NGHIÊN cứu đặc TRƢNG PROTEIN của VIRUS gây hội CHỨNG đỏ đuôi ở tôm sú (penaeus monodon) và tôm THẺ CHÂN TRẮNG (penaeus vannamei)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** ĐẶNG TRỊNH MINH ANH NGHIÊN CỨU ĐẶC TRƢNG PROTEIN CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỎ ĐUÔI Ở TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh -Tháng 9/2006- LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** NGHIÊN CỨU ĐẶC TRƢNG PROTEIN CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỎ ĐUÔI Ở TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn TS VĂN THỊ HẠNH TS NGUYỄN NGỌC HẢI CN LÊ PHÚC CHIẾN Sinh viên thực ĐẶNG TRỊNH MINH ANH KHÓA: 2002 – 2006 Thành phố Hồ Chí Minh -Tháng 9/2006- LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY  RESEARCHING SPECIFIC PROTEIN OF RED TAIL VIRUS IN BLACK TIGER SHRIMP (Penaeus monodon) AND PACIFIC WHITE SHRIMP (Penaeus vannamei) GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Ph.D VAN THI HANH Student DANG TRINH MINH ANH Ph.D NGUYEN NGOC HAI TERM: 2002 - 2006 BSc LE PHUC CHIEN HCMC, 09/2006 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học thầy cô trực tiếp giảng dạy suốt bốn năm qua TS Văn Thị Hạnh hết lòng hướng dẫn, truyền đạt kiến thức tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực tập tốt nghiệp TS Nguyễn Ngọc Hải truyền đạt kiến thức tận tình giúp đỡ tơi q trình thực tập tốt nghiệp CN Đỗ Thị Tuyến thuộc phòng Các Chất Có Hoạt Tính Sinh Học - Viện Sinh Học Nhiệt Đới Anh Lê Phúc Chiến, chị Phạm Thị Hạnh thuộc phịng Cơng Nghệ Tế Bào Động Vật - Viện Sinh Học Nhiệt Đới nhiệt tình giúp đỡ, hướng dẫn trình thực tập Những mà học thời gian thực đề tài Viện Sinh Học Nhiệt Đới học thực tế mà quên Các bạn bè thân yêu lớp Công Nghệ Sinh Học khóa 28 bạn phịng chia sẻ vui buồn thời gian học hết lịng hỗ trợ, giúp đỡ, động viên tơi thời gian thực tập Tp Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng 08 năm 2006 Đặng Trịnh Minh Anh iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÓM TẮT ĐẶNG TRỊNH MINH ANH, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 08/2006 “NGHIÊN CỨU ĐẶC TRƢNG PROTEIN CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỎ ĐUÔI Ở TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei)” Hội đồng hướng dẫn:  TS Văn Thị Hạnh  TS Nguyễn Ngọc Hải  CN Lê Phúc Chiến Khoá luận thực Phịng Cơng Nghệ Tế Bào Động Vật – Viện Sinh Học Nhiệt Đới phần đề tài “Nghiên cứu hội trứng Taura tôm thẻ chân trắng mối liên quan với tác nhân gây hội chứng đỏ đuôi tôm sú tôm xanh” Nguồn virus ban đầu phịng thí nghiệm phân lập nhân lên tế bào côn trùng Sf9 Nội dung khoá luận là: Xác định đặc trưng protein Red - Tail Virus (RTV) kỹ thuật SDS-PAGE Western Blot Sau kiểm tra khả gây nhiễm thực nghiệm tôm sú tôm thẻ chân trắng RTV nhân lên tế bào côn trùng Sf9 Bước tiến hành thăm dò khả phân tách thành phần protein virus phương pháp sắc ký lọc gel để phục vụ cho nghiên cứu Những kết thu được: Sử dụng RTV thu từ tôm sú tôm thẻ chân trắng nhân lên tế bào côn trùng Sf9 gây nhiễm trở lại cho tôm sú tôm thẻ thành công Xác định protein RTV thu từ tôm sú tôm thẻ nuôi cấy tế bào côn trùng Sf9 kỹ thuật điện di gel Sodium dodecyl sulfate – Polyacrylamide (SDS-PAGE) điện di miễn dịch (Western Blot) v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang tựa Lời cảm tạ iv Tóm tắt v Mục lục vi Danh mục chữ viết tắt .ix Danh mục hình .x Danh mục bảng .xi PHẦN MỞ ĐẦU PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình ni tơm giới 2.1.1 Hiện trạng chung 2.1.2 Thiệt hại TSV giới 2.2 Tình hình ni tơm Việt Nam 2.2.1 Hiện trạng chung 2.2.2 Thiệt hại TSV Việt Nam 2.3 Giới thiệu hội chứng Taura – TS (Taura syndrome) 2.3.1 Lịch sử phân bố hội chứng Taura 2.3.2 Phân loại tên gọi 2.3.2.1 Tên gọi 2.3.2.2 Vị trí phân loại 2.3.3 Đặc điểm cấu trúc genom TSV 2.3.4 Biểu bệnh hội chứng Taura tôm 2.3.5 Vật chủ 2.3.6 Sự đa dạng di truyền xuất chủng TSV 10 2.3.6.1 Sự đa dạng di truyền TSV 10 2.3.6.2 Sự xuất chủng TSV 10 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.3.7 Khả lây truyền virus Taura 12 2.3.8 Một số đặc tính virus Taura với yếu tố lý hóa 12 2.4 Các phương pháp kỹ thuật chuẩn đoán virus Taura 13 2.4.1 Chuẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng 13 2.4.2 Phương pháp mô học 14 2.4.3 Phương pháp cảm nhiễm sinh học 14 2.4.4 Phương pháp miễn dịch 14 2.4.5 Phương pháp chuẩn đốn mẫu dị gen (gene probe) 14 2.4.6 Phương pháp RT-PCR .15 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 16 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 16 3.2 Hoá chất, thiết bị, dụng cụ vật liệu 16 3.2.1 Hóa chất 16 3.2.1.1 Các hoá chất để thực sắc ký lọc gel 16 3.2.1.2 Các dung dịch gốc để thực SDS-PAGE 16 3.2.1.3 Các dung dịch gốc để nhuộm gel 16 3.2.1.4 Các dung dịch gốc để thực Western Blotting 16 3.2.1.5 Các dung dịch để thực Dot Blot 17 3.2.2 Thiết bị, dụng cụ 17 3.2.3 Vật liệu 18 3.2.3.1 Kháng thể 18 3.2.3.1 Mẫu 18 3.3 Phương pháp 18 3.3.1 Phương pháp SDS–PAGE 18 3.3.1 Phương pháp SDS–PAGE 18 3.3.1.1 Nguyên tắc 18 3.3.1.2 Phương pháp tiến hành 20 3.3.2 Phương pháp Western Blot 21 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.3.2.1 Nguyên tắc 21 3.3.2.2 Phương pháp tiến hành 23 3.3.3 Gây nhiễm thực nghiệm cho tôm sú (Penaeus monodon) tôm thẻ (Penaeus vannamei) RTV nhân lên tế bào Sf9 26 3.3.4 Phương pháp Dot Blot 27 3.3.4.1 Nguyên tắc 27 3.3.4.2 Phương pháp tiến hành 27 3.3.5 Phương pháp sắc ký 28 3.3.5.1 Nguyên tắc 28 3.3.5.2 Phương pháp tiến hành 29 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 4.1 Kết SDS – PAGE 30 4.2 Kết Western Blot 32 4.3 Kết thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm 34 4.4 Kết Dot Blot thị virus 37 4.5 Kết sắc ký lọc gel 40 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42 5.1 Kết luận 42 5.2 Đề nghị 42 PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤ LỤC 47 PHỤ LỤC 48 PHỤ LỤC 50 PHỤ LỤC 52 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT APS Ammmonium persulphate bp: Base pair DNA: Deoxyribonucleic acid DAB: 3,3’- Diaminobenzidinetetrahydrochloride LOS: Lymphoid Organ Syndrome IHHNV: Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus MBV: Monodon Baculovirus Kb: Kilo base KDa: Kilo Dalton 10 PAb: Polyclonal Antibody 11 PBS: Phosphate Buffered Saline 12 PCR: Polymerase Chain Reaction 13 PL: Post larvae 14 RNA: Ribonucleic acid 15 RT-PCR: Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction 16 RTV: Red - Tail Virus 17 ORF: Open Reading Frame 18 OIE: Office International Des Epizooties (Tổ chức dịch tễ giới) 19 SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis 20 Sf9: Sepodoptera frugiperda 21 SPF: Specific Pathogen Free (Sạch bệnh) 22 TCT: Tôm thẻ chân trắng 23 TEMED: N, N, N’, N’ – tetramethylethylenediamine 24 TTBS: Tween tris buffer saline 25 TSV: Taura Syndrome Virus 26 YHV Yellow Head Virus 27 WSSV: White Spot Syndrome Virus ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1: Sự phân bố TSV giới Hình 2.2: Sơ đồ cấu trúc gen TSV Hình 2.3: Tôm bị nhiễm TSV Hình 2.4: phát sinh lồi 40 phân lập TSV dựa vào trình tự aa VP2 10 Hình 2.5: Cây phát sinh loài theo đoạn ORF2 (1011aa) chủng TSV 11 Hình 3.1: Các bước thực Western Blot 21 Hình 3.2: Cách lắp ráp gel màng nitrocellulose 22 Hình 3.3: Sơ đồ hệ thống chẩn đoán miễn dịch 28 Hình 4.1: Kết SDS – PAGE 30 Hình 4.2: Kết Western Blot 32 Hình 4.3: Tơm thẻ khơng gây nhiễm tôm thẻ gây nhiễm 34 Hình 4.4: Tơm thẻ chết gây nhiễm thực nghiệm với RTV 35 Hình 4.5: Ảnh chụp hiển vi tơm sú đối chứng ni phịng thí nghiệm (x40) 36 Hình 4.6: Ảnh chụp hiển vi tôm sú nhiễm thực nghiệm với dịch tế bào nhiễm RTV 36 Hình 4.7: Ảnh chụp hiển vi phần đuôi tôm sú nhiễm thực nghiệm với dịch tế bào nhiễm RTV 36 Hình 4.8: Tơm sú giống gây nhiễm nhiễm thực nghiệm với RTV .37 Hình 4.9: Chỉ thị mức độ bệnh theo phương pháp Dot Blot 37 Hình 4.10: Kết kiểm tra tôm thẻ trước gây nhiễm 38 Hình 4.11: Kết kiểm tra tôm sú giống trước gây nhiễm 38 Hình 4.12: Kết kiểm tra tơm thẻ sau gây nhiễm 38 Hình 4.13: Kết kiểm tra tơm sú giống sau gây nhiễm 39 Hình 4.14: Kết dịch tế bào (DTB) Sf9 40 Hình 4.15: Kết DTB nhiễm virus từ tơm sú Long An bị bệnh RTV (RT-PmLA).40 Hình 4.16: Kết DTB nhiễm RTV từ tôm thẻ chân trắng bị bệnh RTV (RTV-PvM) 41 x LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 39 4.4.1 Kết kiểm tra tôm thẻ trƣớc thí nghiệm phƣơng pháp Dot Blot với kháng thể tổng hợp Hình 4.10: Kết kiểm tra tơm thẻ trước gây nhiễm Nhận xét: Kết âm tính 4.4.2 Kết kiểm tra tôm sú giống trƣớc thí nghiệm phƣơng pháp Dot Blot với kháng thể tổng hợp Hình 4.11: Kết kiểm tra tơm sú giống trước gây nhiễm Nhận xét: Kết âm tính 4.4.3 Kết kiểm tra tơm thẻ sau thí nghiệm phƣơng pháp Dot blot với kháng thể đặc hiệu RTV Mức độ bệnh: - Mức độ bệnh: ++++ Mức độ bệnh: ++ Hình 4.12: Kết kiểm tra tôm thẻ sau gây nhiễm 39 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 40 Nhận xét: NT 1: kết âm tính NT 2: kết dương tính với mức độ nhiễm (++++) NT 3: kết dương tính với mức độ nhiễm (++) 4.4.4 Kết kiểm tra tơm sú giống sau thí nghiệm phƣơng pháp Dot blot với kháng thể đặc hiệu RTV Mức độ bệnh: - Mức độ bệnh: ++++ Mức độ bệnh: +++ Hình 4.13: Kết kiểm tra tơm sú giống sau gây nhiễm Nhận xét: NT 1: kết âm tính NT 2: kết dương tính với mức độ nhiễm (++++) NT 3: kết dương tính với mức độ nhiễm (+++) Như từ kết gây nhiễm thực nghiệm tôm thẻ thịt tôm sú, kết Dot Blot khẳng định protein mà xác định từ kết SDS-PAGE Western Blot hoàn toàn protein RTV Bước chúng tơi thăm dị khả phân tách thành phần protein RTV sắc ký lọc gel với hy vọng thu loại protein tinh để phục vụ cho nghiên cứu 40 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 41 4.5 Kết sắc ký lọc gel Hình 4.14: Kết dịch tế bào (DTB) Sf9 Hình 4.15: Kết DTB nhiễm virus từ tôm sú Long An bị bệnh RTV (RT-PmLA) 41 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 42 Hình 4.16: Kết DTB nhiễm RTV từ tôm thẻ chân trắng bị bệnh RTV (RTV-PvM)  Nhận xét Sau chạy mẫu: - Dịch tế bào côn trùng Sf9 không nhiễm RTV thu peak - Virus gây hội chứng đỏ đuôi thu từ tôm sú (RTV-Pm) nhân lên dịch tế bào côn trùng Sf9 thu peak lớn peak nhỏ ở phút thứ 540 - Virus gây hội chứng đỏ đuôi thu từ tôm thẻ chân trắng (RTV-Pv) nhân lên dịch tế bào côn trùng Sf9 thu peak lớn peak nhỏ phút thứ 360 Chúng nhận thấy mẫu nhiễm RTV có thêm peak so với mẫu đối chứng chưa đủ tạo thành tín hiệu peak rõ ràng Cả hai mẫu nhiễm RTV có peak hồn tồn giống giống với đối chứng, điều cho thấy peak protein từ dịch tế bào côn trùng Sf9 Như theo phương pháp sắc ký lọc gel khó áp dụng vào việc tinh protein RTV, kích thước lỗ gel cho đồng thời nhiều loại protein có trọng lượng phân tử gần nhau, mặt khác hàm lượng loại protein RTV thấp nên khó tạo thành tín hiệu peak 42 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 43 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận RTV nhân lên tế bào trùng Sf9 có nguồn gốc từ tơm sú hay tơm TCT có khả gây nhiễm cho tôm sú giống tôm thẻ thịt ngày tuổi RTV tôm sú tôm thẻ có protein đặc trưng giống TSV tơm TCT 52, 51 40 kD Có thể RTV từ tơm sú loại virus có liên quan gần với TSV TSV biến thể để thích nghi với vật chủ tơm sú 5.2 Đề nghị Hội chứng đỏ đuôi tôm sú tôm thẻ chân trắng bệnh virus gây Vì cần khuyến cáo người sản xuất lưu ý tượng bệnh để tránh lây lan thành dịch bệnh RTV virus mới, có khả gây bệnh cho nhiều đối tượng tơm ni Vì cần tiếp tục nghiên cứu định danh loại virus khảo sát tình hình phát triển bệnh virus gây đối tượng tôm sú tôm thẻ chân trắng 43 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 44 PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Phạm Thị Quang Anh, 2003 Khảo sát đặc trưng protein số virus gây bệnh phổ biến tôm sú (Penaeus Monodon) Khóa luận tốt nghiệp Cử Nhân Cơng Nghệ Sinh Học, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Lâm Thị Kim Châu, Văn Đức Chín Ngơ Đại Nghiệp, 2004 Giáo trình thực tập sinh hóa lớn Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Lê Phúc Chiến, 2005 Khảo sát đặc tính kháng virus đốm trắng WSSV (White spot syndrome virus) tơm sú (Penaenus monodon) kháng thể lịng đỏ trứng gà-ASV Khố luận tốt nghiệp Cử Nhân Cơng Nghệ Sinh Học, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Văn Thị Hạnh, Nguyễn Văn Uyển, Nguyễn Thu Hằng, Nguyễn Trọng Bình, 2001 Phương pháp chẩn đoán bệnh virus hội chứng đốm trắng tôm dùng phản ứng miễn dịch màng nitrocellulose Bài gửi đăng Tạp chí Sinh học, năm 2001 Văn Thị Hạnh, Nguyễn Văn Uyển, Nguyễn Thị Thu Hằng, Nguyễn Thị Hồng Vân, 2003 Phương pháp enzyme miễn dịch dùng màng nitrocellulose thị virus gây bệnh tôm sú Báo cáo khoa học Hội Nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, NXB Khoa học Kỹ Thuật, Hà Nội , tr 603 – 606 Nguyễn Thị Lang, 2002 Phương pháp nghiên cứu công nghệ sinh học Nhà xuất Nông Nghiệp TPHCM Chalos Limsuwan, Nguyễn Văn Hảo, 2005 Một số định hướng chiến lược cho nghề ni tơm sú tình hình Thơng tin hội thảo kỹ thuật ni tôm sú NXB Nông Nghiệp Tp HCM Nguyễn Ngọc Kiểng, 1996 Thống kê sinh học nghiên cứu khoa học Nhà xuất giáo dục Nguyễn Văn Thanh, 2003 Một nghề cịn bất trắc: Ngành ni tơm Việt Nam Tác động & cải thiện Nhà xuất Chính Trị Quốc Gia Hà Nội 10 Phạm Hùng Vân, 2004 Cẩm nang thực hành SDS-PAGE Western BlottingImmunodetection Bộ y tế, Trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh 44 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 45 11 Nguyễn Hoàng Uyên, 2005 Điều tra nghiên cứu bệnh Taura số bệnh thường gặp tôm chân trắng (Penaeus vannamei) nuôi Việt Nam khả lây nhiễm Báo cáo đề tài KHCN cấp Bộ TS 12 Thông tin Khoa học Công nghệ - Kinh tế Thủy sản tháng 3/2005, 04/2005 13 VietNamNet 03/10/04/ Q:\ khoa giao\NKY\DU PHONG\tom the chan trang.doc) TÀI LIỆU TIẾNG ANH 14 Anne Marie Moore, Jeffrey M Lotz, Shiao Y Wang, Acacia Alcivar-Warren Arun K Dhar, 2000 Detection of Taura syndrome virus using reverse transcription polymerase chain reaction World Aquaculture society 15 Bonami JR, Hassen KW, Mari J, Poulos BT, Lightner DV, 1997 Taura syndrome of marine penaeid shrimp: characterization of the viral agent Journal of General Virologyl 78: 313-319 16 Brock JA, Gose RB, Lightner DV & Hasson KW, 1997 Recent developments and an overview of Taura syndrome of farmed shrimp in the Americas, In: Diseases in Asian Aquaculture III, Flegel TW &MacRae IH, eds Fish Health Section, Asian Fisheries Society, Manila, the Philippines, 275-283 17 Aquatic animal health code, 2003 Taura syndrome International health standards 18 Carlos R Pantoja, Solangel A Navarro, Jaime Naranjo, Donal V Lightner and Charles P Gerba, 2004 Nonsusceptibility of Primate Cells to Taura Syndrome Virus University of Arizona, Tucson, Arizona, USA Suggested citation http://wwwcdc.gov/ncidod/EiD/vol10no12/04-0419.htm 19 Center for Tropical and Subtropical Aquaculture-The Oceanic Institute, 1996 Shrimp Diseases CTSA Publication No 121 20 Diagnostic manual for aquatic animal disease, 2000 Taura syndrome-chapter 4.1.1 International health standards 21 Heidi S Erickson, Martha Zarain-Herzberg, Donald V Lightner, 2002 Detection of Taura syndrome virus (TSV) strain differences using selected diagnostic methods: diagnostic implications in penaeid shrimp Dis Aqua Organ 52: – 10 22 Isawa, H , Asano, S., Sahara, K., Iizuka, T & Bando, H., 1998) Analysis of genetic information of an insect picorna-like virus, infectious flacherie virus of 45 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 46 silkworm: evidence for evolutionary relationships among insect, mammalian and plant picorna (-like) viruses Archives of Virology 143, 127-143 23 Lightner DV, Redman RM, Poulos BT, Nunan LM, Mari JL, Hasson KW, 1997 Risk of spread of penaeid shrimp viruses in the Americas by the international movement of live and frozen shrimp J Struct Biol 120(2): 134-145 24 Lightner DV, 1996a Epizootiology, distribution and the impact on international trade of two penaeid shrimp viruses in the Americas Rev Sci Tech 15(2):579-601 25 Lightner DV, 1996b “Taura syndrome of maine penaeid shrimp: Development and application of molecular detection methods of TSV from domestic shrimp aquaculture and evaluation of challenge studies in Gulf of Mexico Species N OAA fisheries 26 Lightner DV, Redman RM, Hasson KW, Pantoja CR, 1995 “Taura syndrome in Penaeus vannamei (Crustacea: Decapoda): gross signs, histopathology and ultra structure Dis Aquat Organ 21: 53-59 27 Mari J, Poulos BT, Lightner DV, Bonami JR, 2002 Shrimp Taura syndrome virus: genomic characterization and similarity with members of the genus Cricket paralysis-like viruses Journal of General Virology 83(Pt 4):915-26 28 Mari J, Bonami JR, Lightner DV, 1998 Taura syndrome of penaeid shrimp: cloning of viral genome fragments and development of specific gene probes Dis Aquat Organ 33(1):11-7 29 M A Mayo, 2005 Changes to virus taxonomy 2004 Arch Virol.150, 189-198 30 Nunan LM, Poulos BT, Lightner DV, 1998 Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) used for the detection of Taura syndrome virus (TSV) in experimentally infected shrimp Dis Aquat Organ 34(2):87-91 31 Kathy F.J Tang, 2005 Phylogenetic analysis of Taura syndrome virus isolates collected between 1993 and 2004 and virulence comparison between two isolates representing different genetic variants Virus research, 112, 69-76 32 Refugio Robles-Sikisaka, Kenneth W Hasson, Denise K Garcia, Katherine E Brovont, Karyn D Cleveland, Kurt R Klimpel and Arun K Dhar, 2002 Genetic variation and immunohistochemical differences among geographic isolates of Taura syndrome virus of penaeid shrimp Journal of General Virology, 83, 31233130 46 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 47 33 Jocelyne Mari, Bonnie T Poulos, Donald V Lightner and Jean-Rober, 2002 Shrimp Taura syndrome virus: genomic characterization and similarity with members of the genus Cricket paralysis-like viruses Journal of General Virology 34 Yun-Shiang Chang, 2004 Genetic and phenotypic variations of isolates of shrimp Taura syndrome virus found in Penaeus monodon and Metapenaeus ensis in Taiwan Journal of General Virology, 85, 2963-2968 SÁCH 35 Donald V Lightner A handbook of pathology and diagnostic procedures for diseases of Penaeid shrimp Published by THE WORLD AQUACULTURE SOCIETY (Edited, 1996) 36 Rodney F Boyer Modern Experimental Biochemistry ( Second Edited, 1992) 47 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 48 PHỤ LỤC 48 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 49 PHỤ LỤC Danh mục pha hoá chất  Running gel 12,5%  Monomere 5,45 ml  4X running gel 3,25 ml  SDS 10% 0,13 ml  Cho nước cất vào đến 4,16 ml  Amonium persulphate 10% 65 l  TEMED 4,3 l  Stacking gel  Monomere 0,88 ml  4X stacking gel 1,66 ml  SDS 10% 66 l  Cho nước cất vào đến 4,06 ml  Amonium persulphate 10% 33,4 l  TEMED 3,3 l  Loading buffer  4X stacking gel buffer ml  Glycerol 0,8 ml  10% SDS 1,6 ml  – Mecapto etanol 0,4 ml  0,05% Bromophenol blue 0,2 ml  Cho nước cất vào đến ml mg  Destaining solution I  Methanol 80 ml  Acid acetic 14 ml  Cho nước cất vào đến 200 ml  Destaining solution II  Methanol 50 ml  Acid acetic 70 ml 49 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 50  Cho nước cất vào đến lít  TTBS  Tris 12,11 g  Cho nước cất vào đến 900 ml  Chỉnh pH 7,5  NaCl 9g  Cho nước cất vào đến lít  Tween 20 ml  Khuấy  Đệm phosphate  NaH2PO4 0,0262 g  NaHPO4 0,115 g  NaCl 0,9 g  Cho nước cất vào đến 100 ml  Thuốc nhuộm gel  Coomassie brilliant blue R250 1,125 g  Metanol 200 ml  Trộn  Acid acetic 35 ml  Cho nước cất vào đến 500 ml 50 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 51 PHỤ LỤC Tỷ lệ sống chết thí nghiệm a Tỷ lệ sống chết NT NT Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1) -Chi-square D.F Significance -9.60000 1.94577E-3 6.66667 9.82327E-3 with Yates correction WARNING: Expected values in cells < and cells < Statistic Symmetric With rows With columns dependent dependent -Lambda 0.71429 0.66667 0.75000 Uncertainty Coeff 0.56159 0.57500 0.54879 -0.77419 -0.75000 -0.80000 Somer's D b Tỷ lệ sống chết NT NT Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1) -Chi-square D.F Significance -9.60000 1.94577E-3 6.66667 9.82327E-3 with Yates correction WARNING: Expected values in cells < and cells < Statistic Symmetric With rows With columns dependent dependent -Lambda 0.71429 0.66667 0.75000 Uncertainty Coeff 0.56159 0.57500 0.54879 -0.77419 -0.75000 -0.80000 Somer's D 51 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 52 Tỷ lệ sống chết thí nghiệm a Tỷ lệ sống chết NT NT Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1) -Chi-square D.F Significance -20.9354 4.75042E-6 19.4133 1.05271E-5 with Yates correction Statistic Symmetric With rows With columns dependent dependent -Lambda 0.36296 0.33846 0.38571 Uncertainty Coeff 0.11100 0.11121 0.11080 -0.38670 -0.38571 -0.38769 Somer's D b Tỷ lệ sống chết NT NT Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1) -Chi-square D.F Significance -12.6026 3.85220E-4 11.4309 7.22326E-4 with Yates correction Statistic Symmetric With rows With columns dependent dependent -Lambda 0.29496 0.28986 0.30000 Uncertainty Coeff 0.06595 0.06596 0.06595 -0.30003 -0.30000 -0.30006 Somer's D 52 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 53 PHỤ LỤC Các dụng cụ thiết bị thực kỹ thuật SDS-PAGE Western Blotting Đang thực điện di SDS-PAGE 53 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... Tp Hồ Chí Minh Tháng 08/2006 “NGHIÊN CỨU ĐẶC TRƢNG PROTEIN CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỎ ĐUÔI Ở TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei)? ?? Hội đồng hướng dẫn:  TS Văn Thị... tài: ? ?Nghiên cứu đặc trưng protein virus gây hội chứng đỏ đuôi tôm sú (Penaeus monodon) tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)? ?? cần thiết cấp bách nhằm xác định mối liên hệ tác nhân gây bệnh đỏ đuôi. .. VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** NGHIÊN CỨU ĐẶC TRƢNG PROTEIN CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỎ ĐUÔI Ở TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TÔM THẺ