Luận án Tiến sĩ Nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LÊ THỊ TOAN NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC, SINH HỌC PHÂN TỬ CHỦ YẾU CỦA CHỦNG VIRUS PRRS HUA 01 VÀ PRRS HUA 02 PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LÊ THỊ TOAN NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC, SINH HỌC PHÂN TỬ CHỦ YẾU CỦA CHỦNG VIRUS PRRS HUA 01 VÀ PRRS HUA 02 PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM Chuyên ngành: Bệnh lý học chữa bệnh vật nuôi Mã số: 62.64.01.02 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Lan PGS.TS Phạm Công Hoạt HÀ NỘI - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng thân Các kết nghiên cứu đƣợc trình bày luận án trung thực, khách quan chƣa dùng bảo vệ để lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận án đƣợc cám ơn thơng tin trích dẫn luận án đƣợc rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng Tác giả luận án Lê Thị Toan i năm 2017 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án tác giả nhận đƣợc giúp đỡ tạo điều kiện nhiều ngƣời, sau lời cảm ơn chân thành tác giả: Trƣớc hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Lan PGS.TS Phạm Công Hoạt ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận án Nhờ có hƣớng dẫn nhiệt tình ý kiến đóng góp q báu thầy, mà luận án tơi đƣợc hồn thành Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào tạo, Chủ nhiệm khoa Thú y, Bộ môn Bệnh lý học Thú y, Phịng Thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ sinh học Thú y, tồn thể thầy, giáo cán Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, trang bị cho kiến thức q báu giúp đỡ tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu luận án Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn tới bạn bè, đồng nghiệp, ngƣời thân gia đình quan cơng tác tạo điều kiện thời gian, động viên, chia sẻ tinh thần, giúp đỡ tơi q trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận án Tác giả luận án ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng viii Danh mục hình x Trích yếu luận án xiii Thesis abstract xv PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu chung 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.3.1 Đối tƣợng nghiên cứu 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Những đóng góp đề tài 1.5 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài 1.5.1 Ý nghĩa khoa học đề tài 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình PRRS giới Việt Nam 2.1.1 Lịch sử tình hình dịch PRRS giới 2.1.2 Lịch sử tình hình dịch PRRS Việt Nam 10 2.2 Một số hiểu biết virus PRRS 14 2.2.1 Cấu trúc virus PRRS 15 2.2.2 Phân loại virus PRRS 16 2.2.3 Sức đề kháng virus PRRS 17 2.2.4 Một số nghiên cứu đặc tính sinh học virus PRRS 17 2.2.5 Một số nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử virus PRRS 23 iii 2.3 Một số hiểu biết hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn (PRRS) 27 2.3.1 Truyền nhiễm học 27 2.3.2 Triệu chứng bệnh tích 32 2.3.3 Chẩn đốn phịng trị bệnh 35 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 3.1 Địa điểm nghiên cứu 40 3.2 Thời gian nghiên cứu 40 3.3 Vật liệu nghiên cứu 40 3.4 Nội dung nghiên cứu 41 3.4.1 Nghiên cứu đặc tính sinh học chủ yếu 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 phân lập số tỉnh phía Bắc Việt Nam 3.4.2 41 Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 phân lập số tỉnh phía Bắc Việt Nam 42 3.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 42 3.5.1 Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào 42 3.5.2 Phƣơng pháp gây nhiễm virus PRRS tế bào 43 3.5.3 Phƣơng pháp xác định TCID50 44 3.5.4 Phƣơng pháp xác định đƣờng biểu biễn nhân lên virus 45 3.5.5 Phƣơng pháp RT – PCR 45 3.5.6 Phƣơng pháp giải trình tự gene 47 3.5.7 Phƣơng pháp Realtime RT-PCR 48 3.5.8 Phƣơng pháp gây bệnh thực nghiệm 49 3.5.9 Phƣơng pháp khám lâm sàng 51 3.5.10 Phƣơng pháp mổ khám 51 3.5.11 Phƣơng pháp làm tiêu bệnh lý 51 3.5.12 Phƣơng pháp hóa mơ miễn dịch 52 3.5.13 Phƣơng pháp ELISA 52 3.5.14 Phƣơng pháp phân tích xử lý số liệu phần mềm 52 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54 4.1 Nghiên cứu đặc tính sinh học 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 phân lập số tỉnh phía bắc việt nam iv 54 4.1.1 Kết nghiên cứu xác định hiệu giá (TCID50) 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 4.1.2 54 Kết nghiên cứu xác định khả gây bệnh tích tế bào 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 4.1.3 Kết nghiên cứu xác định ổn định đời virus qua đời cấy chuyển 4.1.4 59 Kết nghiên cứu xác định đƣờng biểu diễn nhân lên 02 chủng virus PRRS HUA 01 PRRS HUA 02 4.1.5 61 Nghiên cứu khả gây bệnh 02 chủng virus PRRS HUA 01 PRRS HUA 02 phân lập số tỉnh phía Bắc Việt Nam 4.2 55 64 Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 phân lập số tỉnh phía bắc việt nam 91 4.2.1 Kết phản ứng RT-PCR 91 4.2.2 Kết giải trình tự gene chủng virus PRRS nghiên cứu 92 4.2.3 Kết truy cập ngân hàng gene 93 4.2.4 So sánh mức độ tƣơng đồng trình tự nucleotide chủng virus nghiên cứu 4.2.5 4.2.6 105 So sánh mức độ tƣơng đồng trình tự amino acid chủng virus nghiên cứu 107 Kết xây dựng sinh học phân tử chủng virus nghiên cứu 109 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 114 5.1 Kết luận 114 5.2 Kiến nghị 116 Danh mục cơng trình cơng bố 117 Tài liệu tham khảo 118 Phụ lục 127 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa Tiếng Việt BCĐNTT Bạch cầu đa nhân trung tính CPE Cytophathogenic Effect (Bệnh tích tế bào) DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Môi trƣờng nuôi cấy tế bào) DNA Deoxyribonucleic acid (gen sợi kép) EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid (Dung dịch đệm) ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (Phản ứng miễn dịch gắn enzym) FBS Fetal Bovine Serum (Huyết thai bò) HE Haematoxylin – Eosin (Thuốc nhuộm tiêu bệnh lý) IHC Immuno Histochemistry (Hóa miễn dịch tổ chức) IPMA Immunoperoxidase monolayer Assay (Phản ứng miễn dịch có gắn men tế bào lớp) KKT Kháng kháng thể MARC 145 Tế bào thận khỉ MLV Modifier Live Vacine (Vắc xin nhƣợc độc) MOI Multiplicity Of Infection (Tỷ lệ số lƣợng virus số lƣợng tế bào) NSP Non structural protein (Protein phi cấu trúc) OD Optical Density (Mật độ quang) ORF Open Reading Frame (Khung đọc mở hệ gen) PAM Porcine Alveolar Macrophage (đại thực bào phế nang lợn) PBS Photphat Buffer Saline (Dung dịch đệm) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn) PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (Virus gây Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn) RNA Ribonucleic acid (gen sợi đơn) vi RT- PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp có dùng enzym phiên mã ngƣợc) S/P Sample/Positive (giá trị tính tốn phản ứng ELISA) SP Structural protein (Protein cấu trúc) TCID50 50% Tissue Culture Infective Dose (Liều gây nhiễm 50% mô nuôi cấy) TMB 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine (Cơ chất bắt màu huỳnh quang) TPB Triptose phosphas broth (Dung dịch đệm) vii DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Trang 2.1 Protein cấu trúc PRRSV 16 3.1 Thông tin nguồn gốc 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 40 4.1 Kết xác định hiệu giá 03 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 chủng virus vắc-xin 4.2 54 Khả gây bệnh tích tế bào 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 4.3 55 Khả gây bệnh tích tế bào 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 qua đời cấy chuyển 4.4 60 Hiệu giá 02 chủng virus PRRS HUA 01 PRRS HUA 02 qua đời cấy chuyển 4.5 60 Kết kiểm tra hàm lƣợng kháng thể lợn lô trƣớc gây nhiễm thực nghiệm phƣơng pháp ELISA 4.6 Kết kiểm tra hàm lƣợng kháng thể lợn lô trƣớc gây nhiễm thực nghiệm phƣơng pháp ELISA 4.7 65 65 Kết xét nghiệm có mặt virus PRRS số virus khác phƣơng pháp RT – PCR 66 4.8 Kết xét nghiệm PRRSV phƣơng pháp RT-PCR 67 4.9 Kết xét nghiệm hàm lƣợng PRRSV phƣơng pháp Realtime RT-PCR 70 4.10 Bảng tổng hợp triệu chứng lâm sàng chủ yếu lợn đƣợc gây bệnh thực nghiệm 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 4.11 Bệnh tích đại thể lợn thí nghiệm gây nhiễm chủng PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 4.12 78 Bệnh tích đại thể lợn thí nghiệm gây nhiễm chủng PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 (tiếp) 4.13 79 Bệnh tích vi thể lợn thí nghiệm gây nhiễm chủng PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 4.14 75 83 Kết xác định virus PRRS lợn gây bệnh thực nghiệm phƣơng pháp hóa mơ miễn dịch 87 viii Murtaugh (2009) Comparative infection efficiency of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus field isolates on MA104 cells and porcine alveolar macrophages Canadian Journal of Veterinary Research Vol 73 (3) pp 200-204 32 Ding B.-l., C.-l Sang, M.-h Yan, X.-l LI, Y.-z Wang and J.-h Huang (2005) Pathological Changes in Piglets Infected with SJ Strain of PRRSV [J] Chinese Journal of Veterinary Vol pp 002 33 Done S., D Paton and M White (1996) Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS): a review, with emphasis on pathological, virological and diagnostic aspects British veterinary journal Vol 152 (2) pp 153-174 34 Fang L., Y Jiang, S Xiao, C Niu, H Zhang and H Chen (2006) Enhanced immunogenicity of the modified GP5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus Virus Genes Vol 32 (1) pp 5-11 35 Fang Y., R R Rowland, M Roof, J K Lunney, J Christopher-Hennings and E A Nelson (2006) A full-length cDNA infectious clone of North American type porcine reproductive and respiratory syndrome virus: expression of green fluorescent protein in the Nsp2 region Journal of virology Vol 80 (23) pp 11447-11455 36 Feng Y., T Zhao, T Nguyen, K Inui, Y Ma, T H Nguyen, V C Nguyen, D Liu, Q A Bui and L T To (2008) Porcine respiratory and reproductive syndrome virus variants, Vietnam and China, 2007 Emerg Infect Dis Vol 14 (11) pp 1774-6 37 Gorbalenya A E., L Enjuanes, J Ziebuhr and E J Snijder (2006) Nidovirales: evolving the largest RNA virus genome Virus research Vol 117 (1) pp 17-37 38 Grebennikova T.V., Syroeshkin A.V, Musienko M.I, Zaberezhny A.D., Aliper T.I (2005) Changes of microelement content in Marc-145 cells before and after infection with virulent and attenuated strains of PRRS virus 2005 International PRRS Symposium Westport Conference Center, St Louis, Missouri December 2-3, 2005 39 Halbur P., P S Paul, M Frey, J Landgraf, K Eernisse, X.-J Meng, M Lum, J Andrews and J Rathje (1995) Comparison of the pathogenicity of two US porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates with that of the Lelystad virus Veterinary Pathology Online Vol 32 (6) pp 648-660 40 Han J., G Liu, Y Wang and K S Faaberg (2007) Identification of nonessential regions of the nsp2 replicase protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain VR-2332 for replication in cell culture Journal of virology Vol 81 (18) pp 9878-9890 41 Han, J., M.S Rutherford, and K.S Faaberg (2010) Proteolytic products of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus nsp2 replicase protein Journal of virology, 2010 84(19): p 10102-10112 42 Han W., J.-J Wu, X.-Y Deng, Z Cao, X.-l Yu, C.-B Wang, T.-Z Zhao, N.-H Chen, H.-H Hu and W Bin (2009) Molecular mutations associated with the in 121 vitro passage of virulent porcine reproductive and respiratory syndrome virus Virus genes Vol 38 (2) pp 276-284 43 Harel S., M A Salan and J Kanner (1988) Iron release from metmyoglobin, methaemoglobin and cytochrome c by a system generating hydrogen peroxide Free radical research communications Vol (1) pp 11-19 44 Huang, Y., Y Fang, and X Meng (2009), Identification and characterization of a porcine monocytic cell line supporting porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) replication and progeny virion production by using an improved DNAlaunched PRRSV reverse genetics system Virus research 145(1): p 1-8 45 Ishibata S., M Mori and H Syazawa (2000) Experimental reinfection with homologous porcine reproductive and respiratory syndrome virus in SPF pigs Journal of Veterinary Medical Science Vol 62 (1) pp 105-108 46 Jaffe, E.R (1981) Methaemoglobinaemia Clin Haematol 10: 99-122 47 Keffaber K (1989) Reproductive failure of unknown etiol-ogy Am Assoc Swine Pract Newsl Vol pp 1-9 48 Keirstead N D., C Lee, D Yoo, A S Brooks and M A Hayes (2008) Porcine plasma ficolin binds and reduces infectivity of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) in vitro Antiviral research Vol 77 (1) pp 28-38 49 Kim H., J Kwang, I Yoon, H Joo and M Frey (1993) Enhanced replication of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in a homogeneous subpopulation of MA-104 cell line Archives of virology Vol 133 (3-4) pp 477-483 50 Kim H K., H J Moon, S J Park, H C Chung, M K Choi, A R Kim and B K Park (2014) ORF5-based evolutionary and epidemiological dynamics of the type porcine reproductive and respiratory syndrome virus circulating in Korea Infection, Genetics and Evolution Vol 21 pp 320-328 51 Kim T., C Park, K Choi, J Jeong, I Kang, S.-J Park and C Chae (2015) Comparison of two commercial type porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) modified live vaccines against heterologous type and type PRRSV challenge in growing pigs Clinical and Vaccine Immunology Vol 22 (6) pp 631-640 52 Kim W.-I., J.-J Kim, S.-H Cha, W.-H Wu, V Cooper, R Evans, E.-J Choi and K.-J Yoon (2013) Significance of genetic variation of PRRSV ORF5 in virus neutralization and molecular determinants corresponding to cross neutralization among PRRS viruses Veterinary microbiology Vol 162 (1) pp 10-22 53 Kreutz, L (1998) Cellular membrane factors are the major determinants of porcine reproductive and respiratory syndrome virus tropism Virus research 53(2): pp 121-128 122 54 Kwon B., I H Ansari, F A Osorio and A K Pattnaik (2006) Infectious clonederived viruses from virulent and vaccine strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus mimic biological properties of their parental viruses in a pregnant sow model Vaccine Vol 24 (49) pp 7071-7080 55 Lee, C and D Yoo (2006) The small envelope protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus possesses ion channel protein-like properties Virology 355(1): pp 30-43 56 Leng X., Z Li, M Xia, Y He and H Wu (2012) Evaluation of the efficacy of an attenuated live vaccine against highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus in young pigs Clinical and Vaccine Immunology Vol 19 (8) pp 1199-1206 57 Li B., L Fang, Y J S Liu and H Chen and S Xiao (2014) The genomic and pathogenic characteristics of the highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolate WUH2 ISRN Virology Vol 2014 58 Li G., J Huang, P Jiang, Y Li, W Jiang and X Wang (2007) Suppression of porcine reproductive and respiratory syndrome virus replication in MARC-145 cells by shRNA targeting ORF1 region Virus Genes Vol 35 (3) pp 673-679 59 Li R.-g., Y.-l Jiang, J.-l Wang, Y Wu and X.-e Ma (2010) Comparative clinical pathologic study on highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome Journal of Inner Mongolia Agricultural University (Natural Science Edition) Vol pp 003 60 Li J and M P Murtaugh (2012) Dissociation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus neutralization from antibodies specific to major envelope protein surface epitopes Virology Vol 433 (2) pp 367-376 61 Liu Y., W Shi, E Zhou, S Wang, S Hu, X Cai, F Rong, J Wu, M Xu and M Xu (2010) Dynamic changes in inflammatory cytokines in pigs infected with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus Clinical and Vaccine Immunology Vol 17 (9) pp 1439-1445 62 Lou S C., C Patel, S Ching and J Gordon (1993) One-step competitive immunochromatographic assay for semiquantitative determination of lipoprotein (a) in plasma Clinical chemistry Vol 39 (4) pp 619-624 63 Meng X.-J., P S Paul, P G Halbur and M A Lum (1995) Phylogenetic analyses of the putative M (ORF 6) and N (ORF 7) genes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV): implication for the existence of two genotypes of PRRSV in the USA and Europe Archives of virology Vol 140 (4) pp 745-755 64 Metwally S., F Mohamed, K Faaberg, T Burrage, M Prarat, K Moran, A Bracht, G 123 Mayr, M Berninger and L Koster (2010) Pathogenicity and molecular characterization of emerging porcine reproductive and respiratory syndrome virus in Vietnam in 2007 Transboundary and emerging diseases Vol 57 (5) pp 315-329 65 Murakami Y., A Kato, T Tsuda, T Morozumi, Y Miura and T Sugimura (1994) Isolation and serological characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) viruses from pigs with reproductive and respiratory disorders in Japan Journal of Veterinary Medical Science (Japan) Vol 56 (5) pp 891- 894 66 Murtaugh M., M Elam and L Kakach (1995) Comparison of the structural protein coding sequences of the VR-2332 and Lelystad virus strains of the PRRS virus Archives of virology Vol 140 (8) pp 1451-1460 67 Nelsen C J., M P Murtaugh and K S Faaberg (1999) Porcine reproductive and respiratory syndrome virus comparison: divergent evolution on two continents Journal of virology Vol 73 (1) pp 270-280 68 Nelson E., J Christopher-Hennings, T Drew, G Wensvoort, J Collins and D Benfield (1993) Differentiation of US and European isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by monoclonal antibodies Journal of Clinical Microbiology Vol 31 (12) pp 3184-3189 69 Neumann E J., J B Kliebenstein, C D Johnson, J W Mabry, E J Bush, A H Seitzinger, A L Green and J J Zimmerman (2005) Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome on swine production in the United States Journal of the American Veterinary Medical Association Vol 227 (3) pp 385-392 70 Nodelijk G., M Nielen, M De Jong and J Verheijden (2003) A review of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in Dutch breeding herds: population dynamics and clinical relevance Preventive veterinary medicine Vol 60 (1) pp 37-52 71 OIE (2005) Porcine reproductive and respiratory syndrome in south afica: Fllowup report no disease information 18 Vol pp 422-423 72 Opriessnig T., P Halbur, K.-J Yoon, R Pogranichniy, K Harmon, R Evans, K Key, F Pallares, P Thomas and X Meng (2002) Comparison of molecular and biological characteristics of a modified live porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) vaccine (ingelvac PRRS MLV), the parent strain of the vaccine (ATCC VR2332), ATCC VR2385, and two recent field isolates of PRRSV Journal of virology Vol 76 (23) pp 11837-11844 73 Park C., H W Seo, I Kang, J Jeong, K Choi and C Chae (2014) A New Modified Live Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Vaccine Improves Growth Performance in Pigs under Field Conditions Clinical and Vaccine Immunology Vol 21 (9) pp 1350-1356 124 74 Paton D., I Brown, S Edwards and G Wensvoort (1991) 'Blue ear'disease of pigs Veterinary Record Vol 128 (26) pp 617-617 75 Pol J., J Van Dijk, G Wensvoort and C Terpstra (1991) Pathological, ultrastructural, and immunohistochemical changes caused by Lelystad virus in experimentally induced infections of mystery swine disease (synonym: porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (PEARS)) Veterinary Quarterly Vol 13 (3) pp 137-143 76 Prieto C (2010) PRRS vaccine development, EuroPRRS2010, COST Action FA0902, Understanding and combating porcine reproductive and respiratory syndrome in Europe 77 Shi M., T T.-Y Lam, C.-C Hon, R K.-H Hui, K S Faaberg, T Wennblom, M P Murtaugh, T Stadejek and F C.-C Leung (2010) Molecular epidemiology of PRRSV: a phylogenetic perspective Virus research Vol 154 (1) pp 7-17 78 Terpstra C., G Wensvoort and J Pol (1991) Experimental reproduction of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (mystery swine disease) by infection with Lelystad vims: Koch's postulates fulfilled Veterinary Quarterly Vol 13 (3) pp 131-136 79 Thanawongnuwech R., B Thacker, P Halbur and E L Thacker (2004) Increased production of proinflammatory cytokines following infection with porcine reproductive and respiratory syndrome virus and Mycoplasma hyopneumoniae Clinical and diagnostic laboratory immunology Vol 11 (5) pp 901-908 80 Tian K., X Yu, T Zhao, Y Feng, Z Cao, C Wang, Y Hu, X Chen, D Hu and X Tian (2007) Emergence of fatal PRRSV variants: unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark PloS one Vol (6) pp e526 81 Tsai, Y.-C (2012) The effect of infection order of porcine circovirus type and porcine reproductive and respiratory syndrome virus on dually infected swine alveolar macrophages BMC veterinary research, 8(1): p 82 Valicek, L (1997) Isolation and identification of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in cell cultures Veterinarni medicina, 42(10): p 281-287 83 Wensvoort G., C Terpstra, J Pol, E Ter Laak, M Bloemraad, E De Kluyver, C Kragten, L d Van Buiten, A Den Besten and F Wagenaar (1991) Mystery swine disease in The Netherlands: the isolation of Lelystad virus Veterinary Quarterly Vol 13 (3) pp 121-130 84 XiaoLei G., L SiDang, L ZhongZi and W TianHu (2009) Comparative pathology of piglets naturally infected with high-pathogenic PRRSV and artificially infected with American strains PRRSV (VR-2332) Chinese Journal of Veterinary Science 125 Vol 29 (4) pp 451-455 85 Yu X., Z Zhou, Z Cao, J Wu, Z Zhang, B Xu, C Wang, D Hu, X Deng and W Han (2015) Assessment of the safety and efficacy of an attenuated live vaccine based on highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV) Clinical and Vaccine Immunology Vol pp CVI 00722-14 86 Zimmerman J., K.-J Yoon, R Wills and S Swenson (1997) General overview of PRRSV: a perspective from the United States Veterinary microbiology Vol 55 (1) pp 187-196 87 Zhang M., J Xie, L Sun, Z Cao, H Gu, S Deng, Y Chen, Z Cao, F Tang and S Su (2013) Phylogenetic analysis and molecular characteristics of 17 porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in Southern China from 2010 to 2011 Microbial pathogenesis Vol 65 pp 67-72 88 Zhou Y J., X F Hao, Z J Tian, G Z Tong, D Yoo, T Q An, T Zhou, G X Li, H J Qiu and T C Wei (2008) Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome virus emerged in China Transboundary and emerging 126 PHỤ LỤC Đề tài: “Nghiên cứu đặc tính sinh học sinh học phân tử chủ yếu chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 phân lập số tỉnh phía Bắc Việt Nam” Phụ lục Bảng kết nghiên cứu xác định đƣờng biểu diễn nhân lên chủng virus PRRS HUA 01 24hpi 36hpi 48hpi 60hpi 72hpi 84hpi 96hpi Virus tế bào ( PRRS HUA 01) 2,5 3,83 3,5 4,16 4,83 3,83 3,5 Virus dịch tế bào (PRRS HUA 01) 2,16 3,5 4,5 4,83 4,5 4,83 4,5 Virus tế bào (vắc-xin JXA1) 1,5 3,16 5,5 4,16 3,83 2,83 2,83 Virus dịch tế bào (vắc-xin JXA1) 2,83 3,83 5,5 4,83 5,16 4,16 3,83 Phụ lục Bảng kết nghiên cứu xác định đƣờng biểu diễn nhân lên chủng virus PRRS HUA 02 24hpi 36hpi 48hpi 60hpi 72hpi 84hpi 96hpi Virus tế bào (PRRS HUA 02) 2,16 3,5 4,16 5,5 4,83 3,83 3,5 Virus dịch tế bào (PRRS HUA 02) 2,83 3,5 4,83 5,83 4,5 5,16 4,5 Virus tế bào (vắc-xin JXA1) 1,5 3,16 5,5 4,16 3,83 2,83 2,83 Virus dịch tế bào (vắc-xin JXA1) 2,83 3,83 5,5 4,83 5,16 4,16 3,83 127 Phụ lục Bảng kết hàm lƣợng kháng thể lợn thí nghiệm sau gây nhiễm (S/P) Ngày Lơ thí nghiệm Lơ thí nghiệm Lơ đối chứng Lô đối chứng TN1.4 TN1.5 TN2.1 TN2.2 TN2.3 TN2.4 TN2.5 ĐC1.1 ĐC1.2 ĐC1.3 ĐC2.1 ĐC2.2 ĐC2.3 128 TN1.1 TN1.2 TN1.3 0,22 0,21 0,19 0,12 0,16 0,21 0,22 0,21 0,24 0,23 0,19 0,23 0,20 0,2 0,18 0,14 0,27 0,26 0,22 0,21 0,19 0,26 0,33 0,26 0,3 0,22 0,18 0,15 0,18 0,21 0,19 0,15 0,28 0,28 0,2 0,21 0,22 0,27 0,35 0,28 0,32 0,26 0,2 0,2 0,20 0,2 0,18 0,21 0,35 0,46 0,47 0,37 0,34 0,45 0,47 0,38 0,43 0,48 0,18 0,1 0,20 0,21 0,2 0,2 0,81 0,89 0,9 0,69 0,92 0,89 0,9 0,82 0,96 0,92 0,2 0,11 0,18 0,22 0,18 0,23 11 1,18 1,22 1,28 1,03 1,22 1,47 1,38 1,15 1,26 1,21 0,2 0,13 0,11 0,2 0,2 0,1 13 1,28 1,23 1,26 1,13 1,23 1,54 1,48 1,46 1,35 1,43 0,21 0,11 0,22 0,21 0,2 0,11 15 1,22 1,26 1,12 1,22 1,35 1,42 1,45 1,51 0,2 0,18 0,20 0,23 0,18 0,13 17 1,13 1,16 1,18 1,16 1,3 1,35 1,37 1,42 0,21 0,19 0,21 0,21 0,11 0,11 19 1,02 1,12 1,15 1,06 1,35 1,32 1,31 1,35 0,22 0,16 0,23 0,25 0,19 0,14 21 1,05 1,16 1,13 1,06 1,3 1,25 1,18 1,24 0,11 0,18 0,21 0,2 0,2 0,11 Ghi chú: Chỉ số S/P lơ thí nghiệm (TN) lơ đối chứng (ĐC) Lơ 1: Lơ lợn thí nghiệm đƣợc gây nhiễm chủng virus PRRS HUA 01 Lô 2: Lơ lợn thí nghiệm đƣợc gây nhiễm chủng virus PRRS HUA 02 Lô ĐC: Lô lợn đối chứng (+) Dƣơng tính (-) Âm tính (*) Lợn thí nghiệm chết + Nếu S/P ≥ 0,4 dƣơng tính + Nếu S/P < 0,4 âm tính Phụ lục Thân nhiệt lợn sau gây bệnh thực nghiệm 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 (0C) Ngày Lô gây nhiễm PRRS HUA 01 TN1.1 TN1.2 TN1.3 TN1.4 Lô đối chứng Lô đối chứng Lô gây nhiễm PRRS HUA 02 TN1.5 TN2.1 TN2.2 TN2.3 TN2.4 TN2.5 ĐC1.2 ĐC1.2 ĐC1.3 ĐC2.2 ĐC2.2 ĐC2.3 129 38,5± 0,2 38,6± 0,2 38,5±0,2 38,5± 0,3 38,5±0,2 39,2±0,2 39,3±0,4 39,0±0,2 38,3±0,4 39,4±0,3 38,5±0,1 39,3±0,4 38,5 ±0,3 39,3 ±0,4 38,5± 0,2 38,6± 0,2 38,5± 0,2 39,2± 0,2 38,5± 0,3 39,3± 0,4 38,3± 0,2 38,5± 0,2 38,3± 0,2 38,5± 0,2 38,3± 0,2 38,0± 0,2 38,4 ± 0,1 38,4± 0,2 38,5 ±0,1 38,4± 0,2 38,50 ± 0,1 38,4± 0,2 39,9± 0,2 39,4±0,2 39,4±0,3 39,4±0,2 40,1 ±0,3 39,8±0,3 40,2 ±0,3 39,4± 0,2 39,4± 0,2 39,4± 0,3 38,35±0,1 38,3 ± 0,1 38,3 ±0,1 38,4 ± 0,1 38,5 ±0,1 38,5 ± 0,1 40,3± 0,2 40,1±0,3 40,1 ±0,3 40,2 ±0,3 40,1 ±0,3 40,0±0,1 40,3 ±0,1 40,2 ±0,3 39,7± 0,2 40,2 ± 0,3 38,4± 0,2 38,4± 0,2 38,4± 0,2 38,6± 0,2 38,5 ±0,1 38,5 ± 0,1 40,4 ±0,3 40,2±0,3 40,1±0,3 40,3±0,3 40,4±0,5 40,0±0,3 40,4± 0,3 40,3± 0,3 40,2 ± 0,1 40,1 ± 0,3 38,5 ±0,1 38,50 ± 0,1 38,5 ±0,1 38,5± 0,1 38,5± 0,2 38,5± 0,2 40,5 ±0,3 40,2±0,3 40,4±0,5 40,2 ±0,3 40,2±0,5 40,4±0,5 40,4± 0,3 40,2± 0,3 40,2± 0,3 40,4± 0,5 38,4± 0,2 38,4± 0,2 38,4± 0,2 38,6± 0,2 38,4 ± 0,1 38,4 ± 0,1 41,8 ±0,1 41,8±0,1 41,2±0,5 41,6±0,1 41,7±0,4 41,6±0,4 41,2 ±0,5 41,6± 0,1 41,8 ± 0,1 41,2± 0,5 38,5 ±0,1 38,5 ± 0,1 38,5 ±0,1 38,4 ±0,1 38,4± 0,2 38,4± 0,2 41,7 ±0,1 41,2±0,1 41,7±0,4 41,6±0,2 41,4±0,2 41,4±0,2 41,7± 0,4 40,7± 0,1 41,2 ± 0,1 41,7 ± 0,4 38,5 ±0,1 38,5 ± 0,1 38,5 ±0,1 38,5± 0,2 38,4 ± 0,1 38,45 ± 0,1 41,8 ±0,3 41,0±0,3 41,4±0,2 41,5±0,2 41,6±0,1 41,5±0,1 41,4± 0,2 40,8± 0,3 41,0 ± 0,3 41,4± 0,2 38,5± 0,2 38,5± 0,2 38,5± 0,2 38,5 ±0,1 38,1± 0,2 38,4± 0,2 10 41,6 ±0,2 41,5±0,2 41,6±0,1 41,6±0,2 41,5±0,2 41,3±0,2 41,6± 0,1 41,6± 0,2 41,5 ± 0,2 41,6 ± 0,1 38,4 ± 0,1 38,4 ± 0,1 38,4 ± 0,1 38,4± 0,2 38,4 ± 0,1 38,4 ± 0,1 11 41,7 ±0,2 41,6±0,2 41,5±0,2 41,6±0,2 41,5±0,1 41,8±0,2 41,5± 0,2 41,6± 0,2 41,6 ± 0,2 41,5 ± 0,2 38,4± 0,2 38,4± 0,2 38,4± 0,2 38,5 ±0,1 38,4± 0,2 38,6± 0,2 12 41,5± 0,3 41,5±0,2 41,5±0,1 41,1±0,3 41,4±0,2 41,3±0,1 41,5± 0,1 41,5± 0,3 41,5± 0,2 41,51±0,1 38,4 ± 0,1 38,45 ± 0,1 38,4 ± 0,1 38,5± 0,2 38,4 ± 0,1 38,5 ± 0,1 13 41,8± 0,2 40,8±0,2 41,0±0,2 41,1±0,2 40,8±0,1 40,8±0,2 41,4± 0,2 41,8± 0,2 40,8± 0,2 41,0 ± 0,2 38,4± 0,2 38,4± 0,2 38,1± 0,2 38,4 ± 0,1 38,4± 0,2 38,6± 0,2 14 * 40,5±0,2 40,5±0,1 40,8±0,2 39,3 ±0,2 40,3±0,2 41,0± 0,1 41,3 ±0,2 40,5± 0,2 40,5 ± 0,1 38,4 ± 0,1 38,4 ± 0,1 38,4 ± 0,1 38,4± 0,2 38,4 ± 0,1 38,4 ± 0,1 15 * 39,6±0,2 39,6±0,2 39,5 ±0,2 39,6±0,2 39,3±0,2 40,5±0,1 * 39,6±0,2 39,6 ± 0,2 38,6± 0,2 38,6± 0,2 38,6± 0,2 38,4 ± 0,1 38,6± 0,2 38,5± 0,2 16 * 38,5±0,4 39,1±0,2 38,7 ±0,2 38,6 ±0,2 39,1±0,1 39,6±0,2 * 38,5±0,4 39,1 ± 0,2 38,5± 0,1 38,5 ± 0,1 38,5± 0,1 38,4± 0,2 38,5± 0,1 38,5 ±0,1 17 * 38,6±0,3 38,5±0,3 38,5 ±0,3 38,5±0,3 38,5±0,4 39,1±0,2 * 38,6±0,3 38,5± 0,3 38,6± 0,2 38,6± 0,2 38,0± 0,2 38,4 ± 0,1 38,4 ± 0,1 38,5± 0,2 18 * 38,4±0,3 38,8±0,2 38,8±0,2 38,8±0,2 38,5±0,1 38,5±0,3 * 38,4±0,3 38,8± 0,2 38,4 ±0,1 38,4 ± 0,1 38, ±0,1 38,6± 0,2 38,4± 0,2 38,4 ± 0,1 19 * 38,4±0,4 38,5±0,2 38,5±0,2 38,5±0,2 38,5±0,4 38,8±0,2 * 38,4±0,4 38,5±0,2 38,5± 0,2 38,5± 0,2 38,5± 0,2 38,5± 0,1 38,4 ± 0,1 38,4± 0,2 20 * 38,5±0,1 38,4±0,1 38,7±0,1 38,6±0,1 38,6±0,1 38,5±0,2 * 38,5±0,1 38,4±0,1 38,5 ±0,1 38,5 ± 0,1 38,5 ±0,1 38,4 ± 0,1 38,6± 0,2 38,4 ± 0,1 21 * 38,5±0,3 38,4±0,1 38,4±0,1 38,4±0,1 38,6±0,4 38,6±0,4 * 38,5±0,3 38,4±0,1 38,4± 0,2 38,4± 0,2 38,4± 0,2 38,6± 0,2 38,5 ± 0,1 38,5 ± 0, Ghi chú: Thân nhiệt lơ thí nghiệm (TN) lơ đối chứng (ĐC) lấy giá trị trung bình cộng hai lần đo ngày(*) Lợn thí nghiệm chết Phụ lục Bảng kết xét nghiệm PRRSV phƣơng pháp RT-PCR Lô TN1 gây nhiễm chủng PRRS HUA 01 Dịch ngoáy Máu mũi 5/55/52/5+ 5/55/5+ 3/5+ 5/5+ 5/5+ 5/5+ 5/5+ 5/5+ 11 5/5+ 5/5+ 13 15 17 19 21 5/5+ 4/4+ 4/4+ 4/4+ 4/4+ 5/5+ 4/4+ 4/4+ 4/4+ 4/4+ Ngày gây nhiễm Lô TN2 gây nhiễm chủng PRRS HUA 02 Dịch ngoáy Máu mũi 5/55/54/5+ 5/55/5+ 4/5+ 5/5+ 5/5+ Lơ ĐC1 ĐC2 6/66/66/66/6- Dịch ngốy mũi 6/66/66/66/6- 5/5+ 6/6- 6/6- 5/5+ 5/5+ 6/6- 6/6- 5/5+ 4/4+ 4/4+ 4/4+ 4/4+ 5/5+ 4/4+ 4/4+ 4/4+ 4/4+ 6/66/66/66/66/6- 6/66/66/66/66/6- Ghi chú: (+) Dƣơng tính: Virus xuất máu thải qua dịch ngốy mũi (-) Âm tính: không xuất virus máu thải qua dịch ngốy mũi Lơ TN1 có 01 lợn thí nghiệm chết vào số 13 sau gây nhiễm Lô TN2 có 01 lợn thí nghiệm chết vào ngày số 14 sau gây nhiễm Lô ĐC1, ĐC2: Lô đối chứng lô đối chứng 130 Máu Phụ lục Một số hình ảnh triệu chứng lâm sàng bệnh tích đại thể nhuộm hóa mơ miễn dịch lợn đƣợc gây nhiễm thực nghiệm Hình Xuất huyết da tai, mõm Hình Hai chân sau sƣng to Hình Phân lợn tiêu chảy Hình Phân lợn táo bón Hình Não sung huyết Hình Thận xuất huyết đinh ghim 131 Hình Phổi viêm, bề mặt phổi căng bóng Hình Hạch màng treo ruột tụ máu Hình Virus phân bố phổi (IHC.20X) Hình 10 Virus phân bố hạch ruột (IHC.10X) Hình 11 Virus phân bố phổi (IHC.20X) Hình 12 Virus phân bố hạch (IHC.10X) 132 Phụ lục Các chủng tham chiếu sử dụng để xây dựng sinh học phân tử: STT Gene Full gene Full gene Full gene Mã hiệu (Accession number) U87392 M96262 AY032626 ORF5 ORF5 Full gene ORF5 ORF5 U66380 AF121131 DQ779791 AF176476 AF339494 34075-NE MD-001 Prime Pac PRRSV55 98-31701-1 Hoa Kỳ Đài Loan Hoa Kỳ Hoa Kỳ Hoa Kỳ 1996 1997 1998 2000 2001 10 11 12 13 ORF5 ORF7 Full gene Full gene ORF5 AY297118 AY209228 EF532801 FJ536165 AY656993 02SP3 31D INGELVAC ATP NB/04 SDSU73 Thái Lan Mexico Hoa Kỳ Trung Quốc Hoa Kỳ 2002 2003 2004 2004 2005 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Full gene Full gene Full gene Full gene Full gene ORF7 Full gene Full gene ORF5 GU269541 DQ176019 EF112445 EU864233 EF635006 EF441853 FJ394029 FJ393457 EU758940 GD3 MN184A JXA1 TP HUN4 06K805 07QN 07HEN PRRSV0000008973 Trung Quốc Hoa Kỳ Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Hàn Quốc Việt Nam Việt Nam Hoa Kỳ 2005 2005 2006 2006 2006 2006 2007 2007 2007 23 24 25 26 27 28 29 30 31 ORF5 ORF5 ORF5 ORF5 ORF7 ORF7 ORF7 ORF5 Full gene JQ860371 JQ860362 EU556160 AB546105 JQ860392 JQ860396 JQ860394 GU187014 FJ895329 DN153 DN444 2000-5424 Miyagi08-2 DN444 DN499 DN456 BCL-PS 100 SX2009 Việt Nam Việt Nam Hoa Kỳ Nhật Bản Việt Nam Việt Nam Việt Nam Singapore Trung Quốc 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2009 2009 Tên chủng virus Quốc gia Năm phân lập ATCC VR-2332 Lelystad CH-1a Hoa Kỳ Hà Lan TQ 1990 1991 1995 133 STT Gene 32 33 34 35 36 37 ORF5 ORF7 Full gene ORF5 Full gene Full gene Mã hiệu (Accession number) JQ860372 JQ860398 GU168567 JQ860375 HM214915 JQ663556 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 ORF7 ORF5 ORF5 Full gene ORF7 ORF7 ORF7 ORF7 ORF7 ORF7 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 Quốc gia Năm phân lập DN292 DN42 09HUB7 DN1 GX09-32 10-10QN Việt Nam Việt Nam Trung Quốc Việt Nam Trung Quốc Trung Quốc 2009 2009 2009 2010 2010 2010 JQ860408 JN642707 JQ860378 JF748718 JQ860410 JQ860413 JQ860411 JQ860412 HM027592 KM659199 DN1 SHZ-2010 DN11 DC HCM.CC3 BD.X13 HCM.D06 BD.R1 LC HCM2011-1P Việt Nam Trung Quốc Việt Nam Trung Quốc Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Trung Quốc Việt Nam 2010 2010 2010 2010 2010 2010 2010 2010 2010 2011 ORF5 ORF5 ORF5 ORF5 Full gene ORF7 Full gene ORF5 ORF5 KC263023 AB856283 AB856284 JQ860387 KP771773 JQ860414 KP771770 AB856286 JQ860382 HUAY2-11 HUA-Vet.labPRRS1 HUA-Vet.lab PRRS2 DT7 NVDC-HeB1-2012 CT.C1 NVDC-HuN-2011 HUA-Vet.lab PRRS4 CT.C1 Trung Quốc Việt Nam Việt Nam Việt Nam Trung Quốc Việt Nam Trung Quốc Việt Nam Việt Nam 2011 2011 2011 2012 2012 2012 2012 2012 2012 ORF5 ORF5 ORF5 ORF7 ORF7 Full gene ORF7 Full gene ORF5 JQ860391 JQ860389 AB856285 JQ860422 JQ860423 JX087437 KP771764 JQ955657 KM244763 HG.RV2 DT9 HUA-Vet.lab PRRS3 HG.RV1 HG.RV2 SD16 NVDC-BJ1-2012 GX1001 MN1 Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Việt Nam 2012 2012 2012 2012 2012 2012 2012 2013 2013 Tên chủng virus 134 STT Gene 66 67 68 69 70 71 ORF5 ORF5 Full gene ORF5 Full gene ORF5 Mã hiệu (Accession number) KF699846 AB856287 KP771739 KU556995 KP771739 KC263033 72 73 74 75 Full gene ORF5 ORF5 ORF5 KP998478 LC102499 LC102500 LC102501 Quốc gia Năm phân lập HP1 HUA-Vet.lab PRRS5 NVDC-SC1-2014 HENHB1 NVDC-SC1-2014 ZQ5-GD-11 Việt Nam Việt Nam Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc 2013 2013 2014 2014 2014 2014 FJZH KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-02 KTY-PRRS-03 Trung Quốc Việt Nam Việt Nam Việt Nam 2015 2015 2015 2015 Tên chủng virus 135