Luận án Tiến sĩ Nghiên cứu đặc tính sinh học của vi khuẩn Photobacterium damselae gây bệnh trên một số loài cá biển nuôi lồng tại Việt Nam và tạo chủng đột biến giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc xin phòng bệnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM  - LÊ MINH HẢI NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN Photobacterium damselae GÂY BỆNH TRÊN MỘT SỐ LỒI CÁ BIỂN NI LỒNG TẠI VIỆT NAM VÀ TẠO CHỦNG ĐỘT BIẾN GIẢM ĐỘC LỰC PHỤC VỤ SẢN XUẤT VẮC XIN PHÒNG BỆNH LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Hà Nội, năm 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM  - LÊ MINH HẢI NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN Photobacterium damselae GÂY BỆNH TRÊN MỘT SỐ LỒI CÁ BIỂN NI LỒNG TẠI VIỆT NAM VÀ TẠO CHỦNG ĐỘT BIẾN GIẢM ĐỘC LỰC PHỤC VỤ SẢN XUẤT VẮC XIN PHÒNG BỆNH Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Thị Tâm PGS.TS Tô Long Thành Hà Nội, năm 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi thực Toàn số liệu kết nghiên cứu luận án trung thực chưa sử dụng để cơng bố cơng trình nghiên cứu để nhận học vị, thơng tin trích dẫn luận án rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 18 tháng 12 năm 2018 Tác giả luận án Lê Minh Hải i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài luận án này, lỗ lực thân nhận nhiều giúp đỡ từ tổ chức cá nhân Trước hết tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Phạm Thị Tâm (Viện Đại học Mở Hà Nội), PGS TS Tô Long Thành (Trung tâm chuẩn đoán thú ý Trung ương) định hướng, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ, kỹ thuật viên, học viên Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội nơi thực nội dung đề tài luận án, hỗ trợ mặt để tơi hồn thành luận án Để hồn thành luận án này, tơi cịn nhận động viên, khuyến khích giúp đỡ bạn bè, đồng nghiệp gia đình Tất giúp đỡ tình cảm q báu nguồn động lực lớn giúp tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quý báu đó! Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 18 tháng 12 năm 2018 Tác giả luận án Lê Minh Hải ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC CÁC BẢNG viii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình ni cá biển giới Việt Nam 1.1.1 Tình hình ni cá biển giới 1.1.2 Tình hình ni cá biển Việt Nam 1.2 Một số bệnh thường gặp cá biển nuôi lồng 1.3 Vi khuẩn Photobacterium damselae bệnh vi khuẩn P damselae gây cá biển 10 1.3.1.Vi khuẩn Photobacterium damselae 10 1.3.2 Bệnh vi khuẩn Photobacterium damselae gây cá biển 15 1.4 Tổng quan tạo chủng vi khuẩn nhược độc 19 1.4.1 Phương pháp vật lý 19 1.4.2 Các phương pháp vi sinh vật học 21 1.4.3 Đột biến kháng sinh rifampicin 22 1.4.4 Giảm độc kỹ thuật gen 24 1.5 Đáp ứng miễn dịch cá vắc xin phòng bệnh 25 1.5.1 Đáp ứng miễn dịch cá 25 1.5.2 Vắc xin phòng bệnh cho cá 29 CHƯƠNG VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.1 Đối tượng nghiên cứu 42 2.2 Vật liệu nghiên cứu 42 2.2.1 Động vật thí nghiệm 42 iii 2.2.2 Hóa chất 42 2.2.3 Môi trường dung dịch nuôi cấy vi khuẩn 42 2.2.4 Thiết bị 43 2.3 Nội dung nghiên cứu 43 2.4 Phương pháp nghiên cứu 43 2.4.1 Phương pháp thu mẫu cá bệnh 43 2.4.2 Phương pháp mổ cá để lấy nội tạng 44 2.4.3 Phương pháp phân lập vi khuẩn Photobacterium damselae 44 2.4.4 Phương pháp giữ giống chủng vi khuẩn tuyển chọn 45 2.4.5 Phương pháp xác định đặc tính sinh hóa chủng vi khuẩn tuyển chọn 45 2.4.6 Phương pháp xác định ảnh hưởng điều kiện môi trường đến khả nhân lên sinh độc tố gây dung huyết vi khuẩn 46 2.4.7 Phương pháp nghiên cứu đặc tính gây bệnh Photobacteriosis (xuất huyết nhiễm trùng) cá biển vi khuẩn P damselae 47 2.4.8 Phương pháp gây nhiễm động vật thí nghiệm xác định LD50 48 2.4.9 Phương pháp tách chiết DNA 48 2.4.10 Phương pháp Multiplex PCR phát phân biệt P.damselae subsp Damselae P damselae subsp piscicida 49 2.4.11 Phương pháp PCR phát gen dly hlyA 49 2.4.12 Phương pháp điện di agarose 50 2.4.13 Phương pháp tạo chủng nhược độc kỹ thuật gây đột biến thực nghiệm 50 2.4.14 Đánh giá khả gây dung huyết dòng vi khuẩn đột biến giảm độc lực 51 2.4.15 Phương pháp mô bệnh học 52 2.4.16 Giải trình tự DNA, xử lý phân tích số liệu trình tự gen 53 iv 2.4.17 Phương pháp xác định khả tạo đáp ứng miễn dịch bảo hộ cá dòng vi khuẩn đột biến giảm độc lực 53 2.4.18 Phương pháp ELISA xác định kháng thể đặc hiệu 53 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 55 3.1 Kết phân lập vi khuẩn P damselae 55 3.1.1 Đặc điểm mẫu cá bệnh 55 3.1.2 Kết phân lập vi khuẩn Photobacterium damselae gây bệnh cá biển nuôi lồng 57 3.1.3 Xác định phân loài P damselase gây bệnh cá biển nuôi lồng phương pháp sinh học phân tử 61 3.1.4 Nghiên cứu độc lực chủng P damselae phân lập 63 3.2 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn P damselae phân lập 65 3.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian nuôi cấy đến khả sinh trưởng gây dung huyết vi khuẩn P damselae 65 3.2.2 Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng gây dung huyết vi khuẩn P damselae 69 3.2.3 Ảnh hưởng độ mặn (NaCl) đến khả sinh trưởng gây dung huyết vi khuẩn P damselae 71 3.3 Kết tạo dòng vi khuẩn Photobacterium damselae đột biến giảm độc lực 73 3.3.1 Kết tạo lựa chọn dòng vi khuẩn Photobacterium damselae đột biến 73 3.3.2 Kết đánh giá mức độ giảm độc lực dòng vi khuẩn Photobacterium damselae đột biến 76 3.3.3 Kết đánh giá mức độ an toàn vi khuẩn P damselae đột biến giảm độc lực cá mú 81 v 3.3.4 Kết phân tích kiểm tra đột biến chủng vi khuẩn Photobacterium damselae nhược độc 88 3.4 Nghiên cứu mức độ tạo đáp ứng miễn dịch dòng vi khuẩn Photobacterium damsalae đột biến giảm độc lực 104 3.4.1 Kết xác định khả tạo kháng thể đặc hiệu 104 3.4.2 Kết xác định khả tạo kháng thể bảo hộ 106 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 111 Kết luận 111 Kiến nghị 111 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN 112 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 113 PHỤ LỤC vi Chữ viết tắt AFLP BFNNV BHI CFU cs Da DNA ELISA FA GS IgM LD50 nt OD ORF PCR RNA TCBS UV VNN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Giải thích Amplified fragment length polymorphism Barfin flounder nervous necrosis virus Brain heart infusion Colony forming units - đơn vị khuẩn lạc Cộng Dalton Deoxyribonucleic acid Enzyme linked immunosorbent assay Fluorescent antibody - Kháng thể huỳnh quang Grouper spleen – tế bào lách cá mú Immunoglobulin M - globulin miễn dịch lớp M Lethal dose 50 - liều gây chết 50% Nucleotide Optical density - mật độ quang Open reading frame -khung đọc mở Polymerase chain reaction - Polymerase chain reaction Ribonucleic acid Thiosulphate citrate bile salt- môi trường nuôi cấy Ultra violet Viral nervour necrosis vii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Sản lượng đánh bắt nuôi trồng thủy hải sản giới Bảng 1.2 Các lồi cá biển ni chủ yếu Trung Quốc Bảng 1.3 Báo cáo quy hoạch nuôi cá biển Việt Nam Bảng 1.4 Một số vắc xin sản xuất từ vi khuẩn làm giảm độc lực 37 Bảng 2.1 Mồi khuếch đại gen UreC 16S RNA 49 Bảng 2.2 Mồi khuếch đại gen dly hlyA 49 Bảng 3.1 Kết thu mẫu mẫu bệnh phẩm 56 Bảng 3.2 Kết phân lập vi khuẩn P damsalae từ mẫu cá biển nghi mắc Photobacteriosis (xuất huyết nhiễm trùng) 58 Bảng 3.3 Kết xác định liều LD50 chủng vi khuẩn P.damselae phân lập 64 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian đến khả gây dung huyết vi khuẩn P damselae T1.7 T4.3 69 Bảng 3.5 Ảnh hưởng pH đến khả gây dung huyết vi khuẩn P amselae T1.7 T4.3 71 Bảng 3.6 Ảnh hưởng độ mặn đến khả gây dung huyết vi khuẩn P damselae T1.7 T4.3 73 Bảng 3.7 Kết tạo chủng vi khuẩn P damselae nhược độc tác nhân UV 74 Bảng 3.8 Kết tạo chủng vi khuẩn P damselae nhược độc tác nhân kháng sinh Rifampicin 75 Bảng 3.9 Kết kiểm tra gây dung huyết dòng Photobacterium damsela đột biến 77 Bảng 3.10 Kết xác định liều LD50 dòng vi khuẩn P.damselae đột biến 80 Bảng 3.11 Kết theo dõi triệu chứng lâm sàng cá thí nghiệm 81 viii 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 uptake by Pasteurella piscicida and its role in pathogenicity for fish”, Applied and Environmental Microbiology, 60, pp 2990-2998 Magarinos B., Toranzo A.E and Romalde J.L (1996), “Phenotypic and pathobiological characteristics of Pasteurella piscicida”, Annual Review of Fish Diseases 6, pp 41–64 Manning, M.J and Nakanishi, T (1996), “The specific immune system: cellular defenses In: Iwama, G and Nakanishi, T (eds)”, The Fish Immune System Organism, Pathogen and Environment Academic Press, London, pp 159–205 Masuda Y., Inoue M., Miyata A., Mizuno S., Nanba H (2009), “Maitake beta-glucan enhances therapeutic effect and reduces myelosupression and nephrotoxicity of cisplatin in mice”, International Immunopharmacology, May; 9(5), pp 620-626 McDonnell, M T and Colwell, R R (1985), “Phylogeny of the Vibrionaceae, and recommendation for two new genera, Listonella and Shewanella”, Systematic and Applied Microbiology, 6, pp.171 -182 Mitchell, J.P., Macrae, C.N., Banaji, M.R (2004), “Encoding specific effects of social cognition on the neural correlates of subsequent memory”, Journal of Neuroscience, 24 (21),pp 4912 – 4917 Monique Monique Mancuso, Gabriella Caruso,Rosanna Adone, Lucrezia Genovese,Ermanno Crisafi &Renata Zaccone (2013), “Detection of Photobacterium damselae Subsp piscicida in Seawaters by Fluorescent Antibody”, Journal of Applied Aquaculture Volume 25, 2013 - Issue 4, pp 337 -345 Monique Mancuso, Zaccone R (2016), “Detection of Specific Antibody Levels against Photobacterium damselae subsp piscicida in Sea Bass during Experimental Challenge”, Journal of Marine Biology and Aquaculture, 2(2), pp 1- Moody C.E., Serreze, D.V & Reno, P.W (1985), “Non-specific cytotoxic activity of teleost leukocytes”, Developmental and Comparative Immunology, Vol.9, No.1, pp 51-64, ISSN0145-305X Morris JG., Jr, Miller HG., Wilson R., Tacket CO., Hollis DG., Hickman FW., Weaver RE., Blake PA (1982), “Illness caused by Vibrio damsela and Vibrio hollisae” The Lancet Jun 5;1(8284), pp 1294–1297 Munoz, P., Sitja Bobadilla, A., Alvarez-Pellitero, P (2000ª), “Cellular and humoral immune response of European sea bass (Dicentrarchus labrax L.) 124 124 125 126 127 128 129 130 131 132 (Teleostei: Serranidae) immunized with Sphaerospora dicentrarchi (Myxosporea: Bivalvulida)”, Parasitology 120, pp 465–477 Nagano I., Inoue S., Kawai K., OshimaS.I (2009), “Repeatable immersion infection with Photobacterium damselae subsp piscicida reproducing clinical signs and moderate mortality”, Fisheries Science, 75, pp.707-714 Naka, H., Hirono, I & Aoki, T (2007), “Cloning and characterization of Photobacterium damselae subsp piscicida phospholipase: an enzyme that shows haemolytic activity”, Journal of Fish Diseases 30, pp 681-690 Nakanishi, T., Fischer, U., Dijkstra, J.M., Hasegawa, S., Somamoto, T Okamoto, N & Ototake, M (2002), “Cytotoxic T cell function in fish”, Developmental and Comparative Immunology, Vol.26, No.2, pp 131-139, ISSN 0145-305 Nermeen M Abu-Elala, Mona K Galal , Reham M Abd-Elsalam , Omnia Mohey-Elsaeed and Naela M Ragaa, (2016), “Effects of Dietary Supplementation of Spirulina platensis and Garlic on the Growth Performance and Expression Levels of Immune-related Genes in Nile tilapia (Oreochromis niloticus)”, Journal of Aquaculture Research & Development,7,7, pp 1-10 Norqvist A., Norrman B., Wolf-Watz H (1990), “Identification and characterization of a zinc metalloprotease associated with invasion by the fish pathogen Vibrio anguillarum”, Infection and Immunity 58, pp 3731– 3736 Osorio C.R., Collins M.D., Toranzo A.E., Barja J.L and Romalde J.L (1999), “16S RNA gene sequence analysis of Photobacterium damselae and nested PCR method for rapid detection of the causative agent of fish pasteurellosis”, Applied and Environmental Microbiology 65, pp 2942– 2946 Osorio C.R., Romalde J.L., Barja J.L., Toranzo A.E (2000), “Presence of phospholipase D (dly) gene coding for damselysin production is not a prerequisite for pathogenicity in Photobacterium damselae subsp damselae”, Microbial Pathogenesis 28, pp.119–126 Osorio C.R., Toranzo A.E., Romalde J.L & Barja J.L (2000), “Multiplex PCR assay for ureC and 16S rRNA genes clearly discriminates between both subspecies of Photobacterium damselae”, Diseases of Aquatic Organisms 40, pp 177–183 Pan-Chen Liu, Ching-Fu Cheng, Chen-Hsuan Chang, Shiun-Long Lin, Way125 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 Shyan Wang, Shao-Wen Hung, Ming-Hui Chen, Cheng-Chung Lin, ChingYu Tu, and Yu-Hsing Lin (2011), “Highly virulent Photobacterium damselae subsp piscicida isolated from Taiwan paradise fish, Macropodus opercularis (L.), in Taiwan”, African Journal of Microbiology Research Vol 5(15), August, pp 2107-2113 Pasqualina Laganas, Gabriella Caruso, Eleonora Minutoli, Renata Zaccone, Santi Delia (2011), “Susceptibility to antibiotics of Vibrio spp and Photobacterium damsela ssp Piscicida strains isolated from Italian aquaculture farms” The new microbiologica 34, 1/2011,pp 53-63 Pedersen K., Skall HF., Lassen-Nielsen AM., Bjerrum L., Olesen NJ (2009), “Photobacterium damselae subsp damselae an emerging pathogen in Danish rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), mariculture”, Journal of Fish Diseases, 32, pp 465-472 Plant K P., LaPatra S E (2011) “Advances in fish vaccine delivery” Developmental & Comparative Immunology, 35(12), pp 1256–1262 Preecha Chaisit, Michael J Sadowsky and Sutruedee Prathuangwong (2010), “Lipopeptide Surfactin Produced by Bacillus amyloliquefaciens KPS46 is Required for Biocontrol Efficacy Against Xanthomonas axonopodis pv glycines”, Kasetsart Journal - Natural Science, 44, pp 84 99 Rahman MH, Kawai K (2000), “Outer membrane protein of Aeromonas hydrophila induce protective immunity in goldfish”, Fish Shellfish Immunol,10, pp 379–382 Rahman MH., Kuroda A., Dijistra JM., Kiryu I., Nakanishi T., Ototake M (2000), “The outer membrane fraction of Flavobacterium psychrophilum induces protective immunity in rainbow trout and ayu”, Fish Shellfish Immunol, 12, pp.169–179 Rajan P.R., Lin J.H.-Y., Ho M.-S and Yang H.-L (2003), “Simple and rapid detection of Photobacterium damselae ssp piscicida by a PCR technique and plating method” Journal of Applied Microbiology, 95, pp 1375–1380 Rey A., Verjiin N., Ferguson HW., Iregui C (2009), “Pathogenesis of Aeromonas hydrophila strain KJ99 infection and its extracellular products in two species of fish”, Veterinary Record 164, pp 493-499 Reed, L.J and Muench, H (1938), "A simple method of estimating fifty percent endpoints", The American Journal of Hygiene, 27, pp 493-497 Rivas AJ., Balado M., Lemos ML., Osorio CR (2011), “The 126 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 Photobacterium damselae subsp damselae hemolysins damselysin and HlyA are encoded within a new Virulence plasmid”, Infection and Immunity, 79, pp 4617-4627 Robohm RA (1983), “ Pasteurella piscicida In: Anderson DP, Dorsonand M, Dubourget P (eds) Antigens of fish pathogens”, Collection Foundation Marcel Merieux, Lyon, France, pp 161–175 Rogel-Gaillard C., Chilmonczyk S., Kinkelin P (1993), “In vitro induction of interferon-like activity from rainbow trout leucocytes stimulated by Egtved virus” Fish Shellfish Immune 13, pp 383-394 Romalde JL., Magarinos B (1997), “Immunization with bacterial antigens: pasteurellosis In: Gudding R Lillehaug A, Midtling PJ, Brown F (eds) Fish vaccinology” Development in Biological Standardlzatlon, Vol90 Karger, Basel, pp 167-177 Romalde JL (2002), “Photobacterium damselae subsp piscicida: an integrated view of a bacterial fish pathogen” International Microbiology 5(1), pp 3–9 Ronald L Thune, Denise H Fernandez, John P Hawke, Ron Miller (2003), “Construction of a safe, stable, efficacious vaccine against Photobacterium damselae ssp piscicida”, Diseases Of Aquatic Organisms 57, pp 51–58, Salvador Arijo, Carmen Balebona, Eduardo Martinez-Manzanares, Miguel Angel Morin˜ igo (2004), “Immune response of gilt-head seabream (Sparus aurata) to antigens from Photobacterium damselae subsp piscicida”, Fish and Shellfish Immunology 16 (2004), pp 65–70 Sambrook J and Russell D (2001), “Molecular cloning: a laboratory manual”, Cold Spring laboratory Press, New York Santarem MM., Figueras A.(1994), “Kinetics of phagocytic activity, plaque-forming cells and specific agglutinins of turbot (Scophthalmus maximus L.) immunised with O antigen of Vibrio damsela and Pasteurella piscicida.”, Fish and Shellfish Immunology 4, pp 527–537 Sano, T (1998), “Control of fish disease, and the use of drugs and vaccines in Japan”, Journal of Applied Ichthyology, 14, pp.131–137 Sharma, S R Krupesha and Pradeep, M A and Sadhu, N and Dube, Praveen and Vijayan, K (2016), “First report of isolation and characterization of Photobacterium damselae subsp damselae from cagefarmed cobia (Rachycentron canadum)” Journal of Fish Diseases, pp.1-6 Shen, L.; Stuge, T.B.; Bengten, E.; Wilson, M.; Chinchar, V.G.; Naftel, J.P.; 127 154 155 156 157 158 159 160 161 162 Bernanke, J.M.;Clem, L.W & Miller, N.W (2004), “Identification and characterization of clonal NK-like cells from channel catfish (Ictalurus punctatus)”, Developmental and Comparative Immunology, Vol.28, No.2, pp 139-152 Shinoda, S., Matsuoka, H., Tsuchie, T., Miyoshi, S., Yamamoto, S., Taniguchi, H & Mizuguchi, Y (1991), “Purification and characterization of a lecithin-dependent haemolysin from Escherichia coli transformed by a Vibrio parahaemolyticus gene”, Journal of General Microbiology 137, pp 2705-2711 Silerendrecht, W J., N Lorenzen, J Glamann, C Koch and J H W M Rombout (1995), “Immunocytochemical analysis of a monoclonal antibody specific for rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) granulocytes and thrombocytes”, Veterinary Immunology and Immunopathology, 46, pp 349360 Smith, S.K., Sutton, D.C., Fuerst, J.A and Reichelt, J.L (1991), “Evaluation of the genus Listonella and reassignment of Listonella damsela (Love et al.) MacDonell and Colwell to the genus Photobacterium as Photobacterium damsela comb nov with an emended description” International Journal of Systematic Bacteriology 41 (4), pp 529– 534 Snieszko, S.F., Bullock, G.L., Hollis, E and Boone, J.G (1964), “Pasteurella sp from an epizootic of white perch (Roccus americanus) in Chesapeake Bay tidewater areas” Journal of Bacteriology 88, pp.1814 - 1815 Somamoto T., Yoshiura Y., Nakanishi T., Ototake M (2005), “Molecular cloning and characterization of two types of CD8a from ginbuna crucian carp, Carassius auratus langsdorfii”, Developmental & Comparative Immunology 29, pp 693–702 Sommerser, I., Krossoy, B., Biering, E and Frost, P (2005), “Vaccines for Fish in Aquaculture”, Expert Review of Vaccines, 4(1), pp 89 - 101 Silva AJ., Pham K., Benitez JA (2003), “Haemogglutinin/protease expression and mucin gel penetration in El Tor biotype Vibrio cholerae”, Microbiology 149, pp 1883–1891 Sylvia Rodriguez Saint-Jean, Sara I Pérez-Prieto (2007), “Effects of salmonid fish viruses on Mx gene expression and resistance to single or dual viral infections”, Shellfish Immunology 23, pp 390-400 Takemura, A (1993), “A change in an immunoglobulin M (IgM)-like protein during larval stages in tilapia, Oreochromis mossambicus”, 128 Aquaculture, 115, pp 233-241 163 The state of world fishries and aquaculture contributing to food security and nutrition for all 2016 Food and Agriculture Organization of the United Nations 164 Thiery, R., Cozien, J , Cabon, J , Lamour, F , Baud, M and Schneemann, A (2006), "Induction of a protective immune response against viral nervous necrosis in the European sea bass Dicentrarchus labrax by using betanodavirus virus-like particles", Journal of Virology, 80, pp 10201 – 10207 165 Thuy, N T T., Nguyen, D H and Wergel, H I (2013), “Specific humoral immune response and protection against Vibrio parahaemolyticus in orange spotted grouper Epinephelus coioides, International Journal of Aquatic Science,4(1), pp 24-35 166 Thyssen, A., Van Eygen, S., Hauben, L., Goris, J., Swings, J and Ollevier, F (2000), “The applica- tion of AFLP for taxonomic and epidemiological studies of Photobacterium damselae subsp piscicida”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 50, pp.1013–1019 167 Toranzo, A E., Barreiro, S., Casal, F., Figueras, A., Magarifios, B & Barja, J (1991), “Pasteurellosis in cultured gilthead seabream (Sparus aurata): first report in Spain”, Aquaculture 99, pp 1-15 168 Toranzo AE., Barja JL (1993), “Virulence factors of bacteria pathogenic for coldwater fish”, Annual Review of Fish Diseases 3, pp.5–36 169 Urbanczyk H., Ast JC., Dunlap V.(2011),“Phylogeny, genomics and symbiosis of Photobacterium”, FEMS Microbiology Reviews, 35, pp.324342 170 Vaca Ruiz M L., Silva P G and Laciar A L (2009), “Comparison of microplate, agar drop and well diffusion plate methods for evaluating hemolytic activity of Listeria monocytogenes”, African Journal of Microbiology Research Vol 3(6) pp 319-324 171 Van Muiswinkel, W.B (2008), “A history of fish immunology and vaccination The early days”, Fish Shellfish Immunol, 25, pp 397-408 172 Vera P., Navas J I., Fouz B (1991), “First isolation of Vibrio damselae from seabream (Sparus aurata)”, Bulletin of the European Association of Fish Pathologists,11, pp 112–113 129 173 Victoria M Lo pez-Do riga, Andrew C Barnes, Nuno M S dos Santos and Anthony E (2000), “Ellis Invasion of fish epithelial cells by Photobacterium damselae subsp piscicida: evidence for receptor specificity, and effect of capsule and serum”, Microbiology,146, pp 21–30 174 Wang Yan, Han Yin, Li Yun, Chen Ji-xiang, Zhang Xiao-hua (2007), “Isolation of Photobacterium damselae subsp piscicida from diseased tongue sole (Cynoglossus semilaevis Gunther) in China”, Acta Microbiologica Sinica 47(5), pp 130-768 175 Yamane Kunikazu, Asato Jun, Kawade Naofumi, Takahashi Hajime, Kimura Bon and Arakawa Yoshichika (2004), “Two cases of fatal necrotizing fasciitis caused by Photobacterium damselae in Japan”, Journal of Clinical Microbiology 42,pp.1370 -1372 176 Yambot, A.V and Song, Y.L (2006), "Immunization of grouper, Epinephelus coioides, confers protection against a protozoan parasite, Cryptocaryon irritans", Aquaculture, 260, pp 1-9 177 Yashgin Hassanzadeh, Nima Bahador, Majid Baseri-Salehi (2015), “First time isolation of Photobacterium damselae subsp damselae from Caranx sexfasciatus in Persian Gulf, Iran 184 IRAN”, Journal of Microbiology, Volume Number 3, pp 178-184 178 Young Ah Cho, Hyun-Ja Han, Hee Eun Mun, Sung Hee Jung, Myoung Ae Park and Jin Woo Kim (2013), “Characterization of Photobacterium damselae subsp piscicida isolated from cultured starry flounder, Platichthys stellatus in Korea”, Journal of Fish Pathology, 26(2), pp.77-88 179 Yoshihito Kihiwaraki (2002), “Immunological Laboratory techniques”, Japan International Cooperation Agency 180 Yu-sin Kim, Fei Ke, Qi-Ya Zhang (2009), “Effect of b-glucan on activity of antioxidant enzymes and Mx gene expression in virus infected grass carp”, Fish and Shellfish Immunology 27 (2009), pp 336–340 181 Zappulli V., Patarnello T., Patarnello P., Frassineti F., Franch R., Manfrin A., Castagnaro M., Bargelloni L (2005),“Direct identification of Photobacterium damselae subspecies piscicida by PCR-RFLP analysis”, Diseases Of Aquatic Organisms 63, pp 53 - 61 182 Zhao DH., Sun JJ., Liu L., Zhao HH., Wang HF., Liang LQ (2009) “Characterization of two phenotypes of Photobacterium damselae subsp damselae isolated from diseased juvenile Trachinotus ovatus reared in cage 130 mariculture”, Journal of the World Aquaculture Society, 40, pp 281–289 183 Zhong, Y.B., Zhang, X.H., Chen, J.X., Chi, Z.H., Sun, B.G., Li, Y & Austin, B (2006), “Overexpression, purification, characterization and pathogenicity of Vibrio harveyi hemolysin VHH”, Infection and Immunity 74, pp 6001-6005 131 PHỤ LỤC Một số bảng số liệu Bảng Ảnh hưởng nhiệt độ lên khẳ sinh trưởng P damselae T4.3 (Lần 1) Nhiệt độ (độ C) Thời gian 20 28 37 40 1h 0,005 0,005 0,005 0,005 0,005 6h 0,005 0,075 0,152 0,1 0,012 12h 0,005 0,116 0,18 0,146 0,015 18h 0,005 0,125 0,193 0,204 0,012 24h 0,005 0,140 0,272 0,234 0,013 36h 0,005 0,154 0,300 0,248 0,007 48h 0,005 0,180 0,379 0,282 0,003 60h 0,005 0,100 0,217 0,205 0,002 Bảng Ảnh hưởng nhiệt độ lên khẳ sinh trưởng P damselae T4.3 (Lần 2) Nhiệt độ (độ C) Thời gian 20 28 37 40 1h 0,005 0,006 0,005 0,005 0,005 6h 0,005 0,076 0,151 0,101 0,013 12h 0,005 0,115 0,178 0,147 0,016 18h 0,005 0,126 0,194 0,203 0,014 24h 0,005 0,141 0,272 0,234 0,013 36h 0,005 0,154 0,300 0,248 0,007 48h 0,005 0,181 0,380 0,282 0,003 60h 0,005 0,121 0,219 0,208 0,002 PL Bảng Ảnh hưởng nhiệt độ lên khẳ sinh trưởng P.damselae T1.7 Nhiệt độ (độ C) Thời gian 20 28 37 40 1h 0,005 0,005 0,005 0,005 0,005 6h 0,005 0,06 0,08 0,13 0,012 12h 0,005 0,095 0,15 0,164 0,021 18h 0,005 0,114 0,198 0,180 0,013 24h 0,005 0,14 0,273 0,24 0,011 36h 0,005 0,164 0,28 0,264 0,014 48h 0,005 0,19 0,36 0,289 0,016 60h 0,005 0,102 0,192 0,161 0,002 Bảng Ảnh hưởng pH đến sinh sản vi khuẩn P damselae T1.7 T4.3 Chỉ số OD pH T1.7 T4.3 0.005 0.006 5,5 0.068 0.055 0.126 0.148 6,5 0.238 0.262 0.262 0.285 7,5 0.305 0.312 0.346 0.334 8,5 0.425 0.284 0.326 0.263 PL Bảng Ảnh hưởng độ mặn đến sinh sản vi khuẩn P damselae T1.7 T4.3 Chỉ số OD Độ mặn (%) T1.7 T4.3 0.345 0.356 1,5 0.362 0.38 0.408 0.423 2,5 0.382 0.393 0.294 0.313 3,5 0.291 0.302 0.256 0.269 4,5 0.183 0.192 0.134 0.125 5,5 0.067 0.052 0.006 0.004 PL Bảng Kết theo dõi bệnh thường gặp cá biển nuôi lồng tỉnh Quảng Ninh, Nam Định, Hải Phòng năm 2014 -2018 TT Loại bệnh Biện pháp trị bênh sử dụng gặp Bệnh mòn - Dùng kháng sinh (65%) vây - Dùng hóa chất (iodine, KMnO4) để tắm cho cá bị bệnh kết hợp với cho ăn kháng sinh (25%) Bệnh sán - Dùng formalin (38%) mang - Dùng Malachite green 25% - Dipterex (12%) - Thảo dược (15%) - Tắm nước (10%) Hiệu trị bệnh - Hiệu không cao -formalin, malachite green bệnh giảm - Dipterex cho hiệu - Thảo dược không hiệu - Tắm nước giảm thời gian ngăn - Dùng Malachite green giảm bênh - Dipterex cho hiệu cao - Dùng Malachite green giảm bênh - Dipterex cho hiệu tốt - Khơng có hiệu Bệnh rận cá - Dùng Malachite green 59% - Dipterex (31%) - Tắm nước (10%) Bệnh đỉa cá - Dùng Malachite green 53% - Dipterex (33%) -Không chữa (14%) Bệnh hoại tử -Không chữa (24%) thần kinh - Sử dụng kháng sinh tắm hóa chát (76%) Bệnh xuất - Sử dụng kháng sinh (28%) - Hiệu thấp, huyết nhiễm - Dùng hóa chất (12%) khi khơng trùng Chưa có biện pháp chữa (70%) Bệnh xuất - Khơng chữa (40%) - Hiệu thấp huyết lở loét - Sử dụng kháng sinh tắm hóa chát (60%) Bệnh u sần - Sử dụng kháng sinh tắm hóa - Hiệu thấp chát (100%) PL Bảng Bảng số liệu xác định LD50 chủng vi khuẩn phân lập Tên chủng/Chỉ tiêu theo dõi T1.7 Số chết Mật độ vi khuẩn theo hệ số 10 12 11 10 50 50 50 50 46 41 38 31 28 25 17 100 100 100 100 92 82 76 62 56 50 34 0 0 12 19 22 25 33 Số chết cộng dồn 361 311 261 211 161 115 74 36 Số sống cộng dồn 0 0 13 25 44 66 91 124 100,00 100,00 100,00 100,00 97,58 89,84 74,75 45,00 7,04 50 50 50 50 43 35 32 28 25 19 11 100 100 100 100 86 70 64 56 50 38 22 Tỷ lệ chết Số sống Tỷ lệ chết cộng dồn T4.3 Số chết Tỷ lệ chết Số sống 1,09 - 0 0 15 18 22 25 31 39 Số chết cộng dồn 343 293 243 193 143 100 65 33 Số sống cộng dồn 0 0 22 40 62 87 118 157 100,00 100,00 100,00 100,00 95,33 81,97 61,90 34,74 5,43 50 50 50 50 47 40 38 29 25 18 15 100 100 100 100 94 80 76 58 50 36 30 0 0 10 12 21 25 32 35 Số chết cộng dồn 359 309 259 209 159 112 72 34 Số sống cộng dồn 0 0 13 25 46 71 103 138 100,00 100,00 100,00 100,00 98,15 89,60 74,23 42,50 6,58 50 50 47 41 35 28 25 19 13 100 100 94 82 70 56 50 38 26 18 0 15 22 25 31 37 41 48 Số chết cộng dồn 300 250 200 153 112 77 49 24 Số sống cộng dồn 0 12 27 49 74 105 142 183 231 100,00 100,00 80,58 61,11 39,84 18,60 3,40 50 50 46 36 31 26 23 16 11 100 100 92 72 62 52 46 32 22 10 Tỷ lệ chết cộng dồn T1.8 Số chết Tỷ lệ chết Số sống Tỷ lệ chết cộng dồn B5.22 Số chết Tỷ lệ chết Số sống Tỷ lệ chết cộng dồn T4.4 Số chết Tỷ lệ chết Số sống 98,52 92,73 0,84 - 0,96 - 0,54 - 0 14 19 24 27 34 39 45 49 Số chết cộng dồn 283 233 183 137 101 70 44 21 Số sống cộng dồn 0 18 37 61 88 122 161 206 255 100,00 100,00 73,19 53,44 33,33 14,69 3,01 Tỷ lệ chết cộng dồn B10.25 Số chết Tỷ lệ chết Số sống 97,86 88,39 0,48 - 50 36 29 25 19 12 1 100 72 58 50 38 24 18 10 2 0 14 21 25 31 38 41 45 49 49 50 PL Số chết cộng dồn 190 140 104 75 50 31 19 10 Số sống cộng dồn 14 35 60 91 129 170 215 264 313 363 35,46 19,38 10,05 Tỷ lệ chết cộng dồn T4.2 Số chết 100,00 90,91 74,82 55,56 4,44 1,86 0,32 - 50 50 50 43 37 27 25 18 11 100 100 100 86 74 54 50 36 22 14 0 13 23 25 32 39 43 48 Số chết cộng dồn 305 255 205 155 112 75 48 23 Số sống cộng dồn 0 20 43 68 100 139 182 230 100,00 100,00 100,00 84,85 63,56 41,38 18,70 3,47 Tỷ lệ chết Số sống Tỷ lệ chết cộng dồn 95,68 0,55 - Bảng Bảng số liệu xác định LD50 dịng vi khuẩn đột biến khơng gây dung huyết hồng cầu Mật độ vi khuẩn theo hệ số 10 Tên chủng/Chỉ tiêu theo dõi 12 11 10 T4.3K6 Số chết 42 35 29 25 19 Tỷ lệ chết 84 70 58 50 38 15 21 25 Số chết cộng dồn 176 134 99 Số sống cộng dồn 23 95,65 T4.3K7 Số chết Tỷ lệ chết Số sống Tỷ lệ chết cộng dồn Số sống 11 1 22 14 2 31 39 43 47 49 49 50 70 45 26 15 44 69 100 139 182 229 278 327 377 85,35 69,23 50,36 31,03 15,76 12 11 10 48 41 39 33 29 25 17 11 96 82 78 66 58 50 34 22 16 7,61 3,38 1,77 0,30 - 11 17 21 25 33 39 42 48 49 Số chết cộng dồn 248 200 159 120 87 58 33 16 Số sống cộng dồn 11 22 39 60 85 118 157 199 247 296 99,20 94,79 87,85 75,47 59,18 40,56 21,85 T4.3K8.1 Số chết 12 11 10 40 37 31 25 15 1 Tỷ lệ chết 80 74 62 50 30 18 2 Số sống 10 13 19 25 35 41 46 49 49 49 50 Số chết cộng dồn 167 127 90 59 34 19 10 Số sống cộng dồn 15 34 59 94 135 181 230 279 328 378 98,82 89,44 72,58 50,00 26,56 12,34 T4.3K8.2 Số chết 12 11 10 32 25 11 0 0 0 Tỷ lệ chết 64 50 22 0 0 0 Số sống 18 25 39 47 50 50 50 50 50 50 50 Số chết cộng dồn 76 44 19 5 5 Số sống cộng dồn 27 66 113 163 213 263 313 363 413 463 97,44 61,97 22,35 Tỷ lệ chết cộng dồn Tỷ lệ chết cộng dồn Tỷ lệ chết cộng dồn 6,61 PL 2,98 2,29 5,24 1,87 9,25 2,54 1,57 2,45 1,76 1,36 0,40 - 0,30 0,24 - - T4.3U4.5 Số chết 12 11 10 42 39 26 21 12 1 Tỷ lệ chết 84 78 52 42 24 16 2 Số sống 11 24 29 38 42 47 49 49 49 50 Số chết cộng dồn 157 115 76 50 29 17 Số sống cộng dồn 13 37 66 104 146 193 242 291 340 390 98,74 89,84 67,26 43,10 21,80 10,43 T4.3U6 Số chết 12 11 10 26 24 0 0 0 Tỷ lệ chết 52 48 18 0 0 0 Số sống 24 26 41 49 50 50 50 50 50 50 50 Số chết cộng dồn 65 39 15 5 5 Số sống cộng dồn 28 69 118 168 218 268 318 368 418 468 97,01 58,21 17,86 Tỷ lệ chết cộng dồn Tỷ lệ chết cộng dồn 4,84 PL 2,89 2,24 4,46 1,83 2,42 1,55 1,69 1,34 0,29 0,24 - -