Tách dòng và biểu hiện gen pigi trong escherichia coli tham gia sinh tổng hợp prodigiosin từ chủng vi khuẩn serratia marcesence

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI - LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã ngành: 8420201 ĐỀ TÀI TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN PIGI TRONG ESCHERICHIA COLI THAM GIA SINH TỔNG HỢP PRODIGIOSIN TỪ CHỦNG VI KHUẨN SERRATIA MARCESENCE Họ tên học viên: Lê Thị Tố Uyên Hướng dẫn khoa học: TS Đỗ Minh Trung HÀ NỘI - 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI - LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã ngành: 8420201 ĐỀ TÀI TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN PIGI TRONG ESCHERICHIA COLI THAM GIA SINH TỔNG HỢP PRODIGIOSIN TỪ CHỦNG VI KHUẨN SERRATIA MARCESENCE Họ tên học viên: Lê Thị Tố Uyên Hướng dẫn khoa học: TS Đỗ Minh Trung HÀ NỘI - 2020 LỜI CAM ĐOAN Là người tham gia trực tiếp thực nội dung thuộc đề tài trình bày luận văn Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn cơng trình nghiên cứu tơi với nhóm nghiên cứu thực chưa tác giả khác công bố luận văn, luận án chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng vào luận văn Luận văn sản phẩm khoa học đề tài mã số: ĐT.07.17/CNSHCB Học viện Quân y chủ trì Tác giả luận văn ( Ký tên) Lê Thị Tố Uyên LỜI CẢM ƠN Lời em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Thiếu tá TS Đỗ Minh Trung – Viện nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y người thầy tận tình hướng dẫn bảo em suốt trình học tập nghiên cứu để em hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn thầy cô, anh chị Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân - Học viện Quân y tạo điều kiện cho em suốt trình thực tập Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy cô Khoa Công nghệ sinh học, Trường đại học Mở Hà Nội trang bị cho em kiến thức tảng giúp đỡ em q trình hồn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè thân thiết quan tâm động viên em suốt thời gian học tập nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày 25 tháng năm 2020 Học viên Lê Thị Tố Uyên MỤC LỤC Trang DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung Prodigiosin: 1.1.1 Đặc điểm, cấu tạo prodigiosin 1.1.2 Sinh tổng hợp prodigiosin 1.1.3 Hoạt tính sinh học prodigiosin 1.1.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn 1.1.3.2 Hoạt tính kháng nấm 1.1.3.3 Hoạt tính ức chế ký sinh trùng 1.1.3.4 Hoạt tính ức chế chu kỳ tế bào 1.1.3.5 Hoạt tính ức chế miễn dịch 1.1.3.6 Hoạt tính chống tế bào ung thư 1.1.4 Ứng dụng prodigiosin 1.2 Tổng quan chủng vi khuẩn Serratia 1.2.1 S marcescens 1.2.2 Cơ chế tổng hợp prodigiosin 1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình tổng hợp prodigiosin 1.3 Tổng quan Escherichia coli 1.3.1 Đặc điểm hình thái 1.3.2 Cấu trúc vi khuẩn 1.3.3 Đặc tính ni cấy 1.3.4 Tính chất hóa sinh: 1.4 Tách dịng biểu gen 1.4.1 Tách dòng gen 1.4.2 Biểu gen 1.4.2.1 Các yếu tố điều hoà biểu gen 1.4.2.2 Biểu gen vi khuẩn Ecoli 1.5 Nguồn prodigiosin từ vi sinh vật biến đổi di truyền 1.5.1 Sản xuất prodigiosin in-vitro sử dụng enzyme chìa khoá tái tổ hợp i ii iii 4 5 6 7 14 16 16 16 18 19 19 19 21 22 22 23 24 24 25 28 31 1.5.2 Cải tạo chủng gốc cách biến nạp tăng gen mã hố enzyme chìa khố 1.6 Phương pháp thu nhận tinh prodigiosin 1.7 Tình hình nghiên cứu Prodigiosin CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu: 2.1.2 Các hóa chất sử dụng cho tách dịng biểu gen: 2.1.3 Thiết bị nghiên cứu 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Tách dòng gen 2.2.1.1 Tách chiết DNA tổng số 2.2.1.2 Khuếch đại trình tự vùng gen đích 2.2.1.3 Chuẩn bị tế bào khả biến 2.2.1.4 Tách dòng gen vector pJET1.2 2.2.1.5 Biểu gen đích vi khuẩn E coli 2.2.2 Tách chiết sơ hợp chất prodigiosin 2.2.3 Định lượng prodigiosin 2.2.4 Địa điểm nghiên cứu CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết ni cấy hoạt hóa định danh chủng vi khuẩn Serratia sp 3.1.1 Ni cấy hoạt hóa chủng vi khuẩn Serratia sp 3.1.2 Kết định danh chủng vi khuẩn Serratia sp 3.2 Tách dòng, biểu gen pigI E coli 3.2.1 Nhân vùng gen pigI 3.2.2 Tách dòng pigI vector pJET1.2 3.2.2.1 Kết biến nạp 3.2.2.2 Kết đọc trình tự vector tái tổ hợp 3.2.3 Biểu gen pigI E coli: 3.2.3.1 Tách dòng pigI 3.2.3.2 Kết đọc trình tự 3.2.3.3 Biểu gen pigI E coli KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 33 33 36 36 36 36 40 41 41 41 41 43 43 44 51 51 52 53 53 53 55 59 59 59 59 60 62 62 64 67 71 71 72 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ DMSO: Dimethyl sulfoxide High Performance Liquid Chromatography – Sắc ký lỏng hiệu cao Inhibitors Apoptosis Protein - Protein ức chế trình chết theo chu trình 2-methyl-3-n-amyl-pyrrole 4-methoxy-2,2′-bipyrrole-5-carbaldehyde Optical Density – Mật độ quang học Phosphate buffer saline – Đệm muối phosphat Prodigiosin Thin Layer Chromatography – Sắc ký mỏng HPLC: IAP: MAP: MBC: OD: PBS: PG: TLC: DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Sinh tổng hợp sản phẩm tự nhiên P putida kỹ 31 thuật biểu gen dị loài (Anita Loeschcke et al., 2015) Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi sử dụng 37 Bảng 3.1 Tuyển chọn chủng Serratia sp sinh tổng hợp prodigiosin 55 Bảng 3.2 Mức độ tương đồng trình tự gen pigI chủng Serratia 62 sp SM với chủng tham chiếu DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc prodigiosin Hình 1.2 Bốn đường cảm ứng apotosis khác gây 11 prodiginies [16] Hình 1.3 Quá trình tổng hợp prodigiosin [11] Hình 1.4 Mơ hình cấu trúc operon Lac Error! 18 Bookmark not 25 defined.Hình 1.5 Operon Lactose hoạt động 27 Hình 1.6 So sánh cấu trúc nhóm gen sinh tổng hợp prodigiosin chủng vi 28 khuẩn Serratia sp ATCC 39006 Serratia marcescens ATCC 274 (Williamson et al., 2006) Hình 2.1 Vector tách dịng pJET1.2/blunt 36 Hình 2.2 Máy đo quang phổ DTX 880 - Beckman Coulter, Mỹ (A); 52 Đường chuẩn xác định hàm lượng Prodigiosin (B) Hình 3.1 Hình ảnh màu sắc chủng vi khuẩn Serratia sp Q1, Serratia 53 sp Q2, Serratia sp Q3 môi trường NA sau 18-24 nuôi cấy 28°C Hình 3.2 Hình thái tế bào chủng Serratia sp Q1, Serratia sp Q2, Serratia 54 sp Q3 kính hiển vi quang học Hình 3.3 Điện di DNA tổng số (A) 56 Hình 3.4 Sản phẩm PCR (B) 56 Hình 3.5 Sản phẩm cắt plasmid XhoI XbaI (C) 57 Hình 3.6 Độ tương đồng chủng Serratia sp Q1, Serratia sp 58 Hình 3.7 Cây phân loại chủng S marcescens Q1, S marcescens Q2, S 58 marcescens Q3 với chủng S marcescens ngân hàng Genbank Hình 3.8 Ảnh điện di sản phẩm nhân gen pigI gel agarose 0,8%, 1: 59 Sản phẩm PCR nhân vùng gen pigI tinh sạch; M: Marker 1kb (Thermo) Hình 3.9 Ảnh điện di sản phẩm nhân gen pigI gel agarose 0,8%, 1- 8: Sản phẩm PCR nhân gen pigI từ tám dịng khuẩn lạc 60 Hình 3.10 Kết so sánh trình tự vùng gen pigI chủng Serratia sp 60 SM với trình tự chủng S marcescence WW4 mã số CP003959 Hình 3.11 Kết biến nạp cấu trúc pET22b_ pigI vào vi khuẩn E coli 63 Hình 3.12 Ảnh điện di sản phẩm cắt kiểm tra plasmid gel agarose 0,8% 64 Hình 3.13 So sánh trình tự gen pigI với trình tự gen chủng tham 66 chiếu S marcescence WW4 Hình 3.14 Ảnh điện di protein tổng số biểu E coli BL21 (DE3) gel polyacrylamide 10% 67 Kết phân tích trình tự chúng tơi khuếch đại thành cơng trình tự gen pigI chủng Serratia sp Q1 (SM) (Hình 3.22) Khi so sánh trình tự pigI chủng S marcescence WW4, gen pigI phân lập từ chủng pigI tám vector tái tổ hợp giống có sai khác nucleotide vị trí 335 (A>G); 507 (A>G); 1286 (A>G); 1464 (C>T) Bên cạnh đó, so sánh với trình tự pigI ngân hàng GenBank (CP027798, CP027796, CP021984, CP003959, CP005927, CP016032, CP013046, CP016948, CP031316, AP019009, CP027300, CP018927 AJ833002), trình tự gen pigI chủng nghiên cứu có mức độ tương đồng cao so với trình tự gen pigI chủng tham chiếu khác Mức độ tương đồng lớn lên tới 99,7% so với chủng S marcescence CP027798, CP027796, CP021984 CP003959 nhỏ 97,6% so với chủng S marcescence AJ833002 (Bảng 3.2) Bảng 3.2 Mức độ tương đồng trình tự gen pigI chủng Serratia sp Q1 (SM) với chủng tham chiếu 3.2.3 Biểu gen pigI E coli: 3.2.3.1 Tách dòng pigI Sản phẩm nhân lại gen pigI với cặp mồi đặc hiệu gắn hai enzyme XhoIvà HindIII gắn vào pET22b Sau đó, vector tái tổ hợp biến nạp vào tế bào khả biến E coli BL21, chúng tơi thu nhiều khuẩn lạc đơn (Hình 3.11) Trong trình sinh trưởng E coli, plasmid nhân lên với số lượng lớn Để chọn plasmid mang gen pigI Các dòng tế bào E coli tái tổ hợp chọn lọc 62 môi trường có bổ sung kháng sinh tách chiết plasmid để kiểm tra có mặt gen pigI Sau thu sáu dòng mang vector tái tổ hợp, chúng tơi tiến hành cắt kiểm tra kích thước sản phẩm Hình 3.11 Kết biến nạp cấu trúc pET22b_ pigI vào vi khuẩn E coli Sau phân tích sáu dòng plasmid tái tổ hợp enzyme hạn chế XhoI HindIII, kết điện di cho thấy bảy dòng bị cắt làm đoạn: đoạn lớn có kích thước tương ứng với kích thước vector pET22b (~ 5,5 kb) 1,5 kb tương ứng với sản phẩm đoạn gen pigI (Hình 3.12) Bảy dịng plasmid chứa gen pigI phân lập từ chủng Serratia sp SM (ký hiệu dòng chọn pET22b_pigI_SM1 - SM7) đem đọc trình tự 63 Hình 3.12 Ảnh điện di sản phẩm cắt kiểm tra plasmid gel agarose 0,8% 1-6: Sáu dòng plasmid cắt hai enzyme giới hạn XhoI HindIII; M: Marker 1kb plus (NEB) 3.2.3.2 Kết đọc trình tự Kết đọc trình tự sáu dòng vector tái tổ hợp pET22b_pigI_SM1 – SM6 cho thấy trình tự pigI sáu dịng vector giống có chiều dài 1476 bp, khung dịch mã xác định mã hoá protein pigI gồm 491 acid amin ba mã kết thúc Khi so sánh với trình tự pigI chủng Serratia sp WW4 mã số CP003959, kết đọc trình tự cho thấy trình tự nucleotide đoạn chèn pigI phân lập từ Serratia sp Q1 (SM) khác với trình tự pigI WW4 vị trí 727 A>G dẫn đến thay đổi acid amin N>S Ngồi ra, cịn số vị trí sai khác nhiên khơng làm thay đổi acid amin (Hình 3.13) Do vậy, trình tự gen pigI thu không chứa đột biến lệch khung, đột biến tạo mã kết thúc sử dụng để biểu protein pigI CP003959_S.marcescens WW4 pET22b_pigI_Serratia sp._SM CP003959_S.marcescens WW4 pET22b_pigI_Serratia sp._SM 10 20 30 40 50 60 70 | | | | | | | | | | | | | | -ATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGGTCATCACCATCATCATCACGGGTCCCTGCAGGA M G H H H H H H G S L Q E 80 90 100 110 120 130 140 | | | | | | | | | | | | | | -GGAGAAGCCCAAGGAGGGTGTGAAGACAGAGAATGACCACATCAACCTGAAGGTGGCCGGGCAGGACGGC E K P K E G V K T E N D H I N L K V A G Q D G 150 160 170 180 190 200 210 | | | | | | | | | | | | | | 64 CP003959_S.marcescens WW4 pET22b_pigI_Serratia sp._SM TCCGTGGTGCAGTTCAAGATCAAGAGGCACACGCCGCTGAGCAAGCTGATGAAGGCCTACTGCGAGAGGC S V V Q F K I K R H T P L S K L M K A Y C E R CP003959_S.marcescens WW4 pET22b_pigI_Serratia sp._SM CP003959_S.marcescens WW4 pET22b_pigI_Serratia sp._SM CP003959_S.marcescens WW4 pET22b_pigI_Serratia sp._SM CP003959_S.marcescens WW4 pET22b_pigI_Serratia sp._SM CP003959_S.marcescens WW4 pET22b_pigI_Serratia sp._SM CP003959_S.marcescens WW4 pET22b_pigI_Serratia sp._SM CP003959_S.marcescens WW4 pET22b_pigI_Serratia sp._SM CP003959_S.marcescens WW4 pET22b_pigI_Serratia sp._SM CP003959_S.marcescens WW4 pET22b_pigI_Serratia sp._SM CP003959_S.marcescens WW4 pET22b_pigI_Serratia sp._SM CP003959_S.marcescens WW4 pET22b_pigI_Serratia sp._SM CP003959_S.marcescens WW4 pET22b_pigI_Serratia sp._SM CP003959_S.marcescens WW4 220 230 240 250 260 270 280 | | | | | | | | | | | | | | -AGGGCTTGTCAATGAGGCAGATCAGATTCAGGTTCGACGGGCAGCCAATCAATGAAACTGACACTCCAGC Q G L S M R Q I R F R F D G Q P I N E T D T P A 290 300 310 320 330 340 350 | | | | | | | | | | | | | | -ACAGCTGGAGATGGAGGACGAGGACACCATCGACGTGTTCCAGCAGCAGACGGGAGGTGCCATGGATATC Q L E M E D E D T I D V F Q Q Q T G G A M D I 360 370 380 390 400 410 420 | | | | | | | | | | | | | | -ATGGCAACCTTCATTTCACCGATACTGGAGG M A T F I S P I L E GGAATTAATTCGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGC.T G I N S D P N S S S V D K L A T F I S P I L E 430 440 450 460 470 480 490 | | | | | | | | | | | | | | CCCTGTTCCGGCACGCCCGCCAAGCGCCGGAAAGCACCGCTCTGCTGTGCGGCGATCGGCGCTGGAGCTA A L F R H A R Q A P E S T A L L C G D R R W S Y A L F R H A R Q A P E S T A L L C G D R R W S Y 500 510 520 530 540 550 560 | | | | | | | | | | | | | | TCGTCGCCTGGCCGATCGCGCCTGCATGATGGCGGCGGCGCTGCGACATGCCGGGTTAAAGCAGCAGGCC R R L A D R A C M M A A A L R H A G L K Q Q A R R L A D R A C M M A A A L R H A G L K Q Q A 570 580 590 600 610 620 630 | | | | | | | | | | | | | | GTGCTGCTCAACCTGCAGAAAGGGCCCGACGCCGTCGCCGCCATGTACGCATGTTGGCTGAGCGGCAACC V L L N L Q K G P D A V A A M Y A C W L S G N V L L N L Q K G P D A V A A M Y A C W L S G N 640 650 660 670 680 690 700 | | | | | | | | | | | | | | ACTATGTCCCTATCGATTTCAGCCAACCGACGGCGCGCATCGAACGCATTATCGCCGCCGCCTCACCCGC H Y V P I D F S Q P T A R I E R I I A A A S P A H Y V P I D F S Q P T A R I E R I I A A A S P A 710 720 730 740 750 760 770 | | | | | | | | | | | | | | GCTGATCGTCGATGAGGGCTGGTTGAACGCGCTCGATGGCCGCACCGATCTCGATGGCGCCTGGCCGGAA L I V D E G W L N A L D G R T D L D G A W P E G L I V D E G W L S A L D G R T D L D G A W P E 780 790 800 810 820 830 840 | | | | | | | | | | | | | | GCGATCGCCGCGCTCGGCTCCCCCCTCGCCGCCATTCTCTATACTTCAGGCTCCACAGGCACCCCGAAAG A I A A L G S P L A A I L Y T S G S T G T P K A I A A L G S P L A A I L Y T S G S T G T P K 850 860 870 880 890 900 910 | | | | | | | | | | | | | | GGGTGCAAATCACCCATGACATGCTGACGTTTTTCATCGGCTGGGCCGTCAGCGATACACAACTGACGGC G V Q I T H D M L T F F I G W A V S D T Q L T A G G V Q I T H D M L T F F I G W A V S D T Q L T A 920 930 940 950 960 970 980 | | | | | | | | | | | | | | GCGCGACGTGCTGGCCAATCATGCCAGTTTCGCCTTTGATCTGAGCACCTTCGATCTGTTCGCCGGCGTT R D V L A N H A S F A F D L S T F D L F A G V R D V L A N H A S F A F D L S T F D L F A G V 990 1000 1010 1020 1030 1040 1050 | | | | | | | | | | | | | | TGCGCCGGCGCCGCGACCTGGATCGTGCGCGAAGATGAACAGAAAGATTGCCAGGCTCTCGTTCGCGGAT C A G A A T W I V R E D E Q K D C Q A L V R G C A G A A T W I V R E D E Q K D C Q A L V R G 1060 1070 1080 1090 1100 1110 1120 | | | | | | | | | | | | | | TGCAAACGCACGGCGTCACTCTGTGGTACAGCGTGCCTTCGATTTTAGCCATGCTGGAAAAGAGCGCGTT L Q T H G V T L W Y S V P S I L A M L E K S A L 65 pET22b_pigI_Serratia sp._SM CP003959_S.marcescens WW4 pET22b_pigI_Serratia sp._SM CP003959_S.marcescens WW4 pET22b_pigI_Serratia sp._SM CP003959_S.marcescens WW4 pET22b_pigI_Serratia sp._SM CP003959_S.marcescens WW4 pET22b_pigI_Serratia sp._SM CP003959_S.marcescens WW4 pET22b_pigI_Serratia sp._SM CP003959_S.marcescens WW4 pET22b_pigI_Serratia sp._SM CP003959_S.marcescens WW4 pET22b_pigI_Serratia sp._SM CP003959_S.marcescens WW4 pET22b_pigI_Serratia sp._SM CP003959_S.marcescens WW4 pET22b_pigI_Serratia sp._SM CP003959_S.marcescens WW4 pET22b_pigI_Serratia sp._SM CP003959_S.marcescens WW4 pET22b_pigI_Serratia sp._SM CP003959_S.marcescens WW4 L Q T H G V T L W Y S V P S I L A M L E K S A L 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 | | | | | | | | | | | | | | GCTGGCGCCATCGACGGTGAAAACGCTGCGCCAGGTCACGTTCGCCGGTGAGCCTTATCCGGCCGCCGCG L A P S T V K T L R Q V T F A G E P Y P A A A L A P S T V K T L R Q V T F A G E P Y P A A A 1200 1210 1220 1230 1240 1250 1260 | | | | | | | | | | | | | | CTGAGGCGTCTGGTTGCGCATCTGCCGGCCCGGTGCCGCGTCAGCAACTGGTATGGCCCGACGGAAACCA L R R L V A H L P A R C R V S N W Y G P T E T L R R L V A H L P A R C R V S N W Y G P T E T 1270 1280 1290 1300 1310 1320 1330 | | | | | | | | | | | | | | ATGTCTGCACCGCCTACGCGCTGGATCGAACGCAGTTGGCGACGCTGGAGCAGATCCCCATCGGCCATCC N V C T A Y A L D R T Q L A T L E Q I P I G H P N V C T A Y A L D R T Q L A T L E Q I P I G H P 1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400 | | | | | | | | | | | | | | GTTGCCCGGCTTGACGGCGCAGTTGGTCGATGAACAGGGGCGCCTGCAGCCGATTGACGGTACGCCGGGC L P G L T A Q L V D E Q G R L Q P I D G T P G L P G L T A Q L V D E Q G R L Q P I D G T P G 1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 | | | | | | | | | | | | | | CGACGCGGAGAATTGCTGATCGGCGGGCCGTGCGTGACCCCCGGCTACAGCAACGTCGCCTCATCGCGGC R R G E L L I G G P C V T P G Y S N V A S S R R R G E L L I G G P C V T P G Y S N V A S S R 1480 1490 1500 1510 1520 1530 1540 | | | | | | | | | | | | | | AAGCGCAATGGCATCCGCGCCAATGTCACGCGACCGGCGACTGGGTGGAGACGACGGCGAATGGGCTGGT Q A Q W H P R Q C H A T G D W V E T T A N G L V Q A Q W H P R Q C H A T G D W V E T T A N G L V 1550 1560 1570 1580 1590 1600 1610 | | | | | | | | | | | | | | CTACCGCGGCCGGCTGGACGACATGGTGAAAATCAACGGCTACCGGGTGGAATTGGGTGAGATTGAATCG Y R G R L D D M V K I N G Y R V E L G E I E S Y R G R L D D M V K I N G Y R V E L G E I E S 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 | | | | | | | | | | | | | | ATCCTTCATCACCATCCCTCGGTCAGCCAGGCCGCACTGTATGTCGAGCTCGGCGAGCTGAAGCAAAAAC I L H H H P S V S Q A A L Y V E L G E L K Q K G I L H H H P S V S Q A A L Y V E L G E L K Q R 1690 1700 1710 1720 1730 1740 1750 | | | | | | | | | | | | | | TGATCGCCGTGATCACCCTCCATCCCGGCGCGCTCCGCCCCAACCTGCTGGAGCTCAAGCAGTTCCTGCA L I A V I T L H P G A L R P N L L E L K Q F L Q L I A V I T L H P G A L R P N L L E L K Q F L Q 1760 1770 1780 1790 1800 1810 1820 | | | | | | | | | | | | | | GCCCAGGCTGCCCGCCTATATGCTCCCCAGCCAACTGGTGGTCGCCGACAGTCTGCCCACCAATGCCAAC P R L P A Y M L P S Q L V V A D S L P T N A N P R L P A Y M L P S Q L V V A D S L P T N A N 1830 1840 1850 1860 1870 1880 1890 | | | | | | | | | | | | | | GGCAAGGTGGACAGAGGACGTTTGTCCGAGGTGAACGCGCGA -G K V D R G R L S E V N A R T CTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAG G K V D R G R L S E V N A R L E H H H H H H * 1900 | | - Hình 3.13 So sánh trình tự gen pigI với trình tự gen chủng tham chiếu S marcescence WW4 66 3.2.3.3 Biểu gen pigI E coli Nhằm tiến hành thử khả biểu pigI chủng E coli, tiến hành thử điều kiện biểu điều kiện nhiệt độ (25 oC 37oC) nồng độ IPTG khác Hình 3.14 Ảnh điện di protein tổng số biểu E coli BL21 (DE3) gel polyacrylamide 10% 1: Protein vector pET22b biểu pha tan có cảm ứng IPTG; 2: Protein vector tái tổ hợp pET22b_pigI biểu pha tan nhiệt độ 37oC có cảm ứng IPTG nồng độ 0,5 mM; 3: Protein vector pET22b- pigI biểu pha tan nhiệt độ 37oC có cảm ứng IPTG nồng độ 1mM; 4: Protein vector tái tổ hợp pET22b_pigI biểu thể vùi nhiệt độ 37oC có cảm ứng IPTG nồng độ 0,5 mM; 5: Protein vector tái tổ hợp pET22b_pigI biểu thể vùi nhiệt độ 37oC có cảm ứng IPTG nồng độ 1mM; 6: Protein vector tái tổ hợp pET22b_pigI biểu pha tan nhiệt độ 25oC có cảm ứng IPTG nồng độ 0,5 mM; 7: Protein vector tái tổ hợp pET22b_pigI biểu pha tan nhiệt độ 37oC có cảm ứng IPTG nồng độ 1mM; 8: Protein vector tái tổ hợp pET22b_pigI biểu thể vùi E coli BL21 có cảm ứng IPTG nồng độ 0,5 mM; 9: Protein vector tái tổ hợp pET22b_pigI biểu pha tan nhiệt độ 25oC có cảm ứng IPTG nồng độ 1mM; M: Protein ladder (Intron) 67 Kết cho thấy, tất điều kiện, thu protein có kích thước khoảng 58 kDa phù hợp với tính tốn lý thuyết Tuy nhiên, điều kiện 37 oC, hầu hết protein tái tổ hợp thu nằm dạng thể vùi Trong đó, kết biểu điều kiện 25oC cho thấy thu protein pigI tái tổ hợp dạng thể tan (Hình 3.14) Bên cạnh đó, khơng có khác biệt đáng kể hàm lượng protein pigI thu nồng độ chất cảm ứng khác Do vậy, kết luận điều kiện tối ưu để thu protein pigI tái tổ hợp 25oC nồng độ chất cảm ứng 0,5 mM Hiện nay, có nhiều nghiên cứu biểu gen PigI chủng khác S marcescence tiến hành nhằm tìm nguồn gốc tự nhiên mới, hiệu cao Vào năm 2018 Takashi Kawasaki, Fumi Sakurai, Shun-ya Nagatsuka Yoichi Hayakawa nghiên cứu cụm gen sinh tổng hợp Prodigiosin Streptomyces griseoviridis, kết cụm gen sinh tổng hợp prodigiosin xác định S griseoviridis Cụm bao gồm 24 khung đọc mở, bao gồm 21 gen (rphD – rphZ) tương đồng với gen sinh tổng hợp prodigiosin cụm màu đỏ Streptomyces coelicolor A3 Nghiên cứu Andreas Domrose cộng Pseudomonas putida (2015) cho quy trình mới, nhanh hiệu để chiết xuất tinh chế prodigiosin, cho phép phân lập đơn giản prodigiosin từ P putida môi trường sinh trưởng Nghiên cứu mô tả phương pháp hiệu cao để sản xuất sinh tổng hợp prodigiosin, dùng làm sở để sản xuất lượng lớn hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cung cấp tảng cho nghiên cứu chuyên sâu sinh tổng hợp tiền chất Trên tạp chí vi khuẩn học, nghiên cứu Steven A.Dauenhauer, Richard A.Hull Robert P.Williams đưa giả thuyết prodigiosin, sắc tố đỏ tươi tạo nhiều chủng Serratia marcescens, tổng hợp đường phân đôi kết thúc trình ngưng tụ enzym hai sản phẩm cuối cùng, monopyrrole bipyrrole, đoạn SAU3A DNA S.marcescens đưa vào dòng Escherichia coli K-12 cách sử dụng vector cosmid pHC79, dịng vơ tính biến nạp lựa chọn dựa khả kháng ampicillin Trong số 68 879 chất biến đổi sàng lọc, chất biến đổi tạo để tổng hợp prodigiosin cung cấp với hai sản phẩm đầu cuối đường phân đôi Kết đưa ý tưởng việc sản xuất prodigiosin không thiết phải qua trung gian plasmid Năm 2017, nhóm tác giả nâng cao hiệu xuất sản xuất sắc tố đỏ tăng 12 lần chủng cải biến Streptomyces coelicolor mang thêm cluster tái tổ hợp so với chủng hoang dại (Liu et al., 2017) Kết công bố cho thấy việc sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp việc cải biến di truyền chủng vi sinh vật để sản xuất tái tổ hợp hợp chất thứ cấp thực thành công Tương tự, nghiên cứu này, chúng tơi cải biến, tách dịng gen pigI từ Serratia marcesence biểu thành công Escherichia coli nhằm tăng biểu protein pigI 69 KẾT LUẬN Nhân gen tách dòng gen pigI từ Serratia marcesence: - Ni cấy hoạt hóa chủng Serratia sp Q1, Serratia sp Q2, Serratia sp Q3 xác định chủng Serratia sp có khả sinh tổng hợp prodigiosin, chủng sử dụng cho tách dòng gen tạo chủng vi khuẩn tái tổ hợp - Khuếch đại thành cơng trình tự gen pigI chủng Serratia sp Q1 Trình tự gen pigI chủng nghiên cứu có mức độ tương đồng cao so với trình tự gen pigI chủng tham chiếu khác Mức độ tương đồng lớn lên tới 99,7% so với chủng S marcescence CP027798, CP027796, CP021984 CP003959 nhỏ 97,6% so với chủng S marcescence AJ833002 Biểu gen pigI Escherichia coli: - Sản phẩm PCR nhân gen pigI sau tinh nối ghép vào vector pJET22b Vector tái tổ hợp biến nạp vào tế bào khả biến E coli BL21 (DE3) Biểu thành công protein pigI, thu protein có kích thước khoảng 58 kDa - Điều kiện tối ưu để thu protein pigI tái tổ hợp 25 oC nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,5mM Có khác biệt khơng đáng kể hàm lượng protein pigI thu nồng độ chất cảm ứng khác 70 KIẾN NGHỊ Đề tài nhân gen tách dòng gen pigI từ Serratia marcesence biểu gen pigI E coli Đề tài cần tiếp tục nghiên cứu tiếp: - Nghiên cứu đánh giá khảo sát điều kiện protein pigI tái tổ hợp đường chuyển hóa nhằm thu nhận tăng sản lượng prodigiosin - Nghiên cứu biểu gen pigI tế bào vật chủ khác để thu nhận prodigiosin có chất lượng tốt 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO Chandi G., Sourav B., Arijit D (2012) Assessment pf process parameters influencing the enhanced production of podigiosin form Serratia marcescens and evaluation of its antimicrobial, antiozidant and dyeing potentials Malaysian Journal of Microblology, 8(2), 116-122 Chia-Che C., Wei-Chuan C., Tsing-Fen H., Ho-Shing W., Yu-Hong W (2011) Development of natural anti-tumor drugs by microorganisms Journal of Bioscience and Bioengineering, 111, 501 – 511 Dauenhauer S A., Hull R A., Williams R P (1984) Cloning and expression in Escherichia coli of Serratia marcescens genes encoding prodigiosin biosynthesis Journal of Bacteriology, 158, 1128-1132 Duzhak A B., Panfilova Z I., Duzhak T G., Vasyunina E A., Shternshis M V., 2012 Role of prodigiosin and chitinases in antagonistic activity of the bacterium Serratia marcescens agassinst the fungus Didymella applanata Biochem Biok, 77(8): 910-916 Elahian F., Moghimi B., Dinmohammadi F., Ghamghami M., Hamidi M., Mirzaei S A., 2013 The anticancer agent prodigiosin is not a multidrug resistance protein substrate, DNA Cell Biol, 32(3): 90-97 F Alihosseini, K.S Ju, J Lango, B.D Hammock, G Sun Antibacterial colorants: characterization of prodiginines and their applications on textile materials Biotechnol Prog, 24 (2008), pp 742-747 Furstner A (2003) Chemistry and biology of roseophilin and the prodigiosin alkaloids: a survey of the last 2500 years Angew Chem Int Ed Engl, 42, 3582- 603 Giri A V., Anandkumar N., Muthukumaran G., Pennathur G (2004) A novel medium for the enhanced cell growth and production of prodigiosin from Serratia marcescens isolated from soil BMC Microbiol, 4, 1-10 72 Han S B., Park S H., Jeon Y J., Kim Y K., Kim H M., Yang K H (2001) Prodigiosin blocks T cell activation by inhibiting interleukin - Rα expression and delays progression of autoimmune diabetes and collagen induced arthritis J Pharm Exp Ther, 299, 415-425 10 Harned R L., 1954 The production of prodigiosin by submerged growth of Serratia marcescens Appl Microbiol, 2(6): 365-368 11 Harris K.P., Williamson R., Slater H., Cox A., Abbasi S., Foulds I., Simonsen T., Leeper J., Salmond P.C (2004) The Serratia gene cluster encoding biosynthesis of the red antibiotic, prodigiosin, shows species and strain dependent genome context variation Microbiol, 150, 3547-3560 12 Hwanmook K., Youngkook K., Sangbae H., Sungark Y (2003) Process of using prodigiosin as an immunosuppressive Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology 13 I.D Guryanov, N.S Karamova, D.V Yusupova, O.I Gnezdilov, L.A Koshkarova Bacterial pigment prodigiosin and its genotoxic effect Russ J Bioorg Chem, 39 (2013), pp 106-111 14 K.M Kadish, K.M Smith, R Guilard With application to chemistry, physics, material science, engineering, biology and medicine (Vol 41-44) Handb Porphyr Sci (2016), p 1588 15 Khanafari A., Assadi M.M., Fakhr F.A (2006) Review of prodigiosin, pigmentation in Serratia marcescens Online J Biol Sci, 6, 1-13 16 Lagadic-Gossmann D., Huc L., Lecureur, V (2004) Alterations of intracellular pH homeostasis in apoptosis: origins and roles Cell Death Differ., 11, 953-961 17 Lawanson A.O., Sholeye F.O (1975) Inhibition of prodigiosin formation in Serratia marcescens by adenosine triphosphate Experientia, 32, 439-440 18 Lee J S., Kim Y S., Park S., Kim J., Kang S J., Lee M H., Ryu S., Choi J M., Oh T K., Yoon J H., 2011 Exceptional production of both prodigiosin and cycloprodigiosin as major metabolic constituents by a novel marine 73 bacterium, Zooshikella rubidus S1-1 Appl Environ Microbiol., 77(14): 49674973 19 Llagostera E., Soto-Cerrato V., Joshi R., Montaner B., Gimenez-Bonafe P., Perez Tomas R (2005) High cytotoxic sensitivity of the human small cell lung doxorubicin resistant carcinoma (GLC4/ADR) cell line to prodigiosin through apoptosis activation Anticancer Drugs, 16, 393-399 20 Miao L., Wang X., Jiang W., Yang S., Zhou H., Zhai Y., Zhou X., Dong K., 2013 Optimization of the culture condition for an antitumor bacterium Serratia proteamacula 657 and identification of the active compounds J Microbiol Biotechnol., 29(5): 855-863 21 Pandey R., Chander R., Sainis K B (2009) Prodigiosins as anti cancer agents: living upto their name Curr Pharm Des., 15, 732-741 22 Qadri S M H., Williams R P (1972) Induction of Prodigiosin Biosynthesis after Shift-Down in Temperature of Nonproliferating Cells of Serratia marcescens Appl, Microbiol, 23, 704-709 23 Ramina M., Samira Y Y (2009) The role of red pigment produced by Serratia marcescens as antibacterial and plasmid curing agent University of Duhok, 12, 268- 274 24 Schloss P D., Allen H K., Klimowicz A K., Mlot C., Gross J A., Savengsuksa S., McEllin J., Clardy J., Ruess R W., Handelsman J., 2010 Psychrotrophic strain of Janthino bacterium lividum from a cold Alaskan soil produces prodigiosin DNA Cell Biol, 29(9): 533-541 25 Smithen D A., Forrester A M., Corkery D P., Dellaire G., Colpitts J., McFarland S A., Berman J N., Thompson A., 2013 Investigations regarding the utility of prodigiosenes to treat leukemia Org Biomol Chem., 11(1): 6268 26 Song M J., Bae J., Lee D S., Kim C H., Kim J S., Kim S W., Hong S I (2006) Purification and Characterization of Prodigiosin Produced by 74 Integrated Bioreactor from Serratia sp KH-95 J Biosci Bioeng, 101, 157161 27 Songia S., Mortellaro A., Taverna S., Fornasiero C., Scheiber E A., Erba E., Colotta F., Mantovani A., Isetta A M., Golay J (1997) Characterization of the new immunosuppressive drug undecylprodigiosin in human lymphocytes: retinoblastoma protein, cyclin-dependent kinase-2, and cyclindependent kinase-4 as molecular targets J Immunol., 158, 3987-3995 28 Soto-Cerrato V., Llagostera E., Montaner B., Scheffer G L., Pérez-Tomás R (2004) Mitochondria-mediated apoptosis operating irrespective of multidrug resistance in breast cancer cells by the anticancer agent prodigiosin Biochem Pharmacol., 68, 1345-1352 29 Thomson N R, Crow M A., McGowan S 1., Cox A., Salmond G P C (2000) Biosynthesis of carbapenem antibiotic and prodigiosin pigment in Serratia is under quorum sensing control Mol., Microbial, 36, 539-556 30 W Zhou, C Zeng, R.H Liu, J Chen, R Li, X.Y Wang, et al Antiviral activity and specific modes of action of bacterial prodigiosin against Bombyx mori nucleopolyhedrovirus in vitro Appl Microbiol Biotechnol, 100 (2016), pp 3979-3988 31 Wei Y.H., Chen W.C (2005) Enhanced production of prodigiosin-like pigment from Serratia marcescens SMΔR by medium improvement and oil supplementation strategies J Biosci Bioeng, 99, 616-622 32 Williams R P., Qadri S M H (1980) The pigment of Serratia 31–79.von 33 Williams RP, Green JA, Rappo-Port DA (1956) Studies on pigmentation of Serratia marcescens I Spectral and paper chromatographic properties of prodigiosin J Bacteriol 71:115–20 34 Williams, R P., Gott, C L., Qadri, S M & Scott, R H (1971) Influence of temperature of incubation and type of growth medium on pigmentation in Serratia marcescens J Bacteriol 106, 438–443 75 35 Williamson N R., Fineram P C., Leeper F J., Salmond G P C (2006) The biosynthesis and regulation of bacterial prodiginines Nat Rev Microbiol, 4, 887- 899 36 Williamson N.R., Simonsen H.T., Ahmed R.A., Goldet G., Slater H., Woodley L., Leeper F.J., Salmond P.C (2005) Biosynthesis of the red antibiotic, prodigiosin, in Serratia: identification of a novel 2-methyl-3-n-amyl-pyrrole (MAP) assembly pathway, definition of the terminal condensing enzyme, and implications for undecylprodigiosin biosynthesis in Streptomyces Mol Microbiol, 56, 971-989 37 Witney F.R., Failia M.L., Weinberg E.D (1977) Phosphate inhibition of secondary metabolism in Serratia marcescens Appl Environ Microbiol, 33, 1042- 1046 38 Yamamoto D., Uemura Y., Tanaka K., Nakai K., Yamamoto C., Takemoto H., Kamata K., Hirata H., Hioki K (2000) Cycloprodigiosin hydrochloride, H(+)/Cl(−) symporter, induces apoptosis and differentiation in HL-60 cells Int J Cancer, 88, 121-128 39 Yamashita M., Nakagawa Y., Li H., Matsuama T (2001) Silica gel dependent production of prodigiosin and serrawettins by Serratia marcescens in liquid culture Microb Environ, 16, 250-254 76