten, Laboratory of Virology,Wageningen University,Wageningen, The Netherlands, Arch Virol (2004) 149: 673–697 16 Marks H (2005) Genomics and Transcriptomics of White Spot Syndrome Virus PhD dissertation, Department of Plant Sciences,Wageningen University, The Netherlands 17 Nguyễn Thị Thuý Hằng, (2008) Ứng dụng kỹ thuật PCR-genotyping (ORF125) nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng (WSSV) Đề cương luận văn tốt nghiệp đại học 18 Pradeep B, Shekar M, Gudkovs N, Karunasagar I, Karunasagar I, 2007 Genotyping of white spot syndrome virus prevalent in shrimp farms of India Diseases of Aquatic Organisms 78:189-198 19 Supamattaya K, Boonyaratpalin S (1996) The study of histopathology and cytopathlogical changes in black tiger shrimp Penaeus monodon caused by yellow head virus and red colour and white spot disease virus J Sci Technol 18 1:17–33 20 Tô Vũ An, (2008) Tìm hiểu biến đổi vùng lặp lại thuộc ORF94 ORF125 virút gây bệnh đốm trắng (WSSV) tôm Cà Mau Luận văn tốt nghiệp đại học 21 Trần Thị Mỹ Duyên, (2006) Ứng dụng kỹ thuật PCR-genotyping nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng (WSSV) Luận văn tốt nghiệp đại học 22 Trần Thị Tuyết Hoa, (2004) Bài giảng Sinh học phân tử Trường Đại Học Cần Thơ 23 Triệu Thanh Tuấn, (2006) Tìm hiểu mối quan hệ kiểu gen WSSV với bệnh đốm trắng tôm sú (P monodon) nuôi Cà Mau Bạc Liêu Luận văn tốt nghiệp đại học 24 Tsai MF, Kou GH, Liu HC, Liu KF and Chang CF (1999) Long-term presence of white spot syndrome virus (WSSV) in a cultivated shrimp population without disease outbreaks Diseases of aquatic organisms Vol.38: 107-114 25 van Hulten M.C.W., Witteveldt J., Peters S., Kloosterboer N., Tarchini R., Fiers M., Sandbrink H., Klein-Langhorst R & Vlak J.M (2001a) The white spot syndrome virus DNA genome sequence Virology 286, 7–22 26 van Hulten M.C.W., Witteveldt J., Snippe M & Vlak J.M (2001b) White spot syndrome virus envelope protein VP28 is involved in the systemic infection of shrimp Virology 285, 228–233 27 Vlak J.M., Bonami J.R., Flegel T.W., Kou G.H., Lightner D.V., Lo C.F., Loh P.C & Walker P.J (2005) Nimaviridae In: Virus Taxonomy VIIIth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (ed by C.M Fauquet, M.A Mayo, Elsevier/Academic Press, London 40 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com 28 Wang Q., Poulos B.T & Lightner D.V (2000) Protein analysis of geographic isolates of shrimp white spot syndrome virus Archives of Virology 145, 263–274 29 Wang Q., White B.L., Redman R.M & Lightner D.V (1999) Per os challenge of Litopenaeus vannamei postlarvae and Farfantepenaeus duorarum juveniles with six geographic isolates of white spot syndrome virus Aquaculture 170, 179–194 30 Wongteerasupaya C, Pungchai P, Withyachumnarnkul B and Boonsaeng V, (2003) High variation in repetitive DNA fragment length for white spot syndrome virus (WSSV) isolates in Thailand Dis Aquat org 54: 253-257 31 Yang, F., He, J., Lin, X H., Li, Q., Pan, D., Zhang, X B & Xu, X (2001) Complete genome sequence of the shrimp white spot bacilliform virus J Virol 75, 11811–11820 41 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com PHỤ LỤC I Bảng thông tin thu mẫu Cà Mau năm 2008 TT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Kí Hiệu Ao CN08A CN08B CN08C CN08D CN08E CN08F CN08G CN08H CN08L CN08K CN08M CN08N CN08P CN08R CN08S CN08T CN08U CN08W CN08X CN08Y TB08B TB08K TB08M Lần Lần Mật độ (con/m2) 1 0.5 1 1.5 1 1.5 2 1 1 1 Tuổi tôm (ngày) 150 150 120 150 120 150 150 150 150 170 180 150 150 170 180 150 150 180 150 150 150 150 135 Tôm Dấu hiệu bệnh lý Không Không Không Không Không Không Không Không Không Không Không Không Không Không Không Không Khơng Khơng Khơng Khơng Khơng Có Có Cua (con/ao) 0 4 1 1 1 1 Tuổi tôm (ngày) 60 45 30 60 45 60 30 15 60 45 30 80 60 50 45 60 60 45 45 30 15 15 16 Tôm Tỉ lệ chết (con/ngày) 1-2 2-5 3-6 4-5 5-7 2-4 1-3 >5 5-7 2-4 4-5 7-9 5-8 6-7 1-2 1-2 2-4 1-3 2-3 1-2 0 42 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com PHỤ LỤC II Kết phân tích IQ-2000 mẫu thu tỉnh Cà Mau năm 2008 Mẫu Tôm Mẫu Cua TT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 KH Ao CN08A CN08B CN08C CN08D CN08E CN08F CN08G CN08H CN08L CN08K CN08M CN08N CN08P CN08R CN08S CN08T CN08U CN08W CN08X CN08Y TB08B TB08K TB08M Tổng số Lần (-) 3 1 1 21 (+) 2 1 2 1 37 Tổng Số Lần (++) 1 1 2 12 (+++) 1 2 13 (-) 2 3 5 10 49 (+) 2 1 4 5 5 49 (++) (+++) 5 19 (-) 3 1 1 18 (+) 1 1 1 1 1 13 11 10 13 12 11 11 10 10 11 10 16 17 16 231 43 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com ... KHOA THỦY SẢN CHƯNG THỊ NGHIỄM ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR - GENOTYPING TRONG NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG... ORF125 virút gây bệnh đốm trắng (WSSV) tôm Cà Mau Luận văn tốt nghiệp đại học 21 Trần Thị Mỹ Duyên, (2006) Ứng dụng kỹ thuật PCR- genotyping nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng (WSSV) Luận văn... Nghiên cứu cho thấy, nhiễm bệnh đợt thả tôm liên tiếp ao chủ yếu nguồn tôm giống gây Từ thấy khả ứng dụng phương pháp PCR - Genotying (ORF94 ORF125) nghiên cứu đặc điểm dịch tể tác nhân gây bệnh