Thiet ke vector bieu hien gen ma hoa legumain l13zk 20130427101915 15188 zb7q

Page |1 MỞ ĐẦU Bệnh ung thư coi chứng bệnh nan y nguy hiểm phát với số ca mắc bệnh ngày gia tăng giới Khơng giả thuyết cho rằng, ung thư bệnh phát sinh lối sống, lối sinh hoạt thiếu khoa học người Song phải ung thư bệnh đại? Với số lượng bệnh nhân phát mắc bệnh ung thư số ca tử vong ung thư tăng đột biến vài năm gầm đây, ung thư xem bệnh xã hội thời đại Ts.Roaslie David – trường đại học LOVE Manchester – Anh Ts.Michael Zimmermann – trường đại học Villanova nghiên cứu khẳng định: sống xã hội thời đại góp phần đẩy mạnh hình thành nhiều yếu tố gây ung thư Theo dự báo nhà khoa học Anh, kỷ 21, ung thư tiếp tục bệnh có tỉ lệ tử vong cao giới Khoa học chưa thể tìm cách điều trị dứt điểm trường hợp khối u ác tính, ung thư cẫn xem bệnh nan y khó chữa Theo thống kê Tổ chức ung thư Liên hợp quốc, tới năm 2030, số trường hợp mắc ung thư giới tăng gấp nhiều lần số số trường hợp tử vong ung thư nhiều gấp đôi số thống kê gới vào năm 2008 Theo ước tính này, số người bị tử vong ung thư lên tới khoảng 13,2 triệu người vào năm 2030 Hiệp hội nghiên cứu ung thư quốc tế - IARC cho biết, khoảng 21,4 triệu trường hợp mắc ung thư phát vào năm 2030 tập trung chủ yếu nước nghèo, nơi có mức sống thấp tỉ lệ mắc bệnh cao giới Lý giải cho việc số ca tử vong ung thư tăng lên tương lai, nhà khoa học cho rằng, điều kiện sống thay đổi, thói quen sinh hoạt, kèm theo thay đổi khí hậu tồn cầu dẫn tới khắc nghiệt thời tiết, môi trường bị ô nhiễm nặng nề Thiết kế vector biểu gen mã hóa legumain Page |2 Nồng độ phân tử phóng xạ tự mơi trường tăng cao khiến cho nguy tiếp xúc với lượng phóng xạ gia tăng điều kiện thuận lợi cho xuất bệnh nhân ung thư Ung thư vấn nạn nghiêm trọng người nên việc điều trị ung thư quan trọng chương trình Phịng chống ung thư quốc gia Muốn nâng cao chất lượng điều trị, khơng hồn chỉnh kĩ thuật phương pháp, thiết bị, mà cịn phải có kinh nghiệm, kiến thức, chẩn đốn xác, xây dựng phác đồ điều trị cho bệnh nhân cách hợp lý Các phương pháp điều trị như: LOVE - Phương pháp điều trị chỗ: Phẫu thuật tia xạ, có khả điều trị triệt để bệnh giai đoạn sớm, tổn thương ung thư khu chỗ vùng - Các phương pháp điều trị tồn thân: Điều trị hóa chất, điều trị nội tiết, điều trị miễn dịch… - Ngoài phương pháp điều trị có nhiều nhà nghiên cứu ứng dụng enzyme điều trị ung thư ví dụ như: Chuyển gen mã hóa enzyme để chuyển hóa thuốc chuyên dụng thành chất gây chết tế bào ung thư, sử dụng kháng thể có gắn enzyme chuyển hóa thuốc chuyên dụng thành chất gây độc tế bào Legumain nhiều enzyme ứng dụng nhiều y học Legumain biểu cao số loại khối u, chẳng hạn tuyến tiền liệt, đại tràng ung thư vú Ngồi ra, cịn biểu cao ung thư đại tràng Do chúng tơi tiến hành thực đề tài “Thiết kế vector biểu gen mã hóa legumain” Nhằm mục đích sản xuất legumain với lượng lớn để phục vụ cho y học Thiết kế vector biểu gen mã hóa legumain Page |3 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung Enzyme 1.1.1 Định nghĩa Trong thể sống (các tế bào) ln ln xảy q trình trao đổi chất Sự trao đổi chất ngừng sống khơng tồn Quá trình trao đổi chất tập hợp quy luật nhiều phản ứng hóa học khác Các phản ứng hóa học phức tạp có liên quan chặt chẽ với nhauLOVE điều chỉnh lẫn enzyme hợp chất protein xúc tác cho phản ứng hóa học Chúng có khả xúc tác đặc hiệu phản ứng hóa học định đảm bảo cho phản ứng xảy theo chiều hướng định với tốc độ nhịp nhàng thể sống.[1] Chúng có hầu hết loại tế bào thể sống Chính tác nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme gọi chất xúc tác sinh học (biocatalysators) nhằm để phân biệt với chất xúc tác hóa học.[2] 1.1.2 Lịch sử nghiên cứu Enzyme Do Enzyme học coi cột sống hóa sinh học nên phần lớn nghiên cứu hóa sinh từ trước đến liên quan nhiều đến enzyme Sự phất triển enzyme chia thành giai đoạn [2] - Giai đoạn 1: trước kỷ thứ XVII - Giai đoạn 2: từ kỷ XVII đến nửa đầu kỷ XX - Giai đoạn 3: từ kỷ XIX đến 30 năm đầu kỷ XX - Giai đoạn 4: từ ngững năm 30 kỷ XX đến 1.1.2.1 Giai đoạn Thiết kế vector biểu gen mã hóa legumain Page |4 Trước kỷ XVII người ta biết sử dụng trình enzyme đời sống song có tính chất kinh nghiệm thực tế thông qua hoạt động vi sinh vật Đó q trình lên men rượu, muối dưa, làm tương nước chấm… Ở thời kỳ người ta chưa hiểu chất enzyme trình lên men…[2] 1.1.2.2 Giai đoạn Ở giai đoạn nhà bác học tiến hành tìm hiểu chất trình lên men Thời kỳ khái quát tượng lên men LOVE tượng phổ biến sống enzyme yếu tố gây nên chuyển hóa chất q trình lên men Vào năm 1600 kỷ XVII, Jan Baptista Van Helmont (Hà Lan, 1577 – 1644) người tìm hiểu sâu chất trình lên men Van Helmont nhận thấy chất tiêu hóa chuyển hóa hóa học thức ăn giải thích chế với so sánh với q trình lên men rượu Danh từ ‘ferment’ Van helmont dùng để tác nhân gây chuyển biến chất trinh lên men rượu Vào nửa cuối kỷ thứ XVIII, nhà tự nhiên học người Pháp Réaumur nghiên cứu chất tiêu hóa Ơng nghiên cứu vật thí nghiệm chim quạ đen Đầu kỷ XIX, nhà nghiên cứu tách chất gây trình lên men Năm 1814 Kirchoff, viện sỹ Saint Petercburg phát amylase mầm đại mạch Năm 1833, hai nhà khoa học người Pháp Payen Pessoz chứng minh chất có hoạt động phân giải tinh bột thành đường tách dạng bột Tiếp người ta tìm tách nhiều Enzyme khác Enzyme phân giải protein dich tiêu hóa dày Pepsin Thiết kế vector biểu gen mã hóa legumain Page |5 Sau đó, lý thuyết xúc tác đời Năm 1835, nhà khoa học Berzelius (nhà hóa học Thụy Điển) có quan điểm cho tăng tốc độ phản ứng tượng xúc tác Đây quan điểm Song tiếc cho nhà khoa học coi chất xúc tác hoạt động “ lực sống” không theo điều khiển người Đây quan điểm tâm, siêu hình làm trì trệ phát triển khoa học ảnh hưởng sâu sắc đến phất triển nghành Enzyme học.[2] 1.1.2.3 Giai đoạn LOVE Giai đoạn từ kỷ XIX đến 30 năm đầu kỷ XX Ở giai đoạn số lượng lớn Enzyme dạng hòa tan tách chiết Trong thời kỳ này, có hai trường phái đấu tranh nhau: trường phái Pasteur – nhà bác học vĩ đại người Pháp trường phái Liebig – nhà bác học tiếng người Đức *Trường phái Pasteur: Năm 1856 Pasteur đề cập đến chất q trình lên men Ơng cho tách Enzyme khỏi tế bào Tác dụng tính chất Enzyme gắn liền với sống tế bào trình lên men rượu kết hoạt động sống tế bào nấm men kết tác dụng Enzyme Ông tiến hành thí nghiệm nhận thấy dung dịch hữu cơ, ví dụ dung dịch glucose để bình khử trùng khơng xảy q trình lên men rượu Chính nhờ suy nghĩ ấy, Pasteur chia Enzyme thành hai loại: “ Enzyme có tổ chức” “Enzyme khơng có tổ chức” Theo ông, “Enzyme có tổ chức” Enzyme tách khỏi tế bào, tách chúng tách dụng Các “ Enzyme khơng có tổ chức” Enzyme có dịch tiêu hóa (ví dụ Pepsin dày, amylase tuyến nước bọt, mầm thóc…) Quan điểm sai lầm Pasteur thống trị nghành Enzyme học thời gian dài Thiết kế vector biểu gen mã hóa legumain Page |6 Năm 1878 Kuhne đề nghị dùng danh từ “ferment” để gọi “Enzyme có tổ chức” Cịn “Enzyme” để gọi “Enzyme khơng có tổ chức” Danh từ Enzyme xuất phát từ * Trường phái Liebig Chống lại quan điểm Pasteur, Liebig (trước có Berzeliu) cho khơng có hoạt động tế bào vi sinh vật có q trình lên men Điều có nghĩa ơng coi Enzyme chất hóa học gây lên hiệu tương tự chất xúc tác, tác dụng ngồi tế bào, khơng phụ thuộc vào hoạt động sống vi sinh vật LOVE Nhưng năm 1871 Liebig thất bại thực nghiệm khơng chứng minh quan điểm Các thí nghiệm tiến hành cách lấy dịch chiết từ tế bào nấm men nghiền nát, khơng có tác dụng gây men rượu Cũng vào năm 1871 Mannatxein bác sỹ gười Nga dùng cát thạch anh nghiền tế bào nấm men thu dịch chiết không chứa tế bào có khả biến đổi đường thành rượu Nhưng quan sát không ý tới Chính vậy, quan điểm siêu hình Pasteur hạn chế nhiều phát triển nghành Enzyme học Đến năm 1897, H Buchner – nhà khoa học người Đức nhận dịch chiết nấm men cách phân hủy tế bào hoàn thiện Trong thí ngiệm này, tế bào nấm men nghiền nát hoàn toàn với bột thủy tinh, sau ép áp suất cao Dịch chiết thu khơng chứa tế bào có khả gây q trình lên men (chuyển hóa từ đường glucose thành rượu) Điều chứng tỏ q trình lên men kết hoạt động sống tế bào nấm men mà kết Enzyme vốn có tế bào Do đó, quan điểm sai lầm Enzyme hồn tồn bị xóa bỏ Cũng từ khơng có phân biệt nội dung thuật ngữ “ferment” “enzyme” Có thể nói cơng trình Buchner đánh dấu bước ngoặt quan trọng lịch sử phát triển Enzyme học Thiết kế vector biểu gen mã hóa legumain Page |7 Từ có nhiều Enzyme thể sống tìm Vì việc phân loại gọi tên Enzyme cách thống cần thiết Năm 1883, Duyclo nhà bác học người Pháp đề nguyên tắc phân loại Enzyme theo chất (substrate) chúng biến đổi thêm đuôi tận “ase” vào Tuy vậy, thực tế tồn nhiều ngoại lệ thuật ngữ, ví dụ tên gọi Enzyme pepsin, trypsin, catalase trước dùng Giai đoạn quan trọng thời kì cơng trình nhà bác học vĩ đại người Đức E Fisher Ông đặt móng cho khái niệm đại LOVE tính đặc hiệu Enzyme, tương tác không gian Enzyme chất Giả thuyết tiếng ông Enzyme chất kết hợp với “ổ khóa với chìa khóa” Rồi nghiên cứu Bach Palladin Enzyme oxy hóa khử tạo nên sở cho việc xây dựng học thuyết oxy hóa khử sinh học Trong thời gian người ta phát tính tác dụng thuận nghịch Enzyme (Đanilepsski, 1894), coenzyme phát (Harden Young, 1906) Họ người khám phá dịch chiết tế bào nấm men chứa hai loại chất cần thiết cho trình lên men “zymase” “coenzyme”.[2] 1.1.2.4 Giai đoạn Bản chất hóa học Enzyme xác định đắn từ sau kết tinh Enzyme Năm 1926 nhà khoa học người Mỹ trẻ tuổi Sumner (39 tuổi) thành công việc chứng minh protein kết tinh từ hạt đậu tương chất giống Enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân ure, Enzyme kết tinh Năm 1930 Mỹ Northrop tách pepsin dạng tinh thể, vào năm 1931 Northrop Kunitz tách trypsin dạng tinh thể Các cơng trình Sumner Northrop mở chương lịch sử phát triển Enzyme học đại Những kết đạt khẳng Thiết kế vector biểu gen mã hóa legumain Page |8 định cách dứt khoát chất Enzyme protein Phải nói chất hóa học phần lớn Enzyme protein định nghĩa có tính chất kinh điển Enzyme phải xem lại từ sau phát T.R Cech năm 1981 Cech phát RNA có hoạt tính xúc tác Enzyme gọi ribozyme Ribozyme xúc tác cho trình chuyển hóa tiền chất RNA thơng tin (pre – mRNA) thành m – RNA Do Enzyme khơng thiết phải protein, phát minh có ý nghĩa lớn Tác giả phát minh giải Nobel năm 1989 Từ kỷ XX, thời gian gần enzyme học phát triển LOVE mạnh Nhờ ứng dụng phương pháp mới, đại như: điện di, sắc ký, quang phổ, đồng vị phóng xạ… cho phép nghiên cứu cấu trúc chế tác dụng nhiều Enzyme điều hịa hoạt đơng Enzyme tế bào Năm 1969 người ta tổng hợp Enzyme ribonuclease (Denkewalter Hirschmann, Gutte Merrifielad) Đây Enzyme gồm 124 amino acid, bền với nhiệt, đun nóng lên 80ºC với thời gian ngắn Trong chục năm cuối kỷ XX đấu kỷ XXI, người ta ý nghiên cứu việc ứng dụng Enzyme Người ta tận dụng nguyên liệu giàu Enzyme để tách Enzyme, dung chế phẩm Enzyme để chế biến nguyên liệu khác sử dụng vào mục đích khác Ở nhiều nước hình thành ngành cơng nghệ Enzyme, hàng năm sản xuất hàng trăm chế phẩm Enzyme để phục vụ cho nghành sản xuất khác cho y học.[2] 1.1.3 Phân loại Enzyme Mục đích phân loại enzyme để nhấn mạnh cách xác tổng quát, mối quan hệ điều giống loại enzyme 1.1.3.1 Các lớp enzyme Tiểu ban enzyme (The enzyme Commission EC) tổ chức Hội hóa sinh quốc tế (The internationl Union of Biochemistry, IUB) đưa cách phân loại thống dựa loại phản ứng chế phản ứng Theo Thiết kế vector biểu gen mã hóa legumain Page |9 cách phân loại enzyme chia làm sáu lớp lớn đánh số từ đến Các số thứ tự cố định cho lớp Sáu lớp enzyme theo phân loại quốc tế gồm có:  Oxydoreductase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa - khử Trong nhóm có tất enzyme có tên thơng thường biết dehydrogenase, oxydase, cytochromreductase peroxydase Trong phản ứng chúng xúc tác xảy ta vận chuyển hydrogen, chuyển electron, oxy hóa oxy phân tử, hydrogen peroxide chất oxy hóa khác LOVE  Transferase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị Các transferase chất gốc mà chúng vận chuyển tham gia vào trình trao đổi chất khác Trong lớp transferase bên cạnh transaminase methyltransferase cịn có kinase khác (xúc tác chủ yếu cho vận chuyển gốc phosphate từ hợp chất cao tới chất khác, phần lớn enzyme trước gọi mutase vài loại synthetase, ví dụ enzyme tổng hợp DNA RNA)  Hydrolase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân Trong lớp có enzyme phân giải este (ví dụ lipid), glucozid, amid, peptid, protein  Lyase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng phân cắt không cần nước, loại nước tạo thành nối đôi kết hợp phân tử nước vào nối đơi Thuộc vào lớp có enzyme gọi hydratase, aldolase, decarboxylase số desaminase  Ligase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng tổng hợp có sử dụng liên kết giàu lượng ATP v.v  Isomerase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa Tính chúng xúc tác cho phản ứng chuyển nhóm khác bên phân tử Trong lớp có enzyme chuyển hóa đồng phân hình học đồng phân quang học (như alaninracemase) mà enzyme xúc tác cho phản ứng ví dụ chuyển hóa aldose thành cetose (glucosophosphate isomerase, trước Thiết kế vector biểu gen mã hóa legumain P a g e | 10 gọi phosphohexoisomerase) biến đổi vị trí liên kết este bên phân tử (ví dụ phosphoglucomutase).[2] 1.1.3.2 Các phản ứng enzyme * Lớp enzyme oxydoreductase Lớp enzyme gồm 14 lớp phụ, xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử Phản ứng oxy hóa tương ứng với tách điện tử khỏi cơLOVE chất, phản ứng khử phản ứng thu nhận điện tử thường kèm với Q trình tổng qt biểu thị sau: Akh Box + e AKh + Box ↔ Aox + e Bkh ↔ Aox + Bkh ↔ Trong AKh chất A dạng khử, Aox chất A dạng oxy hóa, e điện tử, Box chất B dạng oxy hóa, B Kh chất B dạng khử Các enzyme thuộc lớp enzyme thành phần có coenzyme NAD+, NADP+, FMN, FAD, - Dehydrogenase: xúc tác cho phản ứng tách H trực tiếp từ chất chuyển đến NAD+ NADP+, FMN, FAD - Oxydase: Xúc tác cho trình chuyển điện tử đến oxy hoạt hóa oxy làm cho có khả kết hợp với proton có mơi trường - Oxygenase: xúc tác cho phản ứng kết hợp trực tiếp oxy vào phân tử hợp chất hữu (thường chất có vịng thơm) Có thể phân biệt hai loại: oxygenase hydroxylase Oxygenase xúc tác cho phản ứng kết hợp tồn phân tử oxy cịn hydroxylase kết hợp nửa phân tử oxy (thường dạng OH) vào hợp chất hữu Thiết kế vector biểu gen mã hóa legumain 10