Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa pectinase từ vi khuẩn chịu lạnh pseudoalteromonas halopplanktis trong e coli

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài : “THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PECTINASE TỪ VI KHUẨN CHỊU LẠNH PSEUDOALTEROMONAS HALOPPLANKTIS TRONG E COLI” Giáo viên hướng dẫn : TS Lê Văn Trƣờng Sinh viên thực : Nguyễn Thị Bích Lớp : CNSH – 1104 Hà Nội - 5/2015 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Sau thời gian nghiên cứu khoa học, giúp đỡ tận tình thầy giáo, anh chị kĩ thuật viên, bạn bè, gia đình, em hồn thành khóa luận tốt nghiệp “Thiết kế vector biểu gen mã hóa Pectinase từ vi khuẩn chịu lạnh Pseudoalteromonas haloplanktis E.coli” Nhân dịp này, em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới GS.Lê Văn Trường – phụ trách phòng Di truyền vi sinh vật – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam, người thầy giáo đáng kính dành nhiều thời gian, tâm huyết để tận tình hướng dẫn, bảo cho em trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn KS.Lê Trọng Tài – Phòng Di truyền vi sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam theo sát,tận tình bảo,hướng dẫn,trao đổi,giúp đỡ em trình thực đề tài Đồng thời, em xin trân trọng cảm ơn thầy cô giáo khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội, anh chị kĩ thuật viên thuộc phịng Di truyền vi sinh vật – Viện cơng nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam tận tình dạy dỗ em kiến thức bản, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em hồn thành khóa luận Cuối em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, người ln bên cạnh, khuyến khích, động viên để em có kết ngày hôm Do thời gian lực thân cịn hạn chế, khóa luận em khơng tránh thiếu sót Em mong nhận bảo, góp ý thầy bạn để em hồn thiện khóa luận đầy đủ hồn thiện Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày 21 tháng 5,năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Bích Nguyễn Thị Bích K18.CNSH.11-04 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Đại cương pectin 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Cấu tạo pectin 1.1.3 Tính chất pectin 1.1.3.1 Tính chất vật lý 1.1.3.2 Tính chất hóa học 1.2 Đại cương pectinase 1.2.1 Khái niệm pectinase 1.2.2 Phân loại pectinase 1.2.3 Cơ chế phân cắt chất pectin 1.2.4 Ứng dụng pectinase công nghiệp 1.2.4.1 Ứng dụng pectinase sản xuất nước trái 1.2.4.2 Ứng dụng pectinase công nghiệp dệt may 10 1.2.4.3 Ứng dụng pectinase công nghiệp sản xuất giấy 10 1.2.4.4 Ứng dụng pectinase công nghệ sinh học 10 1.3 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 11 1.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 11 1.3.2 Tình hình nghiên cứu nước 12 1.4 Đại cương vi khuẩn Pseudoalteromonas haloplanktis 12 1.5 Đại cương vector biểu gen 13 1.5.1 Đặc điểm vector biểu gen 13 1.5.2 Các bước tạo vector biểu gen 14 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 Nguyễn Thị Bích K18.CNSH.11-04 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 2.1 Vật liệu nghiên cứu 16 2.1.1 Chủng vi khuẩn 16 2.1.2 Hóa chất 16 2.1.3 Máy móc thiết bị 16 2.1.4 Môi trường dung dịch 17 2.1.5 Địa điểm nghiên cứu 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Điện di DNA gel agarose 19 2.2.2 Phương pháp PCR 20 2.2.3 Phương pháp tách dòng gen 23 2.2.4 Phương pháp tách DNA plasmid 25 2.2.5 Phương pháp giải trình tự gen 26 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Kết tách dòng gen pectinase E coli 28 3.1.1 Nhân gen pectinase (pel) từ chủng vi khuẩn chịu lạnh Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505 28 3.1.2 Kết biến nạp vào E coli DH10b 29 3.1.3 Kết tách chiết plasmid pJET/pel từ thể biến nạp 30 3.2 Kết thiết kế vector biểu gel E coli 31 3.2.1 Chuẩn bị vector thu nhận pel E coli 31 3.2.2 Gắn pel với vector pET43.1b biến nạp vào E coli BL21 33 3.2.3 Kết tách chiết plasmid, kiểm tra enzyme giới hạn 33 3.2.4 giải trình tự gen pel 34 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 4.1 Kết luận 37 4.1 Kiến nghị 37 CHƢƠNG TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 Nguyễn Thị Bích K18.CNSH.11-04 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid Bp CTAB Cetyl trimethyllammonium bromide dNTP Deoxyribonucleetide E.coli Escherichia coli ETDA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit EtBr Kb Kilobase 10 kDa Kilo Dalton 11 LB Luria and Bertani 12 PCR Polymerase Chain Reaction 13 TAE Tris- acctate- ETDA Nguyễn Thị Bích Chữ viết đầy đủ Base pair Ethydium bromide K18.CNSH.11-04 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại enzym pectinase theo Whitaker (1990) Bảng 2.1 Máy móc thiết bị 15 Bảng 2.2 Thành phần LB đặc 16 Bảng 2.3 Thành phần LB lỏng 16 Bảng 2.4 Thành phần Sol I 17 Bảng 2.5 Thành phần Sol II 17 Bảng 2.6 Thành phần Sol III 17 Bảng 2.7 Thành phần TAE 50X 18 Bảng 2.8 Thành phần phản ứng PCR 20 Bảng 2.9 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 20 Nguyễn Thị Bích K18.CNSH.11-04 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu tạo pectin Hình 1.2 Hình 1.4 Thủy phân pectin pectin methylesterases Thủy phân polygalacturonate Endo- Exopolygalacturonase Sự phân giải polygaclacturonate Exopolygalacturonate lyase Hình 1.5 Cấu trúc vector pET43.1b(+) 14 Hình 1.6 Sơ đồ vector tách dịng pJET1.2/blunt 22 Hình 3.1 Gen pel nhân lên PCR Khuẩn lạc thể biến nạp E.coli DH10b mang ppJET/pel môi trường chọn lọc LB, ampicillin 100µg/ml 28 Điện di sản phẩm cắt plasmid chứa gen pel Loại bỏ Nus-tag plasmid ppET43b cách kết hợp enzyme 30 Kiểm tra gen pel điện di agarose Kết biến nạp vector biểu pET43b vào tế bào E coli 31 Hình 1.3 Hình 3.2 Hình 3.3 Hình 3.4 Hình 3.5 Hình 3.6 29 BL21 31 32 Hình 3.7 Kiểm tra ppET 43.1b-pel enzyme giới hạn 33 Hình 3.8 So sánh trình tự nucleotid gen pel với trình tự nucleotid gen pel công bố ngân hàng gen 35 Nguyễn Thị Bích K18.CNSH.11-04 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp MỞ ĐẦU Đã từ lâu enzym sử dụng rộng rãi nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp, y học nghiên cứu khoa học Việc nghiên cứu ứng dụng loại enzym chế phẩm chúng có ý nghĩa vơ quan trọng thức q trình sản xuất, rút ngắn thời gian sản xuất, nâng cao hiệu sản xuất…từ nâng cao hiệu kinh tế cho người sử dụng Trong số nhiều enzym dử dụng pectinase có ứng dụng rộng rãi, sau amylase cellulase Pectinase thuật ngữ chung cho loại enzym có khả phân hủy chất pectin, loại polysaccharide có nhiều tế bào thực vật Enzym pectinase thường sử dụng nhiều trình liên quan đến biến đổi nguyên liệu thực vật đặc biệt sử dụng trình sản xuất nước ép trái Ngồi ra, pectinase cịn ứng dụng cơng nghệ thực phẩm, dược phẩm, dệt may… Tuy nhiên, có số ngành cơng nghiệp gỗ, bơ sữa, phản ứng với enzym nhiệt độ thấp enzym lạnh đóng vai trị quan trọng giúp nâng cao chất lượng sản phẩm Một enzym lạnh nhà nghiên cứu quan tâm enzym pectinase từ loài vi sinh vật ưa lạnh chúng có đặc điểm tham gia xúc tác nhiệt độ thường nên không cần ủ ấm, bảo vệ chất dễ phân hủy dịch vitamin, hương vị, dễ biến tính nhiệt độ Gen mã hóa pectinase (pel) gen có nguồn gốc từ chủng vi khuẩn chịu lạnh Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505 TS Lê Văn Trường cộng (Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam tạo dòng giải trình tự gen Các nghiên cứu enzyme nghiên cứu tính chất chúng Thơng qua đề tài “Thiết kế vector biểu gen mã hóa Pectinase từ vi khuẩn chịu lạnh Pseudoalteromonas haloplanktis E.coli”, phần công việc nghiên cứu biểu gen nghiên cứu tính chất chúng để ứng dụng thực tiễn Nguyễn Thị Bích K18.CNSH.11-04 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Mục tiêu nội dung nghiên cứu đề tài Mục tiêu đề tài : - Thiết kế vector biểu gen pectinase từ vi khuẩn chịu lạnh Pseudoalteromonas haloplanktis Nội dung nghiên cứu :  Tách dòng gen pectinase (pel) từ chủng vi khuẩn chịu lạnh Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505  Thiết kế vector biểu gen pel E coli Nguyễn Thị Bích K18.CNSH.11-04 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐẠI CƢƠNG VỀ PECTIN 1.1.1 Khái niệm Pectin đại phân tử polisacharid phức tạp tồn phổ biến thực vật, thành phần tham gia xây dựng cấu trúc tế bào thực vật, bao gồm : pectin (polymethylgalacturonate), axit pectin (polygalacturonate) oligogalacturonate) Pectin có nhiều thân thực vật vỏ quả, trọng lượng phân tử từ 10.000 đến 100.000 đơn vị Cacbon, [3,4,12] 1.1.2 Cấu tạo pectin - Pectin hợp chất cao phân tử mạch thẳng, mạch phân tử axit galacturonic kết hợp với liên kết -1,4-glucoside tạo nên Mạch thay đổi tỷ lệ lớn đơn vị axit D-galacturonic methyl hóa gọi axit pectic (axit polygalacturonic), [3,4,12] - Pectin khác với cacbonhydrate thông thường thành phần chủ yếu khơng phải đường đơn mà axit galacturonic Hình 1.1 : Cấu tạo pectin 1.1.3 Tính chất pectin 1.1.3.1 Tính chất vật lý Pectin chất bột, dạng khơ có màu trắng ngà hay màu nâu, điều tùy thuộc vào loại nguyên liệu Nguyễn Thị Bích K18.CNSH.11-04 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp chờ đĩa nguội trước sử dụng Cấy xong phút sau cho vào tủ ấm ủ tủ ấm 37 0C 16-24 - Kiểm tra hiệu việc chuyển gen cách cấy chuyển tách plasmid chạy điện di 2.2.4 Phƣơng pháp tách DNA plasmid: Các khuẩn lạc E.coli DH 10b mang plasmid tái tổ hợp nhân lên riêng rẽ môi trường LB lỏng với có mặt ampicillin Lợi dụng đặc điểm sinh sản nhanh tế bào vi khuẩn, tế bào E Coli mang DNA tái tổ hợp biến nạp sinh sản nhân số lượng vector tái tổ hợp lên nhiều Khi tế bào phát triển đến pha cân ly tâm thu cặn tế bào dùng hóa chất kiềm chất tạo sức căng bề mặt để phá vỡ màng tế bào Sử dụng hàng loạt hóa chất công đoạn khác để thu tủa DNA tổng số protein, thu lại DNA plasmi Tế bào thu pha cuối sinh trưởng để tách DNA plasmid Cách tiến hành : - Cấy trải chủng E.coli DH 10b từ ống giống vào môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh ampicillin (Nồng độ 100 mg/ml), ủ 37 0C ủ qua đêm - Cấy chuyển khuẩn lạc sang ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh ampicillin (Nồng độ 100 mg/ml), ni lắc 200 vịng/ phút 37 0C qua đêm - Cho dịch nuôi tế bào vào ống eppendoft 1,5 ml li tâm với tốc độ 10000 vòng/phút phút - Loại dịch nuôi,thu tủa - Bổ sung 200 µl Sol I, voltex cho tế bào tan hồn tồn - Bổ sung 200 µl Sol II, đảo ngược nhẹ nhàng khoảng đến lần để dung dịch bên trộn Đến thấy dung dịch bên trong suốt,nhớt - Bổ sung 200 µl Sol III, đảo nhẹ khoảng đến lần xuát kết tủa trắng Nguyễn Thị Bích 25 K18.CNSH.11-04 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp - Chiết với 500 µl Chloroform, đảo nhẹ khoảng đến lần ( làm lại lần) - Ly tâm 12000 v/p phút - Hút dịch pha sang ống eppendoft - Bổ sung 1ml cồn 96% để -200C khoảng 1-2 qua đêm - Ly tâm 12 000 v/p 10 phút - Loại dịch nổi, thu tủa, spin nhanh để dịch lắng xuống, dùng pipet hút loại bỏ phần dịch cịn lại, thu tủa - Làm khơ buồng cấy - Bổ sung 50 µl H2O khử ion - Hịa tan,lấy 10 µl để chạy điện di kiểm tra Mẫu lại bảo quản -20 0C 2.2.5 Phƣơng pháp giải trình tự gen Plasmid mang đoạn gen kích thước mong muốn chọn để xác định trình tự gen Quá trình giải trình tự thực phịng thí nghiệm trọng điểm, viện Cơng nghệ Sinh học máy đọc trình tự tự động ABI 3100 với phần mềm Sequencing Analysis Nguyễn Thị Bích 26 K18.CNSH.11-04 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết qua tách dòng gen pectinase (pel) 3.1.1 Nhân gen pectinase (pel) từ chủng vi khuẩn chịu lạnh pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505 Gen mã hóa pectinase (pel) gen có nguồn gốc từ chủng vi khuẩn chịu lạnh Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505 Lê Văn Trường cộng (Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam tạo dịng giải trình tự gen Hiện tính chất enzyme chưa nghiên cứu chúng tơi muốn thiết kế vector biểu gen E Coli cho mục đích nghiên cứu tính chất chúng Để tách dịng gen, trước hết gen pel phải nhân lên PCR Trong thí nghiệm cặp mồi cho phản ừng khuếch đại gen pel đươc thiết kế dựa theo nguyên tắc bổ sung trình tự gen pel chủng Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505 ngân hàng gen quốc tế Trình tự cặp mồi lưa chọn sau : PelC-F1/NdeI: ata cat atg caa aaa cat cct cgc a PelC-R1/XhoI: gat ctc gag ttt taa gtc atc aaa gctt DNA tổng số vi khuẩn Pseudoalteromonas haloplankis ANT/505 sau tách chiết sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen pel kích thước 1193 bp sử dụng mồi xuôi (Pel-F1/NdeI) mồi ngược (Pel-R1/XhoI) Sau kết thúc phản ứng PCR, sản phẩm đươc kiểm tra điện di gel agarose 0,8% đệm TAE 1X Kết điện di cho thấy xuất băng rõ nét, có chiều dài khoảng 1,2 kb kích thức gen pel đươc tính toán từ trước Như gen pel khuếch đại thành công, cặp mồi thiết kế đặc hiệu điều kiện phản ứng PCR phù hợp Nguyễn Thị Bích 27 K18.CNSH.11-04 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp pel (1,2 kb) Hình 3.1 Gen pel nhân lên PCR Đƣờng chạy 1: sản phẩm PCR, 2: DNA marker kb (Thermo Scientific) 3.1.2 Kết biến nạp vào E.coli DH10b Sau nhân lên PCR từ mẫu DNA vi khuẩn ANT/505, pel đươc kiểm tra gel agarose Băng DNA 1,2kb cắt ra, làm sạch, làm tù đầu gắn vào vector pJET1.2/blunt biến nạp vào E.coli DH10b mô tả phần phương pháp Các thể biến nạp chọn lọc môi trường thạch đĩa LB chưa ampicilin 100 µg/ml 370C qua đêm Những tế bào có chứa vector khơng mangg đoạn gen chèn sinh trưởng gen gây chết (lethal gene) có vùng đa điểm nối (multiple cloning site) vector gây Ngươc lại tế bào mang vector có đoạn gen chèn làm hỏng (knock out) gen gây chết vector làm cho gen không biểu tế bào sống phát triểm thành khuẩn lạc môi trường chọn lọc Kết biến nạp thu thể biến nạp mọc tốt đĩa môi trường chọn lọc, khơng có khuẩn lạc mọc đĩa đối chứng điều chứng tỏ phản ứng gắn biến nạp thành cơng Nguyễn Thị Bích 28 K18.CNSH.11-04 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.2 Khuẩn lạc thể biến nạp E.coli DH10b mang pJET/pel mơi trƣờng chọn lọc LB, ampicilin 100 µg/ml 3.1.3 Kết tách chiết plasmid pJET/pel từ thể biến nạp Các khuẩn lạc môi trường chọn lọc nhân lên riêng rẽ mơi trường LB lỏng có bổ sung ampicilin để tách plasmid Plasmid sau tách mô tả phần phương pháp kiểm tra điện di agarose 0,8% sau cắt đồng thời hai enzym giới hạn XbaI – XhoI để kiểm tra đoạn gen chèn vào hay không Kết điện di DNA cho thấy plasmid cho băng khoảng kb băng vector pJT1.2 băng 1,2 kb kích thước gen pel (hình 3.3) Điều chứng tỏ gen pel tách dịng thành cơng vào pJET1.2 nhân lên DH10b Nguyễn Thị Bích 29 K18.CNSH.11-04 Viện Đại học Mở Hà Nội M Khóa luận tốt nghiệp pJET1.2 (3 kb) pel (1,2 kb) Hình 3.3 Điện di sản phẩm cắt plasmid chứa gen pel Đường chạy 1-2: pJET/pel cắt XbaI - XhoI; 5: M: DNA marker 1kb 3.2 Thiết kế vector biểu gen pel E coli 3.2.1 Chuẩn bị vector thu nhận pel từ pJET/pel Chuẩn bị vector: Vector pET43.1b vector biểu mạnh có kích thước 7275bp, mang trình tự Nu-tag đầu N’ vị trí 833 đến 2317, trình tự His-tag đầu C’ vị trí 800 đến 817 Vector pET43.1b chứa promoter T7 có nhiệm vụ khởi đầu trình phiên mã Trình tự Nus-tag đoạn gen mã hóa cho Nus-tag protein nhằm tăng khả biểu gen ngoại lai khó biểu Tùy vào mục đích biểu gen mà người ta có lựa chọn dung hợp với Nú-tag hay không Với mục đich biểu pectinase không dung hợp với Nus-tag cần phải loại bỏ đoạn gen mã hóa Nus-tag vector cách chèn trình tự pel vào vị trí NdeI XhoI Sau cắt pET43.1b hai enzym XhoI NdeI 370C, sản phẩm cắt tách điện di agarose 0,8% Kết cho thấy, vector sau cắt enzym có băng xuất hiện, băng có kích thước nhỏ (khoảng 2,2kb) đoạn Nus-tag băng có kích thước lớn (khoảng 5kb) vector pET43b mở vòng loại bỏ Nus-tag (hình 3.4) Băng vector cắt thơi gel để tinh chuẩn bị cho ligation Nguyễn Thị Bích 30 K18.CNSH.11-04 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp M Vector Nus-tag Hình 3.4 Loại bỏ Nus-tag plasmid pET43b cắt kết hợp enzym hạn chế 1: pET43b cắt NdeI-XhoI; 2: pET43b không cắt M: Thang DNA chuẩn Thu nhận pel từ pJET/pel : Gen biểu pel cắt từ pJET/pel enzym NdeI XhoI Sản phẩm tách phân tích điện di agarose sau thu kích thước 1,2kb để gắn vào vector biểu (hình 3.5) pel (1,2 kb) Hình 3.5 Kiểm tra gen pel điện di agarose 1: DNA marker; 2: mẫu gen pel cắt từ pJET/pel Nguyễn Thị Bích 31 K18.CNSH.11-04 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 3.2.2 Gắn pel với vector pET43.1b biến nạp vào E.coli BL21 Vector pET43b sau xử lý với NdeI-XhoI ghép nối với gen pel nhờ xúc tác T4 DNA ligase mô tả phần phương pháp Sản phẩm ghép nối biến nạp vào tế bào E coli DH10b sau chọn lọc mơi trường có chứa kháng sinh ampicilline Những tế bào biến nạp plasmid có khả sinh trưởng mơi trường LB có kháng sinh Ampiciline Kết biến nạp thu khoảng 20 thể biến nạp đĩa, điều chứng tỏ hiệu phản ứng lai ghép thi nghiệm biến nạp thành công Các thể biến nạp sử dụng để tách chiết plasmid cho thí nghiệm phân tích gen Hình 3.6 Kết biến nạp vector biểu pET43B/pel vào tế bào E Coli BL21 3.2.3 Kết tách chiết plasmid, kiểm tra enzym giới hạn Sau biến nạp, tế bào vi khuẩn nhận plasmid sinh trưởng mơi trường chọn lọc, lý thuyết phần lớn plasmid đóng vịng gắn với gen chèn (pel) Trong thực tế có số plasmid khơng mang gen bị đào thải lý đó, cần thiết phải phân tích plasmid để tìm thể biến nạp mang plasmid có gen chèn pel Để thực thí ghiệm này, số thể biến nạp mô tả mục 3.2 nuôi lắc mơi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh Nguyễn Thị Bích 32 K18.CNSH.11-04 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp ampicilin 370C qua đêm để tách chiết plasmid Plasmid sau tách mô tả phần phương pháp cắt enzym giới hạn NdeI XhoI để kiểm tra xem có đoạn gen chèn hay khơng Sau cắt plasmid với enzym giới hạn 370C, sản phẩm phân tách điện di gel agarose 0,8% để xem có plasmid pET43.1b đoạn gen chèn hay khơng Kết cho thấy mẫu có băng vector khoảng kb băng DNA 1,2 kb kích thước gen pel Điều chứng tỏ gen pel chèn vào vector pET43.1b (hình 3.7) M Vector (5 kb) pel (1,2 kb) Hình 3.7 Kiểm tra pET43.1b-pel enzyme giới hạn 1-2: pET43.1b-pel cắt NdeI XhoI; M: DNA marker 3.2.4 Giải trình tự gen pel Để biết xác đoạn gen tách dịng có phải pel hay không, plasmid mang đoạn gen 1,2 kp chọn để đọc trình tự máy đọc trình tự tự động Kết đọc trình tự gen cho thấy plasmid pET43.1b mang đoạn gen có độ dài 1,2 kb kích thước gen pel nhân lên PCR, dịch mã sang protein trình tự cho khung đọc mở protein Phân tích trình tự gen phần mền BLAST cho thấy trình tự gen giống 100% với trình tự gen pel cơng bố ngân hàng gen (hình 3.7) Điều chứng tỏ gen pel thiết kế thành cơng vào vector pET43.1b Nguyễn Thị Bích 33 K18.CNSH.11-04 Viện Đại học Mở Hà Nội Query Sbjct 1193 Query 61 Sbjct 1133 Query 121 Sbjct 1073 Query 181 Sbjct 1013 Query 241 Sbjct 953 Query 301 Sbjct 893 Query 361 Sbjct 833 Query 421 Sbjct 773 Query 481 Sbjct 713 Query 541 Sbjct 653 Query 601 Sbjct 593 Query 661 Sbjct 533 Query 721 Sbjct 473 Query 781 Sbjct 413 Query 841 Sbjct 353 Query 901 Sbjct 293 Query 961 Khóa luận tốt nghiệp GTGCAAAAACATCCTCGCACTGTCGTATTTGCGGTATCGGGTGTGATCAAATTGGAAGGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGCAAAAACATCCTCGCACTGTCGTATTTGCGGTATCGGGTGTGATCAAATTGGAAGGG GAACTTAAAATATCTCATGGTAATATAACAATCGCGGGGCAAAGTTCGCCAGGTGGGATT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAACTTAAAATATCTCATGGTAATATAACAATCGCGGGGCAAAGTTCGCCAGGTGGGATT 60 1134 120 1074 GCCATTGTTGGTGCTCCTGTGACGGTCTCATCCGCAGATAATGTGATTATCCGCTATATG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCCATTGTTGGTGCTCCTGTGACGGTCTCATCCGCAGATAATGTGATTATCCGCTATATG 180 CGCTTTCGCTTAGGCACATTTGGCTATGCTGATGATTCATTAACGGTGCGTAATAGTGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGCTTTCGCTTAGGCACATTTGGCTATGCTGATGATTCATTAACGGTGCGTAATAGTGAG 240 AATGTCATTATTGATCATTGTTCATTGAGTTGGTCGGTGGATGAAAGCGCGAGCTTTTAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AATGTCATTATTGATCATTGTTCATTGAGTTGGTCGGTGGATGAAAGCGCGAGCTTTTAT 300 AATAACCATAACTTTACGTTACAAGATTCAATTATTTCACATAGTTTAAGCCATTCAATT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AATAACCATAACTTTACGTTACAAGATTCAATTATTTCACATAGTTTAAGCCATTCAATT 360 CACCCTAAAGGCGATCATGGTTATGGTGGCATTTGGGGCGGGGTAAATGCGAGCTTTATT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CACCCTAAAGGCGATCATGGTTATGGTGGCATTTGGGGCGGGGTAAATGCGAGCTTTATT 420 1014 954 894 834 774 AATAATATAATTGCCAATCATGCCAGTAGAACTCCTAGGCTCAATGGTCATAGGCTAAAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AATAATATAATTGCCAATCATGCCAGTAGAACTCCTAGGCTCAATGGTCATAGGCTAAAA 480 TCACCGTATTCACAAAATGAAGAGTTTGTTGAGCTTATCAATAATATTATTTTTAACTGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCACCGTATTCACAAAATGAAGAGTTTGTTGAGCTTATCAATAATATTATTTTTAACTGG 540 GGACATAATAATGTTTATGGATCAGAAAATGGTCGCTTTAACTTGATTAATAATTACTAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGACATAATAATGTTTATGGATCAGAAAATGGTCGCTTTAACTTGATTAATAATTACTAT 600 AAGCCGGGTAAAGCAAGTAAGATCATGCAGTTTTGCTTATATTTGGTATTCCCCCAGAGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGCCGGGTAAAGCAAGTAAGATCATGCAGTTTTGCTTATATTTGGTATTCCCCCAGAGA 660 TCAAAAGAAAATCAGGCATATATTATGGGTAATGTACTGGAGAATAACCCACAACTGACT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCAAAAGAAAATCAGGCATATATTATGGGTAATGTACTGGAGAATAACCCACAACTGACT 720 GAGCATAATTATTTAGGTGTAAATTATCGCAAAGCGGTTAAAGCAAAACGCACTATTAGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAGCATAATTATTTAGGTGTAAATTATCGCAAAGCGGTTAAAGCAAAACGCACTATTAGT GATGAAAATAGCCAGTGGTTAAGTGATCAAGCAATCATTACATCACCCATGCAAACAACG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GATGAAAATAGCCAGTGGTTAAGTGATCAAGCAATCATTACATCACCCATGCAAACAACG 714 654 594 534 474 780 414 840 354 ATGGTTTATGTTAATGCAAAGCAAGCATTTAGTGATGCCATTAAGGGGCAACATATAGGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATGGTTTATGTTAATGCAAAGCAAGCATTTAGTGATGCCATTAAGGGGCAACATATAGGT 900 GCAAGTCGTAATGCACATGGCTATTTCCATGACAGTATTGATACGCTTGTTTATCAACAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCAAGTCGTAATGCACATGGCTATTTCCATGACAGTATTGATACGCTTGTTTATCAACAG 960 CTCACTGATAGTGTCACGATAAAGAAAAATGGTTTGATTGATCATGAGTTTGAGCTAATT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 1020 Nguyễn Thị Bích 34 294 234 K18.CNSH.11-04 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Sbjct 233 CTCACTGATAGTGTCACGATAAAGAAAAATGGTTTGATTGATCATGAGTTTGAGCTAATT 174 Query 1021 1080 Sbjct 173 GGTAATTGGGATGCATATAAACAGGAATTTACAGGGGCTCCCGCAATCGTTGATGCTAAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGTAATTGGGATGCATATAAACAGGAATTTACAGGGGCTCCCGCAATCGTTGATGCTAAT Query 1081 Sbjct 113 Query 1141 Sbjct 53 GAAGATGGTGTTGCGGATGACTGGTTCAAACAGCATCAGCCGCAATTAAAAAATGCAACT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAAGATGGTGTTGCGGATGACTGGTTCAAACAGCATCAGCCGCAATTAAAAAATGCAACT ACAGCACAGGTTTTGCAGCAGTACTTAAATTCACTTAGCAACAAAGAAAGTAA ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACAGCACAGGTTTTGCAGCAGTACTTAAATTCACTTAGCAACAAAGAAAGTAA 114 1140 54 1193 Hình 3.8 : So sánh trình tự nucleotid gen pel với trình tự nucleotid gen pel đa đƣợc công bố ngân hàng gen Nguyễn Thị Bích 35 K18.CNSH.11-04 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp CHƢƠNG : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Đã nhân thành công gen pel từ vi khuẩn ưa lạnh Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505 PCR - Đã tách dòng gen E coli vector tách dòng pJET1.2 - Đã thiết kế thành công vector biểu pET43.1b-pel mang gen pel 4.2 Kiến nghị Sử dụng vector pET43.1b-pel biến nạp vào chủng E coli BL21 DE3 để biểu enzyme pectinase cho mục đích nghiên cứu tính chất enzym Nguyễn Thị Bích 36 K18.CNSH.11-04 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp CHƢƠNG TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt : Công nghệ chế biến bã đậu nành tạo chế phẩm dinh dưỡng giàu chất xơ“, 2008 Lê Hồng Phú, Đại học Bách khoa Thành phố Hồ Chí Minh,“ Tổng hợp enzyme pectinase cellulase từ vi khuẩn Aspergillus niger sử dụng sản phẩm sinh học biến vỏ cà phê thành thức ăn gia súc“, 2007 Lê Ngọc Tú ( chủ biên) (2001), Hóa học thực phẩm, Nxb Khoa học kỹ thuật Hà Nội Lê Ngọc Tú ( chủ biên) (2002), Hóa sinh cơng nghiệp, Nxb Khoa học kỹ thuật Hà Nội Tôn Nữ Minh Nguyệt Đào Văn Hiệp, 2006 “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sấy phun sản xuất bột chanh dây” Tạp chí phát triển KH CN, (4) p 69-75 Trần Thị Thanh (2001), Công nghệ sinh học, Nxb Giáo dục Tài liệu nƣớc Albersheim P., Kilias U (1962), “Study relating to the purification and properties ò pectin transeliminase”, Arhives ò Biochemistry and Biophysics,97-107 Benrnfeld P (1955), Amylases α and β In: Colowick SP, Kaplan NO (eds) Methods in enzymology Academic, New York, 149-158 Buchert, J., and Pere J, “Scouring of cotton with pectinases, proteases and lipases”, Textile Chemist and Colorist & American Dyestuff Reporter, 31(5), 48- 52 (2000) 10 Castelien, J M and a l et (1976) Lebensmittel-Wissencshaft und technolgie 9: 277 11 Corsaro, M; Lanzetta, R.; Parrilli, E.; Parrilli, M and Tutino, M L 2001 "Structural Nguyễn Thị Bích investigation on the 37 lipooligosaccharide fraction of K18.CNSH.11-04 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp psychrophilic Pseudoalteromonas haloplanktis TAC 125 bacterium." Eur J Biochem, 268: 5092-5097 12 Danielle Biscaro Pedrolli, Alexandre Costa Monteiro, Eleni Gomes, Eleonora Cano Carmona (2009), “Pectin and pectinase: production, characterization and industrial application ò microbial pectinolytic enzymes”, The Open Biotechnology Journal,3,9-18 13 Etters, J.N., Husain P A, and N.K Lange, “Alkaline pectinase: an ecofriendly approach to cotton preparation”, Textile Asia, 83-86 (1999) 14 Feller, G and C Gerday (1997) "Psychrophilic enzymes: molecular basis of cold adaptation." Cell Mol Life Sci 53(10): 830-41 15 Feller, G and C Gerday (2003) "Psychrophilic enzymes: hot topics in cold adaptation." Nat Rev Microbiol 1(3): 200-8 16 Gauthier, G., et al 1995 "Phylogenetic analysis of the genera Alteromonas, Shewanella, and Moritella using genes coding for small-subunit rRNA sequences and division of the genus Alteromonas into two genera, Alteromonas (emended) and Pseudoalteromonas gen nov., and proposal of twelve new species combinations." International Journal of Systematic Bacteriology, 45(4): 755-61 17 Loppes, R., N Devos, et al (1996) "Effect of temperature on two enzymes from a psychrophilic Chloromonas (Chlorophyta)." J Phycol 32: 276-278 18 Macmillian J.D and Phaff H.J (1966), “Exopolygalacturonate lygase from Clotridium multifermentans”, Methods in enzymology : 632 – 635 19 Macmillian J.D., Phaff H.J., Vaughn R.H (1964), “Purification and properties of polygalacturonic acid- trans- eliminase produced by Clotridium multifermentans”, Biochemistry 3: 564 – 572 20 Ohgiya, S (1999) "Biotechnology of enzymes from cold-adapted microorganisms In: Margesin, R and Schinner F (Eds.) Biotechnology of enzymes from cold-adapted microorganisms." Spriger: 17-34 21 Okamato K (1963), “Agricultural and Biological chemistry”, 27 : 596 Nguyễn Thị Bích 38 K18.CNSH.11-04 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 22 Okamato K (1964), Berichte des Ohara institut ful Landwirtschaftliche biologie, Okayama Univetsity”, 12 : 115 23 Seagull R W., Oliveri V., Murphy K., Binder A., Kothari S (2000), “Cotton fiber growth and development”, J Cotton Sci (4): 97-104 24 Searle-van Leeuwen M J F., Vincken J P (1996), “Acetyl esterases of Aspergillus niger: purification and mode of action on pectins” In: Visser J, Voragen A G J., editors Pectins and pectinases, Vol 14 Amsterdam, The Netherlands: Elsevier Science: 793-798 25 Shevchik V E., Hugouvieux-Cotte-Pattat N (1997), “Indentification of a bacterial pectin acetyl esterase in Erwinia chrysanthemi 3937”, Mol Microbiol 24(6): 285 – 301 26 Somogyi M (1952), Journal of Biological Chemistry 195: 19 – 23 27 Whitaker J R (1990), “Microbial pectolitic enzyme In: William M Fogerty and Gatherine T Kelly (eds)”, Microbial anzymes and biotechnology, 2nd edition Nguyễn Thị Bích 39 K18.CNSH.11-04