Phân tích đa dạng di truyền của các loài rong biển bằng kỹ thuật sinh học phân tử rapd pcr

Luận văn tốt nghiệp Khoa công nghệ sinh học
 LỜI CÁM ƠN Lời cho phép gửi lời cám ơn chân thành sâu sắc tới P.GS.TS Đặng Diễm Hồng, Phịng Cơng nghệ Tảo, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện cho thực tập phịng thí nghiệm Tơi vơ cám ơn TS Ngơ Thị Hồi Thu tận tình giảng dạy, hướng dẫn tơi suốt q trình thực tập phịng thí nghiệm Chị dành nhiều thời gian, ln tận tâm, tận tình, bảo, giảng dạy cho nhiều kiến thức kĩ thực nghiệm, cung cấp cho nhiều kiến thức đề tài mới, cho chỗ sai giúp tơi nhận định hướng để thực đề tài cách tốt Tôi xin gửi lời cám ơn tới tập thể Phịng Cơng nghệ Tảo giúp đỡ, quan tâm, chia sẻ khó khăn với tơi suốt q trình thực tập Thời gian khơng dài tơi có thật nhiều kỉ niệm đẹp theo tơi suốt đời Tôi xin chân thành cám ơn tới tất thầy cô Viện Đại học Mở Hà Nội, Viện Công nghệ sinh học ân cần dạy bảo cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới bố mẹ, gia đình bạn bè ln bên cạnh, động viên tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 22 tháng 05 năm 2015 Sinh viên Trần Thanh Hoa Trần Thanh Hoa i Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp
 Khoa công nghệ sinh học MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC BẢNG vi MỞ ĐẦU PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu rong biển giới 1.1.1 Giới thiệu chung rong biển 1.1.2 Rong Sụn 1.1.2.1 Đặc điểm sinh học rong Sụn 1.1.2.2 Giá trị dinh dưỡng, nuôi trồng nguồn lợi khai thác Rong Sụn 1.1.3 Rong Nho 13 1.1.3.1 Đặc điểm sinh học 13 1.1.3.2 Giá trị dinh dưỡng, nuôi trồng khai thác rong Nho 14 1.1.4 Rong Câu 17 1.1.4.1 Đặc điểm sinh học 17 1.1.4.2 Giá trị dinh dưỡng, nuôi trồng nguồn lợi khai thác 18 1.2 Tình hình nghiên cứu rong biển Việt Nam 20 1.2.1 Đa dạng nguồn lợi rong biển Việt Nam 20 1.2.2 Hiện trạng khai thác nuôi trồng rong biển Việt Nam 22 1.3 Kỹ thuật RAPD 24 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Vật liệu, hóa chất, thiết bị dùng nghiên cứu 26 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 26 2.1.2 Hóa chất 26 2.1.3 Thiết bị dụng cụ 27 2.2 Phương pháp tiến hành 27 2.2.1 Tách chiết ADN tổng số theo ZR Plant/Seed Kit 27 Trần Thanh Hoa ii Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp
 Khoa công nghệ sinh học 2.2.2 Phản ứng RAPD-PCR với mồi ngẫu nhiên 28 2.3 Điện di gel agarose …………………………………………………29 2.3.1 Chuẩn bị gel agarose 29 2.3.2 Điện di đọc kết 29 2.4 Xử lý số liệu 30 PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 31 3.1 Tách chiết ADN tổng số 31 3.3 Xây dựng phát sinh chủng loại mẫu rong 37 KẾT LUẬN 41 KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 Trần Thanh Hoa iii Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp
 Khoa công nghệ sinh học DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ đầy đủ % Phần trăm ‰ Phần nghìn Độ C C ADN Axit Deoxyribo Nucleotide Bp Số cặp base dNTP Deoxynucleotide DNA Deoxyribonucleic acid mL Mililiter PCR Polymerase Chain Reaction RADP RandomlyAmplifiedPolymosphic DNA TAE Tris/acetate acid /EDTA µg Microgram Kg Kilogram Kb Kilobase µl Microliter EtBr Ethidium Bromide UV Ultraviolet AA Axit Arachidonic (C20:4n-6, C20:4n-3) DHA Axit Docosahexanenoic (C22: 6n-3) EPA Axit Eicosapentaenoic (C20:5n-3) HSĐDDT Hệ số đồng dạng di truyền µm Micrơmét mA Miliampe Trần Thanh Hoa iv Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp
 Khoa cơng nghệ sinh học DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Hình ảnh hai lồi Rong Sụn A: K alvarezii; B: K striatum Hình 1.2 Sơ đồ vịng đời rong Sụn Hình 1.3 Hình thái rong Sụn Hình 1.4 Hình thái rong Nho 13 Hình 1.5 Hình thái rong Câu 17 Hình 3.1 Ảnh hình thái 10 mẫu rong Sụn, rong Nho rong Câu 31 Hình 3.2 ADN tổng số 10 mẫu rong nghiên cứu 32 Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm RAPD-PCR với mồi ngẫu nhiên 32 OPA4, OPA10, OPL12, RA59, RA32, RA142, OPV02, OPN05 OPC19 Hình 3.4 Cây phát sinh chủng loại 10 mẫu rong biển thuộc loài K 39 alvarezii, K striatum, Eucheuma denticulatum, Gracilaria tenuistipitata,G bailinae C lentillifera Trần Thanh Hoa v Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp Khoa công nghệ sinh học
 DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1 Danh sách 10 mẫu rong Sụn, rong Nho rong Câu sử dụng 26 nghiên cứu Bảng 2.2 Trình tự mồi ngẫu nhiên sử dụng nghiên cứu 28 Bảng 3.1 Các đoạn ADN nhân phản ứng RAPD-PCR với 34 mồi ngầu nhiên Bảng 3.2 Hệ số đồng dạng di truyền 10 mẫu rong thuộc loài K alvarezii, K.striatum, Eucheuma denticulatum, 38 Gracilaria tenuistipitata, G bailinae C lentillifera dựa vào kết RAPD-PCR với mồi ngẫu nhiên Trần Thanh Hoa vi Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp
 Khoa công nghệ sinh học MỞ ĐẦU Rong biển ngày sử dụng phổ biến rộng rãi nhiều nước giới Việt Nam, nguồn thực phẩm bổ dưỡng giàu vitamin, khoáng đa vi lượng, giàu protein, lipit, carbonhydrate chất có hoạt tính sinh học đem lại nhiều lợi ích cho sức khỏe người động vật Ngồi ra, rong biển cịn nguồn cung cấp nguyên liệu cho sản xuất sản phẩm ứng dụng lĩnh vực y dược, công nông nghiệp nuôi trồng thủy sản Hiện nay, số nhóm rong biển kinh tế rong Sụn (Kappaphycus), rong Câu(Gracilaria), rong Nho (Caulerpa), rong Đông (Hypnea), rong Mơ (Sargassum), rong Mào gà (Laurencia) đối tượng nuôi trồng rộng rãi phục vụ nhu cầu nước xuất Đây ngành nghề góp phần đáng kể làm thay đổi mặt vùng nông thôn vùng nông thôn ven biển Tuy nhiên vấn đề khai thác chế biến rong biển Việt Nam nhiều hạn chế, rong biển thường nuôi trồng thu vớt cung cấp dạng nguyên liệu thô nên giá trị kinh tế cịn thấp Ngồi ra, sản phẩm chế biến từ rong biển nước ta cịn ít, không đa dạng phổ biến nên người dân Việt Nam biết đến loại thực phẩm đặc biệt giàu dinh dưỡng Trong q trình ni trồng, số giống rong biển thường di nhập từ vùng địa lý khác trồng, xảy tượng tạp nhiễm giống, giống bị thối hóa nhanh, ảnh hưởng đến chất lượng giống gây tượng biến đổi di truyền giống mức độ khác Do vậy, yêu cầu đặt cần xác định giống rong thực thích nghi với thay đổi điều kiện môi trường ngoại cảnh để từ cung cấp sở khoa học giúp cho việc lựa chọn giống rong biển tốt để nâng cao sản lượng chất lượng lồi rong biển khai thác Để góp phần nhỏ bé việc giải vấn đề cấp thiết nêu trên, tiến hành thực đề tài “Phân tích đa dạng di truyền lồi rong biển kỹ thuật sinh học phân tử RAPD-PCR” với nội dung nghiên cứu sau: phân tích biến đổi di truyền loài rong biển thuộc chi Kappaphycus, Eucheuma, Gracilaria Caulerpa Việt Nam kỹ thuật sinh học phân tử nhờ sử dụng mồi đa hình ngẫu nhiên (RAPD-PCR) gồm OPA4, OPA10, OPL12, RA59, RA32, RA142, OPN05, OPV02 OPP19 Trần Thanh Hoa Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp
 Khoa công nghệ sinh học Công việc nghiên cứu thực Phịng Cơng nghệ Tảo, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Trần Thanh Hoa Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp
 Khoa công nghệ sinh học PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu rong biển giới 1.1.1 Giới thiệu chung rong biển Rong biển (hay gọi tảo biển) thực vật biển - nguồn cung cấp thực phẩm giàu dinh dưỡng cho người động vật Chúng thực vật thủy sinh có đời sống gắn liền với nước, thể dạng đơn bào đa bào sống thành quần thể, có kích thước hiển vi có dài hàng mét, có dạng hình cầu, hình sợi, hình phiến hay hình thù đặc biệt Hằng năm, sản lượng rong biển đại dương cung cấp cho trái đất khoảng 200 tỷ rong Các nghiên cứu cho thấy 90% cacbon tổng hợp hàng năm nhờ quang hợp môi trường nước, có 20% rong biển tổng hợp lên Rong biển thường phân bố vùng nước mặn, nước lợ, cửa sông, vùng triều sâu, vùng biển cạn… Hiện nay, rong biển sử dụng phổ biến nhiều quốc gia giới đặc biệt quốc gia ven biển để ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác Điều đem lại giá trị thực phẩm mà đem lại cho quốc gia giá trị kinh tế lớn Việc tiêu thụ sản phẩm từ rong biển trải qua thời kì lịch sử lâu dài Các nghiên cứu khảo cổ học cho thấy Nhật Bản dùng rong biển từ 10 nghìn năm trước Ở Trung Quốc, rong biển từ lâu coi đặc sản dùng ăn tầng lớp quý tộc Ngoài ra, quốc gia khác Scơtlen, Ai-len, New Zealand, quần đảo Thái Bình Dương nước Nam Mỹ… rong biển sử dụng phổ biến từ nhiều kỷ trước Hệ thống phân loại rong biển xếp sau [9]: 1- Ngành tảo Lam (Cyanophyta) 2- Ngành tảo Giáp (Pyrrophyta) 3- Ngành tảo Vàng ánh (Chrysophyta) 4- Ngành tảo Silic (Bacillariophyta) 5- Ngành tảo Vàng (Xanthophyta) 6- Ngành rong Nâu (Phaeophyta) 7- Ngành rong Đỏ (Rhodophyta) 8- Ngành tảo Mắt (Euglenophyta) Trần Thanh Hoa Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp
 9- Ngành rong Lục (Chlorophyta) 10- Ngành tảo Vịng (Charophyta) Khoa cơng nghệ sinh học Mặc dù hệ thống phân loại rong biển khác phần lớn nghiên cứu tập trung vào ngành rong Lam, Nâu, Đỏ, Lục - ngành rong có giá trị kinh tế cao, có phân bố rộng thường thấy nên hệ thống phân loại ngành rong biển Việt Nam nói riêng giới nói chung thường xếp theo trật tự sau: 1- Ngành tảo Lam (Cyanophyta) 2- Ngành rong Nâu (Phaeophyta) 3- Ngành rong Đỏ (Rhodophyta) 4- Ngành rong Lục (Chlorophyta) Hiện nay, thức ăn có nguồn gốc từ biển ngày đóng vai trị quan trọng đời sống hàng ngày người chúng có hàm lượng dinh dưỡng cao, có giá trị kinh tế nguồn nguyên liệu cho y học, dược phẩm, công nghiệp, nhiên liệu sinh học… Trong giới tự nhiên, rong biển có vai trị quan trọng Nó thể sinh vật có khả hấp thụ CO2 thải O2 thơng qua q trình quang hợp nên có vai trị điều hồ khơng khí khí Ngồi ra, rong biển phân bố chủ yếu vùng thềm lục địa rong biển phát triển tạo thành vành đai vững bảo vệ tàn phá tác động lớn sóng gió Bên cạnh đó, nơi rong biển phân bố thường nơi trú ngụ sinh sống nhiều loài sinh vật biển động vật thân mềm, da gai, chân khớp, cá… Tuy vậy, rong biển phát triển mạnh lại gây ảnh hưởng lớn đến trình giao thông khai thác biển gây ô nhiễm môi trường mùa rong tàn lụi 1.1.2 Rong Sụn Rong Sụn có tên thương mại Cottonii, bao gồm hai lồi là: Kappaphycus alvarezii Kappaphycus striatum, nguyên liệu cho chế biến kappa-carrageenan sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực kinh tế chế biến thực phẩm, y dược, mỹ phẩm, dệt may…[35] *Vị trí phân loại Theo Doty cộng [31] mặt hệ thống phân loại Rong Sụn (Kappaphycus alvarezii, Kappaphycus striatum) xếp sau: Trần Thanh Hoa Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp
 Khoa công nghệ sinh học 12000 bp 5000 bp 2000bp 1353 bp 1078 bp 872 bp 1650 bp 1000 bp 850 bp 650 bp 500 bp 400 bp 300 bp 603 bp 300 bp 281 bp 271 bp 234 bp 200 bp 100 bp OPP19 Trần Thanh Hoa 33 Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp Khoa công nghệ sinh học
 Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm RAPD-PCR với mồi ngẫu nhiên OPA4, OPA10, OPL12, RA59, RA32, RA142, OPV02, OPN05 OPP19 Giếng đến 10 tương ứng với mẫu có số thứ tự từ đến 10 Giếng M1: Thang ADN chuẩn 1kb Plus ladder Giếng M2: Thang chuẩn X174 RF DNA/Hae III Fragment Các kết nghiên cứu hình 3.3 cho thấy mồi RAPD-PCR sử dụng nghiên có độ đa hình cao Bảng 3.1 Các đoạn ADN nhân phản ứng RAPD-PCR với mồi ngầu nhiên Thứ tự mẫu 10 OPA4 4000 0 1 1 1 1 2000 0 0 1 1650 0 1 0 0 0 600 0 0 0 0 350 1 1 1 1 1 3000 0 0 0 0 2000 0 1 0 0 1300 1 1 1 1 1000 1 0 1 1 900 1 1 0 0 0 700 1 1 1 600 0 0 0 0 OPA10 Trần Thanh Hoa 34 Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp Khoa công nghệ sinh học
 OPL12 4000 0 0 0 0 2000 0 0 0 0 1500 0 0 0 0 1353 0 0 1 1 1000 1 1 1 0 900 0 0 0 700 0 0 0 600 0 0 1 500 1 1 1 1 1 1300 1 1 1 1 1000 0 0 0 1 1 800 0 0 0 0 600 0 0 0 0 550 0 0 0 0 500 1 1 1 1 4000 1 0 0 0 0 1300 0 0 1 0 1000 0 1 0 0 850 0 0 0 0 650 0 0 1 0 0 500 0 0 0 0 1500 0 1 1 1300 1 1 1 1 1 1000 1 0 1 1 900 0 0 1 0 500 0 0 0 1 RA59 RA32 RA142 Trần Thanh Hoa 35 Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp Khoa công nghệ sinh học
 400 0 0 1 0 0 2000 0 1 0 1 1500 0 1 0 0 1300 0 1 1 1 1000 1 0 1 1 1 850 1 0 1 1 1 600 1 0 1 1 500 1 0 1 0 400 1 0 0 0 2000 0 0 1 1300 1 0 1 1000 1 1 1 1 900 0 1 1 1 600 1 1 1 500 1 0 0 0 0 400 1 1 1 1 2000 1 0 0 0 1650 1 1 1 1 1200 1 1 0 0 1000 1 0 0 0 800 0 0 0 1 700 0 1 0 0 300 0 0 0 0 200 0 0 0 0 OPN05 OPV02 OPP19 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi ngẫu nhiễn chúng tơi trình bày hình 3.3 Các băng ADN nhân phản ứng RAPD-PCR với Trần Thanh Hoa 36 Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp
 Khoa công nghệ sinh học mồi ngẫu nhiên tổng kết bảng 3.1 Kết thu có 62 băng ADN rõ nét, có kích thước khác nhau, có băng chung cho 10 mẫu rong (chiếm 4,84%), băng lại 59 băng đa hình (chiếm 95,16%) Các băng chung cho 10 mẫu sau: mồi OPA4- 350 bp; OPL12 – 500 bp; RA142 – 1300 bp Trong đó, mồi OPL12 nhân băng; mồi OPP19, OPN05, nhân băng; mồi OPA10, OPV02 nhân băng; mồi RA59, RA32, RA142 nhân băng; mồi OPA4 nhân băng tương ứng mồi Kích thước băng thay đổi từ 200bp (OPP19) đến 4000bp (OPL12) Điều chứng tỏ 10 mẫu rong nghiên cứu có sai khác di truyền lớn Khi phân tích tính đa hình mẫu dịng với chúng tơi nhận thấy rằng: Đối với mẫu K alvarezii xanh nâu (mẫu 2): có tổng số 28 băng với kích thước từ 400 bp 4000 bp Trong đó, 24 băng chung cho hai dòng chiếm 85,71% băng đa hình chiếm tỉ lệ 14,29% mẫu Gracilaria tenuistipitata, G bailinae G bailinae CR (mẫu 5, 9): có tổng số 53 băng với kích thước dao động từ 200 bp đến khoảng 4000bp Trong có băng chung cho mẫu, chiếm 16,98 % băng đa hình chiếm 83,02 % Có marker chung cho mẫu nói là: mồi OPA4- 4000, 350 bp; OPA10- 1300 bp; OPL12-1000, 500 bp; RA32-100 bp; RA142 – 1300 bp; OPN05 – 1300 bp; OPV2 – 900bp mẫu Caulerpa lentillifera (mẫu 7, 10): có tổng số 36 băng với kích thước dao động từ 400 bp đến khoảng 4000bp Trong có 14 băng chung cho mẫu, chiếm 38,89% 22 băng đa hình chiếm tỉ lệ 61,11% Có 14 marker chung cho mẫu thuộc loài Caulerpa lentillifera là: mồi OPA4 – 4000, 350 bp; OPA101300, 700bp; OPL12- 1350, 500 bp; RA59- 1300, 1000, 500 bp; RA142-1300, 1000 bp; OPN05- 1300, 1000, 850 bp 3.3 Xây dựng phát sinh chủng loại mẫu rong Sự khác mức độ phân tử biểu hệ số đồng dạng di truyền mẫu loài hay loài khác Hệ số đồng dạng di truyền cao mối quan hệ di truyền lồi hay dịng gần Trần Thanh Hoa 37 Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp Khoa cơng nghệ sinh học
 Chúng ta phân chia mức độ giống (hay gần mặt di truyền) mẫu sau: - Nếu hệ số đồng dạng di truyền mẫu hay lồi > 0,92 chúng coi gần mặt di truyền coi một, khó phân biệt chúng mặt di truyền - Nếu hệ số đồng dạng di truyền