Nghiên cứu biến đổi di truyền ở một bệnh nhân mắc dị tật tim bẩm sinh bằng phương pháp giải trình tự vùng gen mã hóa

Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC BIOTECHNOLOGY ~*****~ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN Ở MỘT BỆNH NHÂN MẮC DỊ TẬT TIM BẨM SINH BẰNG PHƢƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG GEN MÃ HĨA Giáo viên hƣớng dẫn: PGS.TS NGUYỄN HUY HỒNG Sinh viên thực : DƢƠNG THỊ HỒNG HẠNH Lớp : 1701, CNSH Mã SV : 17A31010024 HÀ NỘI, - 2021 Dƣơng Thị Hồng Hạnh I Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC BIOTECHNOLOGY ~*****~ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN Ở MỘT BỆNH NHÂN MẮC DỊ TẬT TIM BẨM SINH BẰNG PHƢƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG GEN MÃ HĨA Giáo viên hƣớng dẫn: PGS.TS NGUYỄN HUY HOÀNG Sinh viên thực : DƢƠNG THỊ HỒNG HẠNH Lớp : 1701, CNSH Mã SV : 17A31010024 HÀ NỘI, - 2021 Dƣơng Thị Hồng Hạnh II Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH LỜI CẢM ƠN Lời tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Huy Hoàng - Viện trƣởng, Trƣởng phòng Hệ gen học chức năng, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam- Ngƣời thầy tận tình hƣớng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ chia sẻ khó khăn cho tơi suốt q trình thực hoàn thành nghiên cứu hoàn thành khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS.NCVC - Nguyễn Thị Kim Liên, Phó Trƣởng phịng Hệ gen học chức ln theo sát giúp đỡ bảo suốt trình tiến hành thí nghiệm Qua tơi biết ơn anh chị phòng Hệ gen học Chức năng- Viện Nghiên cứu hệ gen dạy bảo, hƣớng dẫn tơi tận tình giúp đỡ tơi nhiều thời gian thực tập phịng Tơi chân thành cảm ơn thầy cô giáo giảng dạy Khoa Công nghệ sinh học, Trƣờng Đại học Mở Hà Nội truyền đạt cho kiến thức quý báu bổ ích suốt năm học vừa qua Một lần nữa, xin cảm ơn tất ngƣời Kính chúc ngƣời nhiều sức khỏe hạnh phúc sống Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 4, tháng 5, năm 2021 Sinh viên Dƣơng Thị Hồng Hạnh Dƣơng Thị Hồng Hạnh III Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH LỜI CAM ĐOAN Em tên Dƣơng Thị Hồng Hạnh, sinh viên lớp 1701 - Trƣờng Đại Học Mở Hà Nội, em xin cam đoan: Đây đề tài nghiên cứu em trực tiếp thực dƣới hƣớng dẫn PGS.TS Nguyễn Huy Hồng Em xin đảm bảo tính khách quan, trung thực, xác số liệu nghiên cứu Những kết nghiên cứu chƣa đƣợc công bố nghiên cứu khác Hà Nội, ngày 4, tháng 5, năm 2021 Sinh viên Dƣơng Thị Hồng Hạnh Dƣơng Thị Hồng Hạnh IV Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH MỤC LỤC MỞ ĐẦU……………………………………………………………… ….8 Phần I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh tim bẩm sinh 1.1.1 Khái niệm tim bẩm sinh 1.1.2 Nguyên nhân gây bệnh tim bẩm sinh 1.1.3 Các dạng dị tật tim bẩm sinh triệu chứng lâm sàng bệnh tim bẩm sinh: 1.1.4 Chuẩn đoán bệnh tim bẩm sinh: 1.1.5 Ảnh hƣởng bệnh tim bẩm sinh với bệnh nhân: 1.1.6 Tình hình nghiên cứu lĩnh vực liên quan đến đề tài: 1.2 Các gen liên quan đ ến bệnh tim bẩm sinh: 11 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 18 2.2 Vật liệu hóa chất 18 2.2.1 Vật liệu 18 2.2.2 Hóa chất 18 2.2.3 Thiết bị 19 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Phƣơng pháp tách DNA tổng số 21 2.3.2 Phƣơng pháp kiểm tra nồng độ DNA tổng số 22 2.3.3 Phƣơng pháp điện di gel agarose 23 2.3.4 Phƣơng pháp giải trình tự vùng gen mã hóa 25 2.3.5 Thiết kế mồi nhân đoạn gen chứa đột biến cần kiểm nghiệm 27 2.3.6 Kỹ thuật PCR 27 2.3.6.1 Nguyên lý kỹ thuật PCR 27 2.3.6.2 Nhân đoạn gen LRP2 kỹ thuật PCR 29 Dƣơng Thị Hồng Hạnh V Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH 2.3.6.3 Chu trình nhiệt kỹ thuật PCR đƣợc thực máy GeneAmp PCR System 9700 thơng qua giai đoạn (Hình 5): 31 2.3.7 Phƣơng pháp tinh sản PCR 31 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Thu thập mẫu máu 34 3.2 Xác định nồng độ tinh DNA 34 3.4 Tách chiết DNA tổng số 35 3.5 Kết xác định giải biến thể 39 3.6 Kết sàng lọc biến thể liên quan đến bệnh tim bẩm sinh 40 PHẦN IV: KẾT LUẬN 44 4.1 Kết luận 44 4.2 Kiến nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 ĐỀ CƢƠNG TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC 51 Dƣơng Thị Hồng Hạnh VI Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT Aa Amino acid Bp Base pairs DNA Axit deoxyribonucleic PCR Phản ứng chuỗi polymerase PDB Ngân hàng liệu protein (Protein Data Bank) TAE Tris - Acid acetic - EDTA NST Nhiễm sắc thể Kb Kilo base paris (1kb = 1000 bp) EtBr Ethidium Bromide dNTP Deoxynucleotid triphosphat EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid EMBL Ngân hàng liệu Châu Âu (European Molecular Bioinformatic Laboratory) TBS Tim bẩm sinh Dƣơng Thị Hồng Hạnh VII Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH DANH MỤC HÌNH Hình 1: Tỷ lệ mắc bệnh TBS từ năm 1945 đến năm 2009 10 theo phân loại khuyết tật Hình 2: Phân bố bệnh tim bẩm sinh toàn cầu số 10 lƣợng sinh triệu dân số Hình 3: Vị trí gen LRP2 NST số 13 Hình 4: Quy trình phân tích sàng lọc đột biến 20 Hình 5: Chu trình nhiệt đƣợc tối ƣu hóa 30 Hình 6: Điện di kiểm tra DNA tổng số gel 1% 35 Hình 7: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen LRP2 37 Hình 8: Phân bố kích thƣớc thƣ viện DNA 41 Hình 9: Đột biến gen vị trí c.428-10_428-8dellTTT 42 Dƣơng Thị Hồng Hạnh VII I Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Các thành phần phản ứng trình PCR 30 Bảng 2: Kết đo nồng độ DNA độ tinh 35 Bảng 3: Thơng tin chất lƣợng đọc trình tự 37 Bảng 4: Kết gióng hàng liệu bệnh nhân với hệ gen 38 tham chiếu Bảng 5: Kết xác định sàng lọc biến thể Dƣơng Thị Hồng Hạnh 39 IX Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH MỞ ĐẦU Bệnh tim bẩm sinh (TBS) tình trạng bất thƣờng cấu trúc chức tim Vấn đề có từ trẻ đƣợc sinh đƣợc gọi bệnh tim bẩm sinh hay dị tật tim bẩm sinh (Congenital Heart Defects CHDs) Trên thực tế, nhiều trƣờng hợp bệnh tim bẩm sinh khiến trẻ vừa sinh đời tử vong Trái tim em bé bắt đầu phát triển từ thụ thai đƣợc hình thành hoàn toàn sau tuần mang thai Các dị tật tim bẩm sinh thƣờng xảy tuần Bệnh tim bẩm sinh xảy tim mạch máu gần tim khơng phát triển bình thƣờng trƣớc sinh Các vấn đề tim bẩm sinh dạng từ đơn giản đến phức tạp Một số khiếm khuyết tim đƣợc bác sĩ theo dõi xử trí thuốc Một số trƣờng hợp khác đƣợc yêu cầu phẫu thuật, sau vài đầu sau sinh Một số em bé mắc số vấn đề tim đơn giản Những khiếm khuyết tự phục hồi em bé lớn lên Tuy nhiên vài trƣờng hợp có khiếm khuyết cần đƣợc theo dõi điều trị suốt đời Dị tật tim bẩm sinh bệnh liên quan đến cấu trúc tim buồng tim Xảy cấu trúc tim khác thƣờng buồng tim có dị tật Dị tật tim bẩm sinh liên quan đến phần tim bao gồm buồng tim, van tim, vách tim, động mạch tĩnh mạch tim Chúng làm ảnh hƣởng đến dịng chảy bình thƣờng máu qua tim, khiến thể trẻ không nhận đủ lƣợng oxy cần thiết [1] Chính chuẩn đốn sớm bệnh tim bẩm sinh cần thiết Chẩn đoán muộn bệnh làm chậm bắt đầu phƣơng pháp điều trị đặc hiệu dẫn đến hậu đáng tiếc, đe dọa đến sống bao gồm tình trạng lâm sàng nặng gây tâm lý nặng nề cho bệnh nhân gia đình, chí tử vong trƣờng hợp bệnh tiến triển Trong Dƣơng Thị Hồng Hạnh Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH 31 Bird, G.; Cook, R (23 July 2013) “Mixed emotions: the contribution of alexithymia to the emotional symptoms of autism” Translational Psychiatry 85(4):p 348-351 32 Mullis, Kary B.et al “Process for amplifying, detecting, and cloning nucleic acid sequences” U.S.Patent 4,683,195 33 Tomar, Rukam (2010) “A review of the prevalence of autism spectrum disorders in Asia.” Res Autism Spectrum Disorder 4(2):p 156-157 34 Furlano RI, Anthony A, et al (2001) “Colonic CD8 and gamma delta T cell infiltration with epithelial damage in children with autism” J Pediatr 138(3): 366-372 35 Saiki, R.; Scharf, S.; Faloona, F.; Mullis, K.; Hom, G.; Erlich, H.; Arnheim, N (1985) “Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia” Science 230 (4732):p 1350-1354 Dƣơng Thị Hồng Hạnh 50 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỀ CƢƠNG TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Họ tên sinh viên: Dƣơng Thị Hồng Hạnh Lớp: 1701 Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Tên đề tài: Nghiên cứu biến đổi di truyền bệnh nhân mắc dị tật tim bẩm sinh phƣơng pháp giải trình tự vùng gen mã hóa Giáo viên hƣớng dẫn: PGS.TS Nguyễn Huy Hồng Cơ quan công tác: Viện Nghiên cứu hệ gen- Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam (18 Hồng Quốc Việt) Dƣơng Thị Hồng Hạnh 51 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH NỘI DUNG ĐỀ CƢƠNG Mở đầu: (Cần nêu rõ: Tính cấp thiết, Mục tiêu, Nội dung nghiên cứu) Khái quát bệnh tim bẩm sinh: Dị tật tim bẩm sinh – Congenital Heart Defects (CHDs) bệnh liên quan đến cấu trúc tim buồng tim Xảy cấu trúc tim khác thƣờng buồng tim có dị tật Dị tật tim liên quan đến phần tim bao gồm buồng tim, van tim, vách tim, động mạch tĩnh mạch tim Chúng làm gián đoạn dịng chảy bình thƣờng máu qua tim, khiến thể trẻ không nhận đủ lƣợng oxy cần thiết Tính cấp thiết: - Bệnh TBS (congenital heart diseaes) hay cịn có tên gọi khác dị tật TBS (congentinal heart defects) bất thƣờng tim mạch máu lớn gần tim hình thành trình phát triển bào thai biểu sinh, nên chuẩn đoán sớm bệnh tim bẩm sinh cần thiết Chẩn đoán muộn bệnh làm chậm bắt đầu phƣơng pháp điều trị đặc hiệu dẫn đến hậu đáng tiếc, đe dọa đến sống bao gồm tình trạng lâm sàng nặng gây tâm lý nặng nề cho bệnh nhân gia đình, chí tử vong trƣờng hợp bệnh tiến triển Trong trƣờng hợp bệnh đƣợc di truyền, anh chị em khác gia đình có nguy bị ảnh hƣởng cao Đối với gia đình này, việc khơng có chẩn đốn cụ thể tiếp cận với tƣ vấn di truyền, làm tăng nguy việc có đứa trẻ khác bị bệnh đƣợc sinh Các rối loạn gặp thƣờng khơng phù hợp với cách tiếp cận chẩn đốn truyền thống, dẫn đến Dƣơng Thị Hồng Hạnh 52 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH việc tƣ vấn lâm sàng thử nghiệm lặp lại, gây căng thẳng tinh thần tài cá nhân gia đình Giải trình tự gen hệ (giải trình tự vùng gen mã hóa – whole exome sequencing, tồn bộ gen ngƣời – whole genome sequencing) đƣợc sử dụng để nghiên cứu gen bệnh theo di truyền Mendel Giải trình tự gen hệ đƣợc xem nhƣ công cụ hữu hiệu cho phát gen bệnh mới, đặc biệt giải trình tự vùng mã hóa trở thành công cụ phổ biến đƣợc sử dụng để xác định gen bệnh theo di truyền Mendel cho năm tới Hàng chục nghìn biến thể gen đƣợc xác định vùng gen mã hóa nhiều bệnh phức tạp nhƣ: tim mạch, thần kinh, chuyển hóa Nội dung nghiên cứu: Đề tài tiến hành giải trình tự tồn vùng gen mã hóa (WES) số bệnh nhi mắc dị tật van tim bẩm sinh để tìm hiểu rõ nguyên nhân di truyền bệnh, từ có phƣơng pháp chẩn đốn, điều trị tƣ vấn di truyền thích hợp cho bệnh nhân gia đình Dƣơng Thị Hồng Hạnh 53 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH Phần 1: Tổng quan tài liệu: Bệnh tim bẩm sinh gì? Bệnh tim bẩm sinh (TBS) tình trạng dị tật bất thƣờng cấu trúc chức tim Vấn đề có từ trẻ đƣợc sinh đƣợc gọi bệnh tim bẩm sinh hay dị tật tim bẩm sinh Trên thực tế, có nhiều trƣờng hợp bệnh tim bẩm sinh khiến trẻ vừa sinh đời tử vong Trái tim em bé bắt đầu phát triển từ thụ thai đƣợc hình thành hồn tồn sau tuần mang thai Các dị tật tim bẩm sinh thƣờng xảy tuần Bệnh tim bẩm sinh (TBS)xảy tim mạch máu gần tim khơng phát triển bình thƣờng trƣớc sinh Loại khuyết tật tim khiếm khuyết bất thƣờng thể, bệnh Các vấn đề tim bẩm sinh dạng từ đơn giản đến phức tạp Một số khiếm khuyết tim đƣợc bác sĩ theo dõi xử trí thuốc Một số trƣờng hợp khác đƣợc yêu cầu phẫu thuật, sau vài đầu sau sinh Một em bé chí mắc số vấn đề tim đơn giản Những khiếm khuyết đơn giản tự hết chúng lớn lên Tuy nhiên vài trƣờng hợp có khiếm khuyết cần đƣợc điều trị suốt đời Tình hình nghiên cứu bệnh tim bẩm sinh Việt Nam: Theo tổ chức y tế giới, 1000 trẻ em đời, em trẻ số mắc bệnh TBS Tại Việt Nam, năm có thêm 20.000 trƣờng hợp mang bệnh này, có 1/10 số đƣợc can thiệp phẫu thuật Trẻ bị TBS dễ rơi vào tình trạng suy tim nặng, di chứng khơng phục hồi ảnh hƣởng tới tình trạng tồn thân Dƣơng Thị Hồng Hạnh 54 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH Các bệnh tim bẩm sinh đa dạng, chia thành hai nhóm lớn nhóm kèm không với hội chứng di truyền khác Nhóm kèm với hội chứng di truyền khác bao gồm hội chứng: Hội chứng Down, Hội chứng Edward, Hội chứng Patau, Hội chứng Holt-Oram, Hội chứng Noonan, Hội chứng Ellis-van Creveld, Hội chứng Costello, Hội chứng Leopard, Hội chứng Alagille, Hội chứng Turner, Hội chứng Williams-Beuren, Hội chứng Anderson, Hội chứng Cat-Eye, Hội chứng Marfan, Hội chứng Char, Hội chứng Charge… (Chaix et al., 2016) Nhóm không kèm với hội chứng di truyền khác đƣợc xác định đột biến gen đơn gây Các dạng bệnh tim bẩm sinh phổ biến bao gồm: thông liên nhĩ, thông liên thất, van động mạch chủ hai lá, hẹp eo động mạch chủ, bất thƣờng van hai lá, hai đƣờng tâm thất phải, hội chứng Eisenmenger, hội chứng thiểu sản thất trái, hội chứng Wolff-Parkinson-White, hội chứng Brugada, hội chứng QT dài, bất thƣờng hồi lƣu tĩnh mạch phổi, ống động mạch tồn lƣu, lỗ bầu dục, thiểu sản phổi, thiểu sản phổi với khuyết tật thông liên thất, hẹp van động mạch phổi, thiểu sản phổi với vách ngăn thất nguyên vẹn, tứ chứng Fallot, chuyển vị động mạch lớn, thiểu sản van ba lá, thân chung động mạch, vòng mạch máu, khiếm khuyết thông liên thất Các dị tật tim bẩm sinh thƣờng gặp nguyên nhân gây tử vong hàng đầu số dị tật bẩm sinh trẻ Ngày với tiến chẩn đoán điều trị làm tăng đáng kể tỷ lệ sống trƣờng hợp tim bẩm sinh phức tạp Dị tật van tim kèm dị tật khác tình trạng nghiên cứu bệnh van tim Việt Nam Dị tật van tim tình trạng van tim khơng đóng kín khiến máu bị trào ngƣợc trở lại buồng tim trƣớc tim co bóp Bệnh xảy van tim là: van hai lá, van ba lá, van động mạch phổi van động mạch Dƣơng Thị Hồng Hạnh 55 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH chủ Trong đó, hở van tim lá, loại thƣờng gặp Bình thƣờng van tim giữ vai trò quan trọng hoạt động bơm máu tim, chúng làm nhiệm vụ đóng mở nhịp nhàng, giúp máu lƣu thông theo chiều định Bởi vậy, van tim hoạt động không cách gây hệ lụy không nhỏ cho sức khỏe ngƣời bệnh - Nguyên nhân dẫn đến dị tật van tim: Bệnh thấp tim (hay sốt thấp khớp) nguyên nhân phổ biến Thấp tim biến chứng bệnh viêm họng liên cầu khuẩn beta tan huyết nhóm A gây nên Nếu bệnh viêm họng liên cầu không đƣợc điều trị triệt để, sau khoảng – tuần tiến triển thành thấp tim với triệu chứng nhận biết sốt, đau khớp… Khi đó, ngƣời bệnh cần sớm tới gặp bác sĩ để đƣợc chẩn đoán điều trị, nhằm hạn chế tổn thƣơng cho hệ thống van tim Một số nguyên nhân thƣờng gặp khác bệnh cao huyết áp làm thay đổi cấu trúc tim, viêm nội tâm mạc, bệnh tim bẩm sinh, tác dụng phụ số loại thuốc,… Dƣơng Thị Hồng Hạnh 56 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH Phần 2: Phƣơng pháp nghiên cứu: Đối tƣợng nghiên cứu: Bệnh nhân thành viên gia đình bệnh nhân mắc bệnh mà chƣa đƣợc chẩn đoán nguyên nhân Khoa Tim mạch, Bệnh viện E Tất đối tƣợng tham gia nghiên cứu đƣợc cung cấp đầy đủ thông tin Mục tiêu nghiên cứu tham gia nghiên cứu tự nguyện theo quy định đạo đức nghiên cứu y sinh học tổ chức nƣớc giới Tất thông tin liên quan đến bệnh nhân nghiên cứu đƣợc bảo mật Nghiên cứu đƣợc đồng ý từ gia đình bệnh nhân đƣợc Hội đồng đạo đức nghiên cứu y sinh học Viện Nghiên cứu hệ gen thơng qua Vật liệu hóa chất: 2.1: Vật liệu: - Vật liệu nghiên cứu mẫu máu bệnh nhân tim bẩm sinh Việt Nam đƣợc cung cấp Khoa tim mạch- Bệnh viện E 2.2: Hóa chất: Các hóa chất đƣợc sử dụng nghiên cứu bao gồm: - Bộ KIT GeneJET Whole Blood Genomic DNA purification Minikit hãng Thermo (Mỹ) QIAamp DNA hãng QIAGEN dùng để tách DNA tổng số - Bộ KIT giải trình tự WES hãng Illumina - Bộ KIT GeneJET Extraction hãng Thermo (Mỹ) dùng để tinh PCR - Nhóm hóa chất dùng cho phản ứng PCR: Taq DNA polymerase, buffer, dNTP, mồi đặc hiệu Dƣơng Thị Hồng Hạnh 57 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH - Nhóm hóa chất dung cho điên di gel agarose: Gel agarose, đệm TAE 1X, dye, ethidium bromide - Và số hóa chất khác nhƣ: nƣớc cất lần, ethanol, 2.3: Thiết bị: Các thiết bị nghiên cứu bao gồm: - Tủ lạnh -20C Vestfrot (Đan Mạch) - Máy li tâm BioFuge fresco (Đức) - Lò vi sóng Sharp (Nhật Bản) - Cân điện tử Precisa ( Thụy Sĩ) - Máy chu trình nhiệt GeneAmp PCR System 9700 (Mỹ) - Máy chụp Gel BioRad (Đức) - Máy điện di BioNeer (Nhật Bản) - Pipette Gilson (Pháp) - Bể ổn nhiệt Memmert (Hàn Quốc) - Bộ dụng cụ điện di (Đài Loan) - Máy đo quang phổ (Đức) - Ống đầu côn hãng Thermo Phƣơng pháp nghiên cứu: Quy trình nghiên cứu bao gồm bƣớc chính: thu thập mẫu máu, tách chiết DNA, giải trình tự tồn vùng gen mã hóa, phân tích số liệu nhằm tìm đột biến liên quan đến bệnh, sàng lọc kiểm chứng lại đột biến gây bệnh Dƣơng Thị Hồng Hạnh 58 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH Hình 1: Quy trình sàng lọc đột biến 3.1: Thu thập mẫu máu: Mẫu máu bệnh nhân thành viên gia đình bao gồm bố, mẹ anh, chị, em bệnh nhân đƣợc cung cấp Khoa Tim mạch- Bệnh viện E Hà Nội, sau đƣợc đồng ý bố mẹ bệnh nhân Mỗi đối tƣợng tham gia nghiên cứu đƣợc thu thập ml máu tĩnh mạch, chống đông EDTA 1,5 mg/ml Tất mẫu máu sau đƣợc bảo quản nhiệt độ -20 độ C Dƣơng Thị Hồng Hạnh 59 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH 3.2: Tách chiết DNA giải trình tự tồn vùng mã hóa số bệnh nhân mắc dị tật tim bẩm sinh: Mẫu máu bệnh nhân thành viên gia đình đƣợc tách chiết kit QIAamp DNA theo hƣớng dẫn nhà sản xuất Sản phẩm DNA tổng số đƣợc tiến hành điện di kiểm tra gel agarose 0,8% đo quang phổ để xác định nồng độ độ tinh DNA tổng số đƣợc cắt, lai tinh SureSelect All Exon V6 để tạo theo hƣớng dẫn nhà sản xuất Illumina Thƣ viện exome sau đƣợc xử lý, đƣợc tiến hành giải trình tự máy giải trình tự hệ Illumina theo hƣớng dẫn nhà sản xuất Illumina Kiểm định chất lƣợng đọc ban đầu phần mềm FastQC Bƣớc đặc biệt quan trọng đảm bảo cho bƣớc phân tích 3.3 Xác định giải biến thể: Sau giải trình tự máy Illumina, chất lƣợng đọc đƣợc kiểm tra phần mềm FastQC Dữ liệu trình tự đƣợc xếp so sánh với trình tự gen ngƣời (hg19) phần mềm BWA 0.7.10 (Li and Durbin, 2009) Công cụ Picard (http://broadinstitute.github.io/picard/) đƣợc sử dụng để xử lý liệu sau gióng hàng Các biến thể đƣợc phát phần mềm Genome Analysis Toolkit v3.4 (McKenna et al., 2010) Ảnh hƣởng biến thể đƣợc xác định phần mềm SnpEff v4.1 (Cingolani et al., 2012) Đây cơng cụ thích dự báo ảnh hƣởng biến thể gen (nhƣ thay đổi axit amin) Dữ liệu đầu vào công cụ biến thể đƣợc dự đốn (SNPs, chèn, xóa MNPs), kết giải trình tự, có định dạng VCF (Variant Call Format) Trong liệu đầu ra, SnpEff phân tích biến đầu vào để giải tính tốn tác động mà biến thể tạo SnpEff đƣa kết nhƣ sau: Kiểu gen điểm bị ảnh hƣởng biến thể; vị trí biến thể; ảnh hƣởng biến Dƣơng Thị Hồng Hạnh 60 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH thể đến trình tổng hợp protein; so sánh với liệu khác để tìm biến thể biết 3.4 Sàng lọc biến thể liên quan đến bệnh van tim kèm dị tật khác: Sau phân tích, biến thể đƣợc sàng lọc theo tiêu chí sau:  Biến thể xảy gen đƣợc công bố liên quan đến bệnh dị tật van tim bẩm sinh  Biến thể có tần suất alen MAF < 1% Tần suất alen biến thể đƣợc tham khảo dựa  sở liệu 1000 hệ gen ngƣời (1000 Genomes Project)  Lọc biến thể dự đốn có ảnh hƣởng đến chức protein  Những đột biến đƣợc báo cáo lành tính sở liệu ClinVar bị loại bỏ 3.5 Kiểm chứng lại đột biến bệnh nhân thành viên gia đình: Các đột biến tiềm gây bệnh tìm đƣợc đƣợc kiểm chứng phƣơng pháp giải trình tự Sanger bệnh nhân gia đình nhằm xây dựng phả hệ nghiên cứu chế di truyền bệnh Dƣơng Thị Hồng Hạnh 61 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH Phần 3: Kết (dự kiến): Đề tài dự kiến thu thập mẫu máu, tách chiết DNA tổng số 01- 02 bệnh nhân nhi mắc bệnh tim bẩm sinh thành viên gia đình Dữ liệu giải trình tự tồn vùng gen mã hóa bệnh nhân đƣợc phân tích từ xác định 01- 02 đột biến liên quan đến bệnh tim bẩm sinh Ảnh hƣởng đột biến tìm đƣợc đánh giá phần mềm tin sinh học nhƣ Mutation Taster, Sift, PolyPhen2 từ tìm đƣợc mối tƣơng quan kiểu gen với kiểu hình chế di truyền bệnh Dƣơng Thị Hồng Hạnh 62 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH Tài liệu tham khảo: https://www.webmd.com/heart/leaky-heart-valve-symptoms-causes- treatments#1 https://www.belmarrahealth.com/leaky-heart-valve-symptoms-causes- treatments/ https://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/mitral-valve regurgitation/symptoms-causes/syc - 20350178 Li, H., and Durbin, R (2009) Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform Bioinforma Oxf Engl 25, 1754–1760 McKenna, A., Hanna, M., Banks, E., Sivachenko, A., Cibulskis, K., Kernytsky, A., Garimella, K., Altshuler, D., Gabriel, S., Daly, M., et al (2010) The Genome Analysis Toolkit: A MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data Genome Res 20, 1297– 1303 Cingolani, P., Platts, A., Wang, L.L., Coon, M., Nguyen, T., Wang, L., Land, S.J., Lu, X., and Ruden, D.M (2012) A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3 Fly (Austin) 6, 80–92 Griffiths et al (2000), Chapter (Genetics and the Organism): Introduction https://www.tudu.com.vn/vn/y-hoc-thuong-thuc/diem-bao/nhung- nghien-cuu-ve-gen-lam-thay-doi-the-gioi/ https://tinbaihay.net/nhung-nghien-cuu-ve-gen-lam-thay-doi-the- gioi/post-15249600771235887113.htm Dƣơng Thị Hồng Hạnh 63 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Xác nhận giáo viên hƣớng dẫn (Ký ghi họ tên) Dƣơng Thị Hồng Hạnh Sinh viên thực (Ký ghi họ tên) 64