t PCR GENOTYPING (ORF75) trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng trên tôm sú (penaeus monodon)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN DIỆP THỊ DIỆU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR GENOTYPING (ORF75) TRONG NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm tạ Quý Thầy – Cô giảng viên Khoa Thủy Sản, trường Đại học Cần Thơ tận tâm giảng dạy, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu suốt thời gian em học tập trường Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn cô Trần Thị Tuyết Hoa - Bộ môn Sinh học Bệnh Thủy Sản thuộc khoa Thủy Sản – trường Đại Học Cần Thơ tận tình giúp đỡ, hướng dẫn em hoàn thành luận văn tốt nghiệp, tạo điều kiện để em có hội học tập nắm bắt thêm phương pháp nghiên cứu khoa học Chân thành cảm ơn anh, chị môn Sinh học Bệnh thủy sản nhiệt tình hỗ trợ, giúp đỡ tận tình suốt thời gian thực luận văn Xin cám ơn bạn lớp Bệnh học thủy sản khóa 31 động viên, giúp đỡ, trao đổi kiến thức suốt thời gian học tập, làm luận văn tốt nghiệp Khoa Thủy Sản Xin chân thành cảm ơn chúc Quý thầy cô anh, chị, bạn bè lời chúc sức khỏe thành đạt i LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com TÓM TẮT Bệnh tác nhân virus gây tôm vấn đề nan giải cho nuôi trồng thủy sản Việt Nam giới Trong đó, bệnh đốm trắng White spot syndrome virus gây bệnh nguy hiểm tôm nuôi Các nghiên cứu đặc điểm dịch tể WSSV thực nhằm đề biện pháp phòng ngừa hiệu qủa để hạn chế đến mức thấp thiệt hại WSSV gây Và kỹ thuật PCR công cụ quan trọng nghiên cứu dịch tể học WSSV Do đề tài “Ứng dụng kỹ thuật PCRgenotyping (ORF75) nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng (White spot syndrome virus – WSSV) tôm sú (Penaeus monodon)” thực Qui trình PCR genotyping (ORF75) thực với kết ghi nhận: (i) thành phần hóa chất tham gia phản ứng là: PCR buffer nồng độ 1X, nồng độ MgCl2 1,5 mM, nồng độ dNTPs 200µM, nồng độ mồi xi mồi ngược 20 pmol, nồng độ taq ADN polymerase U, nồng độ ADN chiết tách µl Tổng thể tích cho phản ứng 25 µl, (ii) điều kiện phản ứng thực theo chu kỳ nhiệt là: máy làm nóng đến 85oC Sau đến giai đoạn 94oC phút, 94oC 30 giây, 49oC 30 giây, 72oC 60 giây lặp lại 30 chu kỳ cuối 72oC phút Tổng thời gian khuếch đại khoảng 1giờ 20 phút ii LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH vi CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình ni tơm dịch bệnh giới 2.1.1 Tình hình ni tơm giới 2.1.2 Tình hình dịch bệnh giới 2.2 Tình hình ni tơm dịch bệnh nước ta 2.2.1 Tình hình ni tơm Việt Nam 2.2.2 Tình hình dịch bệnh Việt Nam 2.3 Sơ lược bệnh đốm trắng 2.3.1 Đặc điểm cấu tạo WSSV 2.3.2 Dấu hiệu bệnh lý 10 2.3.3 Loài giai đoạn cảm nhiễm 10 2.3.4 Phương thức lây nhiễm 11 2.3.5 Một số phương pháp phát WSSV 12 2.3.6 Một số kết nghiên cứu dịch tể bệnh đốm trắng 12 2.4 Kỹ thuật PCR yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 14 2.4.1 Nguyên tắc phản ứng PCR 14 2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 15 2.4.3 Ứng dụng PCR .16 iii LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Địa điểm thời gian thực 18 3.1.1 Địa điểm .18 3.1.2 Thời gian thực 18 3.2 Vật liệu nghiên cứu 18 3.2.2 Hóa chất thí nghiệm .18 3.2.3 Dụng cụ thí nghiệm 18 3.3 Phương pháp nghiên cứu 19 3.3.1 Qui trình phát WSSV 19 3.3.2 Qui trình PCR genotyping (ORF75) 20 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN .22 4.1 Ứng dụng qui trình PCR genotyping (ORF75) 22 4.2 Chu kỳ nhiệt 23 4.2.1 Chu kỳ phản ứng 23 4.2.2 Nhiệt độ gắn mồi 24 4.3 Hàm lượng ADN khuôn 25 4.4 Nồng độ mồi 25 4.5 Nồng độ MgCl2 26 4.6 Nồng độ taq ADN polymerase .27 4.7 Điều kiện phản ứng 28 4.8 Ứng dụng kỹ thuật PCR genotyping sau tối ưu 29 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 32 5.1 Kết luận 32 5.2 Đề xuất 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO .33 PHỤ LỤC .38 iv LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1 : Quá trình bộc phát bệnh đốm trắng châu Á châu Mỹ (EscobedoBonilla C M et al.,2008) Bảng 4.1 Cường độ nhiễm WSSV mẫu tôm dùng nghiên cứu 21 Bảng 4.2 : Thành phần hóa chất sử dụng để ứng dụng 30 Phụ lục 1: Thành phần hóa chât phản ứng PCR genotyping (ORF75) trước tối ưu 38 Phụ lục 2: Thành phần hóa chất phản ứng PCR genotyping (ORF75) tối ưu nồng độ taq 38 Phụ lục 3: Thành phần hóa chất phản ứng PCR genotyping (ORF75) tối ưu nồng độ mồi 20 pmol 39 Phụ lục 4: Thành phần hóa chất phản ứng PCR genotyping (ORF75) tối ưu nồng độ mồi 40 pmol 39 Phụ lục 5: Thành phần hóa chất phản ứng PCR genotyping (ORF75) tối ưu nồng độ mồi 60 pmol 40 Phụ lục 6: Thành phần hóa chất phản ứng PCR genotyping (ORF75) tối ưu nồng độ MgCl2: ( nồng độ MgCl2 thực từ 0.5- mM) .40 Phụ lục 7: Thành phần hóa chất phản ứng PCR genotyping (ORF75) tối ưu chu kỳ nhiệt .41 v LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1 Diện tích ni nước lợ qua năm Hình 2.2 Sơ đồ phản ứng PCR 16 Hình 4.1: Kết mẫu chạy với qui trình PCR genotyping (ORF75 22 Hình 4.2: Kết 10 mẫu chạy với qui trình PCR genotyping (ORF 75) 23 Hình 4.3: Kết qui trình PCR genotyping (ORF75) với nhiệt độ gắn mồi khác 24 Hình 4.4: Kết qui trình PCR genotyping (ORF75) với nồng độ mồi 28 Hình 4.5: Kết qui trình PCR genotyping (ORF75) với nồng độ MgCl2 27 Hình 4.6: Kết qui trình PCR genotyping (ORF75) với nồng độ taq ADN polymerase 28 Hình 4.7: kết ba mẫu có cường độ nhiễm khác 29 Hình 4.8: Kết ứng dụng mẫu nhiễm WSSV thu Cà Mau 31 vi LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com CHƯƠNG GIỚI THIỆU Việt Nam nước có điều kiện tự nhiên thuận lợi cho việc phát triển thủy sản Ngành thuỷ sản ngành kinh tế mũi nhọn quốc gia Trong năm gần phong trào nuôi tôm Việt Nam đạt thành tựu khả quan Tuy nhiên, song song với việc tăng diện tích ni, tăng sản lượng, tăng mức độ thâm canh bệnh dịch thủy sản mối nguy lớn nghề nuôi trồng thủy sản, đặc biệt bệnh virus gây làm sản lượng tôm giảm cách đáng kể Với khả lan truyền bệnh gây chết tôm hàng loạt, bệnh virus gây thiệt hại lớn ảnh hưởng không nhỏ đến kinh tế nhiều quốc gia có nghề ni tơm phát triển Đặc biệt bệnh đốm trắng (White spot disease-WSD), bệnh đầu vàng (Yellow head disease - YHD), bệnh đỏ đuôi (do Taura syndrome virusTSV)… Vì bệnh virus tơm chưa có thuốc đặc trị, nên cơng tác phịng ngừa chẩn đoán bệnh sớm điều cần thiết Các phương pháp chẩn đốn truyền thống mơ bệnh học hay dựa dấu hiệu bệnh lý bên ngồi khơng giúp phát sớm xác tác nhân gây bệnh Vì vậy, việc ứng dụng cơng nghệ sinh học vào chẩn đoán bệnh bước phát triển giúp người ni tơm có giải pháp kịp thời nhằm làm giảm thiệt hại virus gây Kỹ thuật PCR kỹ thuật chẩn đoán bệnh nhạy Kỹ thuật giúp phát bệnh giai đoạn sớm mà dùng công cụ để nghiên cứu dịch tể học bệnh tác nhân gây bệnh Qua đó, phương pháp phòng trị bệnh xây dựng để giúp nuôi hạn chế thiệt hại đến mức thấp dịch bệnh gây nâng cao suất nuôi Do vậy, đề tài “ứng dụng kỹ thuật PCR genotyping (ORF75) nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng tôm sú (Penaeus monodon)” thực Mục tiêu đề tài Chuẩn hóa qui trình PCR- genotyping (ORF 75) để góp phần vào việc nghiên cứu dịch tể học tác nhân gây bệnh đốm trắng (WSSV) tôm sú nuôi Đồng Bằng Sông Cửu Long LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Nội dung thực Xác định chu kỳ nhiệt, thành phần nồng độ hóa chất thích hợp cho phản ứng PCR- genotyping (ORF75) Xác định khả ứng dụng qui trình PCR- genotyping (ORF75) sau tối ưu để phân tích số mẫu tôm bị nhiễm WSSV LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình ni tơm dịch bệnh giới 2.1.1 Tình hình ni tơm giới Hiện nay, nghề ni tơm biển giữ vai trị quan trọng kinh tế nhiều nước giới Từ năm 1980 với phát triển mạnh mẽ nghề nuôi tôm biển qui mô mức độ thâm canh làm cho sản lượng tôm tăng vọt Trong giai đoạn 2000-2003, sản lượng nuôi trồng thủy sản châu Á chiếm tới 90% sản lượng 80% giá trị nuôi trồng thủy sản giới Theo thống kê FAO (2004), hàng năm tỉ lệ tăng trung bình ni trồng thủy sản tính từ năm 1970 đến năm 2002 8,9 % Sản lượng nuôi trồng thủy sản giới năm 2002 đạt 51,4 triệu Trong sản lượng tơm đạt khoảng 1,29 triệu (trích dẫn Phạm Minh Đức, 2004) Các lồi tơm ni nhiều tôm sú (Penaeus monodon), tôm thẻ Trung Quốc (Penaeus chinensis) tôm chân trắng (Penaeus vannamei) Riêng lồi tơm chiếm 86% sản lượng tơm nuôi giới Tôm sú nuôi khắp nơi giới, đặc biệt khu vực Châu Á Thái Bình Dương (chiếm 72%) Mỹ La Tinh (chiếm 28%) Năm 2003, hai lồi tơm sú tôm thẻ chân trắng chiếm tới 77% tổng sản lượng tôm nuôi (thông tin chuyên đề Bộ Thủy Sản, sơ 4/2003) 2.1.2 Tình hình dịch bệnh giới Do việc gia tăng hoạt động nuôi trồng thủy sản dẫn tới bùng nổ dịch bệnh, bệnh vi khuẩn virus tôm, gây tổn thất lớn kinh tế ngành thủy sản Bệnh tôm, bệnh virus nỗi lo người nuôi trồng mối quan tâm hàng đầu nhà khoa học Mặc dù virus gây bệnh tơm khơng có ảnh hưởng đến sức khỏe người gây tổn thất lớn cho người nuôi tôm Trong năm 1980 Đài Loan dẫn đầu giới sản lượng tôm Nhưng đến 1988 dịch bệnh xảy làm sụp đổ nghề ni tơm nước Cịn Indonesia nước có nghề ni tơm xuất lâu đời Châu Á nước dẫn đầu sản lượng tôm nuôi vùng Tốc độ phát triển LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com M 10 500bp Hình 4.5 Kết qui trình PCR genotyping (ORF75) với nồng độ MgCl2 Giếng 1: nồng độ MgCl2 0,5mM Giếng 6: nồng độ MgCl2 3,0mM Giếng 2: nồng độ MgCl2 1,0mM Giếng 7: nồng độ MgCl2 3,5mM Giếng 3: nồng độ MgCl2 1,5mM Giếng 8: nồng độ MgCl2 4,0mM Giếng 4: nồng độ MgCl2 2,0mM Giếng 9: nồng độ MgCl2 4,5mM Giếng M: Thang ADN 1kb Giếng 10: nồng độ MgCl2 5,0mM Giếng 5: nồng độ MgCl2 2,5mM Nhưng sử dụng nồng độ để kiểm tra với mẫu có cường độ nhiễm nhẹ mẫu khơng kết Do đó, nồng độ MgCl2 giữ 1,5mM Như nồng độ MgCl2 khơng ngun nhân làm cho mẫu có cường độ nhiễm nhẹ không kết Sau khảo sát nồng độ MgCl2 mẫu có cường độ nhiễm nhẹ khơng kết qủa Vì vậy, cần phải tiếp tục khảo sát thành phần phản ứng khác để phát mẫu có cương độ nhiễm nhẹ Trong phản ứng PCR, taq ADN polymerase thành phần quan trọng Taq ADN polymerase mạnh phản ứng PCR triệt để (Khuất Hữu Thanh, 2003) Vì thành phần phản ứng xem xét nồng độ taq ADN polymerase 4.6 Nồng độ taq ADN polymerase Nồng độ taq ADN polymerase kiểm tra với nồng độ nhiều nồng độ khác Nồng độ taq ADN polymerase thay đổi từ 1- 2,5 U/ phản ứng (thành phần hóa chất nêu phụ lục 2) Phản ứng thực với mẫu có cường độ nhiễm trung bình 27 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com M 500 bp Hình 4.6: Kết qui trình PCR genotyping (ORF75) với nồng độ taq ADN polymerase Giếng M: Thang ADN 100 bp Giếng 3: taq ADN polymerase 2U Giếng 1: taq ADN polymerase 1U Giếng 4: taq ADN polymerase 2,5 U Giếng 2: taq ADN polymerase 1,5U Với nồng độ khác taq ADN polymerase kết sau: nồng độ 1U vạch nhạt, cịn nồng độ cịn lại vạch rõ Vì để tiết kiệm hóa chất giá thành cho phản ứng nồng độ taq ADN polymerase chọn 1,5U Tuy nhiên tiến hành khảo sát với số mẫu nhiễm nhẹ nồng độ taq ADN polymerase 1,5U khơng kết Do đó, nồng độ taq ADN polymerase giữ U/phản ứng giống qui trình ban đầu Những mẫu có cường độ nhiễm nhẹ khơng kết ADN khn chưa tách thành phần hóa chất phản ứng trước Có thể mà làm hiệu phản ứng giảm Vì vậy, cần phải tiếp tục tối ưu hóa phản ứng 4.7 Điều kiện phản ứng Để qui trình khuyếch đại mẫu không tạo sản phẩm bước thử nghiệm Tiến hành thực với điều kiện phản ứng: máy làm nóng lên đến 85oC sau bắt đầu giai đoạn 94oC phút, 94oC 30 28 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com giây, 49oC 30 giây, 72oC 60 giây lặp lại 30 chu kỳ cuối 72oC phút Và thành phần hóa chất khơng thay đổi so với mô tả ban đầu (phần 3.3.2) M 500 bp Hình 4.7: Kết mẫu có cường độ nhiễm khác tạo sản phẩm Giếng M: Thang ADN 100bp Giếng Mẫu nhiễm trung bình Giếng Mẫu nhiễm nhẹ Giếng Mẫu nhiễm nặng Kết sau thực thay đổi điều kiện phản ứng cho thấy với qui trình phát mẫu có cường độ nhiễm nhẹ tốt 4.8 Ứng dụng kỹ thuật PCR genotyping sau tối ưu Sau tiến hành chuẩn hóa số thành phần hóa chất điều kiện phản ứng thành phần hóa chất điều kiện phản ứng qui trình PCR genotyping (ORF75) chọn để ứng dụng nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng tôm sú sau: 29 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Bảng 4.2 : Thành phần hóa chất sử dụng để ứng dụng Nồng độ Hóa chất Thể tích mẫu PCR bufer 1X µl MgCl2 1,5 mM 1,5 µl dNTPs 200 µM 0,5 µl ORF75- Flank Forward 20pmol µl ORF75- Flank Reverse 20 pmol µl Taq ADN polymerase 2,0U 0,4 µl Nước 14,6 µl ADN chiết tách µl Tổng thể tích 25 µl Thành phần hóa chất sử dụng để ứng dụng khác với qui trình ban đầu lượng ADN chiết tách Cịn thành phần hóa chất khác tổng thể tích phản ứng khơng thay đổi so với qui trình ban đầu Điều kiện phản ứng thay đổi khác so với qui trình ban đầu Điều kiện phản ứng thực với điều kiện là: máy làm nóng đến 85oC Sau đến giai đoạn 94oC phút, 94oC 30 giây, 49oC 30 giây, 72oC 60 giây lặp lại 30 chu kỳ cuối 72oC phút 30 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Qui trình chạy ứng dụng với mẫu có cường độ nhiễm khác (được kiểm tra dương tính kit IQ2000-WSSV) nhằm kiểm tra tính ứng dụng qui trình sau tối ưu Và kết sau: M 10 500bp Hình 4.8: Kết ứng dụng mẫu nhiễm WSSV thu Cà Mau Giếng M Thang ADN 100bp Giếng Mẫu M8 Giếng Mẫu N4 Giếng Mẫu M10 Giếng Mẫu W1 Giếng Mẫu M11 Giếng Mẫu W4 Giếng Đối chứng âm Giếng Mẫu W5 Giếng 10 Đối chứng dương Giếng Mẫu M9 Từ kết cho thấy mẫu có kích thước sản phẩm khác Qua mẫu khảo sát (hình 4.8) kích thước sản phẩm có dạng, dạng kích thước sản phẩm xác định nằm khoảng là: 400-500bp (giếng 1, 2, 3, 4), 600-700bp (giếng 10), 800-900bp (giếng 5), 900-1000bp (giếng 6, 7, 8) Vì vùng lặp lại thuộc ORF75 có loại trình tự lặp lại 45bp, 102bp dùng công thức để xác định xác số lần lặp lại trình tự giống ORF94 ORF125 Nên xác định dạng sản phẩm Nếu muốn xác định xác số lần lặp lại vùng ORF75 phải giải mã trình tự Do điều kiện khơng cho phép nên đề tài thực đến 31 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Qui trình PCR genotyping (ORF75) sau tối ưu sử dụng để ứng dụng là: — Thành phần hóa chất tham gia phản ứng là: PCR buffer nồng độ 1X, nồng độ MgCl2 1,5 mM, nồng độ dNTPs 200µM, nồng độ mồi xuôi mồi ngược 20 pmol, nồng độ taq ADN polymerase 2,0 U, nồng độ ADN chiết tách µl Tổng thể tích cho phản ứng 25 µl — Điều kiện phản ứng thực theo chu kỳ nhiệt: máy làm nóng đến 85oC Sau đến giai đoạn 94oC phút, 94oC 30 giây, 49oC 30 giây, 72oC 60 giây lặp lại 30 chu kỳ cuối 72oC phút Tổng thời gian khuếch đại khoảng 20 phút 5.2 Đề xuất — Ứng dụng mẫu giáp xác khác (tôm xanh, tôm chân trắng, cua, ghẹ…) để đánh giá khả ứng dụng qui trình — Dùng phương pháp giải mã trình tự gen để xác định xác số lần lặp lại vùng ORF75 32 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com TÀI LIỆU THAM KHẢO 1) Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 1999 Di truyền sinh học phân NXB Nông nghiệp 2) Bui Thi Minh Dieu, Hendrik Marks, Joukje Siebenga, Rob W Goldbach, Dowe Zuidema, Tran Phuoc Duong and Just M Vlak, 2004 Molecular epidemiology of white spot syndrome virus within Vietnam Journal of General Virology 85: 3607–3618 3) Bùi Quang Tề, 2006 Bệnh học Thủy sản Nhà xuất Nông Nghiệp 439 trang 4) Chang P S., C F Lo, Y C Wang and G H Kou 1996 Identification of white spot syndrome associated baculovirus (WSBV) target organs in the shrimp Penaeus monodon by in situ hybridization Diseases of Aquatic Organisms 27: 131-139 5) Chang P.S, L.J Chen and Y.C Wang, 1998 The effect of ultraviolet irradiation, heat, pH, ozone, salinity and chemical disinfectants on the infectivity of white spot syndrome baculovirus Aquaculture 166: 1-17 6) Chou H.Y., C.Y Huang, C.F Lo and G.H Kou, 1998 Studies on transmission of white spot syndrome associated baculovirus (WSBV) in Penaeus monodon and P japonicus via waterborne contact and oral ingestion Aquaculture 164: 263-276 7) Durand, S., D V Lightner, R M Redman and Bonami, J R (1997) Ultrastructure and morphogenesis of white spot syndrome baculovirus (WSSV) Diseases of Aquatic Organisms 29: 205-211 8) Henegariu O, N.A Heerema, S.R Dlouhy, G.H Vance and P.H Vogt, 1997 Multiplex PCR: Crutical Parameters and step- by- step rotocol BioTechniques 23:504-511 9) Hà Anh, 2007 10) Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998 Giáo trình sinh học phân tử NXB Giáo dục 11) http://www.fistenet.gov.vn/details.asp?Object=1292058&news_ID=195481 37 Ngày truy cập 20/02/2009 12) http://www.fistenet.gov.vn/details.asp?Object=101262&news_ID=2611514 56 Ngày truy cập 20/02/2009 13) http://www.gso.gov.vn/default.aspx?tabid=390&idmid=3&ItemID=7384 Ngày truy cập 20/02/2009 33 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com 14) http://www.gso.gov.vn/default.aspx?tabid=390&idmid=3&ItemID=7387 Ngày truy cập 20/02/2009 15) http://www.gso.gov.vn/default.aspx?tabid=390&idmid=3&ItemID=7392 Ngày truy cập 20/02/2009 16) http://www.gso.gov.vn/default.aspx?tabid=390&idmid=3&ItemID=7393 Ngày truy cập 20/02/2009 17) http://www.gso.gov.vn/default.aspx?tabid=390&idmid=3&ItemID=7400 Ngày truy cập 20/02/2009 18) http://www.gso.gov.vn/default.aspx?tabid=390&idmid=3&ItemID=7401 Ngày truy cập 20/02/2009 19) Innis MA and D.H Gelfand, 1990 Optimization of PCRs pp 3-12 in: PCR Protocols, Innis, Gelfand, Sninsky and White (Editors); Academic Press, New York 20) Inouye K., K Yamano, N Ikeda, T Kimura, H Nakano, K Momoyama, J Kobayashi and S Miyajima, 1996 The penaeid rod-shaped DNA virus (PRDV), which causes penaeid acute viremia Fish Pathology 31:39–45 21) Jiravanichpaisal P., K.Soderhall and I.Soderhall, 2004 Effect of water temperature on the immune response and infectivity pattern of white spot syndrome virus (WSSV) in freshwater crayfish Fish Shellfish Immunol., 17: 265-275 22) Khuất Hữu Thanh, 2003 Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen NXB khoa học kỹ thuật 23) Lê Vân Hải Yến, 2006 Khảo sát mối quan hệ kiểu gen White spot syndrome virus (WSSV) với bệnh đốm trắng tơm sú (Penaeus monodon) ni Sóc Trăng Trà Vinh Luận văn đại học Trường Đại Học Cần Thơ 24) Lightner D.V (Ed.) (1996) Handbook of Pathology and Diagnostic Procedures for Diseases of Penaeid Shrimp World Aquaculture Society, Baton Rouge, USA 25) Lo, C F., C H Ho, C H Chen, K F Liu, Y L Chiu, P Y Yeh., S E Peng, H C Hsu, H C.Liu, C F.Chang, M S Su, C H Wang, and G H Kou 1997 Detection and tissue tropism of White spot syndrome baculovirus (WSBV) in captured brooders of Penaeus monodon with a special emphasis on reproductive organs Diseases of Aquatic Organisms 30: 53-72 26) Lo C.F., C.H Ho., S.E.Peng, C.H Chen, H.C Hsu, Y.L Chiu, C.F Chang, K.F Liu, M.S Su, C.H Wang and G.H Kou 1996 White spot syndrome 34 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com baculovirus (WSBV) detected in cultured and captured shrimps, crabs and other arthropods Diseases of Aquatic Organisms 27: 215-225 27) Lo C.F, H.C Hsu, M.F Tsai, C.H Ho, S.E Peng, G.H Kou and D.V Lightner, 1999 Specific genomic DNA fragment analysis of different geographical clinical samples of shrimp white spot syndrome virus Diseases of Aquatic Organisms 35: 175–185 28) Lo C.F., J.H Leu, C.H Ho, C.H Chen, S.E Peng, Y.T.Chen, C.M Chou, P.Y Yeh, C.J Huang, H.Y Chou, Wang C.H and Kou G.H 1996 Detection of baculovirus associated with white spot syndrome virus (WSBV) in penaeid shrimps using polymerase chain reaction Diseases of Aquatic Organisms 25: 133-141 29) Lotz, J M 1997 Viruses, Biosecurity and Specific Pathogen Free Stocks In Shrimp Aquaculture World J Microbiol Biotechnol 13: 405-413 30) Lý Ngọc Hà, 2008 Tìm hiểu biến đổi vùng lặp lại thuộc ORF94 ORF125 virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) tôm sú Bạc Liêu Luận văn đại học Trường đại học Cần Thơ 31) Marks H, 2005 Genomics and transcriptomics of White spot syndrome virus PhD dissertation, Department of Plant Sciences, Wageningen University, The Netherlands 32) Marks H., Goldbach, R W., Vlak, J M & van Hulten, M C W 2003 Genetic variation among isolates of White spot syndrome virus Arch Virol 149: 673-697 33) Marks, H., van Duijse, J J A., Zuidema, D., van Hulten, M C W & Vlak, J M 2005 Fitness and virulence of an ancestral White spot syndrome virus isolate from shrimp Virus Res, 110: 9-20 34) Martha F Kramer Donald M Coen, 2001 Enzymatic Amplification of DNA by PCR: Standard Procedures and Optimization The Polymerase Chain Reaction Protocols in Molecular Biology 15.1.1-15.1.14 35) Momoyama K., M Hiraoka., H Nakano and M.Sameshima, 1998 Cryopreservation of penaeid rod-shaped DNA virus (PRDV) and its survival in sea water at different temperatures Fish Pathol.,33:95-96 36) Nguyễn Thanh Phương Trần Ngọc Hải, 2004 Giáo trình kỹ thuật sản xuất giống nuôi giáp xác Khoa Thủy Sản, trường đại học Cần Thơ 161 trang 37) Nguyễn Thị Thúy Hằng, 2008 Ứng dụng kỹ thuật PCR genotyping (ORF 125) nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV) tôm Sú (Penaeus monodon) Luận văn đại học Trường Đại Học Cần Thơ 35 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com 38) Nguyễn Văn Hảo, 2004 Một số bệnh thường gặp tôm sú (Penaeus monodon) Các phương pháp chẩn đốn phương pháp phịng trị Nhà xuất Nơng Nghiệp, Thành Phố Hồ Chí Minh, 223 trang 39) Nguyễn Văn Thanh, 2007 Sinh học phân tử NXB Giáo dục 40) Nguyễn Viết Khuê, 2006 Chẩn đoán bệnh động vật thủy sản phương pháp PCR http://www.eds.mofi.gov.vn/docs/quangbinh 41) Phạm Minh Đức, 2004 Tổng quan tình hình ni trồng thủy sản giới http://www.mekongfish.net.vn/modules/tinyd5/index.php?id=3-19k 42) Phạm Thành Hổ, 2003 Di truyền học Nhà xuất Giáo Dục 613 trang 43) Pradeep B, 2007 Genotyping of white spot syndrome virus prevalent in shrimp farms of India Diseases of Aquatic Organisms 78:189-198 44) Quang, 2007 http://www.ria2.org/modules.php?name=News&op =viewst& sid= 160 ngày truy cập 05/11/2008 45) Rosenberry, B (2004) World shrimp farming 2004 In Shrimp News International San Diego, California, USA 46) Teunissen, O S P., Faber, R., Booms, G H R., Latscha, T & J H Boon, 1998 Influence of vaccination on vibriosis resistance of the giant black tiger shrimp Penaeus monodon (Fabricius) Aquaculture 164, 359-366 47) Thông tin chuyên đề Bộ Thủy Sản, sơ 4/2003 Tình hình ni trồng thuỷ sản giới vấn đề đáng quan tâm 48) Thông tin chuyên đề Bộ Thủy Sản số 2/2005 Phát triển nuôi tôm bền vững, trạng, thách thức Việt Nam Trung tâm tin học, Thủy Sản 49) Thông tin chuyên đề Bộ Thủy Sản số 4/2005 Tình hình sản xuất thương mại thủy sản nuôi trồng giới Trung tâm tin học, Thủy Sản 50) Thông tin chuyên đề Bộ Thủy Sản số 3/2006 Tình hình cung cấp thủy sản giới xu hướng phát triển Trung tâm tin học, Thủy Sản 51) Trần Thi Mỹ Duyên, 2006 Ứng dụng kỹ thuật PCR-genotyping nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV) Luận văn đại học Trường Đại Học Cần Thơ 52) Trần Thị Tuyết Hoa, 2004 Bài giảng Bệnh virus động vật thủy sản Trường Đại học Cần Thơ 53) Trần Thị Tuyết Hoa, 2004 Bài giảng Sinh học phân tử Trường Đại học Cần Thơ 54) Tran Thi Tuyet Hoa, Richard Aj Hodson, Dang Thi Hoang Oanh, Nguyen Thanh Phuong, Nigel J Preston and Peter J Walker, 2005 Genotyping Virations in Tandem Repeat DNA Segements between Ribonucleotic 36 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Reductase Subunit Genes of White Spot Syndrome Virus (WSSV) Isolates from Viet Nam Disease in Asian Aquaculture, 13: 339- 351 55) Trần Thị Tuyết Hoa, Triệu Thanh Tuấn Nguyễn Thanh Phương, 2008 Ứng dụng phương pháp PCR-genotyping (ORF94) nghiên cứu virus gây bệnh đốm trắng tơm sú (Penaeus monodon) Tạp chí Nghiên cứu Khoa học 7: 163-169 56) Van Hulten MC, J Witteveldt., S Peters, N Kloosterboer and others, 2001 The white spot syndrome virus DNA genome sequence Virology 286:7–22 57) Venegas C.A., L Nonaka, K Mushiake, T Nishizawa and K Muroga, 2000 Quasi-immune response of Penaeus japonicus to penaeid rod-shaped DNA virus (PRDV) Diseases of Aquatic Organisms 42: 83–89 58) Viện nghiên cứu ni trồng thủy sản 1, 2006 Chẩn đốn bệnh động vật thủy sản phuương pháp PCR http://www.eds.mofi.gov.vn/docs/quangbinh 59) Wang, C H., C F Lo, J H Leu, C M Chou, P Y.Yeh, H Y Chou M C Tung, C F Chang, M S Su, and G H Kou 1995 Purification and genomic analysis of baculovirus associated with White spot syndrome (WSBV) of Penaeus monodon Diseases of Aquatic Organisms 23: 239242 60) Wongteerasupaya, C., P Pungchai, B Withyachumnarnkul, V Boonsaeng, S Panyim, T.W Flegel,and P.J Walker 2003 High variation in repetitve DNA fragment length for white spot syndromevirus (WSSV) isolates in Thailand Diseases of Aquatic Organisms 54: 253-275 61) Wongteerasupaya, C., J E Vickers, S Sriurairatana, G L Nash, A Akarajamorn, V Boonsaeng, S Panyim, A Tassanakajon, Withyachumnarnkul, B and T W Flegel 1995 A non-occluded, systemic baculovirus that occurs in cells of ectodermal and mesodermal origin and causes high mortality in the black tiger prawn Penaeus monodon Diseases of Aquatic Organisms 21, 69-77 37 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần hóa chât phản ứng PCR genotyping (ORF75) trước tối ưu: Nồng độ Hóa chất Thể tích mẫu PCR bufer 1X µl MgCl2 1,5 mM 1,5 µl dNTPs 200µM 0,5 µl ORF75- Flank Forward 20pmol µl ORF75- Flank Reverse 20 pmol µl Taq ADN polymerase 2,0U 0,4 µl Nước 13,6 µl ADN chiết tách µl Tổng thể tích 25 µl Phụ lục 2: Thành phần hóa chất phản ứng PCR genotyping (ORF75) tối ưu nồng độ taq: Nồng độ Hóa chất Thể tích mẫu PCR bufer 1X µl MgCl2 1,5 mM 1,5 µl dNTPs 200µM 0,5 µl ORF75- Flank Forward 20pmol µl ORF75- Flank Reverse 20 pmol µl Taq ADN polymerase 1- 2,5 U 0,4 µl Nước ADN chiết tách µl Tổng thể tích 25 µl 38 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Phụ lục 3: Thành phần hóa chất phản ứng PCR genotyping (ORF75) tối ưu nồng độ mồi 20 pmol Nồng độ Hóa chất Thể tích mẫu PCR bufer 1X µl MgCl2 1,5 mM 1,5 µl dNTPs 200µM 0,5 µl ORF75- Flank Forward 20pmol µl ORF75- Flank Reverse 20 pmol µl Taq ADN polymerase 2,0U 0,4 µl Nước 13,6 µl ADN chiết tách µl Tổng thể tích 25 µl Phụ lục 4: Thành phần hóa chất phản ứng PCR genotyping (ORF75) tối ưu nồng độ mồi 40 pmol Nồng độ Hóa chất Thể tích mẫu PCR bufer 1X µl MgCl2 1,5 mM 1,5 µl dNTPs 200µM 0,5 µl ORF75- Flank Forward 40pmol 2µl ORF75- Flank Reverse 40 pmol µl Taq ADN polymerase 2,0U 0,4 µl Nước 11,6 µl ADN chiết tách µl Tổng thể tích 25 µl 39 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Phụ lục 5: Thành phần hóa chất phản ứng PCR genotyping (ORF75) tối ưu nồng độ mồi 60 pmol Nồng Nồng độ độ Hóa Hóa chất chất PCR bufer 1X Thể Thể tích tích 11 mẫu mẫu µl MgCl2 1,5 mM 1,5 µl dNTPs 200µM 0,5 µl ORF75- Flank Forward 60pmol µl ORF75- Flank Reverse 60 pmol µl Taq ADN polymerase 2,0U 0,4 µl Nước 9,6 µl ADN chiết tách µl Tổng thể tích 25 µl Phụ lục 6: Thành phần hóa chất phản ứng PCR genotyping (ORF75) tối ưu nồng độ MgCl2: ( nồng độ MgCl2 thực từ 0.5- mM) Nồng độ Hóa chất Thể tích mẫu PCR bufer 1X µl MgCl2 0,5- mM 1,5 µl dNTPs 200µM 0,5 µl ORF75- Flank Forward 20pmol µl ORF75- Flank Reverse 20 pmol µl Taq ADN polymerase 2,0U 0,4 µl Nước ADN chiết tách µl Tổng thể tích 25 µl 40 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com PCR bufer 1X µl MgCl2 1,5 mM 1,5 µl dNTPs 200µM 0,5 µl ORF75- Flank Forward 20pmol µl ORF75- Flank Reverse 20 pmol µl Taq ADN polymerase 2,0U 0,4 µl Nước 13,6 µl ADN chiết tách µl Tổng thể tích 25 µl Phụ lục 7: Thành phần hóa chất phản ứng PCR genotyping (ORF75) tối ưu chu kỳ nhiệt Điều kiện phản ứng: Nhiệt độ 94 0C phút, Nhiệt độ 94 0C 30 giây, Nhiệt độ 490C 30 giây, Nhiệt độ 720C 60 giây, lặp lại chu kỳ chu kỳ 35 lần Cuối 720C phút 41 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com ... mức thấp thi? ?t hại WSSV gây Và kỹ thu? ?t PCR công cụ quan trọng nghiên cứu dịch t? ?? học WSSV Do đề t? ?i “Ứng dụng kỹ thu? ?t PCRgenotyping (ORF75) nghiên cứu t? ?c nhân gây bệnh đốm trắng (White spot... đến mức thấp dịch bệnh gây nâng cao su? ?t nuôi Do vậy, đề t? ?i “ứng dụng kỹ thu? ?t PCR genotyping (ORF75) nghiên cứu t? ?c nhân gây bệnh đốm trắng t? ?m sú (Penaeus monodon)? ?? thực Mục tiêu đề t? ?i Chuẩn... 51) Trần Thi Mỹ Duyên, 2006 Ứng dụng kỹ thu? ?t PCR- genotyping nghiên cứu t? ?c nhân gây bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV) Luận văn đại học Trường Đại Học Cần Thơ 52) Trần Thị Tuyết