Nghiên cứu sinh tổng hợp và thu nhập poly y glutamic axit và hướng ứng dụng trong thực phẩm

MỞĐẦU Tínhcấpthiếtcủađềtài Khoahọc cơng nghệ vàứng dụng củan ó đ i s ố n g n g y c n g quan tâm giới nói chung Việt Nam nói riêng Nhữngứng dụng khoa học công nghệ vào sống ngày thểhiện quan trọng củalĩnh vựcnày.C c h ợ p c h ấ t c ó n g u n g ố c thiên nhiên dần thay hợp chất có nguồn gốc hóa học Sự pháttriển công nghệ sinh học giúp xã hội phát triển theo hướngthích ứng với tự nhiên, q trình tổng hợp hợp chất tự nhiên từ visinhvậtđanglàđiểmđếncủacácnhànghiêncứu.Cáchợpchấtcónguồn gốc tự nhiên thu nhận từ vi sinh vật nhờ việc tổng hợp từchutrìnhsốngcủachúng.Sovới cáchợpchấtđượctổnghợpbằngcon đường hóa học, tổng hợp phương pháp sinh học có nhữngưu điểm vượt trội như: an toàn cho sứck h ỏ e c o n n g i , t h â n t h i ệ n vớimơitrườngvàcótínhchấtbềnvững Axit poly γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóglutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóγ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA) có tính chất polyme, cóthểđược tạo cách sử dụng axit glutamic thơng qua phươngthức tổng hợp hóahọc để tạo ra, cách thứhai sửd ụ n g v i s i n h v ậ t có khả tổng hợp polyme từ trình sinh trưởng phát triểncủa vi sinh vật Bản chất polyme có khả phân hủy,khơng độc với người, tự nhiên nên γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA nghiên cứuvà ứng dụng nhiều lĩnh vực.Trong ngànhcơngnghiệpxửlýmơitrườngγ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGAđượcsửdụnglàmchấtkếttụ,hỗtrợqtrìnhlắng, thay dần chất kết tụ có nguồn gốc hóa học Trong cơngnghiệp sản xuất thực phẩm γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA sử dụng dạng phụgiaổn định chất lượng sản phẩm,t r o n g y dược γ -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có P G A d ù n g nhưcác chấtmang,chấtgiữẩm Theo số tài liệu nghiên cứu cho thấy vi khuẩnBacilluscó khảnăngsinh tổnghợpγ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGAkhơngchỉcótrongcácsảnphẩmnướcngồi mà phân lập từ sản phẩm thực phẩm truyềnthống Việt Nam Tương Bần, Tương Nam Đàn, Nước Mắm,Chao…Từ thực trạng nghiên cứu γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có PGA sản xuất ứngdụng Việt Nam cho thấy cần có nghiên cứu rộnghơnvề tính chấtưu việtcủavi khuẩnBacilluscũng nhưc c s ả n phẩm vi khuẩn tạo Hơn việc tạo sản phẩm cónguồn gốc từ q trình lên men xu hướng phát triển,bởit í n h a n t o n , k h ả n ă n g ứ n g d ụ n g c a o , í t ả n h h n g đếnmôi trường sống Để đáp ứng nhu cầu đề tài “Nghiên cứu sinh tổnghợp thu nhận axit poly γ glutamic hướng ứng dụng trongthực phẩm”ra đời nhằm khai thác những điểm mạnh vikhuẩnBacillusvàtạo ran h ữ n g s ả n p h ẩ m m i đ p ứ n g n h ữ n g n h u cầubứcthiếtcủaxã hộihiệnnay Mụctiêunghiêncứucủaluậnán:  Nghiêncứucôngnghệsảnxuấtaxitpolyγglutamic từvi sinh vật  Ứng dụng chế phẩm axit poly γ glutamic vào sảnphẩmthực phẩm Nộidungnghiêncứugồm  Phân lập, tuyển chọn định danh chủng vi sinh vật cókhảnăngsinhtổnghợpγ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGAtừcácsảnphẩmthựcphẩmlênmentruyềnthống  Khảosátvàtốiưucácđiềukiệnnicấychochủnglựa chọnđểthíchhợp sinhtổnghợp axitpolyγglutamic  Tinhsạch,thu nhận vàkhảosátcácđặcđiểmcủaaxitpolyγ glutamic  Bướcđầuứngdụngthử nghiệmaxitpolyγglutamicvào mộtsốsảnphẩmthực phẩm Nhữngđónggópmớicủaluậnán  Luận án nghiên cứu cách có hệ thống công nghệthu nhận axit poly γ glutamic từ việc phân lập, tuyển chọn chủnggiống vi sinh vật, tối ưu hóa điều kiện nuôi vi khuẩn sinh tổnghợp γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA, tách, tinh sạch, thu nhận đến việc xác định cấu trúc vàđặctínhcủaγ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA  Bước đầu ứng dụng có hiệu γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA việc ổn địnhtrạng thái, màu sắc, hương vị nước cam chế biến bảoquản,cũngnhư cảithiệnđộ giòn,dai,màu sắctrongsảnxuấtgiò  Bố cục luận án: Luận án gồm 120 trang với 36 bảng sốliệu 53 hình 130 tài liệu tham khảo ngồi nước; đó:Mở đầu (γ-PGA) có tính chất polyme, có2 trang); Chương Tổng quan (γ-PGA) có tính chất polyme, có37 trang),C h n g V ậ t liệu phương pháp nghiên cứu (γ-PGA) có tính chất polyme, có11 trang), Chương Kết vàthảo luận (γ-PGA) có tính chất polyme, có58 trang), Chương Kết luận (γ-PGA) có tính chất polyme, có1 trang), Danh mục cáccơng trình nghiên cứu với báo cơng bố (γ-PGA) có tính chất polyme, có1 trang), Tài liệuthamkhảo(γ-PGA) có tính chất polyme, có10trang) Chương 1.TỔNGQUAN Phầntổngq u a n tàiliệut ổ n g h ợ p c c n g h i ê n c ứ u t r o n g nư c v ngồ inước đềcậpđếncác vấnđềchínhsau: 1.1 Giớithiệuvềaxitpolygammaglutamic 1.2 Tình hình nghiêncứu γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGAtrênthếgiớivàViệtNam 1.2.1 Tìnhhìnhnghiêncứuγ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGAtrênthếgiới 1.2.2 Tìnhhìnhnghiêncứuγ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGAởViệtNam 1.3 Cơ chếsinhtổnghợpγ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA 1.4 Tínhchất γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA 1.5 Phânloạiγ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA 1.6 Hệvikhuẩnsinhtổnghợp γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA 1.7 Cácyếutốảnhhưởngđếnqtrìnhsinhtổnghợpγ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA 1.7.1 Ảnhhưởngcủanguồn dinh dưỡng 1.7.2 Ảnhhưởngcủayếu tốngoạicảnhđếnqtrình lênmen 1.7.3 Phươngpháplên menγ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA 1.8 Xácđịnhvàđánhgiá chấtlượngvà γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA 1.8.1 Địnhtínhvàđịnhlượngγ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA 1.8.2 Thunhận vàtinhsạchγ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA 1.8.3 Đánh giácấu trúcvàkhốilượngphântử củaγ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA 1.8.4 Xácđịnhkhốilượngphântửγ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA 1.9 Ứngdụngγ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA 1.9.1 Tronglĩnhvựcmơitrường 1.9.2 Tronglĩnhvựcydược 1.9.3 Tronglĩnhvựcnông nghiệp 1.9.4 Tronglĩnhvực côngnghiệpthực phẩm Chương 2.VẬTLIỆUVÀ PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 2.1 Vậtliệu 2.1.1 Nguồn phân lập: tương Bần, tương Nam Đàn, chao ĐạiBìnhDương,mắmRươiTứKỳ,Natto-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có NhậtBảnvàThuaNao-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóThái 2.1.2 Hóachất:Agarrose(γ-PGA) có tính chất polyme, cóMerck),ethidiumbromide,PCRbuffer (γ-PGA) có tính chất polyme, cóBioLabs), dNTP (γ-PGA) có tính chất polyme, cóBioLabs), Taq polymerase (γ-PGA) có tính chất polyme, cóBioLabs), kittinh sản phẩm PCR (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPromega), cặp mồi đọc trình tự 16SF và16SR(γ-PGA) có tính chất polyme, cóInvitrogen),markerprotein(γ-PGA) có tính chất polyme, cóhãngSigma) 2.1.3 Môitrườngnuôicấy:môitrườngLBvàđặchiệuE 2.1.4 Dụng cụ thiết bị: Máy đo mật độ quang -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có Ultrospec2000 uv/vis (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPharmacia Biotech); Máy li tâm lạnh -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóAvanti TM 30CentifugeBeckman(γ-PGA) có tính chất polyme, có Đ ứ c ) ; Máyđ o c ấ u trúc-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có TextureAnalyser TA.XTP l u s (γ-PGA) có tính chất polyme, có Đ ứ c ) ; M y đ o p h ổ h n g n g o i N i c o l e 0 F T -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có I R (γ-PGA) có tính chất polyme, cóĐức);ThiếtbịlênmenphịngthínghiệmBioTron(γ-PGA) có tính chất polyme, cóHànQuốc) 2.2 Phươngphápnghiêncứu 2.2.1 Phươngphápvisinhvàsinhhọcphântử:sửdụngbộkit API50CHB(γ-PGA) có tính chất polyme, cóBioMérieux,Pháp)vàgiảitrìnhtựgen16SrRNA 2.2.2 Khảosát, đ n h giá y ế u t ố ả nh h n g đến k h ả s i n h t hợpγ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGAtheophươngphápđơnyếutố 2.2.3 Phươngp h p t o n h ọ c -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có tốiưuđiề uk i ệ n nuôic ấ y theo quyhoạchthựcnghiệm-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóBox-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóBehnken vớiphần mềmDesginExpert 2.2.4 Phương phápphân tíchhóalý,hóasinh:Đoquang,HPLC,GPC,SDS-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có PAGE,đođộquaycực,đohuyềnphùKrop 2.2.5 Phươngpháp đánhgiácảmquan 2.2.6 Nghiên cứu đánh giá mức độ ảnh hưởng γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có PGAđến chất lượng giò lụa phương pháp đo lực nén, lực cắt vàcườnglực gel Chương 3.KẾTQUẢ VÀTHẢOLUẬN 3.1 Phânlậpvàtuyểnchọnvikhuẩn c ó k h ả năngs i n h tổng hợpPolyγ-glutamic.glutamic Từ mẫu, phân lập môi trường thạch LB, sau quan sáthình thái khuẩn lạc, hình thái vi khuẩn, kết sau thu 27chủng vi khuẩn tổng số 40 chủng vi sinh vật qua phươngpháp hình thái, nhuộm bào tử, nhuộm gram Tiến hành nuôi cấy 27chủng vi khuẩn môi trường đặc hiệu, thu chủng phânlập chủng có khả phát triển mạnh môi trường đặchiệu sau 72 h nuôi cấy Từ chủng thu thông qua nuôi cấy trênmôi trường đặc hiệu E, cho thấy hai chủng B5 T1 hai chủng tạorađộnhớtlớnnhấttừ5,2– 5,3cp Hình3.1 Sựtạomàngcủacácchủngvikhuẩntrênmơitrườngđặchiệu Phương pháp sử dụng độ nhớt để đánh giá khả sinh tổng hợpγ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA củacácchủng chỉmang tính chấtđịnh tính,đượcnhiềunghiên cứu sử dụng thước đo γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA Tuy chưa thể kết luậncó γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA thành phần dịch nhớt,đ ể c h ứ n g m i n h t r o n g d ị c h nhớt có γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có PGA, tiến hành kết tủa phần dịch nhớt thủy phân kết tủabằngHCL6N, dịch sau thủy phân đem thẩm tách loại muốivà chạy sắc ký mỏng dịch sau thẩm tích với mẫu chuẩn axitglutamic chất hiển thị màu ninhydrin Kết cho thấy băngchạy dịch nhớt sau thủy phân từ chủng B5 xuất vết vịtrí tương đương với vết axit glutamic chuẩn Điều chứng tỏdịch nhớt canh trường lên men có chứa γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA Để đánh giáchính xác khả sinh γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA, chủng tạo màng lầnnữa đem nuôi môi trường đặc hiệu thu nhận sau 24 h.Đem xử lý định lượng γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA đo phổ hấp thụ quang tạivùng tử ngoại Nghiên cứu cho thấy cho thấy hàm lượng γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA tạothành cao hai chủng B5 T1 với giá trị 5,564 g/lvà 5,041 g/l sau 96h nuôi cấy khả sinh γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có PGA mạnh làthờiđiểm96hcủacác chủngphânlậpđược Dựa kết đo độ nhớt, đo hàm lượng γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA bằngphương pháp phổ tử ngoại đặc điểm hình thái thấy hai chủngvi khuẩn có mã hiệu B5 T1 có khả sinh tổng hợp γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA lớnnhấttrong số chủng vi khuẩn phân lập được.T r ê n c s đ ó l ự a chọn hai chủng vi khuẩn B5 T1 để nghiên cứu sinh tổng hợp γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA 3.2 Địnhdanhchủng vikhuẩnsinhγ-glutamic.PGA 3.2.1 Địnhdanhtheođặcđiểmhìnhtháikếthợpvớisử dụng kitAPI 50CHB Dựa vào kết phân loại theo đặc tính: hình thái khuẩn lạc,tế bào, khả sinh bào tử, khả nhuộm Gram, nhu cầu oxy,ảnhhưởngcủapH,nồngđộmuối Đánh giá khả sử dụng loại đường chủng với KitAPI50 CHB đối chiếu với phần mềm nhận dạng API PLUS đểđánhgiáthuđượckếtquảtrongbảng3.6 TT 10 11 12 13 14 Bảng3.6.Kết quảsửdụngcarboncủavikhuẩnB5vàT1bằngKit API 50CHB Khả Khảnăngsử sửdụng dụng Phépthử TT Phépthử B5 T1 B5 T1 Đốichứng -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có 25 Esculin + + Glycerol + + 26 Salixin + + Erythritol -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có 27 Xelobiose + + D-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóArabinose -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có 28 Mantose + + L-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóArabinose + + 29 Lactose + + Ribose + + 30 Melibiose + -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có D-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóXylose -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có + 31 Saccarose + + L-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóXylose -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có 32 Trehalose + + Adonitol -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có 33 Inulin -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóMetyl-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóD-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có 34 Melezitose -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có Glucozit Galactose -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có 35 Rafinose + + Glucose + + 36 Tinhbột + + Fructose + + 37 Glycogen + + Manose + + 38 Xylitol -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có Sorbose -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có 39 Gentiobiose + + 15 Rhamnose -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có 40 D-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóTuranose + -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có 16 Dulxitol -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có 41 D-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóLyxose -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có 17 18 19 Inozitol Mannitol Sorbitol -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóMetyl-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóD-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có Manozit -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóMetyl-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóD-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có Glucozit N-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóAcetyl-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có Glucosamin Amygdalin Arbutin + + + + + + 42 43 44 D-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóTAgartose D-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóFucose L-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóFucose -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có 45 D-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóArabitol -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có + + 46 L-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóArabitol -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có + 47 D-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóTAgartose -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có 20 21 22 23 24 -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có + 48 2-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóketogluconat -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có + + 49 5-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóketogluconat -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có (+):Phảnứngdươngtính (-):Phảnứngâmtính Sau kết hợp việc đánh giá dựa đặc điểm sinh lý, sinhhóavà phầnmềmAPIPLUSchothấychủngvikhuẩnB5cóđộtương đồng vớiB subtilislà 98% độ tương đồng vi khuẩn T1vớiloàiB.subtilislà73% 3.2.2 Địnhtênbằng phương phápsinhhọcphântử: Trình tự đoạn gen giải trình tự hệ thống máy ABI3103XL, xác định đoạn gen 16S rRNA chủng B5 có 1250bp T1 1516bp (γ-PGA) có tính chất polyme, cóphụ lục) Phân tích mối quan hệ phát sinhlồi tiến hành dựa thuật toán Maximum Likelihood, sửdụngphầnmềmP h y l o g e n y v i d ữ l i ệ u t r ê n n g â n h n g g e n N B C I , cho thấy chủng vi sinh vật B5 T1 có quan hệ gần nhất(γ-PGA) có tính chất polyme, có98-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có99%) vớilồiB.subtilis Hình 3.6 Cây phát sinh chủng (B5) dựa trình tự gen mã hóa 16S rRNAKếtquảđịnhdanh bằnghaip h n g p h p h ó a s i n h v p h n g phápsinhhọc phântửchothấychủngvikhuẩnB5làchủngvikhuẩncóđộtương đồng 98-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có 99%vớiB.SubtilisBA-71 Từ kếtquảt r ê n , luậná n đ ã đ ề x u ấ t đ ị n h t ê n c h o c h ủ n g v i k h u ẩ n n y l B a c i l l u s subtilisB5.ĐốivớichủngT1saukhiđịnhdanhbằn gphươngpháphóasinhchothấycóđộtươngđồnglàlà73%vàphương phápsinhhọcphântửchokếtquảcóđộtươngđồngvớiB.subtilisC-39(γ-PGA) có tính chất polyme, có 8-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có 99%)nênchưathểkếtluậnchủngT1thuộclồiB.subtilis 3.3 Nghiêncứucácyếutốảnhhưởngđếnqtrìnhsinh tổnghợpγ-glutamic.PGA 3.3.1 Nghiêncứutiềnchất thíchhợpcho sinhtổng hợp γ-PGAPGA Những nghiên cứu sinh tổng hợp γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA cho thấy tiền chất đểtạo thành γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA chủ yếu hợp chất glutamic, glutamat hay bột đậutương Việc bổ sung đậu tương dạng bột vào canh trường lên menkhơng làm tăng lượng γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA, khơng bổ sung đậutương gây ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng vi khuẩn, ảnhhưởng đến hình thành γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA Trong mơi trường có chứa natriglutamat,hàm lượngγ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có PGAtạothànhcaohơntrongmơitrườngcó chứa glutamic Như sử dụng natri glutamat làm nguồn tiềnchấttrongqtrìnhtạoγ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGAthaythếchoaxitglutamictrongtồnbộqtrìnhnghiêncứu 3.3.2 Ảnhhưởngcủanhiệtđộ B subtilislà lồi vi khuẩn ưa ấm có khả sinh trưởng pháttriển tốt dải nhiệt độ từ 30 oC đến 45oC Để tìm chế độnhiệtthích hợpchosinhtổnghợpγ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA,tiếnhànhsửdụngmơitrường nghiên cứu có natri glutamat, điều kiện nuôi tĩnh, lênmen nhiệt độ 30 oC; 35oC; 40oC 45oC 50oC để nuôi cấy,thunhận kếtquả 24h mộtlần, kếtthúc trình lênm e n s a u t h i gian 120h Kết nghiên cứu thể qua đồ thị hình 3.9 KếtquảnghiêncứuchothấychủngB subtilisB5 có khả sinh tổnghợp γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA cao ởnhiệtđộ 40 oC, tạo raγ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA đạt giát r ị l n nhất9,07g/ltạithờiđiểm96hlênmen 3.3.3 Ảnhhưởngcủatốc độlắc Tốcđộlắccủaq u t r ì n h lênmenđược khảosátởtốcđôtừ0 –200 v/p,tốc độ lắc làt h ô n g s ố đ n h g i m ứ c đ ộ c u n g c ấ p k h í c h o mơitrườnglênmen Hình 3.9 Ảnh hưởng nhiệt độđếnquátrìnhsinhtổnghợpγ-PGA Hình 3.10 Ảnh hưởng tốc độ lắcđếnquátrìnhsinhtổnghợpγ-PGA Kết biểu diễn hình 3.10 cho thấy: lượng γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA đạt giá trịlớn tốc độ v/p (γ-PGA) có tính chất polyme, có10,36 g/l ), tốc độ lắc cao xu hướnghình thành γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA giảm Đối với mẫu ni tĩnh không tạo áplựctácđộnglênlớp vỏ tế bào,n ê n s ự h ì n h t h n h γ -glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, có P G A k h n g b ị ảnh hưởng, việc cung cấp oxy hòa tan cho mơi trường lên men trongbình tam giác củacácmẫuthí nghiệm vừađủ đểv i k h u ẩ n s i n h trưởng tổng hợp γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA Do vậy, phương án ni tĩnh lựachọnchocácqtrìnhnghiêncứutiếp theotrênquymơthínghiệm (γ-PGA) có tính chất polyme, cóđấth o t tính)haitácnhânnàycótácdụnghấpthụmàuvàhấ p thụmùi sản phẩm nên khơng có mùi lạ phương pháp lại Dovậy phương pháp tinh γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA lựa chọn cho nghiên cứutiếptheolàphươngpháp1nhưsau: Hình1.4.Quytrìnhtinhsạchγ-PGAtheophươngphápcủaHovàcộngsự 3.7.3 Kiểmtr am ứ c đ ộ tinhs ạc h c ủ a s ả n p hẩ m p h n g phápsắc ký lỏngcaoáp(HPLC) Để đánh giá mức độ tinh sản phẩm, việc kiểm traprotein, carbonhydrat có sản phẩm sau tinh sạch, ta cịn có thểkiểm tra axit amin cịn lại sau trình tinh phươngpháp sắc ký lỏng cao áp sản phẩm γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA Kếtq u ả s ắ c k ý c h o t h ấ y có hiển diện axit L-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóglutamic, ngồi có peak nhỏ thểhiệnsựlẫntạpchấttrongsảnphẩmsauthủyphân,hình3.22 3.7.4 Đánh giá chất lượng sản phẩm tinh qua kính hiển viđiệntửqt Mẫu thơ cịn lẫn nhiều tạp chất nên cấu trúc γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA chưa hiển thị rõ cấu trúc khối, hiển thị nhìnthấy dạng phẳng hai chiều, khơng làm rõ cấu trúc phântử γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA mẫu tinh mẫu chuẩn Giữa mẫu tinhsạch mẫu chuẩn thấy rõ nét cấu trúc γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, cóPGA dạngkhơng gian ba chiều Mẫu tinh thể cụm nhỏ liên