Nghiên cứu thu nhận hoạt chất kìm hãm α glucosidaza từ aspergillus oryzae và hướng ứng dụng

Đặtvấn đề

Xã hội ngày càng phát triển với những thành tựu lớn của khoa học công nghệ và sựnghiệp Công nghiệp hóa– Hiện đại hóa.Bên cạnh những thành tựu đạt được làh ậ u q u ả ảnh hưởng tớimôi trường sống của nhân loạimà con người làđối tượng trực tiếpg á n h chịu hậu quả đó Môi trường ô nhiễm kéotheosự ảnh hưởng không nhỏ tớil ư ơ n g t h ự c thực phẩm dẫn tới những căn bệnh hiểm nghèo trong số đó phải kể đến bệnh đái tháođường(ĐTĐ).

Theo dự báo của Hiệp hội đái tháo đường Quốc tế IDF, trong một thập kỉ trở lại đây,bệnh ĐTĐ có xu hướng phát triển nhanh chóng Ước tính năm2010, thế giới có khoảng221 triệu người mắc bệnh ĐTĐ và dự báo đến năm2025sẽ lên tới 330 triệu người (chiếmkhoảng 6% dân số toàn cầu) Tỷ lệ người mắc bệnh ĐTĐ ở các nước phát triển khoảng42%, tỷ lệ này tăng lên170%ở các nước đang phát triển (như ViệtNam)[ 1] Theo Tổchức Y tếthếgiớiWHO(World Health Organization), trong vòng 20nămtớichỉt í n h riêngchâuÁ,bệnhĐTĐbùngphátvớikhoảng330 triệungười mắc bệnhsẽnguyhiểmhơn AIDS hay cúm gà Ở châu Âu, năm 2005 có khoảng 19 triệu người mắc tương đươngvới 4% dân sốvàcon sốnàyđượcdự báotănglệ26 triệu vào năm 2030[160].

Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) và thừa cân béo phì đã trở thành căn bệnh phổ biếnkhông chỉ ở các nước phát triển mà còn ở nước đang phát triển, do thay đổi trong lối sốngcủa người dân và thói quen ăn uống Chất kìm hãm α-glucosidase (AGIs) thường được sửdụng để ngừa bệnhĐTĐ loạiII [53].Với cơ chế tác dụng là AGIskếthợpvớiα- glucosidase ở ruột làm kìm hãm sự thủy phân tạo thành glucose, ngăn hấp thụ glucoseđường huyết sau ăn [85] AGIs có thể được tạo ra bằng nhiều con đường khác nhau như:Chiếtxuấttừthựcvật,tổnghợpbằngconđườnghóahọchoặcbằngconđườngsinhh ọc nhờcácvisinhvật.CácAGIscónguồngốctựnhiênđươc đă c biêṭquantâmvìkhônggây phảnứngphu, dođóAGIstựnhiênlàmộttrongnhữngliệupháphấpdẫnđểđiềutrịtăng đường huyết và thừa cân béo phì Gần đây cónhiều nghiên cứu về các AGIs từnguồn visinh vâṭ nhưBacillus subtilis,Actinoplanesspp,Aspergillus oryzae(A.oryzae) AGIs đượctìm thấy trong nhiều thực phẩm lên men, được đánh giá cao về hoạt tính kìm hãm α-glucosidase, ứngdụnghỗtrợ trị bệnh ĐTĐvàthừacân béo phì SửdụngA.oryzaebằnglên men bề mặt trên môi trường rắn đỗ tương đang là hướng mới cho chất chiết xuất có hoạttínhkìmhãmα- glucosidase,sảnphẩmAGIstừđỗtươnglênmenbềmặttrênmôitrường rắnbằngA.oryzaehiệnđangđượcpháttriểnởnhiềuquốcgia,vớimụcđíchhỗtrợkiểmso átđườnghuyết,hỗtrợkiểmsoátthừacânbéophì.Trongcácnghiêncứuđãcôngbốchủ yếusửduṇ gđỗtương(Glycinemax)lênmenbằngA.oryzaeđểthunhân AGIs.Tuynhiên các thông tin công bố về bản chất và cơ chế hình thành AGIs từ các loại đậu đỗ lên men bềmặt trên môi trường rắn băngA.oryzaecòn hạn chế Chính vì thế, việc nghiên cứu có hệthống thu nhận AGIs từA.oryzaelên men trên các nguồn nguyên liệu trong nước và hướngứngdụngởđiềukiệnhiệntạicủaViệtNamlàvấnđềcấpthiết,mangýnghĩakhoahọcvà thựctiễncao“Nghiêncứuthunhậnhoạtchấtkìm hãmα-glucosidazatừ Aspergillus oryzaevà hướng ứng dụng” là một việc làm cấp thiết hiện nay, được tiến hành với những mục tiêusau:

(1) Phânlập,tuyểnchọnA.oryzaephùhợp(choquátrìnhlênmenbềmặttrênmôitrườngrắn)ch o hoạt tính kìm hãm α-glucosidasecao.

(2) Xácđịnhđiềukiệnlênmenmặttrênmôitrườngrắnphùhợpchoquátrìnhnhângiống,sinhtrưởn gvàhình thành AGIsbằngA.oryzaenghiên cứu.

(4) Tinhchế, xácđịnh thành phầnhóahọc AGIshình thành bằngA.oryzaenghiêncứu.

A.oryzaenghiêncứu. Đểđạt đượcmục tiêuđềra, luậnán đượctiến hànhvới nộidungsau:

Nội dung

-Phần1:TuyểnchọnA.oryzaechohoạttínhkìmhãmα-glucosidase cao:

+ Phân lậpA.oryzaetừ các mẫu tương, mẫu đỗ đen mốc; đỗ xanh mốc; đỗ tươngmốc và gạo mốc lấy ở Bần, Yên Nhân, Hưng Yên; Cựu Đà, Thanh Oai, Hà Nội và

+TuyểnchọnA.oryzaephân lậpđược, cóhoạttính kìmhãm α-glucosidase cao.

+ Định danhA.oryzaetuyển chọn được dựa trên so sánh trình tự gen vùng ITS1 -

- Phần 2: Xác địnhmột sốy ế u t ố ( đ ộ ẩ m , p H b a n đ ầ u , c ơ c h ấ t m ô i t r ư ờ n g l ê n men,n h i ệ t đ ộ , t ỷ lệt r ấ u m ô i t r ư ờ n g r ắ n , đ ộ d à y k h ố i m ô i t r ư ờ n g l ê n m e n v à t h ờ i g i a n nhângiống)ảnhhưởngtớiquátrìnhnhângiốngA.oryzaenghiêncứu.

- Phần 3: Xác định một số yếu tố (độ ẩm, pH ban đầu, cơ chất môi trường lên men,thành phần K 2 HPO4; KCL và MgSO4b ổ s u n g v à o m ô i t r ư ờ n g , n h i ệ t đ ộ , t ỷ l ệ t i ế p g i ố n g ban đầu, tỷ lệ trấu môi trường rắn, độ dày khối môi trường lên men và thời gian nhângiống) ảnh hưởng tới khả năng hình thành AGIsb ằ n gA.oryzaenghiên cứu bằng lên menbềmặttrên môi trườngrắn.

- Phần 4: Nghiên cứu ảnh hưởng dung môi, nồng độ, tỷ lệ dung môi : nguyên liệu,nhiệt độ, thời gian và cường độ sóng siêu âm đến khả năng chiết xuất AGIs từ môi trườngđỗ đen xanh lòng sau lên men bề mặt trên môi trường rắn bằngA.oryzaenghiên cứu (mụctiêu3).

- Phần 5: Nghiên cứu tinh sạch, xác định thành phần hóa học và định lượng AGIsđược hình thành bằngA.oryzaenghiên cứu: Xây dựng phương pháp xác định dung môi,nồng độ dung môi cho tinh sạch sơ bộ AGIs; Thu nhận AGIs bằng các enzyme thủy phânlầnl ư ợ t v ớ i p e p s i n , t r y p s i n , p a n c r e a t i n , α - a m y l a s e v à m a l t a s e ; X â y d ự n g p h ư ơ n g p h á p tinh sạch và kiểm tra độ tinh sạch AGIs bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP -HPLC); Xác định khối lượng phân tử và trình tự amino acid của AGIs tinh sạch được phântích bằng thiết bị MALDI-TOF/TOF mass spectrometer Phổ AGIs được phân tích bằngphầnm ề m M a s c o t v à d ữ l i ệ u n g â n h à n g L u d w i g N R h o ặ c S w i s s P r o ; Đ ị n h l ư ợ n g h à m lượngAGIsbằngRP– HPLC.

+Xâydựngphươngpháp cô sấydịchchiết AGIscho tạo chếphẩm AGIs.

+Đánhgiátínhantoànvềđộctínhcấp,hoạttínhkìmhãmα-glucosidasevàantoànthựcphẩm của AGIstạorabằngA.oryzaenghiêncứu.

Đốitượngvàphạm vi nghiêncứu

Nước ta có nguồn nguyên liệu đậu đỗ rất đa dạng và nấm mốcA.oryzaephân lập từtự nhiên là rất phong phú Trong sản xuấtA G I s t ừ n ấ m m ố cA.oryzaengười ta thườngdùngđỗtươnglàmmôitrườnglênmenbềmặttrênmôitrườngrắn[100].SảnphẩmAGIs từ môi trường sau lên men bề mặt trên môi trường rắn từ đỗ tương bằngA.oryzaecho hiệuquả giảm đường huyết đối với người bệnh ĐTĐ cao, sử dụng an toàn và không có tác dụngphụ Đó là lý do thúc đẩy nghiên cứu chọn các đậu đỗ trong nước làm nguyên liệu để lênmenA.oryzaecho sản xuấtAGIs.

CácA.oryzaebản địa phân lập từ các nguồn nguyên liệu mẫu tương, mẫu đỗ đenmốc; đỗ xanh mốc; đỗ tương mốc và gạo mốc lấy ở Bần, Yên Nhân, Hưng Yên; Cựu Đà,ThanhOai, HàNội vàChợ ĐồngXuân – Hà Nội.

Phương thức lên men bề mặt trên môi trường rắn được chọn lựa dựa trên điều kiệnthínghiệm đơn giản.

Tinh sạch AGIs dùng cho nghiên cứu thành phần, hoạt tính kìm hãm α- glucosidasevàđịnh lượngAGIs đượchình thànhbằngA.oryzaenghiên cứu.

Chế phẩm AGIs kỹ thuật, chỉ qua chiết xuất, làm sạch sơ bộ có khả năng ứng dụngthựctiễn trongcải thiệnAGIsgiúp hỗtrợ điều trịở ngườibệnh ĐTĐ.

Nhữngđónggóp mới,ýnghĩa khoahọcvàtínhthựctiễn củaluậnán

Luận án nghiên cứu hệ thống từ việc lựa chọn, định tênA.oryzae, xác định bản chấtcủa AGIs và đưa ra phương án thích hợp nhất về điều kiện lên men, tách chiết hoạt chất vàhoàn thiện để có sản phẩm dạng bột chứa AGIs Bằng quy trình công nghệ tạo ra chế phẩmđã đề xuất và bản chất của AGIs từ đỗ đen lên men bằngA.oryzaecó thể ứng dụng để sảnxuấtsản phẩmcho ngườibệnhĐTĐ,gópphần nângcaochất lượngsứckhoẻcộngđồng.

Về mặt khoa học, đề tài đã đưa ra một số điểm mới: Đây là một nghiên cứu đầu tiêncủa Việt Nam tuyển chọn đượcA.oryzaecho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao trên môitrường đỗ đen xanh lòng (Vigna Cylindrica Skeels), nghiên cứu được một số yếu tố ảnhhưởng tới quá trình nhân giống và lên men hình thành AGIs Nghiên cứu đầu tiên sử dụngsóng siêu âm để chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men, tinh sạch được AGIs từ đỗ đen lênmen, xác định được khối lượng phân tử và bản chất của AGIs này là peptide Nghiên cứuđầut i ê n đ ề xu ất đ ư ợ c qu ytrìnhc ô n g nghệ s ản x u ấ t c h ế p hẩ m A G I s t ừ đ ỗ đ e n l ê n m e n bằngA.oryzaeT6 Dựa vào kết quả khoa học của đề tài cho thấy tiềm năng sản xuất chếphẩm AGIs ở quy mô lớn, tạo chế phẩm AGIs từ đỗ đen lên men cho chế biến thực phẩmchongười bênh ĐTĐvàbéo phì.

Kết quả luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thốngvề peptide có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase bằng phương pháp lên men rắn trên môitrường đỗ đen xanh lòng nhờAspergillus oryzae(từ việc phân lập tuyển chọnA.oryzae,cácđiều kiện lên men, tách tinh sạch AGIs, tạo chế phẩm, kiểm tra chất lượng, an toàn thựcphẩm) Bước đầu ứng dụng có hiệu quả chế phẩm AGIss ả n x u ấ t b ộ t ă n l i ề n Đ â y l à k ế t quả bước đầugóp phầnlàm phong phú thêm nguồn thucácchấtc ó h o ạ t t í n h k ì m h ã m alpha glucosidaseđểngăn ngừabệnh ĐTĐvàbéophì.

Bốcụcluận án

Bệnhđái tháo đường (ĐTĐ)

Bệnh ĐTĐ hay còn gọi là bệnh tiểu đường, là một bệnh do rối loạn chuyển hóacarbohydratek hi h o o c m o n i n s u l i n c ủ a t uy ến tụ y bị t h i ế u h a y giảmt á c độ ng vàoc ơ t h ể , biểu hiện bằng mứcđườngtrong máu cao hơn 7 mmol/l ĐTĐ liên quan đến rối loạnchuyển hóa glucid, lipid, protid và điện giải Những rối loạn này thường dẫn tới hôn mê vàtửvongtrongthờigianngắnnếukhôngđượcđiềutrịkịpthời.Tăngđườnghuyếtkéodàisẽ gây ra rất nhiều biến chứng nguy hiểm ở nhiều phủ tạng đặc biệt là mắt, bệnh tim, mạchvành, tai biến mạch máu não, suy thận, thần kinh, biến chứng gây mù lòa và rất nhiều biếnchứngc ấ p t í n h k h á c đ e d ọ a đ ế n t í n h m ạ n g n g ư ờ i b ệ n h R i ê n g b i ế n c h ứ n g t i m m ạ c h ở những người mắc bệnhtiểu đường tăng gấp 2- 3 l ầ n s o v ớ i n h ữ n g n g ư ờ i b ì n h t h ư ờ n g Theo ước tính, tuổi thọ trung bình của bệnh nhân tiểu đường giảm 5 -

10 năm so với ngườikhôngbị tiểu đường[1].

Theo Tổ chức Y tế thế giới(World Health Organization – WHO)[160] bệnh ĐTĐphânthành hai nhóm sau:

- Bệnh ĐTĐ typ 1 hay còn gọi là ĐTĐ phụ thuộc insulin (nồng độ insulin giảm thấphoặc mất hoàn toàn): Do tổn thương hay suy giảm chức năng tế bào beta của tuyến tụy,tuyến tụy không hoạt động tạo ra đủ insulin để cân bằng đường huyết nên bệnh nhân cầnphải tiêm hoặcuốnginsulin.

- Bệnh ĐTĐ typ 2 hay còn gọi là ĐTĐ không lệ thuộc insulin: Do kháng insulin kếthợp với khả năng bài tiết insulin giảm ĐTĐ typ 2 chiếm tỷ lệ chủ yếu của bệnh ĐTĐ, cơthể người bệnh vẫn tiết ra insulin nhưng không đủ khiến đường chỉ lưu hành trong máu màkhông đưa vào tế bào Điều trị bệnh này, người bệnh áp dụng chế độ ăn uống hợp lý có thểkiểmsoátđượcbệnh.

- ĐTĐ typ đặc biệt khác: Giảm chức năng tế bào beta do khiếm khuyết gen;giảmhoạt tính insulin do khiếm khuyết gen; bệnh tụy ngoại tiết; bệnh tụy nội tiết; tăng đườnghuyếtdo thuốc, hóachất; nhiễm trùng….

- ĐTĐt h a i n g h é n : l à b ệ n h đ ư ợ c p h á t h i ệ n ở n h ữ n g p h ụ n ữ c ó r ố i l o ạ n d u n g n ạ p glucosehoặcĐTĐkhởi phát trongthời kỳmangthai.

- Mức1: Mứckiểm soátđườnghuyết tốt, hàmlượngglucosetrongmáu 13mmol/l.

Phương pháp điều trị bệnh ĐTĐ loại 1: Những người mắc bệnh ĐTĐ loại 1, họ sẽphải tiêm insulin thường xuyên trong cả cuộc đời vì cơ thể họ không có khả năng tạo rahormon này.I n s u l i n c ó n h i ề u l o ạ i n h ư n g n ằ m t r o n g h a i d ạ n g c h í n h t ù y t h e o t á c d ụ n g nhanh hay chậm: Dạng tác dụng nhanh dùng ngay trước bữa ăn để tăng lượng insulin trongcơthểphùhợpvớilượngcarbohydratesắpnhậpvào,dạngtácdụngchậmdùngvàobu ổitối để giữ lượng đường trong máu không tăng vọt trong nhiều giờ vào hôm sau Hiện nay,việc uống insulin dạng viên là không thể vì insulin trong môi trường dạ dày sẽ bị phân hủy.Do đó, các nhà khoa học đang nghiên cứu bọc insulin trong một vỏ nang thích hợp để cóthểquađượcdạdày,giảiphóngratrongruột nonvàngấm vào máu.

Phương pháp điều trị bệnh ĐTĐ loại 2: Phụ thuộc vào tình trạng của bệnh nhân,phương pháp chữa trị gắn liền với việc ăn uống thích hợp, tăng cường hoạt động. Chỉ bệnhnhân ĐTĐ loại 2 mới dùng thuốc uống kết hợp với những chất đặc hiệu nhằm làm giảmlượng đường huyết Bệnh nhân có thể dùng riêng thuốc viên hoặc kết hợp với phương pháptiêminsulin Hoạt chất đểđiềutrị bệnh ĐTĐloại 2 chủyếu chia 3nhóm:

- Nhóm hoạt chất thúc tụy tạng tiết thêm insulin như nhóm sulfonylurea:Glyburide(Micronase, DiaBeta, Glynase), glipizide (Glucotrol, Glucotrol XL), glimepiride(Amaryl)vànhóm meglitinide: repaglinide (Pradin).

- Nhómhoạtchấtgiúpinsulinhoạtđộnghữuhiệuhơnnhưnhómbiguanide:Metformin(Glu cophage,GlucophageXR,MetforminXR);nhómthiazolidinedione:glitazone,rosiglitazone(A vandia), pioglitazone(Actos)

- Nhóm hoạt chất ngăn ruột bớt hấp thu chất đường khi ăn bằng AGIs: acarbose(Precose,Glucobay), miglitol (Glyset)

Phương pháp kìm hãmα-glucosidase trong điều trị ĐTĐ loại 2 được ưu tiên sử dụngvì cơ chế đơn giản, an toàn, chỉ xảy ra trong bộ phận tiêu hóa chứ không tham gia vào quátrìnhchuyểnhóa đường hay cảit hi ện chứcnăng củainsulin c ũn g nhưkích thích sựsảnsinhinsulin … như cácphươngpháp khác.

Cơ sở khoahọccủaviệcsửdụngAGIsđến quátrình trao đổi đườngtrongcơ thể

Enzyme là chất xúc tác sinh học có thành phần cơ bản là protein và có trong mọi tếbào sinh vật Trong cuộc sống, nhờ có enzyme mà xảy ra rất nhiều phản ứng hóa học vớimộthiệu suất rấtcao mặcdù ởđiều kiện bìnhthườngvềnhiệt độ,áp suất,pH.

Như vậy, enzyme là một loại protein xúc tác các phản ứng hóa học Trong các phảnứng này, các phân tử lúc bắt đầu của quá trình được gọi là chất nền, enzyme sẽ biến đổichúng thành các phân tử khác nhau Tất cả các quá trình trong tế bào đều cần enzyme.Enzyme có tính chọn lọc rất cao đối với chất nền của nó Hầu hết phản ứng được xúc tácbởi enzyme đều có tốc độ cao hơn nhiều so với khi không được xúc tác Có trên

Hoạt tính của enzyme chịu tác động bởi nhiều yếu tố Tác nhân kìm hãm là các phântửlàmgiảmhoạttínhcủaenzyme,trongkhiyếutốhoạthóalànhữngphântửlàmt ănghoạttính củaenzyme.

Enzymeα- glucosidasevớinhữngtênkhácnhưmaltase,glucoinvertase,glucosidoinvertase, glucosidosucrase, maltase-glucoamylase, nitrophenylα–D-glucosidase,transglucosidase,α- glucopyranosidase,glucosidoinvertase,α-D-glucosidase,α-glucosidase hydrolase,α-1,4-glucosidase, thuộc nhóm hydrolase (nhóm enzyme xúc tác các phản ứngthủyphân).

Enzyme glucosidase là enzyme thủy phân thuộc nhóm glucosidase (α-, β- và α-1,3- glucosidase) là enzyme exohydrolysis có chức năng thủy phân từ đầu khử đến đầu khôngkhử của oligosaccharide chứa các α-D-glucose nối với nhau bằng liên kết 1-4 glycosides.Enzyme glucosidase có thể có nhiều nguồn gốc khác nhau: Từ vi khuẩn, nấm mốc, đườngtiêu hóa động vật việc khác nhau về nguồn gốc α-glucosidase có thể dẫn đến sự khác biệtvề pH hoạt động, khoảng nhiệt độ hoạt động, hoạt độ của enzyme những thông số này chỉcó thể thu nhận được qua thực nghiệm trên một α-glucosidase cụ thể enzyme α-glucosidaseđược phân chia theo cấu trúc chínhgồm có gen mã hóal y s o s o m a l α - g l u c o s i d a s e d à i khoảng 20 kb. Enzyme α-glucosidase hoạt động ở pH tối ưu từ là 4 - 4,5 α-glucosidase cókhả năng phân cắt các liên kết α -1 →4, α-1 →3 và α-1 →2 D glucoside có thể hấp thụ trựctiếp vào máu [62]. α-glucosidase có tác dụng xúc tác thủy phân đường maltose và đườngsucrose.

Khi thức ăn được hấp thụ vào cơ thể thì các carbohydrate trong thức ăn được thủyphân thành những phân tử đường nhỏ hơn bởi những enzyme trong ruột non Tiến trìnhthủy phân này đòi hỏi tụy tạng phải tiết ra enzyme α-amylase dùng để thủy phân các phântử carbohydrate lớn thành oligosaccharide Enzyme α-glucosidase ở màng ruột non lại tiếptục phân hoá các oligosaccharide thành các phân tử đường nhỏ hơn nữa rồi mới thẩm thấuvàom áu B ằn g c á c h k iề m c h ế ho ạt đ ộ n g c ủa en zy me α - g l u c o s i d a s e có t h ể l àm gi ả m s ự thủyphâncủacarbohydrate vàlàm chậmsựthẩmthấu glucosevào mạch máu[73].

Cho đến nay, ĐTĐ vẫn là bệnh chưa thể chữa khỏi hoàn toàn Thuốc chữa bệnh ĐTĐđược chia thành nhóm: Biguanides, Sulphonylurea, Glinidines, Thiazolidinediones, chấtkìmhãm dipeptidyl peptidaseIVvà AGIs.

Hiện nay, rất nhiều AGIs được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi để điều trị bệnh ĐTĐnhư voglibose (U.S Pat No 6,200,958), acarbose (U.S Pat No 5,643,874), miglitol (U.S.Pat.No 4,639,436)

Các nghiên cứu trên thế giới đã làm sáng tỏ cơ sở khoa học về sử dụng AGIs để điềutrịbệnhĐTĐnhư:Tinhbộthoặcđường(sucrose),cònđượcgọilàcarbohydrate.Cấut ạo carbohydrategồm hai hay nhiều monosaccharide (glucosehoặc fructose) Đểc ơ t h ể h ấ p thụ được, carbohydrate sẽ phân cắt hoàn toàn thành các monosaccharide nhờ hệ thốngenzyme tiêu hóa Dưới tác dụng của amylase, tinh bột phân cắt thành maltose. Maltose vàsucrose là các disaccharide, dưới tác dụng của α-glucosidase các disaccharide sẽ phân cắtthành các monosaccharide ở ruột non AGIs có thể kìm hãm hoạt tính α- glucosidase nênngăn cản sự tạo thành monosaccharide từ disaccharide làm cho quá trình tổng hợp insullindiễn radễdànghơn [129].

Hình1.1M ô phỏng tiêuhóaCarbohydrate (tinhbột vàđường sucrose)trongcơthể[53]

AGIs có tác dụng làm tăng nồng độ peptide -1 dạng glucagon (GLP-1) và peptide -2dạng glucagon (GLP-2) trong huyết tương GLP-1 và GLP-2 là các hormon được sinh ra từtế bào L nội tiết nằm trong vùng ngoại biên của ruột non và ruột kết GLP-1 kích thích sựtiết insulin phụ thuộc glucose và sự sinh tế bào beta GLP-2 cải thiện cấu trúc và chức năngcủaruộtnonbằngcáchtăngcườngcấutrúccủalôngnhungvàtănghoạttínhvậnchuyển vàenzyme.GLP-2làmgiảm sựviêmruột GLP-1vàGLP-2đượctạorakhicósựkích thích thần kinh, hormon hoặc cácyếu tố dinh dưỡng.AGIsc ó k h ả n ă n g n g ă n c ả s ự p h â n cắt carbohydrate nên kéo dài thời gian có mặt carbohydrate trong ruột Vì vậy một lượnglớncarbohydratesẽđếnvùngngoạibiêncủaruộtnonvàtươngtácvớitếbàoLlàmtăn gsự tiết GLP-1 và GLP-2 Cho rằng khi có mặt glucose ở ngoại biên ruột non, glucose sẽ bịlên men tạo thành các axit chuỗi ngắn kích thích sự sản xuất và tiết GLP-1 và GLP-2 hoặcquá trình vận chuyển glucose phụ thuộc vào Na khi qua màng tế bào L sẽ kích thích tiếtGLP-1 và GLP-2 Nồng độ GLP-1 trong huyết tương tăng sẽ thúc đẩy quá trình kiểm soátglycemicvàcản trở sự có mặt glucosetrongmáu[34].

1.3 Chấtkìmhãmα-glucosidaseglucosidaseα-glucosidase(alpha-glucosidaseGlucosidaseα-glucosidaseinhibitor)(AGIs)

Việc tìm kiếm các AGIs có ý nghĩa rất lớn trong các lĩnh vực như dược phẩm, thựcphẩm… Đã có nhiều hợp chất được tìm thấy trong tự nhiên hoặc tổng hợp có hoạt tính kìmhãm α-glucosidase Tuy nhiên, những tác nhân kìm hãm α-glucosidase tổng hợp bằng conđường hóa học hiện nay thường gây nhiều phản ứng phụ Vì vậy, việc tìm kiếm các hoạtchất có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase vẫn đang được sự quan tâm của các nhà khoa họctrên thế giới Thông thường, việc nghiên cứu các AGIs luôn bắt đầu từ các hợp chất cótrong tự nhiên vì nguồn rất phong phú, đa dạng và ít phản ứng phụ Do đó, các nhà khoahọc trên thế giới thường sử dụng những phương pháp sàng lọc hoạt tính kìm hãm enzymenàyđểđịnhhướngtrongnghiêncứu.Nhiềunướcđãcôngbốtrêncáctạpchíquố ctếvềcác thực vật, vi sinh vật có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase với mục đích sử dụng tronglĩnh vực thực phẩm chức năng, dược phẩm, cũng như đã trích ly được nhiều hợp chất cóhoạttính kìm hãm α-glucosidase từnày.

Năm 1970, người ta đã nhận ra rằng việc sử dụng các AGIs có thể kiểm soát sự hấpthụ carbonhydrat và giúp hỗ trợ điều trị cho những người mắc bệnh ĐTĐ một cách hiệuquả Bản chất của các chất kìm hãm là các flavonoid, pseudooligosaccharide, thiosugars,iminosugar,carbasugar,…có nguồngốcchủyếutừthựcvậtvà visinh vật[62].

Hiện nay, các AGIs được chia thành các nhóm chính: Disaccharide, iminosugar,thiosugar, pseudoaminosugar, carbasugar và các hợp chất không có liên kết glucosidic.AGIscóthể tạor a b ằ n g n h i ề u c o n đ ư ờ n g k h á c n h a u n h ư : C h i ế t x u ấ t t ừ t h ự c v ậ t , đ ộ n g vật,tổnghợpbằngconđườnghóahọchoặcbằngconđườngvisinhvật[98].

Chấtkìm hãm α-glucosidase(alpha-Glucosidaseinhibitor)(AGIs)

Các AGIs từ tổng hợp, như: kojibiose (2-alpha-D-glucosyl-D-glucose) là hợp chấtthuộcnhómchấtdisaccharide,nólàsảnphẩmcaramenhóacủaglucose,3-O-(-D-

Glucopyranozyl)-1-deoxynojirimycin,IsofagominvàNoeuromycinlàhợpchấtt h u ộ c nhóm chất iminosugar, Valiolamin, Hydroxyvalidamin và Voglibose là hợp chất thuộcnhóm chất carbasugar và pseudoaminosugar, X = O; S; Se; N Tetrahydroxyazepan là hợpchấtthuộcnhóm chất thiosugar vàcáchợp chất khôngcóliên kếtglycosidic.

Năm 2009, các nhà khoa học Việt Nam và Hàn Quốc đã khám phá ra chất chiết xuấttừStichopus japonicas(Hải Sâm)có hoạttính kìm hãm α- glucosidase.Nghiêncứuc h o thấy nếu chiết hải sâm bằng hexan ở tỷ lệ nguyên liệu : dung môi là 0,5 mg/ml thì hoạt tínhkìm hãm α-glucosidase từ nấm men là 68% và từ dịch chiết Hải Sâm đã thu được ba loạiAGIs [127].

Năm 1997,Yoshikawa và cộng sựđã phát hiện salacinol từ dịch chiết của rễ và lá câySalacia reticulata(một loại cây bụi leo thuộc họCelastraceaeđược người dân Ấn Độ vàSri Lanka sử dụng như một loại thuốc dân gian từ lâu đời ) có hoạt tính kìm hãm α- glucosidase Salacinolcóhoạttínhkìmhãmα-glucosidase, sucrase vài s o m a l t a s e c ủ a chuột với giỏ trị IC50lần lượt là 3,2; 0,84; 0,59 àg/àl Cỏc nghiờn cứu thử nghiệm trênchuột chứng minh salacinol có hoạt tính kìm hãm sự tăng nồng độ đường trong máu mạnhhơn acarbose Một vài nghiên cứu lâm sàng cho thấy salacinol có tác dụng kiểm soát lượngđường trong máu [165] Tại Nhật Bản, salacia oblonga đã được bán như một thực phẩmchứcnăng (TPCN)vànócũngđượcbiếtđến ở Mỹvới têngọi Saptrangi hayPonkora.

Năm 2002,Ye vàcộngđã nghiêncứu tác dụnghạ đường huyết của dịchc h i ế t m ộ t loại thảo mộc Trung Quốc có tên làRamulus mori(Sangzhi) trên chuột Kết quả cho thấychuột bị gây ĐTĐ bằng alloxan được uống dịch chiết này đã làm giảm lượng đường huyếtsau ăn, ổn định lượng đường trong máu lúc đói Tuy nhiên chất chiết này không gây ảnhhưởngđếnsựhấp thụglucosetrongruột non ở chuột bình thường[164].

Năm 2004,Kim và cộng sựnghiên cứu AGIs từ quả thể của nấm Linh chi, chiết xuấtra được AGIs, đặt tờn là SGK-3 cú hoạt tớnh kỡm hóm α-glucosidase với giỏ trị IC50là 4,6àg/ ml,nhưngkhôngcóhoạt tính kìm hãm glucosidasekhác[105].

Năm 2005,Li vàcộng sựđã công bốdịch chiết của hoaLựupunica granatumc óhoạt tớnh kỡm hóm α-glucosidase với giỏ trị IC50= 1,8àg/ml Cỏc thử nghiệm trờn động vậtcho thấy, khicho chuộtuống dịch chiếtnày thìlượng đường trong máucủa lôc h u ộ t b ị bệnhĐTĐđãgiảm đángkểcòn ở lô chuột bình thườngthì khôngbị ảnh hưởng[115].

Năm 2007,Nilubon và cộng sựđã công bố dịchc h i ê t b ằ n g m e t h a n o l t ừ l á c â y h o a sữa phơikhô(Alstonia scholaris) cóhoạttính kìmhãmα- glucosidaseruộtn o n c h u ộ t AGIsđãđượctìmthấytrongdịchchiếtnàylà3-O-β-d- xylopyranosyl(1m→2")-β-d-galactopyranosudeva(-)-lyoniresinol3-O-β-d- glucopyranoside[129].Trongđó,(-)-lyoniresinol 3-O-β-d-glucopyranoside có hoạt tính kìm hãm sucrase với giá trị IC50=1,95mM và kìm hãm α-glucosidase với IC50là 1,43 mM; 3-O- β-d-xylopyranosyl (1m→2")-β-d-galactopyranosudechỉkìmhãm α- glucosidasevớigiátrịIC50l à1,96 mM[129].

Từlâuđờinhândântađãbiếtsửdụnglávối(Cleistocalyxoperculaturs)haynụvối với cách chế biến đơn giản tạo thành loại trà nấu hay hãm lấy nước uống thường ngày.Các kết quả nghiên cứu cho thấy trong lá và nụ vối chứa tanin, khoáng chất và vitamin…Gần đây, các nhà khoa học của Viện Dinh dưỡng Quốc gia và Đại học phụ nữ Nhật Bản đãcông bố lá vối và nụ vối ở nước ta có hoạt tính kìm hãm α- glucosidase, trong đó nước chiếttừ nụ vối cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao nhất Các kết quả nghiên cứu trên độngvật cho thấy uống nụ vối thường xuyên có khả năng hạn chế tăng đường huyết sau ăn và hỗtrợổn địnhđườnghuyết,hỗ trợ giảmlipid máu,phòngngừabiến chứngcủa ĐTĐ [156].

Các nghiên cứu từ Nhật Bản đã chứng minh 1-deoxynojirimycin (DNJ) trong thànhphần cao lá dâu tằm là chất kìm hãm mạnh glucosidase và disaccharidase DNJ ngăn cảnquá trình tạo glucose tại thành ruột và gan, từ đó làm giảm hàm lượng glucose đi vào máu.Trong thành phần cao dâu tằm còn chứa nhiều polyphenol mà điển hình là resveratrol, chấtnày giúp tăng tính nhạy cảm của thụ thể insulin với hormone, do đó làm tăng phân hủyglucose dư thừa Như vậy, chiết xuất DNJ từ cao dâu tằm vừa kìm hãm tổng hợp mới, vừalàm tăng thủy phân glucose giúp hạ đường huyết Thêm nữa, các polyphenol còn có tácdụngchốngoxyhóamạnh,giúpchống lạiquátrìnhperoxide hóalipid, từ đógiúp ngăn ngừa các rối loạn chuyển hóa lipid dẫn đến nguy cơ gây biến chứng thành mạch ở bệnhnhânĐTĐ[154].

Năm 2009,Preecha và cộng sựđã nghiên cứu hai AGIs là corchorusides A và B từdịch chiết lá câyCorchorus olitorius, một loại rau có tác dụng hạ đường huyết của ThỏiLan, hoạt tớnh kỡm hóm α-glucosidase với IC 50 lần lượt là 0,18±0,03 àM, 0,72 ± 0,03 àM[138].

Trênthựctếcònrấtnhiều loài thực vậtchứaAGIsđãđượcnghiêncứuvàcông nhận.

Tuynhiên, sản xuất cácAGIs từthựcvật trên quymô lớn cũngtốn kém vàphứctạp.

ViệcsảnxuấtAGIsbằngvisinhvậtđangthuhútsựquantâmnghiêncứucủa cácnh à khoa học cũng như các nhà sản xuất vì chúng sử dụng an toàn, không có các tác dụngphụ đối với cơ thể sống Hiện nay một số chủng vi sinh vật như:A.oryzae, Actinomucorelegans, Rhizopus arrhizus,Streptomyces,

Actinoplanes,Flavobacterium saccharophilium,Saccharomyces cerevisiae, Bacillussp đã được nghiên cứu cho hình thành AGIs [101,166,99] Một số AGIs phổ biến như: Acarbose là một pseudotetrasaccharite được thu nhậntừ canh trường lên men bề mặtActinoplanes spp SE-50. Validamycin A từStreptomyceshygroscopicusvar limoneus Adiposin, trestatin B, cyclophellitol và CKD – 711 được lấytừStreptomyces calvusTM – 521,Streptomyces dimorphogenesvàPhellinussp AGIs từA.oryzaelà hướngnghiên cứu mới.

Acarbose(pseudotetrasaccharideđượctáchchiếttừdịchlênmenbềmặtloàiActinopl anesSE50)làAGIsđượctỡmrađầutiờntrờnthếgiớivớigiỏtrịIC50=0,5àM.Núlàchấtbộtmầutrắng,cútỏcdụng kìmhãmα-glucosidaseởniêmmạcruột,làmchậmquátrìnhthủyphâncácdi-,oligo-,poly- saccharidethànhmonosaccharidelàdạngcóthểhấpthụđược.Acarbosekhônglàmtăngtiếtinsulin,không gâygiảmglucosetrongmáulúcđóikhidùngtrịliệuởngười.Acarbosecótênhóahọclà:O-4,6-didesoxy- 4-[(1S,4R,5S,6R]-4,5,6,trihydroxy-3-hydroxy-methyl-2-cyclohexne-1-amino]-α-D- glucopyranosyl-(1-4)-α-D-glucopyranosyl-(1-4)-D-glucopyranose;O-4,6-didesoxy-4-

[[(1S,4R,5S,6S)-4,5,6,trihydroxy-3-(hydroxymethyl)-2-cyclohexen-1-yl]amino]-α-D- glucopyranosyl-(1-4)-O-α-D-glucopyranosyl-(1-4)-α-D- glucose.Côngthứchóahọclà:C25H43NO18,cókhốilượngphântử:645.63,khihòatantrongnướccópKalà5,1. SauAcarbose,năm1984,KamedavàcộngsựđãtìmravaliolaminelàAGIstừvikhuẩnStreptomy ceshygroscopicus.Năm2000,cácnhàkhoahọcHànQuốcđã phát hiện cyclo (dehydroala-L-Leu), một AGIs từ dịch chiết củaPenicillium sp F 70614 cóhoạttínhkìmhãmα-glucosidasetừnấmmenvàruộtnonlợn[93].

Nhiềul o à i v i s i n h v ậ t c ó k h ả n ă n g t i ế t A G I s v ơ ́ib a ̉nc h ấ t k h a ́cn h a u ( Bảng1 1 ) [155].TronghainhómchínhcácAGIsđươcnghiêncứuthìnhómAGIscóban̉ chấtcủa polypeptidekhôngbềnnhiệt,khóphântách,dễbịvôhoạtkhixửlýbằngtrypsinureahoặc beta-mercaptoethanol;cònnhómchấtkìmhamcóban̉ chât́pseudooligosaccharidethi thườngổnđịnhvớitácđôṇgnhiệt,pHbềntrongkhoảng2-12.

Nguồnthu nhận Bảnchất Tính đặc hiệu

Carbohydrate cópolypeptide α- glucosidaset r o n g n ư ớ c b ọ t , t ụ y , ruộtnon,α-glucosidase vi sinhvật

Nojirimycin, 1-deoxynojỉimycin α-glucosidaseđộngvật cóvú, β-glucosidase

Actinomycetes Protein,oliosaccharaide α- glucosidaset r o n g n ư ớ c b ọ t , t ụ y , ruộtnon

Trong lịch sử, tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ loại 2 của người châu Á thấp hơn so với các nướcphương Tây Một trong những lý do là người châu Á ăn nhiều sản phẩm đỗ tương lên men[60].Kaisavàcộngsựđãnghiêncứu,kiểmtrahơn100loạichấtchiếttừthựcphẩmvới mục đích kìm hãm các enzyme tiêu hoá và cuối cùng họ đã tìm thấy một loại chất chiết từcácAspergillusspp lên men bề mặt trên môi trường rắn từ đỗ tương có hoạt tính kìm hãmα- glucosidase.Loạiđỗtương lênmennày gọilàTouchi dovậydịchchiếtcủa nógọi làdịch chiết Touchi (TE– touchi extract) [100]. Đỗ tương lên men đã được biết đến là loại thực phẩm an toàn với con người và độngvật, là loại thực phẩm được yêu thích của người Trung Quốc và Nhật Bản cách đây hàngnghìn năm Các nghiên cứu về chất chiết Touchi gần đây cũng được các nhà khoa học củacác nước này nghiên cứu tích cực [70;78;98] Các nghiên cứu về vai trò của chủng nấmmốc đến khả năng hình thành AGIs cũng đã xác nhận hoạt tính kìm hãm α- glucosidase củaAGIs thu được từA.oryzaemạnh hơn hẳn các chủng nấm mốc khác Năm 2007,Jing chenvà cộng sựcho thấy hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của Touchi từA.oryzaelên men bềmặt trên môi trường rắncao hơn hẳn so với các sản phẩm lênm e n ở c á c l o à i k h á c [ 99].Hơn thế nữa,A.oryzaeđược xác nhận là chủng nấm có đặc tính an toàn, dễ phát triển vàphân lập[107].AGIschiết xuất từ Touchi có thể được bổ sung vàoc á c s ả n p h ẩ m : C á c sản phẩm chế biến nông sản và thủy sản (mứt, bánh mì, bánh gạo, ngũ cốc, các sản phẩmchế biến từ đỗ tương, bột cá, xúc xích cá, thực phẩm có chứa trứng, các loại thực phẩmđóng hộp; các sản phẩm sữa và chế biến từ sữa (bơ, phô mai, sữa đặc, sữa bột), nước giảikhát lên men bề mặt lactic; miso, nước tương, các loại hương vị, phụ gia và các loại TPCNbổ sung dinh dưỡng khác [102] Kết quả này chính là nền tảng cho nghiên cứu chuyên sâuvề tuyển chọn chủng nấm mốcA.oryzaeđặc hiệu cho quá trình hình thành AGIs với hoạttínhkìm hãm α-glucosidaseđạthiệu quảcao trongđiều kiện ở ViệtNam.

1.4 Đỗđeα-glucosidasenvà cácsảnphẩmlênmeα-glucosidasen bề mặttừđậuđỗ

Phong lan và họ Cúc, với khoảng 730 chi và 19400 loài Trên thế giới hiện này cókhoảng trên 1,000 loại đậu dỗ với nhiều đặc điểm khác nhau từ hạt đậu đỗ có kích thướcnhỏ nhất như hạt đậu Hà lan (pea) cho tới lớn nhất giống trái anh đào (cherry), hạt đậu cónhiềumàu sắcnhư đỏ, vàng,xanh, nâu vàmàu đen. ĐỗđencótênkhoahọclàVignacylindricalSkeelshayVignaunguiculatawalp.subsp.cylin drica (L) Verdc.Có hai loại đỗ đen: Loại vỏ đen ruột trắng và loại vỏ đenruột xanh thường gọi là đỗ đen xanh lòng (loại này thường được sử dụng làm thuốc hơn).Hàmlượngproteintrongđỗđencóthểsánhvớiproteintrongcácthựcphẩmthịtha ybơ sữa Chất đạm thực vật có trong đỗ đen là loại protein quý và đặc biệt đỗ đen có đủ 10 loạiaxit amin cần thiết như: Lysine, methionine, tryptophane, phenylalanine, threonine, valine,leucine, isoleucine, arginine và histidine Trong thành phần dinh dưỡng hạt đỗ đen, gluxitchiếm 53,3%, protein chiếm 24,2%, lipid chiếm 1,7%, nước chiếm 14%, xellulo chiếm

A.oryzaevàlên menbềmặt

Các loại nấm mốc trong tự nhiên có khả năng thích ứng cao với điều kiện sống. Vớimỗi nguồn cơ chất nhất định, chúng sẽ sinh chất tương thích, đặc hiệu với cơ chất đó nhờchuyển cơ chất từ dạng phức tạp khó hấp thu thành dạng cơ chất đơn giản dễ hấp thu.Chẳng hạn như, môi trường giàu cơ chất pectin là động lực cho việc tiết enzyme ngoại bàotươngthíchlàpectinase [7].Nóicách khác,muốnthunhậnchấtnàothìphải cósựh iệndiện của cơ chất đặc hiệu với nó đó trong môi trường nuôi cấy Ta rất hay gặpA.oryzaephát tiển ở các nguyên liệu nông sản (gạo, đỗ tương, ngô…) và các nghiên cứu cho thấyA.oryzaehình thành AGIs chủ yếu từ môi trường đỗ tương được biết đến là chất nền quantrọngchohình thành hoạt tính [56,93,99].

Do vậy, đậu đỗ có một ý nghĩa đặc biệt quan trọng đối với sự phát triển củaA.oryzaehình thành hoạt tính kìm hãm α-glucosidase Với mục tiêu tuyển chọn đượcA.oryzaethíchhợp cho quá trình lên men hình thành hoạt tính kìm hãm α-glucosidase đạt hiệu quả, việcphân lậpA.oryzaetừ các nguyên liệuA.oryzaelên men hình thành hoạt tính kìm hãm α-glucosidase caođượcquantâm,chínhlànềntảnggópphầnnghiêncứutuyểnchọnA.oryzaehình thành AGIs với hoạt tính kìm hãm α-glucosidase đạt hiệu quả cao trong điềukiệnở Việt Nam.

Aspergillus oryzaeđược phân loại [106]: Giới:Fungi; Ngành:Ascomycota;

Lớp:Eurotiomycetes;Bộ:Eurotiales;Họ:Trichocomaceae;Giống:Aspergillus;Loài:Aspergill usoryzae.

Theo khóa phân loại củaKlich:A.oryzaecó đặc điểm phát triển khác nhau khi nuôicấy trên các môi trường czapek, czapekyeast agar (CYA25), czapekyeast agar20%sucrose(CY20S),maltextractagar(MEA).Quansáttrênkínhhiểnviởvậtkính10và40 chothấyđặcđiểmhìnhtháicủaA.oryzaenhư:Cơthểsinhtrưởngcủanólàmôṭhệsơi bao gồmnhững sơirât́manh,̉ chiêùngang5-7μm, phânnhańhnhiêùvàcóvaćhngangchiasơi có các cuống đính bào tử (dài 1 – 2 mm), ở đó có cơ quan sinh sản vô tính; phía đầu cuốngđính bào tử phồng lêngọi là bọng, bọng đỉnhgiá có hình quả lê,hìnhc h ù y h o ặ c h ì n h cầu ,đườngkínhtừ(8)22-

50(90)àm;cuốngsinhbàotửnhẵnhoặcsằnsựi,kớchthướctừ 500-2500 (5000) àm Bào tử trần hỡnh cầu đến hỡnh trứng, nhẵn đến cú gai nhẹ, đườngkớnh (3,5) 4-8,5 (10) àm, cú màu vàng lục hay màu vàng hoa cau.A.oryzaelà sinh vật dinhdưỡng hóa năng hữu cơ, chúng chỉ có khả năng thu nhận năng lượng từ môi trường bênngoài nhờ quá trình oxy hóa hiếu khí hoặc quá trình lên men kị khí các chất hữu cơ ngoạibào.A.oryzaelà loài hiếu khí hoàn toàn và có kiểu carbon dị dưỡng thuộc loại hoại sinh, cónghĩa là có khả năng phân giải xác sinh vật, sử dụng các chất hữu cơ để làm chất dinhdưỡng.A.oryzaetiếtramôitrườngcácenzymethủyphânnhưcellulase,pectinase,hemicellula se, xylase khi phát triển trên môi trường cơ chất tương tự như cellulose, pectin,hemicellulose, xylan nênA o r y z a eđược ứng dụng rộng rãi trong sản xuất, chế biến đồ ănvà trong công nghiệp sản xuất enzyme [107] Ở Nhật BảnA.oryzaeđược sử dụng trong quátrình sản xuất thức ăn như xì dầu, rượu sakê và trong công nghiệp sản xuất enzyme nhưamylase, protease, hemicellulose, cellulase, oxidoreductase, lipase, phytase và pectinase ỞViệt NamA.oryzaeđược sử dụng chủ yếu trong quá trình làm tương Năm 2000, bộ gen ditruyềnc ủ aA.oryzae đ ãđ ư ợ c phân t íc hv à g i ả i m ã H ệg e n g ồ m 8 nh iễ m s ắ c thể vớ i

1 2 ngàn gen và 37 triệu cặp base Trình tự bộ gen củaA.oryzaeRIB40 (ATCC – 42149) đượchoàn thành vào năm 2005 Các trình tự này được công bố từ nhóm các nhà khoa học baogồm Nhật, Mỹ và châu Âu, tỷ lệ trình tự mỗi genome mà họ đọc được đạt khoảng 95%.Tổng dung lượng genome từ 3 loài đã đọc là 95 Megabase, bao gồm 33500 gene mã hóaprotein chứa trong

24 nhiễm sắc thể (8 nhiễm sắc thể mỗi loài) So sánh ba bộ gen củaAoryzae, A nidulansvàA fumigates.Người ta thấy rằng bộg e n c ủ aA.oryzaetăng lên vềkíchthướcđến

20%so với 2 loài còn lại [71,117](Hình1.2).

Hình1.2C ấ u t r ú c bộ gencủaA.oryzae[117] Đặc điểm của giốngA.oryzaelà giàu các enzyme thủy phân (amylase, protease,pectinase…) Ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa bột, gạo…đã hết nhưng không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lõi ngô, ở bã sắn… Chúng mọcvà phát triển có khi thành lớp mốc, có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau Màu do bào tửgià có màu sắc Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiệnthuận lợi sẽ mọc thành mốc.Jing Chen và cộng sựnghiên cứu công nghệ sản xuất AGIs từnấm mốcA.oryzae, Actinomucor elegans vàRhizopus arrhizus… Nhóm tác giảc h o r ằ n g sự hình thành AGIs phụ thuộc vào ảnh hưởng bởi chủng vi sinh vật cũng như các yếu tốcôngnghệ[99].

Lên men bề mặt là phương pháp lên men mà vi sinh vật phát triển trên bề mặt môitrường Phương pháp này thường được sử dụng để sản xuất các sản phẩm lên men nhờ nấmmốc như acid citric và một số loại enzyme Phương pháp này được áp dụng trong buổi đầucủa công nghiệp kháng sinh. Môi trường nuôi cấy bề mặt có thể là các cơ chất ở dạng rắnhoặclỏng.

Thành phần môi trường là yếu tố cơ bản nhất quyết định khả năng sinh tổng hợp hoạtchấtcũngnhưcá cenzymekháctừvisinhvật.Trong thànhphầnmôitrường phảic óđủ cácchấtđảmbảođượcsựsinhtrưởngngb ìn hthường củavisinhvậtvàtổnghợpenzyme( Bảng1.3)[6].

Bảng1.3 Các chất dinh d ưỡng ng đa l ượng ng , vi l ượng ng , nguồn gốc và chức năng đối với tế bào nấmmốcAspergillusspp[6]

Carbon Hợpchất hữucơhoặcCO 2 Xâydựngthànhphầnvậtchấtcơbản của tếbào Oxygen H 2 O,h ợ p c h ấ t h ữ u c ơ , C O 2

Xâydựngnênvậtchấtvànướctrong tếbào,O 2 làchấtnhậnđiệntửtronghô hấp hiếu khí

Hydrogen H 2 O,hợpchất hữucơ,H 2 Xây dựng nên các hợp chất hữu cơThamgiacácquátrìnhsinhnăng lượngnhưcácproton

Phospho Phosphatevôcơ Xâydựngn ê n cácacidnucleic,nucelotide, phospholipid, acid teichoic

Xâydựngnêncystein,methionine,glutat hionevànhiều coenzyme

Kali Muối kali Xây dựng nêncáccationvôcơcủatế bàov à l à đ ồ n g n h â n t ố c ủ a c á c enzym e

Magie Muốimagie Dạngcáccationvôcơcủatếbàovàlà đồng nhântốchonhi ề u phảnứ ng enzyme

Calcium Muốicalcium Cationvôcơlàđồngnhântốchonhiềuenz ymevàlàcấuphầncủanội bào tử

Sắt Muốisắt Cấup h ầ n c ủ a c y t o c hr o m e v à c á c pr oteinkháccũngl à đồngn h â n tố chomột số phảnứngenzyme

Bảng 13 cho thấy nguồn carbon là thành phần đầu tiên, đóng vai trò đặc biệt trong sựphát triển của vi sinh vật [47].A.oryzaecó thể sử dụng nguồn thức ăn carbon khác nhau vàkhông đòi hỏi nghiêm ngặt đối với các loại thức ăn carbon Nhiều loài nấm mốc còn có khảnăng đồng hóa các hợp chất hữu cơ rất bền vững hoặc rất độc đối với nhiều sinh vật khác(cáchợpchấtn- ankal,ankaloid,phenol,nhiềuchấtkhángsinh…).Đốivớinguồnthứcăn phức tạpnhư:Xylan,tinhbột,cellulose,chitin trước hếtA.oryzaephảisinhrac á c enzyme để phân hủy cáchợp chấtnày thành cáchợp chấtđ ơ n p h â n t ử s a u đ ó m ớ i đ ồ n g hóa được chúng Đối với quá trình sinh tổng hợp hoạt chất, cũng nhưAGIs từA.oryzae,nguồn carbon từ nông sản như đậu đỗ, gạo, cám gạo…là những nguồn carbohydratethườngngđượccsử dụng cho phát triển của nấm mốc [18,47] Các thành phần nông sản nàykhông chỉ đóng vai trò đơn thuần là nguồn carbon cho sự phát triển của vi sinh vật, mà cònlà cơ chất cảm ứng, xúc tác cho quá trình sinh hoạt chất, enzyme, cũng như hình thànhAGIs Ngoài ra còn có sự hiện diện của các nguyên tố đa lượcngvà vi lượcngvà proteintrong các nông sản này [7,56,93,99].Chính vì thế, việc khảo sát tỷ nguồn carbonthích hợp cho quá trình lên men hình thành AGIs cần phải được tiến hành cho từngcơchấtchuyênbiệtvàđiềukiệnnuôicụthể.

Các loàiA.oryzaekhác nhau có nhu cầu khác nhau đối với nguồn thức ăn nitơ,A.oryzaethường có khả năng sử dụng cả nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ Sự tăng trưởngngvàphát triển của nấm mốc ngoài sự hiện diện của các nguyên tố đa lượcng, vi lượcngvàcarbohydrate,trongđó protein là thành phần cóảnh hưởngngl n [ớn [ 47]. Đặc điểm chung của môi trườngngnuôi cấy vi sinh vật thu hoạt chất cũng như AGIs làsự có mặt chất cảm ứng [7,99] Tuy nhiên, tỷ lệ giữa carbon và nitrogen trong môi trường,tính cân bằng của môi trường dinh dưỡng về carbon và nitrogen có ý nghĩa lớn đối với sinhtổng hợp sinh khối của vi sinh vật và sự tạo thành enzyme Nitrogen tham gia vào quá trìnhtạo protein, acid nucleic và nhiều chất có đặc tính sinh học khác của tế bào sinh vật Môitrường có đủlượng carbon và nitrogen cần thiếtsẽ tíchlũy lượng enzyme lớn nhất.S ự thiếu hụt cấu tử này không dược bù đắp bằng sự dư thừa của cấu tử kia Ngoài ra, do acidamin là những cấu tử hợp thành phân tử enzyme, acid amin có ảnh hưởng tốt đến sinh lýcủavisinhvậtcũngnhưquátrìnhsinhtổnghợpchấtcóđặctínhsinhhọc.Acidamincóthể đồngthời vừalà nguồn carbon,nguồn nitrogen vàlà nguồn nănglượng [7].

Bằng các phương pháp phân tích quang phổ, người ta đã xác định được các chấtkhoáng có trong tế bào nấm mốc Về các nguyên tố đại lượng, có thể kể đến: S, P, K,Ca,Mg, Fe, chúng thường chiếm từ vài phần nghìn đến vài phần trăm trọng lượng khô.Cácnguyêntốvi lượngcó: Mn,Mo,Zn,Cu, Co,Ni,B.Hàmlượngcácnguyêntốkhoángtrong tếbàonấmmốcthayđổitùythuộcvàođiều kiệnnuôicấy, thànhphần môitrường, thờ igian nuôi cấy Sự tăng trưởngngvà phát triển của nấm mốc rất cần sự hiện diện của cácnguyêntố đalượcngvàvilượcng[47].

Cácn g u y ê n t ố đ a v i l ư ợ n g c ó ả n h h ư ở n g l ớ n đ ế n s ự s i n h t r ư ở n g v à t ổ n g h ợ p enzymecủavisinhvật.Phosphocầnđểtổnghợpcáchợpphầnquantrọngcủasin hchấtvànhiềucoenzyme,đồng thờiđể phosphorylhóag l u c i d t r o n g q u á t r ì n h o x y h ó a s i n h học Phospho ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh sản của nấm sợi và các vi sinh vật khác.CationM g 2+c ó ả n h h ư ở n g đ ế n đ ộ b ề n n h i ệ t c ủ a e n z y m e t u y n h i ê n M g S O

4s ẽc ó ả n h hưởng xấu đến sự tổng hợp enzyme bởi nấm sợi Trong khi đó, lưu huỳnh - có mặt trongcác acidamin quan trọng nhưmethionine,cysteine,c ó v a i t r ò t í c h c ự c t r o n g v i ệ c k í c h thíchsựhìnhthànhenzyme Ngoàira, c a l c i u m , mangan,corban,… cũngả n h hưởngđếnsựtổnghợpenzyme[7].

Nhiệt độ đóng vai trò chủy ế u t r o n g q u á t r ì n h s i n h t r ư ở n g c ủ a s ợ i n ấ m N h i ệ t đ ộ thích hợp nhất cho quátrìnhhình thành AGIs của nấm mốcA.oryzaelàởn h i ệ t đ ộ 3 0 - 32 0 C Nhiệt độ quá thấpA.oryzaephát triển chậm, thời gian nuôi cấy kéo dài Nhiệt độ quácao dẫn đến hô hấp quá mạnh, không tốt cho quá trình tạo sinh khối và hình thành AGIs[78,149,83].

Trong những nhân tố tác động vào sự phát triển của nấm mốc, độ ẩm có vai trò rấtlớn Độ ẩm môi trường thích hợp cho sự hình thành bào tử khoảng 45- 55% [78] Độ ẩmcủamôitrườngcũngnhưđộẩmtươngđốicủakhôngkhílàyếutốquantrọngquyếtđịnhsự sinh trưởng của hệ sợi nấm và sự sản sinh bào tử Cần giữ cho độ ẩm môi trường khôngbịgiảm trongquátrìnhnuôi nấm mốcphát triển.

Thành phần nước chiếm từ 70 ÷ 90% khối lượng cơ thể vi sinh vật, tất cả quá trìnhphân hủy thức ăn và các phản ứng chuyển hóa các chất trong tế bào đều diễn ra với sự cómặt của nước Độ ẩm cao ảnh hưởng đến độ thoáng khí, ngược lại độ ẩm thấp quá sẽ kìmhãm sự sinh trưởng và phát triển của sợi nấm cũng như khả năng tạo enzyme [6].Độ ẩmcủamôitrườngliênhệđếnsựkếtdính,ảnhhưởngđếnđộthoángkhí.Từđóảnhhưởn g đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm sợi cũng như khả năng sinh hoạt chất Trong quátrình lên men trên môi trường lỏng, độ ẩm không giữ vai trò quyết định đến hiệu quả tổnghợp enzyme Ngược lại, ở điều kiện lên men bề mặt trên môi trường rắn, vi sinh vật pháttriển và sản sinh ra sản phẩm tại gần bề mặt cơ chất rắn có hàm lượng ẩm thấp Do đó, việccungcấpmộtlượng nướcthích hợpvà kiểmtra độhoạtđộngcủa nướccủacơ c h ấ t l ên men là cần thiết Hàm lượng ẩm cao hơn hoặc thấp hơn đều ảnh hưởng bất lợi cho hoạtđộng của vi sinh vật Hơn nữa, nước có ảnh hưởng sâu sắc đến các tính chất hóa lý của cơchất và do đó ảnh hưởng đến hiệu suất của toàn bộ tiến trình nuôi cấy [132] Trong điềukiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tốiưucủa môi trường là 50 ÷ 60% và sự duy trì độ ẩm củamôi trường ổn định trong quá trình nuôi đóng vai trò quan trọng Độ ẩm tăng quá 70% sẽlàmgiảmđộthoáng khí,cònđộẩmthấp hơn50% làmkìmhãmsựsinhtrưởngvàph áttriển của vi sinh vật cũng như giảm hiệu quả hình thành enzyme [132] Khi nuôi cấy trongđiều kiện không được vô trùng tuyệt đối thì độ ẩm môi trường sau khi cấy giống khôngđượcvượt quá60%đểtránh sựnhiễm khuẩn, vi sinh vật lạ[7].

A.oryzaehoàn toàn hiếu khí và chỉ phát triển trong điều kiệncó oxy.N ế u b ề m ặ t môi trường không đảm bảo sự thoáng khí, độ dày khối môi trường lớn sẽ dẫn đến thiếu sựlưu thông oxy và carbon dioxit, nấm mốc phát triển cục bộ Một lượng nhỏ khí carbon làcần thiết choAspergillusnảy mầm nhưng nếu nồng độ này quá cao lại kìm hãm sự pháttriểncủachúng.Khinuôicấynấmmốcbằngphươngphápbềmặtmôitrườngrắncầnchúý tới độ dày khối môi trường để đảm bảo độ thoáng khí cần thiết cho sự phát triển của nấmmốc Để đáp ứng điều kiện nuôi này, môi trường nuôi phải xốp, rải thành lớp không quádàyvàphòngnuôiphảithoáng.Tiếnhànhđảotrộnđịnhkìđểtănglưuthôngkhívàtra ođổi nhiệt trongquátrìnhnuôi cấy[8,14].

Khinuôic ấ y b ằ n g p h ư ơ n g p h á p b ề m ặ t m ô i t r ư ờ n g r ắ n p H m ô i t r ư ờ n g ả n h h ư ở n g ít,d o m ô i t r ư ờ n g c ó d u n g l ư ợ n g đ ệ m c a o v à h à m ẩ m t h ấ p , p H k h ô n g t h a y đ ổ i m ấ y trong quá trình nuôi Tuy nhiênpHban đầucủa môit r ư ờ n g c ũ n g c ó ả n h h ư ở n g k h ô n g nhỏt ớ i s ự p h á t t r i ể n c ủ a n ấ m m ố c vàs ự t ạ o e n z y m e N h ư đ ố i v ớ iA a wam or i p Hb a n đầulà6,3thìnấmmốctạoα- amylase cựclớn.NếupHbanđầulà3thìnấmsợisẽtạoranhiềuoligo-1,6-glucosidasevàα-

1,4-amyloglucosidase.P h ầ n n h i ề uA o r y z a e p h á ttriểntrongphạmvipHtừ4–8nhưngmộtsốnấmmốccókhảnăngchịuđượccơchất cópHacidhơnhoặckiềmhơn pHmôitrường thuậnlợichosựpháttriểncủaA.oryzae thườnglàmôitrườngaxityếupH5,5–6,5[149].

Thunhận AGIs

Để thu nhận AGIs từ nấm mốc lên men môi trường rắn cho thấy quá trình tách chiết,tinh sạch và thu AGIs còn phụ thuộc vào dung môi, tỷ lệ thể tích dung môi : lượng cơ chất,nhiệtđộ, thời gian, phươngphápchiết xuất, tinh sạch [100].

Với đặc điểm của quá trình lên men bề mặt trên môi trường rắn là lượng nước tự docó môi trường sau khi lên men rất ít [133], các hoạt chất tiết ra thường ở trạng thái liên kếtchặtchẽvớicác thànhphần cơchấtlên men, ngăncảnviệc chiếttách và thunhận h oạt chất Chính vì vậy, việc bổ sung một tỷ lệ dung môi thích hợp để thực hiện quá trình chiếtxuất lỏng - rắn nhằm cải thiện tối đa hiệu quả thu nhận hoạt chất từ môi trường rắn sau lênmen bề mặt [51] Quá trình chiết xuất hoạt chất từ môi trường rắn, dựa trên sự phân táchcấu tử hoạt chất từ chất rắn tuân theo định luật Fick [121] Nói cách khác, vận tốc truyềncủa một quá trình truyền tỷ lệ thuận với động lực của quá trình và tỷ lệ nghịch với trở lựccủa quá trình [121] Động lực của quá trình chiết xuất hoạt chất phụ thuộc vào sự chênhlệch nồng độ chất tan giữa dung môi và cơ chất rắn [116]; chịu sự chi phối của mức độxuyên thấu của dung môi vào cơ chất (môi trường rắn sau lên men) hay khoảng cáchkhuếchtán– trởlựccủaquátrìnhchiếtxuất[51,76,147].Hiệuquảcủaquátrìnhchiếtxuất phụ thuộc vào một số yếu tố cơ bản: Sự chênh lệch nồng độ; Diện tích tiếp xúc; Khảnăng hòa tan của chất tan (hay AGIs) vào dung môi; Độ nhớt của dung môi; Khả năngkhuếchtáncủadungmôivàobêntrongcơchấtrắn;Nhiệtđộtríchly;Tốcđộkhuấytrộ nđể cải thiện hiệu quả khuếch tán Đối quá trình chiết xuất cơ chất rắn từ dung môi lỏng nóichungvàAGIsnóiriêng,quátrìnhkhuếchtánchấttanvàodungmôicòncóthểchịuảnh hưởng của đặc tính liên kết của AGIs và cơ chất (điển hình như tương tác kỵ nước, liên kếthydrogen, lực Val de Walls) Các điều kiện chiết xuất như loại dung dịch đệm, thời giancũng như nhiệt độ chiết xuất là những yếu tố có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả thu hồiAGIs sau quá trình lên men môi trường rắn Mặc dù vậy, các nghiên cứu về điều kiện chiếtxuất thích hợp đối với AGIs còn chưa nhiều NhưKawabata và cộng sựđã nghiên cứuthăm dò một số dung môi để chiết tách AGIs từ đỗ tương lên men bề trên mặt môi trườngrắn, cho thấy hiệu suất của quá trình chiết xuất phụ thuộc vào tỷ lệ thể tích dung môi :lượng cơ chất, nhiệt độ và thời gian Dung môi chiết xuất có thể là hỗn hợp nước : ethanoltheo tỷ lệ 1 : 10, 10 : 1, 1 : 5, 5 : 1 hoặc sử dụng nguyên nước để chiết AGIs Sản phẩm đậuđỗ sau khi lên men bề mặt trên môi trường rắn, chiết xuất bằng hỗn hợp nước và rượu tỷ lệđỗhỗnhợp:nguyênliệulà1:15w/vsau1-3giờởnhiệtđộ40–60 0 Choặcsau10giờđến 7 ngày ở nhiệt độ 30 0 C, hoặc sản phẩm đỗ lên men bề mặt trên môi trường rắn đượcxay nhỏ, đem ngâm trong nước với tỷ lệ nước: nguyên liệu là 1 : 20 w/v, chiết xuất sau 12 đến 20 giờ ở nhiệt độ 40đến 60 0 C hoặc sau 1 đến 3 giờ ở nhiệt độ 100 đến140 0 C Cho hoạttính kìmhãmα- glucosidase có hoạtlực kìmhãmα-glucosidase đạtI C50l à 0 , 5 - 0 , 5 5mg/ml Tác giả cũng khảo sát một số phương pháp để cô đặc và tinh sạch sản phẩm bằngmột số dung môi phân cực như methanol, ethanol, propanol, hexan… và sử dụng cácphương pháp như sắc ký cột,sắc ký trao đổii o n , s ắ c k ý l ỏ n g c a o á p h o ặ c s ử d ụ n g c á c màng

[103] Năm 2001,Hiroyukiv à c ộ n g s ựcũng đã nghiên cứu chiết xuất AGIs từtouchi. Theo tác giả, từ 100 g touchi có thể thu nhận được 9,8 g chế phẩm có hoạt tính kìm hãm α- glucosidase với hoạt lực kìm hãm α-glucosidase đạt IC50đối với α-glucosidase từruột chuột sử dụng cơ chất sucrose là 0,34 g/l [83] Tách chiết và thu hồi Touchi cũng đượcDong và cộng sựnghiên cứu vào năm 2008 [60] Theo Fujita H,Yamagami và cộng sựbộtđỗ tương sau lên men bề mặt được xay, ngâm với nước theo tỷ lệ lượng nguyên liệu : thểtích nước là 1 : 5 w/v, sau đó chiết xuất ở nhiệt độ 80 0 C, dịch chiết sau khi lọc được sấyphuntạodạngbộtmàunâusáng(bộtTouchichiếtxuất)cóhoạttínhkìmhãmα-glucosidase với hoạt lực kìm hãm α-glucosidase IC50là 0,05 – 0.55mg/ml [69] Đây chínhlà cơ sở cho việc nghiên cứu điều kiện chiết xuất AGIs thích hợp từ môi trường rắn sau khilên men bề mặt đối vớinghiênc ứ u t h ự c t ế A G I s s a u k h i c h i ế t x u ấ t c ó t h ể d u y t r ì p h ẩ m chất ổn định và ứng dụng hiệu quả, cần phải được tinh sạch qua các bước khác nhau, tùytheo mục đích sử dụng Trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm hay một số lĩnh vực kỹ thuậtkhác,chếphẩm AGIs kỹthuật thườngđượcsửdụngrộngrãi nhất.

Dựa vào đặc tính của AGIs, một số phương pháp tách, tinh chế thu chế phẩm enzymecó thể sử dụng Trong số các phương pháp, phổ biến nhất là phương pháp kết tủa, sắc kýlỏng (sắc ký trao đổi ion, sắc ký ái lực, sắc ký lọc gel) hay sốc nhiệt, thay đổi pH hay sửdụng chất hóa học Việc chọn lựa mức độ cũng như biện pháp tinh sạch phụ thuộc vào yêucầu của AGIs sử dụng Theo nghiên cứu củaKawabata và cộng sự(2001) AGIs có trọnglượng phân tử ≤ 3000 Da do đó tác giả đã khảo sát một số phương pháp để loại bỏ thànhphần có trọng lượng phân tử từ

3000 Da trở lên từ dịch chiết như sử dụng phương pháp lọcmàng, phương pháp phân tách hai pha nước hoặc sử dụng các dung môi hữu cơ nhưmethanol,ethanol,propanol,butanol,chloroform,ethylacetate,toluene,hexanehoặcbezen Chothấysảnphẩmsautinhsạchcóhoạttính kìmhãmα-glucosidase lớngấp2đến 1000 lần so vớichấtchiết thu được sau chiết xuất Từ 30 g chất thuđược sau khic ô đặcdịchchiếtđượctinhsạchAGIsbằngphươngpháplọcmàngthuđược5,8gchất khôcó hoạt tính kìm hãm α-glucosidase lên đến 90,4% trong đó thành phần chất có trọng lượngphân tử lớn hơn 3000 Da khoảng 15% và bằng phương pháp sử dụng ethanol để hòa tanAGIs và loại tủa, dịch sau khi loại tủa được cô đặc cho sản phẩm có hoạt tính lên đến90,8% [100] Ngoài ra, còn có một số nghiên cứu sử dụng các phương pháp khác như sắcký cột, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lỏng cao áp Theo nghiên cứu củaFujita và cộng sự(2007), trong phương pháp lọc gel, sử dụng gel sephadex G-75 tinh sạch AGIs có hoạt tínhkìm hãm α-glucosidase trong khoảng 85-90% [69,70] TheoMin và các cộng sự(2013) đãtinh sạch và xác định được 2 peptide có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase từ đỗ tương lênmen bề mặt trên môi trường lỏng củaAspergilluso r y z a eN159-1: Dịch chiết sau lên mencó hoạt tính kìm hãm α-glucosidase có IC50là 10 mg/ml được tinh sạch bằng màng siêu lọc(Centriprep YM-50, 30, 3) thu được sản phẩm có IC50là 7,7 mg/ml, tinh sạch bằng phươngpháp xử lý với pepsin thu được sản phẩm có IC50là 5,3 mg/ ml, tinh sạch bằng sắc ký cộtShephadex G-25 thu sản phẩm có IC50là 4,7 mg/ml, tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion(SCX) thu được sản phẩm có IC50đạt 0,4 mg/ml, sau đó tiếp tục tinh sạch bằng sắc kí lỏnghiệu năng cao phađảo(RP- HPLC) thu được 2AGIs; Kết quả phân tíchs ắ c k ý l ỏ n g – songsongkhốiphổ(LC-MS/MS)đãxácđịnhđượchaihợpchấtcóhoạttínhkìmhãmα- glucosidasecóbảnchấtlàpeptideđượcđặttênP-1làmộtCys-Leu,hoạttínhkìmhamα- glucosidasecógiátrịIC50l à12,1mg/ml.PeptidecònlạiđặttênP-2làmộttri-peptidePro-

Phe-Procóhoạttínhkìmham α-glucosidase caohơnP-1vớiIC50l à3,1mg/ml.Khốilượng phân tửcủaP-2 đượcxácđịnh là 360,1Da[124].

Trong thực tế, sản xuất các chế phẩm AGIs có thể được sử dụng dưới các dạng khácnhau, có thể chia thành 3 nhóm: chế phẩm thô, chế phẩm kỹ thuật hoặc chế phẩm tinh khiếttùy theo mục đích và yêu cầu sử dụng Không kể đến chế phẩm thô, chế phẩm kỹ thuậtthườngchứahỗnhợpAGIschủyếu,thuđượcsauquátrìnhtinhsạchsơbộ,trongđómộtsố protein, enzyme và peptide tạp đã được tách ra Chế phẩm tinh khiết - chỉ chứa mộtAGIsduynhấtsaucácbướctinhsạchphứctạp,cóýnghĩaquantrọngtrongcácnghi êncứukhoahọc cơbản, xácđịnhbản chất, đặctínhcủaAGIscũng nhưứngdụngtron gy học Tuy nhiên, AGIs tinh khiết rất khó ứng dụng trong công nghiệp do hiệu suất thu hồithấp, giá thành cao Hơn thế nữa,các điều kiện hoạt động tốiưucủa AGIs tinh khiết khôngthểáp dụngđối với chếphẩm AGIs kỹthuật

Ứngdụngsóngsiêuâmtrongchiết xuất

Định nghĩa sóng siêu âm :Siêu âm là sóng cơ học hình thành do sự lan truyền daođộng của các phần tử trong không gian có tần sốlớn hơngiớihạn trên ngưỡng nghec ủ a conngười, tứclà trên16kHz[96].

Phân loại sóng âm :Dựa vào tần số, sóng siêu âm được chia làm 3 loại, Siêu âm tầnsố thấp (siêu âm năng lượng cao) (20 – 100 kHz): Khi đó có sự hình thành và vỡ ra của cácbong bóng khí có kích thước lớn sẽ làm cho nhiệt độ và áp suất tăng cao Do đó có khảnăng làm thay đổi tínhc h ấ t h ó a l ý c ủ a n g u y ê n l i ệ u N g à y n a y s i ê u â m t ầ n s ố t h ấ p đ ư ợ c ứng dụng, vô hoạt enzyme, tăng hiệu quả quá trình chiết xuất cũng như tăng tốc độ cácphản ứng hóa học [108,122,143,168] Siêu âm tần số cao (siêu âm năng lượng thấp)(100kHz-2MHz): Khi tần số cao, kích thước các bong bóng khí khá nhỏ nên quá trình sủibọt diễn ra nhẹ nhàng, không làm thay đổi tính chất hóa lý của nguyên liệu nên thườngdùng trong phân tích, xác định tính chất hóa lý, thành phần cấu trúc và trạng thái vật lý củathực phẩm[67,95,108,122] Siêu âm chẩn đoán (5-10MHz): Không có hiện tượng sủibong bóng và là dòng âm thanh để đo hệ số tốc độ và hấp thụ của sóng trong môi trường,dùng trong y học,phân tích hóa học Phạm vi ứng dụng sóng siêu âm là bảo quản thựcphẩm, vô hoạt vi sinh vật [144,118,131], khuấy trộn, đồng hóa và nhũ hóa [120], phá bọt,quátrình lọc[110],quátrình sấy,chiết xuất và kết tinh [55].

Cơ chế xâm thực khí của sóng siêu âm: Khi sóng siêu âm truyền vào môi trường chấtlỏng, các chu trình kéo và nén liên tiếp được tạo thành Trong điều kiện bình thường, cácphân tử chất lỏng ở rất gần nhau nhờ liên kết hóa học Khi có sóng siêu âm, trong chu trìnhnén các phântử ởgần nhau hơn và trong chu trình kéo chúng bị tách rax a Á p l ự c â m trong chu trình kéo đủ mạnh để thắng các lực liên kết giữa các phân tử và tạo thành nhữngbọt khí nhỏ Trong quá trình dao động, bọt khí ổn định có thể thành bọt khí tạm thời Sóngsiêu âm rung động những bọt khí này, tạo nên “ sốc sóng “ Bọt khí ổn định có thể lôi kéonhữngbọtkhíkhác vàotrongtrườngsóng,kếthợp lạivớinhauvàtạothànhdòngnh iệtnhỏ [111] Các bọt khí tạm thời có kích cỡ thay đổi rất nhanh, chỉ qua vài chu trình chúngbị vỡ ra,hình thành những điểm có nhiệt độ và áp suất rất cao (5000 K và 50000kPa) đạtđược trong bong bóng nổ [145] Hiện tượng xâm thực khí mở đầu cho rất nhiều phản ứngdo có sự hình thành các ion tự do trong dung dịch; thúc đẩy phản ứng hóa học nhờ có sựtrộn lẫn các chất phản ứng với nhau; hỗ trợ chiết xuất các chất tan như enzyme từ tế bàođộngvật, thựcvật, nấmmen hayvi khuẩn; tách virus rakhỏi tếbào bị nhiễm [111].

Hình1.3Q u á t r ì n h h ì n h thành,pháttriển vàvỡtung của bọtkhí

Tácđộngcơsởcủa sóngsiêuâmlênmộtmôitrường lỏngliên tụclàdotác độngcủ am ộ t á p s u ấ t â m t h a n h ( Pa)v à m ộ t á p s u ấ t t h ủ y t ĩ n h s ẵ n c ó t r o n g m ô i t r ư ờ n g Á p suấtâmthanhlàsóngdạngsin,phụthuộcvàothờigian(t),tầnsố(f)vàbiênđộápsuấtlớ n nhấtcủa sóng (Pa max) [125], Pa= Pa maxxsin(2πft)ft).Biênđ ộ á p s u ấ t l ớ n n h ấ t c ủ a sóng( Pam a x)t ỷ l ệ t h u ậ n v ớ i n ă n g l ư ợ n g đ ầ u v à o c ủ a n g u ồ n p h á t s i ê u â m ( t r a n s d u c e r ) Ởc ư ờ n g đ ộ ( b i ê n đ ộ ) t h ấ p , s ó n g á p s u ấ t t ạ o r a s ự c h u y ể n đ ộ n g v à t r ộ n l ẫ n b ê n t r o n g chấtlỏng,được gọilà dòngâmthanh( a c o u s t i c s t r e a m i n g ) Ở c ư ờ n g đ ộ c a o h ơ n , á p suất cục bộ trong pha giãn nở của chu kỳ rơi xuống dưới áp suất hơi của dung dịch, cácbong bóng không chịu được áp suất bên trongv à c u ố i c ù n g b o n g b ó n g n ổ t u n g t ạ o r a s ự cânbằng động giữaáp suất bêntrong vàb ê n n g o à i c h ấ t l ỏ n g [ 151]. Thông quah i ệ n tượng này, năng lượng cơ học của sóngs i ê u â m đ ư ợ c b i ế n đ ổ i v à t r u y ề n q u a d u n g d ị c h lỏng[151,114].

Hiện tượng vi xoáy:Sóng siêu âm cường độ cao truyền vào trong lòng chất lỏng sẽgây nên sự kích thích mãnh liệt Tại bề mặt tiếp xúc giữa 2 pha lỏng / rắn hay khí / rắn,sóng siêu âm gây nên sự hỗn loạn cực độ do tạo thành những vi xoáy Hiện tượng này làmtăng cường sự truyền khối đối lưu và thúc đẩy xảy ra sự khuyếch tán ở một vài trường hợpmà khuấytrộn thôngthườngkhôngđạt được[111].

Quátrìnhsủibongbóng:Sủibọtkhíổnđịnhlàsựsủibọt khítừsóngsiêuâmcómứ c năng lượng thấp tạo ra những bọt khí có kích thước nhỏ và ít thay đổi trong suốt cácchu trình nén và giãn nở Kết quả là kích thước của bọt khí tăng lên sau mỗi chu trình, saunhiều chu trình nén và giãn nỡ, bọt khí sẽ đạt kích thước giới hạn mà năng lượng âm khôngcònkhảnănggiữphahơiởbêntrong.Đếnchutrìnhnéntiếptheo,hơibấtchợtngưngtụ và những bọt khí sẽ vỡ Trong suốt quá trình siêu âm, sự sủi bọt khíổ n đ ị n h c ó t h ể t r ở thành sựsủi bọt khí nhất thời haycó thểđồngthờixảyra[42]. Ứng dụng của sóng siêu âm trong công nghệ thực phẩm : Đối với các thiết bị siêuâm giống nhau thông qua điều chỉnh cường độ siêu âm hay thời gian siêu âm cũng sẽ ảnhhưởnglớnđếnquátrìnhxửlínếusựthayđổinàyđượclàđángkể.Nhiệtđộcàngcaogâyra các chuyển động nhiệt hỗn loạn cùng với tác động gây rung động của sóng siêu âm cànglàmhạtdễdàngbịphávỡhơn Ivana Lj ub ić Herceg[92]chothấyhìnhthái hạtngu yênliệu chiết xuất sẽ thay đổi tùy thuộc vào thiết bị sử dụng Sự thay đổi cường độ siêu âmtrong trường hợp thay đổi 34, 55 và

73 W/cm 2 trong cùng thời gian là 15 phút, theo lýthuyết cường độ siêu âm càng lớn kích thước hạt nguyên liệu càng giảm nhiều hơn, nhưngthực chất dưới tác động của sóng siêu âm bên cạnh việc phá vỡ hạt nguyên liệu nó cũng tácđộng vào các phân tửnước tạo ra các gốc tự do là H + và OH - Các gốc tự do sau đó sẽ thoátra ngoài và có khuynh hướng kết hợp với các phân tử hòa tan khác.Wenjian Cheng[159]cũng tiến hành thí nghiệm điều chỉnh với các bước thời gian khác nhau và cường độ siêuâm 74W/cm 2 cho kết quả trước khi xử lí sóng siêu âm hạt nguyên liệu gần như còn nguyênvẹn,sau 15 phút siêuâmcho thấytất cảcáchạtnguyên liệu biến mất.Hầu hết các phân tử sinh học đều nằm trong các tế bào, để tách chúng bằng cách phávỡ thành tế bào cho dung môi hòa chất nội bào và khuếch tán chúng ra môi trường chiết.Hiện nay, nguyên tắc phá vỡ tế bào chủ yếu bằng phương pháp cơ học và thẩm thấu hóahọc Phương pháp cơ học phá vỡ vật lý, giải phóng các chất bên trong tế bào vào môitrường xung quanh Quá trình phá vỡ tế bào được thực hiện bằng hiệu ứng va chạm của cáctế bào dưới tác dụng của áp suất, dẫn đến sự phá vỡ tế bào, giải phóng các phần tử bêntrong.Phávỡtếbàobằngphươngphápcơhọcchiphínănglượngcao.Phươngpháphóa học tách các chất bên trong tế bào vi sinh vật bằng cách thẩm thấu hóa màng ngăn bênngoài tế bào Sử dụng các dung môi hữu cơ: toluen, ether, benzene, methanol, tácđ ộ n g để tạo thành các kênh dẫn qua màng tế bào hoặc sử dụng các men như glycanases beta (1-6) và beta (1-3), protease và mannase Các protein cơ bản, như protamine hoặc cationicpolysaccharidechitosan c ũ n g c ó t h ể g â y thẩmt hấ u h ó a tế b à o H ạ n c h ế c h í n h c ủ a ch iế t xuất hóa học là tốc độ chiết xuất chậm, giá thành cao và yêu cầu phải loại bỏ các dung môichiết tách từ sản phẩm cuối cùng Nhiều nước (Đức, Anh, Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật,Nga, ) đã ứng dụng hiệu ứng nổ bóng khí trong nông nghiệp để chiết xuất các hợp chất tựnhiên như: chiết xuất lá, rễ cây sâm, cây cỏ thảo, nhiều loại cây dược liệu quý (florescrataegi, fructus crataegi, herba hyperici) với quy mô công nghiệp làm giảm thời gian chiếtxuất 2 đến 3 lần, chỉ sử dụng 50 - 70% lượng dung môi, hiệu suất chiết tách tăng lên 30 -50%sovới phươngphápchiết truyền thống[12,15,150].

Bảng1.4C á c ứ n g d ụ n g củasiêu âmnăng lượng caotrongcôngnghiệpthực phẩm[134] Ứngdụng Cơ chế Lợiích

Nhũ hóa Sự vỡ những bọt khí sẽ giúp cho 2 phakhôngt a n l ẫ n v à o n h a u đ ư ợ c t r ộ n l ẫ n vào nhau hiệu quảhơn

Lọc Làmnhiễu loạn lớp biên Gia tăngtốcđộdòngchảy,giảmtắcnghẽn

Phá bọt Áp suấtâmsẽ làmvỡnhữngbọtkhí Tăng năng suất, làm giảm hoặc loạibỏ những chất hóa học chống tạobọt Ép đùn Daođộngcơhọc,giảmma sát Tăngnăngsuất

Tăngquátrìnhtruyềnnhiệtcũngn h ư lực trượt Sự vỡ những bọt khí sẽ ảnhhưởnglênthành tế bàoVSV

Lênmen Tăngquátrìnhtruyềncơchất,kíchthíchcácq uá trình sống

Xử lý siêu âm sẽ làm tăng tốc độ và sản lượng việc lên men, như đẩy mạnh quá trìnhsản xuất ethanol từ sinh khối [119] Ngày nay các thiết bị siêu âm công suất lớn ứng dụngchiết xuấttrong sảnxuấtcácchế phẩmsinh học[43,45,57] Ấn Độđãứ n g d ụ n g r ộ n g công nghệ siêu âm để chiết xuất các hợp chất tự nhiên như actemisin, chè xanh, thực vật cho thấy chiết xuất nghệ tây với tỷ lệ chất rắn : dung môi Ethylen dichlorid là 1:5, phươngphápchiếtxuấtthông thườngởnhiệt độ60 0 Csau4lầnchiếtxuất x3giờvớitổn gthờigian chiết 12 giờ cho hiệu suất thu hồi dầu đạt 85-90%, khi đó chiết xuất bằng siêu âm ởnhiệt độ phòng sau 3 lần chiết xuất x 30 phút với thời gian 1 giờ 30 phút cho hiệu suất thuhồi dầu đạt 90 - 95% [44]. Chiết xuất thanh hao, phương pháp chiết xuất thông thường vớitỷlệchấtrắn:dungmôin- hexanlà1:6,sau9lầnchiếtxuấtx5giờvớitổngthờigianchiết 45 giờ cho hiệu suất thu hồi dầu đạt 85-90%, khi đó chiết bằng siêu âm với tỷ lệ chấtrắn : dung môi n- hexan là 1:8, sau 4 lần chiết xuất x 30 phút với thời gian 2 giờ cho hiệusuất thu hồi dầu đạt 90 - 95% [45] Chiết xuất chè xanh ở nhiệt độ phòng có tỷ lệ chất rắn :dung môi ethyl acetat là 1 : 5, chiết thông thường sau 4 lần chiết xuất x 2 giờ với tổng thờigian chiết 45 giờ cho hiệu suất thu hồi dầu đạt 65-70%, khi đó chiết bằng siêu âm sau 3 lầnchiếtxuất x30 phút với1 giờ 30phút cho hiệu suất thu hồi dầu đạt85-90%[150].

Chai Junhong và cộng sự, chiết xuất polysaccharidest ừ n ấ m Đ ầ u k h ỉ b ằ n g c ô n g nghệsóngsiêuâm,tiến hành2lầntrongthờigian 45phút,nhiệtđộ60°C,tỷlện guyên liệu / dung môi lỏng = 1/15, so với chiết xuất truyền thống bằng nước ấm cho thấy chiếtxuất sóng siêu âm giảm tới 4/5 thời gian và lượng polysaccharides tăng thêm 40%.

[54].XiaoPingC h e n v à c ộ n g s ự,c h i ế t x u ấ t p o l y s a c c h a r i d e s t ừ n ấ m L i n h c h i b ằ n g s ó n g s i ê u âmtrongnướcởnhiệtđộ95 0 Ctrong3giờ,điềukiệnnàyhiệusuấtchiếtxuấtPolysacchari destănglên42%đến75%.[161].NghiêncứukháccủaSheng-

QuanHuangvàc ộ n g s ự,x ử lý nguyênl i ệ u b ằ n g só ng si êu â m , t ỷ lện g u y ê n l i ệ u / d u n g m ôi l à 1 / 1 1 , 6 cho hiệu suất chiết tăng 115,56% so với chiết bằng nước nóng [148].YANG Ding-long vàcộngsự,chiếtxuấtpolysaccharides từLinh chibằngsiêuâmởn h i ệ t độ55 0 C,thờig ian20p h ú t c h o h à m l ư ợ n g p o l y s a c c h a r i d e s đ ạ t 1 4 , 2 5 % , c ò n p h ư ơ n g p h á p c h i ế t x u ấ t t h ẩ m thấu là 5,44% trong 180 phút, trộn thông thường là 7,35%, cho thấy trích ly bằng siêu âmcó lợi thế tiết kiệm thời gian, năng lượng, hiệu quả chiết xuất cao [163] Nghiên cứu củaWenboZ h a n g v à c ộ n g s ự v àn g h i ê n c ứ u c ủ a N I A NB a o - y i v à c ộ n g s ự c ũ n gc h o t h ấ y chiếtx u ấ t L e n t i n a n h ỗ t r ợ b ằ n g s ó n g s i ê u â m g i ú p g i ả m đ ư ợ c c h i p h í t r o n g s ả n x u ấ t , nhiệtđ ộ v à r ú t n g ắ n t h ờ i g i a n c h i ế t x u ấ t … [ 158,1 2 8 ].H U B i n - j i e , S H I Z h a o - z h o n g s ửdụngphươngphápsiêuâmtrongchiếtxuấtpolysaccaridestừnấmbờmsưtửởđiề ukiện cơc h ấ t / d u n g m ô i n ư ớ c = 1 / 1 5 , ở n h i ệ t đ ộ 5 0 0 C,2 g i ờ c h i ế t x u ấ t , c h o h i ệ u s u ấ t c h i ế t xuất trên 40% (so với tổng số polyasaccharides), thời gian chiết ngắn hơn phương phápchiếtbằngnướcnóngtruyềnthốnglà4- 5lần[90].

Phân tích kết quả trên cho thấy chiết xuất bằng siêu âm có nhiều ưu điểm hơn so vớiphương pháp thông thường không sử dụng nhiệt, số lần chiết ít hơn nên tiết kiệm đượcdungmôi,tỷlệthuhồicaohơn Cơchếcủasóngsiêuâmgiúp làmtăngkhảnăngch iếtxuất của các qui trình chiết xuất truyền thống, là dựa trên tạo một áp lực lớn xuyên quadung môi và tác động đến tế bào vật liệu, tăng khả năng truyền khối tới bề mặt phân cách,phávỡ thành tếbào trênbềmặt vàbên trongcủavật liệu,thoát chất tan đượcdễdàng.

Nghiên cứu, thửnghiệm vàứngdụngAGIs từđậu đỗ lênmen trên thế giới

Từ năm 1984,Stein và cộng sựđã tìm ra hoạt chất 1-deoxynojirimycin từ sản phẩmlên men củaBacillus subtilisDSM 704 Những năm gần đây các nhà khoa học Trung Quốcđã nuôi cấyBacillus subtilisB2 từ các nguồn cơ chất khác nhau và thu nhận được DNJ cóhoạt tính cao nhất trong môi trường có 4,5% bột đỗ tương Sau quá trình tinh sạch đã xácđịnh được hoạt tớnh kỡm hóm α-glucosidase với giỏ trị IC50là 0,2àg/ml Bằng phương phỏpkhối phổ, các nhà khoa học đã xác định chính xác công thức cấu tạo của DNJ thu được từdịchlên menđỗ tươngbởiBacillus subtilisB2 [167,169].

Nghiên cứu thử nghiệm tính an toàn về độc tố cấp tính của AGIs: Năm2000,Hiroyuki Fujita và cộng sự[78] đã thử nghiệm chất chiết từ đỗ lên men bề mặt trên môitrường rắn bởiA.oryzaetrên chuột ở liều 100 mg/kg và 500 mg/kg Kết quả cho thấy hàmlượng glucose trong máugiảmsovớinhómđốichứng (n) sau15- 60p h ú t n ạ p sucrose Hàm lượng glucose trong máu giảm tương ứng là 17.96 ± 0,42 và 16,76 ± 0,39mmol/l khi so sánh với nhóm chuột đối chứng là 19,91 ± 0,58 mmol/l Nhóm tác giả nàycũngđ ã t h ử n g h i ệ m t r ê n n g ư ờ i b ệ n h Đ T Đ [ 82],đ ể x á c n h ậ n s ự a n t o à n , 9 n g ư ờ i k h ỏ e mạnhđ ã đ ư ợ c u ố n g 3 g / n g à y t r o n g 1 2 t u ầ n K ế t q u ả l à k h ô n g c ó s ự t h a y đ ổ i v ề đ ư ờ n g huyếtvàcácchỉsốhóas inhmáu,cânnặng…ĐiềunàychứngminhAGIstừđỗlênmenbềmặtkhôngcóđộccấptính.

Nghiên cứu tính an toàn về độc tố mãn tính của AGIs: Năm 2003,Hiroyuki Fujita vàcộng sự[82] đã đánh giá AGIs từ đỗ tương lên men là 18 bệnh nhân ĐTĐ typ 2 đã đượcthử nghiệm với liều 0,9 g/ngày (0,3 g/bữa ăn) trong 6 tháng Kết quả cho thấy hàm lượngđườngm á u b a n đ ầ u l à 9 , 3 1 ± 0 , 7 1 m m o l / l v à H b A1c:1 0 , 2 4 ± 0 , 5 8 % S a u 6 t h á n g t h ử nghiệm, hàm lượng đường máu giảm còn 8,61 ± 0,66 mmol/l, HbA1c: 8,96 ± 0,3%, chỉ sốmỡ máu và tổng cholesterol, triglycerit cũng giảm Hơn nữa, enzyme tiêu hóa không bị ảnhhưởngtrongsuốt quá trình thửnghiệm.

Nghiên cứu về tính an toàn đối với các enzyme tiêu hóa: Năm 2001,Hiroyuki Fujitavà cộng sự[79] nghiên cứu cho thấy AGIs từ đỗ lên men bề mặt nấm mốc có tác dụng kìmhãm α-glucosidase nhưng lại không kìm hãm các enzyme tiêu hóa khác như amylase,protease, pepsin, trypsin, chymotrypsin hoặc lipase Hiện nay, người ta chưa phát hiện ramột tác dụng phụ nào về tiêu hoá Chất chiết xuất này còn có tác dụng điều hoà sự hoạtđộng của các enzyme tiêu hóa trong ruột non nên nó là một sản phẩm an toàn và có lợi chotiêu hoá Cácchỉ số vềcân nặnghaychiềucao khôngthayđổi.

Nghiên cứu tính an toàn của AGIs đối với người ĐTĐ: Chất chiết từ đỗ sau lên menbề mặt trên môi trường rắn bởiA.oryzaecó hàml ư ợ n g đ ư ờ n g t h ấ p v à c ó l ư ợ n g l ớ n c á c chất béo không bão hòa như axit α- l i n o l e n i c ( a x i t b é o o m e g a - 3 ) c ó t á c d ụ n g h ạ triglyceritmáuvàLDL- cholesterolởnhữngbệnhnhânĐTĐvàbéophì.Ngoàira,chấtxơ chứa trong sản phẩm đỗ lên men bề mặt trên môi trường rắn giúp hấp thu glucose chậmhơn,làm chậm tốcđộ tiêu hóatại dạdầyvàviệcgắn glucosetại ruột non.

Năm 2001,Hiroyuki Fujita và cộng sự[79] đã thử nghiệm trên 8 bệnh nhân có nguycơ mắc bệnh ĐTĐ và 4 bệnh nhân ĐTĐ Kết quả là sau khi sử dụng chất chiết từ đỗ lênmen bề mặt trên môi trường rắn thì sự kìm hãm hàm lượng glucose trong máu được quansát thấy sau 60 và 90 phút tiêu thụ sacarose (người có nguy cơ ĐTĐ) và tác dụng giảmđường huyết có ý nghĩa tại thời điểm 60 phút và 120 phút sau khi ăn (người ĐTĐ), so sánhvới đối chứng không uống chất chiết từ đỗ lên men bề mặt Cả các đối tượng có nguy cơmắc ĐTĐ và các bệnh nhân ĐTĐ đều không có bất cứ tác dụng phụ nào, không quan sátthấysựbất thườngtrongmáu haycácchỉ số sinhhóa.

Năm 2000, các nhà khoa học Hàn Quốc đã phát hiện cyclo (Dehydroala – L – leu),mộtAGIstừdịchchiếtcủaPenicilliumsp.F70614cóhoạttínhkìmhãmα- glucosidasetừnấmmenvàruộtnonlợnvớihoạttínhkìmhãmα- glucosidasecógiátrịIC50lầnlượtlà

30và50μg/ml.Tuynhiên,cyclokhôngcóhoạttínhkìmhãmβ–glucosidase,α–glucosidase từAspergillus, β – glucosidase từEscherichia colivà α – mannosidase từ đậuván [113] Sau đó, năm 2002,Kwon, Y I và cộng sựđã công bố CKD-711 và CKD-711 làAGIs mới thu được từ dịch lên men củaStreptomycessp.CK 4416 –m ộ t l o à i v i k h u ẩ n đượcphânlậptừđấtrừngcủađảoJeju.CKD-711vàCKD–

Dowex 50W-2X và cột sắc ký Sephadex G-10 Hoạt tính kìm hãm α–glucosidase của haichất này đã được nghiên cứu và so sánh với acarbose Bên cạnh đó, hoạt tính kìm hãm cácenzyme kể trên của CKD-711a kém hơn so với CKD-711 Thử nghiệm việc giảm 50%đường huyếtsau ăn với đốitượng thínghiệm là chuột,các tácg i ả đ ã b ổ s u n g

C K D - 7 1 1 vào các bữa ăn có chứa tinh bột và sucrose Kết quả cho thấy lượng CKD-

711 cần bổ sungđể kìm hãm α-glucosidase và sucrase tương ứng là 3,07 mg/kg và 1,15 mg/kg, trong khilượngacarbosechỉ phải sửdụngtươngứnglà1,94mg/kgvà1,15/kg[112].

Năm2 0 0 1 ,K a i s a v à c ộ n g s ự [100],c ù n g cớ i c ô n g ty Nipponc ủ a N h ậ t B ả n - n ổ i tiếng chuyên cung cấp các chất bổ sung cho sảnx u ấ t T P C N - đ ã s ả n x u ấ t đ ư ợ c A G I s t ừ môi trường sau lên men bề mặt trên môi trường rắn củaAspergillusspp Trong phần giớithiệu của mình, Nippon cũng đã dẫn hàng loạt các nghiên cứu khoa học của Fujita chứngminh về hiệu quả và tính an toàn của AGIs chiết từ đỗ lên men bề mặt trên môi trường rắnbởi nấm mốcthựcphẩm[130].

Năm 2001Hiroyuki Fujita và cộng sự[80] đã lên men bề mặt trên môi trường rắn đỗtươngbằngA.oryzaeđãcảithiệnchấtlượngdinhdưỡngthựcphẩmtừđỗtương.Sau4

8giờ lên menA.oryzaeđã loại được phần lớn chất kìm hãm trypsin, hàm lượng protein thôtăng, hàm lượng các mạch peptide cỡ nhỏ (< 20 kDa) tăng và các mạch peptide lớn (>60kDa) gảm thay vì khoảng 22,1% peptide lớn ở đậu đỗ sống và các loại thức ăn từ đậu đỗthôngthườngkhác.

Năm 2001,Hiroyuki Fujita và cộng sựđã nghiên cứu lâm sàng sản phẩm Touchi trênbệnh nhân có nguy cơ ĐTĐ và các bệnh nhân ĐTĐ Ở nhóm bệnh nhân có nguy cơ ĐTĐcho uống dịch chiết Touchi với liều lượng 0,1 - 10g trước khi sử dụng 75g sucrose Sau 60và 90 phút nhận thấy có sự kìm hãm hàm lượng glucose trong máu Ở nhóm bệnh nhânĐTĐ, sử dụng 0,3g chất chiết Touchi trước khi ăn 200g cơm Sau 60 phút và 120 phút sauăn đã nhận thấy sự giảm đường huyết và insulin khi so sánh với bệnh nhân không sử dụngchất chiết Touchi Cả hai nhóm bệnh nhân trên đều không thấy xuất hiện các tác dụng phụnào như đau bụng, buồn nôn, không thấy bất thường các chỉ số sinh hóa của máu [77] Tớinăm 2005, nhóm tác giả này đưa ra sản phẩm cao chiết Touchi dưới dạng thuốc với liềulượng 0,3g/viên cho người bị ĐTĐ trong 6 tháng Nhận thấy chỉ trong một tháng đầu sửdụng, hàm lượng đường huyết đã giảm [63] Rất nhiều sản phẩm thương mại ứng dụng từđỗ tương lên men được sản xuất dưới dạng viên nén/viên nang, dạng túi hòa tan hay bổsungvà o c á c l o ạ i đ ồ u ố n g v à t h ự c p h ẩ m T h e o k i ế n n g h ị c ủ a ủ y banc h â u Â u , t ổ c h ứ c

EFSA về sản phẩm cho người ăn kiêng, dinh dưỡng và dị ứng (NDA) khuyến cáo nên bổsung thêm lượng sản phẩm này với liều lượng 0,3g trong mỗi bữa ăn hàng ngày Với liềulượng trên, từ 3 - 4 bữa ăn trong ngày sẽ bổ sung trung bình 0,9 - 1,2g dịch chiết Touchi,lượng tối đa của dịch chiết được bổ sung theo kiến nghị là 4,5g trên ngày tương đương với15gđỗ tươnglên men làcó khảnănghỗ trợsựgiatăngcủabệnhĐTĐ[63].

Năm 2007Jing Chen và cộng sự[99] đã khảo sát sản phẩm douchi của Trung quốc(sảnphẩm lênmenbằngnấmmốc A.oryzae,Actinomucor elegantsvàR h i z o p u s arhizus) chothấyhoạttínhkìmhamα-glucosidasecủasảnphâm̉ lênmenbằngA.oryzaecaohơnso vớiActinomucorelegantsvàRhizopusarhizus.

Năm 2013,Min và các cộng sự[124] đã tinh sạch và xác định được 2 peptide là cóhoạt tính kìm hãm α-glucosidase từ từ đỗ tương lên men lỏng bằngAspergillus oryzaeN159-1làtri-peptidePro-Phe-ProvàCys-Leu.

Vào tháng 6 năm 2008, chế phẩm AGIs từAspergillusspp lên men bề mặt đỗ tươngđã được cấp phép vào thị trường Châu Âu (tháng 6 năm 2008) - một thị trường nổi tiếng về sự quản lý nghiêm ngặt các loại sản phẩm thực phẩm và đã nhận được sự đánh giá cao củaUỷ bancốvấn Thực phẩmvà Chế biến Hộiđ ồ n g c h u n g c h â u Â u H i ệ n n a y , c h ế p h ẩ m AGIs từ nấm mốc lên men bề mặt đỗ tương được sử dụng rộng rãi không chỉ ở các nướcNhật Bản, Trung Quốc mà cả ở các nước Châu Âu [102] Có nhiều nghiên cứu chứng minhAGIs từ đậu đỗ lên men bề mặt là an toàn qua các thử nghiệm trên chuột và người AGIsđược sử dụng trước bữa ăn để cản trở quá trình thuỷ phân carbohydrate trong ruột non.Công ty Nippon chuyên cung cấp chất bổ sung cho sản xuất TPCN của Nhật Bản đã sảnxuất được hợp chất có hoạt chất kìm hãm AGIs từ đỗ tương lên men [130] Đây được coi làTPCN được khuyến cáo sử dụng thường xuyên trong bữa ăn hàng ngày với tác dụng hỗ trợđiều trịĐTĐ[50]. Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu thu nhận sản phẩm chứa AGIs ứng dụng chosản xuất sản phẩm chức năng từ nguồn thực phẩm mà chủ yếu là đỗ tương lên men với cácchủng vi sinh vật khác nhau Đặc biệt tại Nhật Bản – quốc gia công nhận sản phẩm đỗtươnglênmenlàsảnphẩm thựcphẩmcólợiđặcbiệtchosứckhỏevàtácdụngđiềutr ịbệnhĐTĐ.

Nghiên cứu vàứngdụngAGIs ở Việt Nam

Ở Việt Nam có khoảng 4,5 triệu người mắc bệnh ĐTĐ, dự tính đến năm 2025 cókhoảng 7 triệu người mắc bệnh ĐTĐ trong đó bệnh ĐTĐ type 2 chiếm trên 90%. Nhữngnămg ầ n đ â y , t r ê n t h ị t r ư ờ n g , T P C N c h o n g ư ờ i m ắ c b ệ n h Đ T Đ c ó g i á t r ị t ừ v à i t r ă m nghìnđếnvài triệunhư: viêngiáp xácT i a n s h i , t á o x o ắ n T i a n s h i , o y s t e r P l u s , t i n h d ầ u hoa anh thảo Hiện nay để chữa bệnh ĐTĐ người ta thường dùng các nhóm thuốcsulphonylurea và biguanidses Ngoàira các thuốc có hoạt tính kìmh ã m α - g l u c o s i d a s e cũngđượcsửdụngnhiều,nhưngcácthuốcnàychủyếuđượcchỉđịnh chonhữngngườiđãm ắ c b ệ n h [1].H i ệ n na y, ở n ư ớ c t a c h ư a c ó n h i ề u c ô n g tr ìn hn gh i ê n c ứ u n g h i ê n c ứ u sâu về thu nhận AGIs từ nấm mốc để chế biến thực phẩm, thuốc cho người ĐTĐ mà mớichỉ tập trung vào tạo sản phẩm dinh dưỡng hay tạo sản phẩm chức năng chứa hàm lượngcaonattokinasehay chứapeptide chuyển hóa angiotensin [16] Trongnhững nămg ầ n đây đã có một số công trình nghiên cứu và sản xuất TPCN cho người bệnh ĐTĐ nhưĐặngHồng Ánh và cộng sự, 2007 đã nghiên cứu công nghệ sản xuất bột lá dâu tằm giàu DNJ vàứng dụng trong một số sản phẩm TPCN cho người bệnh ĐTĐ [2], nghiên cứu sản xuấtTPCN từ râu ngô [10], chống oxy hóa từ sữa vừng đen ở người có tuổi [33] và đã nghiêncứuthu nhận thành côngGammaOryzanoltừcámgạobằngcôngnghệ chiết xuất [9].Năm 2011,QuảnLêHàvàcộngsựnghiêncứuchothấyđỗđenlênmencóhoaṭtínhkìmham̃lớnhơnsovớ iđỗtương;hoạttínhkìmhãmđốivớiα- glucosidasetừđộngvật:Đỗđen:77%,đỗtương: 49.5%.H o ạ t tínhkìmhãm vớicác loạ iα-glucosidase từvisinhvật:Đỗđen:65%vớ i α- glucosidase từba ci ll us l i c h e n i f o m i s ,62% α - g l u c o s i d a s e từAspergillus niger,4 5 % v ớ i α - g l u c o s i d a s eA o r y z a e Đ ỗt ư ơ n g : 3 1 % v ớ i α - g l u c o s i d a s e t ừb a c i l l u s lichenifomis,22.4%α- glucosidase từAspergillusniger,28%vớiα-glucosidaseA.oryzae

[140,141] Năm 2011,Nguyễn Thị Hương Trà và cộng sựnghiên cứu công nghệ sản xuấtTPCN từ đỗ tương lên men dùng cho người ĐTĐ, đã tuyển chọn đượcA.oryzaeTBV1 cóhoạt tính kìm hãm α-glucosidase đạt 32% [17] Năm 2013,Quản Lê Hà và cộng sựđã xácđịnh điều kiện lên men rắn choA.oryzaetrên môi trường đỗ đen, giai đoạn 1 là lên men rắnởnhiệtđộ30 o C,thờigian30giờ,giaiđoạn2(thủy phân)làởnhiệtđộ50 o C,thườigian48 giờ [142,75,61].

Hiện trong nước chưa có công trình công bố nghiên cứu bản chất của AGIs, trích lyAGIs bằng sóng siêu âm và thu nhận AGIs này từ đỗ đen xanh lòng lên men bề mặt môitrườngrắnbằngA.oryzaechochế biếnthực phẩmdànhchongườiĐTĐ.Đâylà mộthướng nghiên cứu cần thiết để sản xuất AGIs này làm nguyên liệu chế biến thực phẩm cho ngườiĐTĐvàbéo phì.

Từ các nghiên cứu thực tế trong và ngoài nước ở lĩnh vực phân lập, tuyển chọn nấmmốcp h ù h ợ p c h o h o ạ t t í n h k ì m h ã m α - g l u c o s i d a s e , đ ế n q u á t r ì n h l ê n m e n h ì n h t h à n h AGIs, chiết xuất, thu nhận và tinh sạch AGIs, xác định bản chất của AGIs này và hướngứngdụngAGIsnày, mộtsố vấn đềcơbảncần đượcquan tâm là:

- Hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của AGIs thu nhận, hiệu suất tổng hợp phụ thuộcvào chủng vi sinh vật – chịu sự chi phối của điều kiện môi trường lên men Tuy nhiên, cònthiếu nghiên cứu tuyển chọn vi sinh vật nói chung, nấm mốc và đặc biệt làA.oryzaephùhợp cho hình thành AGIs cao ở Việt Nam Các ngân hàng giống vi sinh vật ở Việt Namcũng không có chủng vi sinh vật hình thành hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao được lưutrữvànhângiống.

- Việcs ử d ụ n g n g u y ê n l i ệ u l à n ô n g s ả n t r o n g n ư ớ c l à m c ơ c h ấ t c h í n h c h o q u á trìnhhình thành AGIsnày là có tính khả thi Đây cũng lànguồn nông sản phong phúở ViệtNam.

- Cácthôngsốkỹthuậtcủaquátrìnhlênmen,hìnhthànhAGIsphụthuộcvàotừngvisin h vật khảo sát-cầnphải đượcxácđịnh cụ thểtheo thựcnghiệm.

- Không phải tất cả AGIs từ nấm mốc, ngay cả AGIs từA.oryzaeđều có tính chấtgiốngnhau Hoạt lựccủaAGIs thu nhậnphụ thuộcvàovi sinh vật, điềukiện lên men.

- Thu nhận AGIs, tinh sạch và tạo chế phẩm AGIs cho hoạt tính, hoạt lực kìm hãm α- glucosidase cao và hiệu quả phụ thuộc vào công nghệ thu nhận, tinh sạch - cần phải đượcxácđịnh cụ thểtheo thựcnghiệm.

Chính vì vậy, việc nghiên cứu phân lậpA.oryzaecó hoạt tính kìm hãm α- glucosidasecao, nhiên cứu đề xuất các điều kiện lên men bề mặt trên môi trường rắn thích hợp trên cơsở sử dụng các nông sản, điển hình là một số đậu đỗ ở Việt Nam để thu nhậnAGIs này,nghiên cứu các điều kiện chiết xuất AGIs bằng sóng siêu âm, các điều kiện tinh sạch, xácđịnhbản chất cũngnhư hướngứngdụng AGIsnàyđượcthựchiện.

Nguyênvật liệu nghiên cứu

-Ba mẫu mốc tương Bần, Yên Nhân, Hưng Yên; 3 mẫu mốc tương Cựu Đà,

ThanhOai, Hà Nội; 3 mẫu đỗ đen mốc ở Bần Yên Nhân, Hưng Yên; 3 mẫu đỗ đen mốc ở Cựu Đà,Thanh Oai, Hà Nội; 3 mẫu đỗ xanh mốc ở Cựu Đà, Thanh Oai, Hà Nội; 2 mẫu đỗ tươngmốcở Chợ ĐồngXuân – HàNộivà2 mẫugạo mốcở ChợĐồngXuân –HàNội.

- Đỗ đen xanh lòng, đỗ đen trắng lòng, đỗ tương (VN93 - 4), đỗ xanh (ĐX 11), gạonếpcái hoa vàng(nếpcáihoavàngKinhMôn), cámgạo, trấu.

- Đỗ đen xanh lòng dùng trong nghiên cứu đã được xác định thành phần hóa học vàtính chất vật lý: Có khối lượng 1000 hạt là 118,85 g, dung trọng 807,3±0,8 g/l, độ ẩm12,73±0.26 %, Gluxit 52,16±0,21%, tro tổng số 3,35%, protein 23,55±0.2 % và thànhphần axit amin g/100 g là: 3,85 g Threonin, 5,23 g Valine, 1,52 g Methionine, 1,46 gIsoleucine,1,14gLeucine; 1.25gPhenylalanine,0.40gTryptophanvà1,24gLysine.

- Cám gạo dùng trong nghiên cứu: Cám gạo từ lúa gạo sau khi xay xát được diệtenzymel i p a s e b ằn g phương phápsấy cámở n h i ệ t đ ộ 10 0- 10 5 0 C/ 1 0 phút, t hà nh p h ầ n : độẩ m 7 , 2 % , P r o t e i n ( 1 3 , 2 % ) , L i p i t ( 1 7 , 5 % ) , S ợ i t h ô ( 9 , 3 % ) , c a r b o h y d r a t e ( 3 7 , 6 % ) ,

Trothô(7,2%),Canxi(0,74mg/g),M a g i e ( 8 , 2 m g / g ) , P h o t p h o ( 1 5 , 4 m g / g ) , P h y t i n photpho (9,7 mg/g),Silica (8,7mg/g),Kẽm(41mg/g),Vitamin B1(17,5 mg/g)v à VitaminB2(3,8mg/g)

- Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng, chủng Swiss, có trọng lượng 20 ± 2 g, cảđực cả cái, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp. Độngvật được nuôi trong điềukiện phòng thí nghiệmv ớ i đ ầ y đ ủ t h ứ c ă n v à n ư ớ c u ố n g t ạ i n ơ i thínghiệm từtrướckhi nghiêncứu 5 ngàyvàtrongsuốt thời gian nghiên cứu.

2.1.2 Hóachất α-glucosidase từ ruột non chuột (rat interstinal aceton power), p-Nitrophenyl α-D- glucopyranoside (PNP-G), NaCL, Tris Base, đệm phosphat 0,1 M (lấy từ SigmaChemicalCo, Mỹ), đệm phosphate 0,5M pH 6,7 (Trung Quốc); acarbose (Glucobay,100mg) (BayerMedicalCo.Leverkusen,Đức) Cáchóachất thôngdụng…

Môi trường Czapek-Dox (g/l): NaNO33; KCl 0,5; MgSO4.7H2O 0,5; FeSO4.7H2O0,01; ZnSO4.7H2O 0,01; CuSO4.7H2O 0,005; aga 20 (nếu là môi trường lỏng thì không cóaga);nướccất 1000ml,pH =5,0 Thanh trùngởnhiệtđộ 121 0 C trong15 phút.

Khiphân loại nấmmốcbằngchỉtiêu hình thái học,sửdụngloạimôi trường sau:

1 0 0 m l : N a N O 33 0 ; KCL5,0;MgSO4.7H2O5 ; F e S O4.7H2O0,1;ZnSO4.7H2O0,01; CuSO4.5H2O0,05; nướccất100ml.

- Môi trường Czapek Yeast Agar với 20% sucrose (CYA20S) g/l:K2HPO41; MôitrườngCzapekconcentrate10ml;caonấmmen5,0;s u c r o s e 2 0 0 ; a g a r 1 5 ; n ư ớ c c ấ t 1000ml.

- Môi trường Czapek Dox Agar (CZ) g/l:K2HPO41; Môi trường Czapek concentrate10ml;sucrose30; agar 17,5; nướccất 1000 ml.

- Môi trường Czapek Yeast Agar (CYA25, CYA37) g/l:K2HPO41,0; Môi trườngCzapekconcentrate 10ml;cao nấmmen 5,0; sucrose30; agar15; nướccất1000 ml.

Các môi trường được khử trùng ở nhiệt độ 121 0 C trong 30 phút sau đó phân phối 25mlmụi trườngvào mỗi đĩapetri (ỉ100mm) vụ trựng.

2.1.3.3 Môitrườngđậu đỗgiáthểrắn Đậu đỗ rửa sạch, ngâm nước 10 giờ ở nhiệt độ phòng, để ráo 5 phút, hấp chín ở nhiệtđộ121 0 C trongvòng60phút.

Nămmôi trườngnhângiốngvớithành phầntỷlệkhốilượng(g/g)như sau:

- M1có tỷlệ: Bộtngô : trấu là4: 1

- M2có tỷlệ: Đỗ tương:trấu là 4: 1

- M3có tỷlệ: Cám gạo : trấu là 4: 1

- M5có tỷlệ: Cám gạo : gạo :trấu là2 : 2 : 1

Cácmôi trườngnàyđềucó độ ẩm 50%vàpH5,5.

2.1.3.5 Đỗđenlênmen Đỗ đen lên men là bột của môi trường (đỗ đen xanh lòng) sau lên men bằngA.oryzaeT6, được sấy ở nhiệt độ 60 0 C, hàm ẩm đạt khoảng 5% và nghiền thành bột (trình bày ởchương4).

Cácthiếtbị:Tủsấy (TrungQuốc),máyđoquang(Ultrospec2000,PharmaciaBiotech), nồi thanh trùng (Trung Quốc), tủ cấy vô trùng (Labgard, Mỹ), tủ lạnh (Sanyo,NhậtB ả n ) , tủ n u ô i l ắ c ( N h ậ t B ả n ) , kính h i ể n vi q u a n g học( O l y m p u s –

C H 2 , Nh ậ t B ả n ) máy đánh sóng siêu âm ultrasonic LC30, máy li tâm (Đức), hệ thống trich ly và cô chânkhông quy mô 70 lít/mẻ Thiết bị siêu âm TJS-3000 intelligent Ultrasonic Generator V6.0(do Công ty Hangzhou Success Ultrasonic Equipment Co.,Ltd sản xuất), bể siêu âm dungtích 20 lít, tần số 20 kHZvàcôngsuất tối đa 3000W

Nghiên cứu thực hiện tuyển chọnA.oryzae, lên men bề mặt, chiết xuất AGIs, tinhsạch AGIs, tạo chế phẩm AGIs và ứng dụng chế phẩm cho sản xuất TPCN tại phòng thínghiệm của Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, phòng thí nghiệm của Viện Cơ điện nôngnghiệp và Công nghệ sau thu hoạch và Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzymevà Protein – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội Nghiên cứuxác định khối lượng phân tử và trình tự amino acid bằng khối phổ bằng thiết bị MALDI-TOF/ TOFmassspectrometerđượcthựchiệntạiphòngthínghiệmcủaProteomicsInternationalPtyLtd. Địachỉ:Box3008,Broadway,Nedlands, WesternAustralia6009.

Thời gian đào tạo theo hệ không tập trung 4 năm(2010 – 2014) Thờig i a n n g h i ê n cứu của nghiên cứu sinh cho đến khi hoàn thành các nội dung nghiên cứu theo đề cươngcủađềtài: 5/ 2010 -5/ 2014.

Phươngpháp phân tích vàđo đạc

Bằng phương pháp đếmgián tiếp thông qua sốl ư ợ n g k h u ẩ n l ạ c m ọ c t r ê n m ô i trường đĩa thạch: Cân 10 gam mẫu hòa với 90 ml nước cất vô trùng, đồng nhất mẫu Hút 1ml chuyển sang ống nghiệm thứ nhất có chứa 9 ml nước cất vô trùng. Trộn bằng máyVoltex Lập lại lần thứ ba, thứ tư tới nồng độ thích hợp để tách các khuẩn lạc Hút 200 μldung dịch đã pha loãng cho vào đĩa petri có môi trường Czapek – Dox. Trang thật đều trênbề mặt thạch Đặt vào tủ ở nhiệt độ 30 0 C trong 2 ngày sau đó lấy ra đếm số khuẩn lạcA.oryzae.

Sốlượng visinhvật trungbìnhcótrong1mlhay1gmẫu(N)đượctínhtheocông thức:

∑C:t ổ n g sốđ ơ n v ị h ì n h t h à n h k h u ẩ n l ạ c ( C o l o n y forming u ni t ( C F U ) ) đ ế m đ ư ợ c trêntất cảcácđĩa n1: số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ nhất (độ pha loãng thấp nhất)n2: số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ hai (độ pha loãng tiếp theo)f1:hệsố phaloãngcủađĩađếm thứnhất v:thểtích mẫu cấyvàomỗi đĩapetri

2.2.2.1 Xácđ ịn h hoạttí nh k ì m hãmα- glu co sida se c ủ a m ô i t r ư ờ n g s a u l ê n m e n theophươngpháp củaYamaki và Mori(2006)[162]

10 g môi trường sau lên men bề mặt được nghiền nhỏ bằng cối sứ, bổ sung 90 g nướccất,chiết ở 100 0 C trong 3 giờ Lọc bằng ly tâm ở 3800 vòng/phút trong 15 phút, thu dịchtrong,xácđịnh %hoạt tính kìm hãm α-glucosidase (mục2.2.2.3).

Dịch chiết xuất bằng dung môi được lọc tách cặn, phần dịch lọc được ly tâm 3800vòng / phút trong 10 phút, thu dich nổi, cô dịch nổi bằng thiết bị cô chân không (ở nhiệt độ60 0 C, - 0,8 atm) để loại dung môi, thu cao khô, hòa tan trở lại trong nước cất bằng lượngdịch chiết trước khi cô, đem xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase (%) theo phươngpháp củaToomoyuki và cộng sự, 1999 [153] (mục 2.2.2.3) Thí nghiệm tiến hành lập lại 3lần đốivới mỗi mẫu.

NO 2 p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosidα - D-glucosep-nitrophenol α–glucosidasephản ứngvớip-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid(pNPG)giảiphóng4

– nitrophenol Hoạt tính kìm hãm α-glucosidase được đánh giá bằng cách xác định sự tạothành 4 – nitrophenol ở bước sóng 405 nm sau khi phản ứng xúc tác của α-glucosidase vớicơ chất p-Nitrophenyl α - D - glucopyranoside có tham gia của AGIs Điều kiện phản ứngvới nồng độ cơ chất 1mg/ml, thời gian phảnứng là 30 phút và lượng α- g l u c o s i d a s e l à 50àl (nồngđộ 0,2 U/ml).

Ađối chứng:Độhấp thụcủamẫuphảnứngbaogồmcơchấtpNPGvàα-glucosidase.

Amẫu:ĐộhấpthụcủamẫuphảnứngbaogồmcơchấtpNPG,α- glucosidasevàdungdịchchứahoạt chất AIGs.

IC50( I n h i b i t o r yconcentration) l à n ồ n g đ ộ c ủ a h o ạ t c h ấ t m à c ó t h ể k ì m h ã m đ ư ợ c50%hoạtđộenzyme(trongtrườ nghơpnàylàα-glucosidase)(theophươngphápcủaJing và cộng sự 2007) [99] IC50được xác định bằng cách khảo sát hoạt tính kìm hãm của hoạtchất với enzyme ở các nồng độ khác nhau Nếu hoạt lực kìm hãm enzyme của hoạt chấtbiếnthiêntuyếntínhvớinồngđộ,chúngtasẽvẽđượcmộtđườngthẳngy=ax+b(vớiylà

% hoạt tính kìm hãm và x là nồng độ) Nếu hoạt lực kìm hãm enzyme của hoạt chất khôngbiến thiên tuyến tính với nồng độ, một cách gần đúng, chúng ta chọn 2 nồng độ kìm hãmtrên và dưới 50% và cũng vẽ được đường thẳng y = ax+b Thay y = 50% vào phương trìnhta sẽ thu được giá trị x, đó chính là IC50 Một số công trình nghiên cứu đã làm sáng tỏ rằnghoạt tính kìm hãm α-glucosidase khác nhau khi sử dụng-glucosidase có nguồn gốc khácnhau Với mục tiêu là tạo được AGIs và ứng dụng cho bệnh nhân ĐTĐ nên chúng tôi lựachọn-glucosidase từ chuột cho các thí nghiệm định tính và định lượng hoạt tính kìm hãmα-glucosidase.

2.2.3 Xácđịnhhàmlượngproteα-glucosidasein,lipit,carbonhydrateα-glucosidasevàđộẩmtrongcácsảnphẩmthựcph ẩm

Xác định hàm lượng protein (%), theo AOAC 991,20 [40]; Xác định hàm lượnglipit(%), theo AOAC 991,36 [41]; Xác định độ ẩm (%) theo TCVN 4326: 2001 (ISO6496:1999)[21].

2.2.4 Phươngphápphântíchcảmquan Đánh giá cảm quan thực phẩm thực hiện theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 3215 – 79.Sử dụng phép thử thị hiếu để đánh giá mức độ ưa thích đối với sản phẩm Người thử sẽđược mời nếm sản phẩm và đo mức độ ưa thích, hài lòng của mình đối với từng mẫu sảnphẩm.Thangđiểm sửdụngtừ1 – 9 (Hình2.1)

Khảnăngphân biệt sản phẩm vềmặt thị hiếu củacácthangđo thang9 điểm thị hiếu:

Thang điểm được định nghĩa trước thông qua các thuật ngữ mô tả mức độ hài lòng,ưathíchđối với sản phẩm:

1–cựckìghét2– rấtghét 3–tươngđốighét4– hơi ghét 5– khôngthíchcũngkhôngghét

7 – tươngđốithích8– rất thích9– cựckì thích

Sự khác nhau giữa các sản phẩm được kiểm định bằng phương pháp phân tíchphương sai ANOVA mô hình S*A (S: người thử, A: sản phẩm) Sau đó tính LSD (giá trịkhácnhau nhỏ nhất) đểkiểm định hậu nghiệm (Hà DuyênTư, 2006)[5].

2.2.5 Phương pháp tínhtoán,đánhgiáhiệu quảtinh sạchchếphẩmAGIskỹthuật

Hiệu quả tinh sạch chế phẩm AGIs được đánh giá qua các thông số cơ bản như hiệusuấtthu hồi, độ sạch.

TA0:tổngAGIs có trongmẫuthô; TA1: tổngAGIscó trongmẫu sau tinhchế

- Côngthức: P = CAGIsx100/A vớiA:Hàmlượngmẫu;CAGIs:HàmlượngAGIscủamẫu.

- Xác định tổng số vi khuẩn yếu khí, nấm men, nấm men, nấm mốc trong các sảnphẩm thực phẩm theo TCVN 4886-89 [26]; Xác địnhE.coli, theo TCVN 6846:2007 [30];Xác địnhSalmonella, theo TCVN 4829:2005 [22]; Xác địnhStaphylococcus aureus, theoTCVN 4830:2005 [23]; Xác địnhClostridium perfringens, theo TCVN 4991:2005 [27];Xác địnhBacillus cereus, theo TCVN 4992:89 [28]; Xác định aflatoxin, theo TCVN7596:2007 [31]; Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí, theo TCVN 4884:2005 [25]; Tổngbàotửnấmmen–mốcTCVN6265:2007[29];XácđịnhColiforms,theoT C V N 4882:2007 [24].

- Xác định hàm lượng chì, theo AOAC 994.02 [39]; Xác định Asen, theo AOAC952,13 [37]; Xác định hàm lượng cadimi, theo AOAC 2000 [36]; Xác định hàm lượng thủyngân, theo AOAC 971,21 [38]; Xác định hàm lượng đồng, theo ISO 8294:1994 [91]; Xácđịnhhàm lượng3-MCPD, theoTCVN 7731: 2007 [32].

Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, lập lại ít nhất 3 lần Số liệu được xử lý trênphầnmềm thốngkêIrristat 4.0 và thốngkêtoán học.

Phươngphápnghiêncứu

Phân lậpA.oryzaetừ mẫu tương, mẫu đỗ đen mốc; đỗ xanhmốc;đỗtươngmốcvàgạo mốc

↓ Tuyển chọn chủng nấm có hoạt tính kìm hãm α- glucosidasecao.

↓ Định danhA.oryzaetuyển chọn được dựa trên so sánh trìnhtự genvùng ITS1-5,8S-ITS2

↓ MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SINH

GIỐNGTRÊNMÔITRƯỜNGRẮN Ảnh hưởng của thành phần cơ chất môi trường rắn đến sinhtrưởngcủaA.oryzaeT6

↓ Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ trấu trong môi trường rắnđến sinhtrưởngcủaA.oryzaeT6

↓ Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường nhân giống đếnsinh trưởngcủaA.oryzaeT6

↓ Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nhân giống đến sinhtrưởngcủaA.oryzaeT6

↓ Ảnh hưởng của độ dày khối môi trường nhân giống đến sinhtrưởngcủaA.oryzaeT6

↓ MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ

NĂNGHÌNHTHÀNHAGIs BẰNGA.ORYZAET6 Ảnhhưởngcủanguồncơchấtmôitrườnglênmenđếnkhản ănghìnhthànhAGIsbằngA.oryzaeT6

↓ Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ cám gạo bổ sung vào môitrường lên men đến khả năng hình thành AGIs bằngA.oryzaeT6

↓ Ảnh hưởng của thành phần K 2 HPO 4 ; KCL và

↓ Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường lên men đến khảnănghìnhthànhAGIsbằngA.oryzaeT6

↓ Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường lên men đến khảnănghìnhthànhAGIsbằngA.oryzaeT6

↓ Ảnh hưởng của độ đầy khối môi trường lên men đến khảnănghìnhthànhAGIsbằngA.oryzaeT6

↓ Ảnh hưởng của lượng giống ban đầu lên men đến khảnănghìnhthành AGIsbằngA.oryzaeT6

↓ Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến khả năng hìnhthànhAGIs bằngA.oryzaeT6

Sự biến động AGIs và sinh trưởng củaA.oryzaeT6 trongquátrìnhlênmen

↓ CHIẾT XUẤT AGIs TỪ ĐỖ ĐEN LÊN MEN BẰNGSỬDỤNGSÓNGSIÊUÂM Ảnh hưởng của dung môi đến khả năng chiết xuất

↓ Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến khả năng chiết xuấtAGIstừđỗđenlênmen

↓ Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi ethanol và đỗ đen lên menđến khảnăngchiết xuất AGIs

↓ Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết xuất AGIs từđỗđenlênmen

↓ Ảnh hưởng của thời gian và cường độ sóng siêu âm đếnkhảnăngchiếtxuấtAGIstừđỗđen lênmen

↓ TINH SẠCH VÀ ĐỊNH LƯỢNG AGIs TỪ ĐỖ ĐENLÊNMEN Khảosát dungmôichotinh sạchsơbộAGIs

↓ Xác định khối lượng phân tử và trình tự amino acid bằngkhốiphổ

↓ ỨNGDỤNGAGIs Ảnh hưởng của nhiệt độ cô, sấy tạo chế phẩmAGIsđếnchấtlượngchếphẩmAGIs

↓ Đánh giá chỉ tiêu chất lượng, cảm quan và an toàn thựcphẩmcủachếphẩmAGIs

↓ ĐỀ XUẤT CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẾ PHẨMAGIs TỪ ĐỖ ĐEN XANH LÒNG LÊN MEN

Hình2.2 S ơ đồ nghiên cứu tổng quát

2.3.2 Tuyểnchọn A.oryzaecó hoạttínhkìmhãmα-glucosidaseglucosidaseα-glucosidasecao

Thí nghiệm được tiến hành phân lậpA.oryzaetừ các mẫu mốc tương; đỗ đen mốc; đỗxanhmốc; đỗ tươngmốcvàgạo mốc(mục2.1.1).Tiến hành lấymẫu phânlậpA.oryzae.

- Phân lập: Tiến hành lấy mẫu nghiên cứu một cách ngẫu nhiên trên các lô sản phẩmtạicáccơsởsảnxuất.Mẫuđượclấybằngcácdụngcụvôtrùng,đóngtúinilon,dánnhãnv à đưa mẫu về phòng thí nghiệm để phân tích ngay Phân lậpA.oryzaetừ tạo dãy nồng độpha loãng bằng cách cân 1g mẫy hòa tan với 9 ml nước cất vô trùng, trộn đều trên máyVoltex Hút 1ml chuyển sang ống nghiệm thứ hai có 9 ml nước cất vô trùng, trộn đều, lậplại lần thứ ba, thứ tư tới nồng độ thớch hợp để tỏch khuẩn lạc Hỳt 50 àl dung dịch phaloóng cho vào đĩa pettri cú môi trường Czapek – Dox (mục 2.1.3.1) Trang thật đều bề mặtđĩa thạch Nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 28 0 Ctrong 2 ngàylấyraquan sát đọckết quả.

- Kiểm tra lại độ thuần khiết khuẩn lạc chủng nấm mốc lựa chọn: Chọn các khuẩn lạctrên môi trường thạch đĩa pettri, tách các khuẩn lạc này ra và hòa tan, pha loãng ở nồng độcần thiết trong nước cất vô trùng. Nhỏ một giọt dịch trên vào đĩa petri có môi trường, dùngque gạt phân phối giọt dịch đều khắp bề mặt thạch đĩa petri thứ nhất, rồi thứ 2, thứ 3 Đặtcác đĩa petri trên vào tủ ấm ở nhiệt độ 28 0 C trong 2-3 ngày Lấy ra quan sát các khuẩn lạcmọcriêngrẽ,sựthuần khiếtcủakhuẩnlạclà biểuhiện sựthuần khiết của giốngnấmmốc.

- Kiểm tra vết cấy: Cấy truyền các khuẩn lạc mang những đặc điểm củaA.oryzaevàocác ống thạch nghiêng, để vào tủ nuôi cấy ở nhiệt độ 28 0 C trong 3 ngày Quan sát sự sinhtrưởng củaA.oryzaequa vết cấy trên môi trường thạch nghiêng Nếu vết cấy có bề mặt vàmầu sắc hồng đều, thuần nhất chứng tỏ giống phân lập được là tinh khiết Giữ giống trongtủ lạnh ở nhiệt độ 4 0 C Cấy truyền bảo quản giống nấm mốcA.oryzae:A.oryzaeđược giữtrên môi trường thạch nghiêng và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 4 đến 6 0 C rồi đượccấytruyền định kỳ3 tháng/lần.

- ĐịnhloạiA.oryzaetheokhóa phânloạiAspergilluscủaKlich[107]: Cấy chấmđiểm để nghiên cứu đặc điểm theo phương pháp củaPitt và Hocking, 1997 [136]: Chuẩn bịdungd ị c h A ( 0 , 2 % a g a r + 0 , 0 5 % T w e e n 8 0 ) , d u n g d ị c h B ( b à o t ử n ấ m t r o n g n ư ớ c v ụ trựng) Trộn đều dung dịch A và dung dịch B theo tỷ lệ 1:1 thu được dung dịch C Lấy 2 àldung dịch C đặt vào 3 điểm trờn mặt thạch của hộp petri chứa môi trường CYA25, môitrường CYA20S và môi trường CZ (mục 2.1.3.2.) Nuôi cấy 7 ngày ở nhiệt độ 28 0 C.

1) lên lam kính, dùng que cấy mốc lấy mốc trong ống thạch nghiêng đặt trên tiêu bản. Rửatiêu bản bằng dung dịch nước: ethanol, nhỏ một giọt xanh methylene, đậy lá kính, để khô,tiến hành soi kính Các chỉ tiêu quan sát để định loại: Mầu sắc bào tử, đường kính khuẩnlạc, mầu sắc hệ sợi, mầu sắc mặt sau khuẩn lạc, hạch nấm, kích thước và hình dạng bào tửtrần, cấu trúcthểbình, kích thướcvàhình dạngbọngđỉnhgiá, hình dạngbôngnấm.

Từ 12 chủng nấm mốc ký hiệu từ T1 - T12, khảo sát khả năng sinh tổng hợp AGIscủa các nấm mốc phân lập được bằng xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase. Nuôi cấycác chủng nấm trong các bình tam giác 250 ml với thể tích là 100 ml trong môi trường CZlỏng (không cóaga) (mục 2.1.3.1) nuôi lắc ở 30 ± 2 o C trong 24g i ờ , s a u đ ó c h u y ể n 5 % sang nuôi trong các bình tam giác 250 ml với thể tích là 100 g môi trường đỗ tương (mục2.1.3.3) nuôi tĩnh 48 giờ ở nhiệt độ 30 0 C, xác định hoạt tính kìm hãm α- glucosidase củamôi trường sau lên men (mục 2.2.2.1) ở các bình tam giác So sánh hoạt tính kìm hãm α-glucosidaseở cácchủngnghiêncứu.

2.3.2.3 Định danh chủng nấm tuyển chọn được dựa trên so sánh trình tự genvùngITS1-5,8S-ITS2[68,137,59] Định tênnấmmốc bằng phương pháp giảitrìnhtự genvùngITS1- 5 , 8 S -

DNA Purification Kit của Fermentas Trình tự tiến hành: Dùng pipet sạchquyệt khoảng 2mm 2 khuẩn lạc trên thạch nghiêng cho vào ống 1,5ml; Thêm 200 μl TE 1X(Tris: 0,1212 g và EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid): 0,03 g H2O trong 100 ml;chuẩn pH =8.0), trộn đều hỗn hợp tránh tạo bọt; Thêm 400 μl dung dịch Lysis và ủ ở nhiệtđộ 65 0 C trong 10 phút.; Thêm

600 μl dung dịch chloroform vào ống đã ủ, lắc nhẹ vài lần;Ly tâm 10.000 vòng/phút trong

3 phút; Hút toàn bộ dịch trên sang ống mới và thêm 800 μldung dịch tủa ADN (720μl dung dịch H2O khử ion + 80 μl dung dịch Supplied 10X) Để ởnhiệt độ phòng trong 5 phút; Ly tâm, loại dịch nổi Hoà tủa ADN trong 100 μl dung dịchNaCl 1,2M Thêm 2 μl RNAse 10mg/ml, ủ nhiệt độ 37 0 C trong 1 giờ; Thêm3 0 0 μ l ethanol tuyệt đối vào ống và để nhiệt độ -20 0 C trong 3 giờ hoặc qua đêm; Ly tâm 12.000vòng/phút trong 15 phút, thu tủa Rửa tủa hai lần bằng ethanol 70 0 ( Thêm 500 μl ethanol70 0 ,trộnđều;Lytâm12.000vòng/phúttrong5phút;LàmkhôADNbằngmáyhú tchân

Lặp lại 35 chu trình khônghoặclàmkhôtựnhiêntrongbốcsạch);HoàtủaADNtrong50μlTE1X.Bảoquảnở nhiệt độ -20 0 C.

-Khuếch đạiđoạn genITS1 -5,8S - ITS2 bằngphản ứngPCR

ITS1: 5′ - TCC GTA GGT GAA CCT GCG G - 3′ITS4:5′ -

Phản ứng PCR được thực hiện trong 35 chu kỳ Kết thúc phản ứng hạ nhiệt độ xuốngnhiệtđộ 4 0 C.Mẫu đượcđọctrình tựtrên máygiảitrìnhtựtựđộng3100 (ABI-Mỹ)

-Tinh sạch sản phẩm PCR:Điện di các mẫu PCR cần làm sạch trên gel agarose1,5%; Nhuộm, soi, cắt gel và cân gel cho vào ống Eppendoff, sau đó cho thành phần buffercủa bộ kít QIAquick Gel Extraction Kit Protocol vào với 3 thể tích thành phần buffer củabộ kít QIAquick Gel ExtractionKit Protocol : 1 thể tích gel (100mg tương đương 100l);Đem ủ hỗn hợp ở 50 o C trong 10 phút sao cho mầu của hỗn hợp chuyển sang vàng; Chothêm 1 thể tích izopropanol vào mẫu và mix đều; Dùng Eppendoff cột (có màng lọc) đặtvào trong một Eppendoff 2ml thường khác Cho hỗn hợp mẫu lên cột và tiến hành ly tâm ở12000 vòng/phút trong 1 phút; Hút bỏ dung dịch bên dưới, chèn cột lại; Thêm 0,5 ml thànhphần buffer của bộ kít QIAquick Gel Extraction Kit Protocol và ly tâm như trên; Rửa cộtbằng 0,75 ml PE, để 2 - 5 phút rồi lại tiến hành ly tâm như trên; Hút bỏ dịch bên dưới và lytâmlạiđểdịchxuốnghết;RútcộtravàchènvàoốngEppendoffsạch,sauđódùngnướccất hoặc dung dịch TE (10MTris, - pH 8,0 -HCl, 1mM Ethylenediaminetetraacetic acid)cho chảy nhẹ qua lưới lọc để hoà tan ADN bám trên lưới Thu sản phẩm PCR sạch và dùngđểgiải trình tự.

- Đọc trình tự gen vùng ITS1-5,8S-ITS2:Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch tiếnhànhđọctrình tự bằngbộ kítBigdye3.1 trên máy3100 (ABI-Mỹ).

Nuôi cấyA.oryzaeT6 vào các bình chứa thành phần cơ chất môi trường (100 g môitrườngtr on g b ì n h t a m g i á c 2 5 0 m l ) : M 1 , M 2 , M 3 , M 4 v à M 5 ( m ụ c 2 1 3 4 ) ( v ớ i t h à n h phầncơchấtlàbộtngô,bộtđỗtương,cámgạovàgạo).Sau3ngàynuôitĩnhởnhiệtđộ30 ±2 0 C,xácđịnh mật độ tếbào củaA.oryzaeT6 (mục2.2.1).

2.3.3.2 Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ trấu trong môi trường rắn đến sinh trưởngcủa A.oryzaeT6

Nuôi cấyA.oryzaeT6 vào các bình chứa môi trường M5 (mục 2.1.3.4) có thành phầncám gạo : gạo là 1 : 1 (100 g môi trường trong bình tam giác 250 ml) với thành phần ở tỷ lệtrấu: 5; 10; 50; 15; 20; 25; 30; 35 và 40% Sau 72 giờ nuôi tĩnh ở nhiệt độ 30 ± 2 0 C, xácđịnhmật độ tếbào củaA.oryzaeT6 (mục2.2.1).

2.3.3.3 Ảnhhưởngđộẩmbanđầucủa môitrườngnhân giốngđếnsinhtrưởng của A.oryzaeT6

NuôicấyA.oryzaeT6vàocácbìnhchứamôitrườngM5(mục2.1.3.4)đượcchỉnh độẩmbanđầutheo cácthang 45;50;55;60 và65%(100g môitrường trongbìnhtamgi ác 250 ml) Sau 120 giờ nuôi tĩnh ở nhiệt độ 30 ± 2 0 C, xác định mật độ tế bào củaA.oryzaeT6 (mục2.2.1).

NuôicấyA.oryzaeT6vàocácbìnhchứamôitrườngM5(mục2.1.3.4)đượcchỉn hpH ban đầu theo các thang 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5 và 7,0 (100 g môi trường trongbìnhtamgiác250ml).Sau72giờnuôitĩnhởnhiệtđộ30±2 0 C,xácđịnhmậtđộtếbàocủa

Nuôi cấyA.oryzaeT6 vào các bình chứa môi trường M5(mục 2.1.3.4)ở c á c n h i ệ t độ: 20 ± 2; 25 ± 2; 30 ± 2; 35 ± 2 và 40 ± 2 0 C (100 g môi trường trong bình tam giác 250ml).Sau72 giờ xácđịnh mật độ tếbào (mục2.2.1).

Nuôi cấyA.oryzaeT6 vào trong các khay (kích thước 50 x 30 x 25 cm) chứa môitrường môi trường M5 (mục 2.1.3.4) được chỉnh độ dày khối môi trường theo các thang2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 và 9,0 cm Sau 120 giờ nuôi ở nhiệt độ 30 ± 2 0 C, xác địnhmật độtếbào (mục2.2.1).

NuôiA.oryzaeT6trongcác khay với6cmđộ dày khốimôitrường M5( m ụ c 2.1.3.4), pH 5,5 và độ ẩm 55%, nuôi ở nhiệt độ 30 ± 2 0 C Xác định mật độ tế bào (mục2.2.1)ở cácmốcthời gian: 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8 và 9ngày.

CấyA.oryzaeT6 vào các bình chứa cơ chất môi trường (100 g môi trường trong bìnhtam giác 250 ml): đỗ đen trắng lòng, đỗ đen xanh lòng, đỗ tương, đỗ xanh, cám gạo và gạo(mục 2.1.3.3) Sau 48 giờ lên men ở nhiệt độ 30 ± 2 0 C, xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidasecủamôi trườngsau lên men(mục2.2.2.1).

2.3.4.2 Ảnhh ư ở n g c ủ a t h à n h p h ầ n t ỷ l ệ c á m g ạ o b ổ s u n g v à o m ô i t r ư ờ n g l ê n men đến khả nănghình thànhAGIsbằngA.oryzaeT6

CấyA.oryzaeT6 vào các bình chứa môi trường đỗ đen xanh lòng (mục 2.1.3.3) có bổsung cám gạo theo các tỷ lệ: 0 (đối chứng); 5; 10; 15; 20 và 25% (100 g môi trường trongbìnhtamgiác 250ml).Sau48giờlênmen ởnhiệtđộ 30±2 0 C,xácđịnhhoạttính kìm hãmα-glucosidasecủamôi trườngsau lên men (mục2.2.2.1).

2.3.4.3 Ảnhh ư ở n g c ủ a t h à n h p h ầ n K 2 HPO 4 ;K C L v à M g S O 4 bổs u n g v à o m ô i trườnglênmenđếnkhả nănghìnhthànhAGIsbằng A.oryzaeT6

CấyA.oryzaeT6 vào các bình chứa môi trường đỗ đen xanh lòng (mục 2.1.3.3) có bổsung K 2 HPO4; KCL và MgSO4theo các tỷ lệ trình bày ởBảng 2.1(100 g môi trường trongbình 250 ml) Sau 60 giờ lên men ở nhiệt độ 30 ± 2 0 C, xác định hoạt tính kìm hãm α- glucosidasecủamôi trườngsau lên men.

Bảng2.1H àm lượngmộtsốchấtkhoángtrong môi trườnglênmen

MT0 MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7 MT8 MT9 MT10

CấyA.oryzaeT6 vào các bình chứa môi trường đỗ đen xanh lòng (mục 2.1.3.3) đượcchỉnh pH ban đầu theo các thang pH 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0 và 7,5 (100 g môitrường trong bình tam giác 250 ml) Sau 60 giờ lên men ở nhiệt độ 30 ± 2 0 C, xác định hoạttínhkìm hãmα-glucosidasecủamôi trườngsau lênmen (mục2.2.2.1).

2.3.4.5 Ảnhhưởngđộ ẩmbanđầu củamôitrườnglênmen đ ế n khảnăng hìnht hànhAGIs bằngA.oryzaeT6

2.3.5.4 Nghiêncứu ảnhhưởng củanhiệtđộ đếnkhả năngchiếtxuất AGIstừ đỗ đen lênmen: 56 2.3.5.5 Ảnhhưởngcủathờigian vàcườngđộsóngsiêuâmđếnkhảnăngchiếtxuấtAGI stừ đỗđen lênmen 56 2.3.6 Tinhsạch vàđịnh lượngAGIstừđỗ đen lênmen

Khảosátdungmôichotinhsạch sơbộAGIs

Mỗi mẫu 2,28 gam chế phẩm AGIs (chiết xuất từ 100 gam đỗ đen lên men bề mặt)hòa tan trong 100 ml nước cất, sau đó kết tủa từng mẫu trong 900 ml:( e t h a n o l , m e t h a n o l vàisopropylalcohol),đểởnhiệtđộ25 0 C,sau24giờđemlytâmtáchtừngphầnkếtt ủavà dịchlọcmỗimẫu.Sauđóđemsấykhôđểloạidungmôiởtừngphầncủacácmẫurồixácđịnhlượngc hất khô vàhoạt tính kìm hãm α-glucosidase(mục2.2.2)

Khảosátnồngđộethanolcho tinhsạchsơbộAGIs

Mỗi mẫu 2,28 gam chế phẩm AGIs hòa tan trong 100 ml nước cất, sauđ ó k ế t t ủ a từng mẫu trong 900 ml ethanol 70, 75, 80, 85, 90 và 95%, để ở nhiệt độ 25 0 C sau 24 giờđem ly tâm tách từng phần kết tủa và dịch lọc mỗi mẫu Sau đó đem sấy khô để loại dungmôi ở từng phần của các mẫu rồi xác định lượng chất khô và hoạt tính kìm hãm α- glucosidase(mục2.2.2).

Thunhận AGIs

Sử dụng các enzyme thủy phân để xác định bản chất của AGIs từ đỗ đen lên men saukhi tinh sạch sơbộ bằng ethanol 90% cóphảilà peptideh a y k h ô n g 0 , 3 2 g a m b ộ t c h ế phẩm AGIs tinh sạch sơ bộ bằng ethanol 90% hòa tan trong 100 ml nước cất, sau đó xácđịnhAGIscóphảilàpeptidetheophươngphápcủaMin-Gu-

[124] là xử lý bằng các enzyme thủy phân (1%) lần lượt với pepsin, trypsin, pancreatin, α- amylase, α-glucosidase, sau các phản ứng với các enzyme thủy phân được vô hoạt enzymeở nhiệt độ 100 0 C trong 10 phút, loại bỏ kết tủa, rồi thu dịch lọc bằng ly tâm tốc độ10000rpm, 25 phút ở nhiệt độ 4 0 C Dịch lọc thu được thêm nước cất đạt 100 ml, đem xác địnhhoạttính kìm hãm α-glucosidase (mục2.2.2).

Tinhsạch AGIsbằng RP-HPLC

Sau khi, chế phẩm AGIs tinh sạch sơ bộ bằng ethanol 90% và xử lý bằng 1% pepsin(mục 2.3.6.3) tiến hành tách phân đoạn bằng RP - HPLC (cột C18 5 mm, 4,6 x 250 mm).Đầu tiên cột được cân bằng với acetonitrile AGIs sẽ được rửa giải bằng phương phápgradient với dải nồng độ từ 0% đến 50% acetonitrile (v/v) trong đệm 0,1 TFA với tốc độdòng là 0,8 ml/phút AGIs được phân tích bằng cách xác định khả năng hấp thụ tại bướcsóng 280 nm Thể tích mỗi phân đoạn thu được là 1ml Các phân đoạn sau khi xác định cóhoạt tính kìm hãm α-glucosidase sẽ được làm đông khô tạo chế phẩm AGIs tinh sạch.

- Chuẩn bị đệm Phosphate: Potassium phosphate được cân chính xác khoảng 6,8 gamvàbổsungnướccất đến1000 ml.

- Chuẩnbịphađộng:Phađộngđãđượcchuẩnbịbằngcáchtrộn50thểtíchacetonitrile và 50 thể tích 0,05

M phosphate buffer cùng với 0,1% TFA Dung dịch cho phađộngđượclọckhí bằngsiêu âm, lọcquamànglọc0,45mmvàkhửkhí.

- Tiếnh à n h p h â n t í c h : Đ ư a d ị c h m ẫ u s a u k h i đ ư ợ c s ử l ý s ơ b ộ b ằ n g e t h a n o l v à pepsin lên cột bằng kim tiêm tự động với tốc độ 0,5 ml/phút Chạy chương trình gradientvới dải nồng độ từ 0% đến 50% của dung dịch pha động với tốc độ 0,8 ml/phút.S ử d ụ n g bộ phận thu mẫu tự động để thu các phân đoạn với thể tích là 1ml/phân đoạn Các phânđoạn thu được sẽ đemđánh giá lạihoạttính.C á c p h â n đ o ạ n c ó h o ạ t t í n h s ẽ đ ư ợ c đ e m đôngk h ô v à k i ể m t r a l ạ i đ ộ t i n h s ạ c h b ằ n g R P -

Xácđịnhkhối lượngphân tử và trìnhtựaminoacid củaAGIs bằngkhối phổ

Xác đinh được khối lượng phân tử và trình tự amino acid của AGIs Mẫu chế phẩmAGIs tinh sạch, xử lý xử lý mẫu bằng trypsin, chiết xuất được peptide và phân tích bằngthiếtb ị M A L D I - T O F / T O F m a s s s p e c t r o m e t e r t h e o p h ư ơ n g p h á p c ủ aB r i n g a n s v à c ộ n g sựn ă m2 0 0 8 [ 49].P h ổ A G I s đ ư ợ c p h â n t í c h b ằ n g p h ầ n m ề m M a s c o t v à d ữ l i ệ u n g â n hàngLudwigNRhoặcSwissPro.

(PhântíchmẫuđượcthựchiệnbởiProteomicsInternational Pty Ltd Địa chỉ: Box 3008,

Broadway, Nedlands, Western Australia 6009)(PhụlucKQKP).

Địnhlượng peptideAGIs bằngRP- HPLC

Peptide AGIssau khitinh sạchbằng RP- HPLC(xem mục 2.3.6.4) có được sảnphẩm peptide AGIs tinh sạch dưới dạng đông khô, dùng peptide AGIs này làm chất chuẩn,tiếnhànhsắcký,dựngđườngchuẩnpeptideAGIsvàthôngquadiệntíchcủacácpíc sắcký đồ chạy RP - HPLC tương ứng với các nồng độ khác nhau của sản phẩm AGIs, tínhđượchàm lượngpeptideAGIs.

- Chuẩn bị đệm Phosphate vàchuẩn bị phađộng(xem mục2.3.6.4)

- Chuẩnbịdungdịchchuẩn: Dungdịchchuẩnđượcchuẩnbịbằngcáchcân chín hxác125 mgAGIsđãđượcphân tích khối phổ vàhòatan trong5 ml phađộng.

- Tiến hànhphân tích:Đ ư a m ẫ u d u n g d ị c h c h u ẩ n l ê n c ộ t b ằ n g k i m t i ờ m t ự đ ộ n g ở cỏc thể tớch khỏc nhau 10, 20, 30, 40, 50 àl tốc độ 0,5 ml/phút Chạy chương trình gradient(xemmục2.3.6.4).SaukhitạođượcđườngchuẩnđộcủaAGIsdựavàodiệntíchpíc của từng nồng độ Đưa mẫu dịch sau khi được sử lý sơ bộ bằng ethanol và pepsin lên cột bằngkim tiêm tựđộngvới tốcđộ 0,5 ml/phút.

Có được đường chuẩn peptide AGIs, xác định được diện tích píc của sản phẩmpeptide AGIs trong dịch lên men Từ đây suy ra được nồng độ peptide AGIs cần tìm trongdịchchiết đỗ đen lên men.

ỨngdụngAGIs

Mỗi mẫu 1 lít dịch từ dịch chiết của đỗ đen lên men (chiết xuất ở điều kiện: nhiệt độ60 0 C/ 10 phút siêu âm 20kHz với cường độ 8 W/cm 2 , chiết xuất ở tỷ lệ ethanol 50% / bộtđỗ đen lên men (hạt bột Φ 0,8 mm) là 6 lít / kg,) được khảo sát xác định cô sấy ở các nhiệtđộ khác nhau: 50±2; 60±2; 70±2; 80±2; 90±2 và 100±2 0 C Cô sấy cùng điều kiện -0,8 atm, cao cô sấy khô đến độ ẩm 3,5%, được nghiền tạo chế phẩm AGIs, chế phẩm AGIsthuđ ư ợ c đ e m x á c đ ị n h h o ạ t t í n h k ì m h ã m α - g l u c o s i d a s e ( m ụ c 2 2 2 ) v à c ả m q u a n c h ế phẩmAGIs tạo ra.

2.3.7.2 Đánhgiá c hỉ t iêu c h ấ t l ượ n g , c ả m quanvà an t o à n t h ự c phẩmcủac hế phẩmAGIs

Từ5kgchếphẩmAGIs tạo ra, lấymẫu đểphân tích:

- Các chỉ tiêu hoạt tính kìm hãm α-glucosidase, độ ẩm, hàm lượng proterin, lipit, trotổng số, cảm quan, an toànthực phẩm về kim loại nặng, vi sinh vật, aflatoxind ư ợ c x á c địnhtheophươngpháp xem mục2.2.3; mục2.2.4 vàmục2.2.6.

- Thử độc tính cấp chế phẩm theo phương pháp củaĐỗ Trung Đàm, 1996[4]: Chuộtnhắt trắng thực nghiệm được nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm 5 ngày trướckhithínghiệmđểchuộtthíchnghiđiềukiệnthínghiệm.Chuộtđạtyêucầuvềcânnặng20 ± 2 g sẽ được đưa vào thí nghiệm Đường dùng thuốc: đường uống, cho chuột uống bằngcách dùngbơm tiêm có kimđầu tù đểđưathuốc một cách nhẹnhàngvàodạdầychuột.

Tiến hành thử nghiệm trên các lô chuột (mỗi lô 10 con) theo mức liều 0,25ml dịchchiết/ 10g chuột/ 1 lần Khoảng cách giữa hai lần uống liên tiếp là 2 giờ Chuột được đểnhịn đói15 giờtrước khitiến hành thínghiệm,c h o u ố n g n ư ớ c t h e o n h u c ầ u T h e o d õ i chuột liên tục trong vòng 6 giờ, tỉ lệ chết trong 72 giờ và các dấu hiệu khác trong vòng 7ngàysau khi dùngchếphẩm thử.

Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm: Tình trạng chung của chuột: hoạt động tự nhiên, tưthế, màu sắc (mũi, tai, đuôi), lông,phân,nước tiểu; Tỉ lệc h u ộ t c h ế t t r o n g

7 2 g i ờ v à c á c dấuhiệukháctrong vòng 7ngày saukhithử nghiệm;XácđịnhLD50(nếuc ó ) t h e o phươngphápLitchfield–Wilcoxon.

Tìm liều tối đa mà không có chuột nào của lô thí nghiệm chết (LD0) và liều tối thiểuđể 100% chuột của lô thí nghiệm chết (LD100) Thử thêm 3-4 liều trung gian giữa 2 liều nóitrênđểxácđịnhLD50.

Thời gian theo dõi: Chuột được để ở phòng thí nghiệm có khí hậu đảm bảo để mọihoạt động của chuột bình thường Theo dõi vàq u a n s á t c á c b i ể u h i ệ n v ề h à n h v i , h o ạ t động,ăn uống, bài tiết củachuột vàsố chuột sốngchết trong3 ngày.

Tiến hành thử nghiệm: Người thử: Số lượng 12 người Tiêu chí lựa chọn người thử:Làngười18-

45tuổi.Khôngcóbệnhvềgiácquan.Cótinhthầnhợptác.Khôngăncácsảnp hẩ m c ó v ị m ạ n h , kh ôn g hút t h u ố c t rư ớc khit i ế n h àn h t h í n g h i ệ m 2 g i ờ Khô ng sửdụng các mỹ phẩm (son môi, nước hoa, xà phòng thơm) ngay trước khi làm thí nghiệm.Đếnphòngthí nghiệm đúng giờ.

- Phép thử: Phép thử thị hiếu cho điểm thang 9 điểm thị hiếu Mỗi công thức tạo bộtuống liền được khảo sát có lượng mẫu là 100 túi/liều x 300 mg/túi, tiến hành trên 5 sảnphẩmbột uốngliền có thứcT1, T2, T3, T4 vàT5(Bảng2.2).

Bảng2.2 Tỷ lệ phốitrộn cácthành phầntạora sản phẩmbộtuống liền

Công thức Thànhphần Tỉ lệ

- Mẫu được chuẩn bị ở khu vực riêng với khu vực tiến hành cảm quan, ngoài tầmquan sát của người thử Tất cả các mẫu chuẩn bị phải giống nhau (cùng dụng cụ, cùnglượng sản phẩm, cùng dạng vật chứa…) Bột uống liền AGIs sẽ được pha với nước cất ởnhiệt độ 90 0 C, tỉ lệ 1 gói bột uống liền AGIs (300 mg) / 100 ml nước Mẫu sẽ được giữ ởnhiệtđộ 50 0 C vàđem racho ngườithửở điều kiện nhiệt độ thí nghiệm.

- Cách thức trình bày mẫu: Mẫu được mã hóa bằng 3 chữ số ngẫu nhiên, thứ tự sắpxếp mẫu tuân theo hình vuôngWilliams(Bảng2.3)[13].

Bảng2.3Mườitrật tựtrìnhbàymẫutuântheonguyêntắchìnhvuôngWilliamstươngứngvới5 mẫukhảo sát

STT Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 STT Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5

VớiA:làT3; B: làT4; C: làT1; D:làT5 vàE:làT2

- Điều kiện thí nghiệm: Phép thử được tiến hành trong phòng thí nghiệm cảm quantuân theo tiêu chuẩn ISO 8589 Phải đảm bảo sạch sẽ, không có mùi lạ, thoáng mát và yêntĩnh Phòng thử được ngăn cách với khu chuẩn bị mẫu Mỗi đợt 10 người thử Độ chiếusáng đồng nhất tại mọi vị trí trong phòng Nhiệt độ phòng duy trì ở nhiệt độ 20±2 0 C, độẩm tươngđối từ70 đến 85%.

- Tiến hành: Đánh giá cảm quan về mầu sắc, mùi, vị và trạng thái Người thử nhậnphiếu hướng dẫn Người điều hành thí nghiệm giải thích cách tiến hành thí nghiệm cũngnhưnhiệmvụcủ a ngườithử Ngườithửnhận lầnlượttừng mẫuthử đựng trongly thủytinhđãmãhóa,cùngvớiphiếutrảlờitươngứng.Ngườithửthanh vịtrướckhithửm ẫuđầu tiên Sau khi người thử đánh giá xong mẫu đó, thu lại phiếu trả lời cùng với mẫu cũ.Đưa mẫu tiếp theo cùng với phiếu trả lời tương ứng cho người thử, người thử cần thanh vịbằng nước lọc trước khi sử dụng mẫu tiếp theo Sau khi người thử đánh giá xong 5 mẫu sẽphátphiếu điều tracho người thử.

2.3.8 ĐềxuấtcôngnghệsảnxuấtchếphẩmAGIstừđỗđeα-glucosidasenxanhlònglênmeα-glucosidasenbằng A.oryza eT6

Từ các sốliệu nghiên cứu được, tiến hành đề xuấtcông nghệ sản xuất AGIst ừ đ ỗ đenxanhlònglênmenbằngA.oryzaeT6,từđâytiếnhànhthửnghiệmsảnxuấtAGIsởquy mô 100 kg đỗ đen xanh lòng và đưa ra được sơ đồ và thuyết minh quy trình công nghệlênmensản xuấtAGIsbằngA.oryzaeT6.

3.1 Tuyểnchọn A.oryzaecó hoạttínhkìmhãmα-glucosidaseglucosidaseα-glucosidasecao

Ngũ cốc và đậu đỗ là nguồn cơ chất thuận lợi cho sự phát triển của nấm mốc. NhiềucôngtrìnhnghiêncứuđãchỉrasựcómặtcủamộtsốloạinấmmốcnhưA.oryzae,A niger,

A flavus… trên các loại đậu đỗ, gạo Jing chen và cộng sự[99] đã khảo sát cho thấyA.oryzaecho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao,A.oryzaelà loài mốc chính trong quátrình chế biến tương và đậu xị Từ những lý do trên, nên mẫu mốc tương, gạo mốc, đỗtương mốc, đỗ đen mốc và đỗ xanh mốc (mục 2.1.1) được tiến hành phân lập theo phươngpháp phân lậpA.oryzae(mục 2.3.2.1) Thu nhận các chủng nấm có đặc điểm hình tháigiống nhóm nấmA.oryzaetừ mẫu tương, mẫu đỗ đen mốc, đỗ xanh mốc, đỗ tương mốc vàgạo mốc Định loại được hình thái, vi thể các chủng nấm đã phân lập và lựa chọn đượcchủngcó đặcđiểmgiốngA.oryzae Kếtquảnêu trongBảng3.1.

Bảng3.1K ế t quảphânlập Aspergillusspptừcác nguồn khác nhau

Nguồn phân lập Sốmẫu Aspergillussppphânlập

MốctươngCựu Đà,ThanhOai,Hà Nội 3 3 Đỗđenmốcở Bần YênNhân,HưngYên 3 1 ĐỗđenmốcởCựuĐà,Thanh Oai,HàNội 3 3 Đỗxanh mốcởCựu Đà,Thanh Oai,HàNội 3 1 Đỗtươngmốc ở ChợĐồngXuân –HàNội 2 1

Từ 19 mẫu mốc tương, gạo và đỗ tương thu thập ở các địa điểm khác nhau, thựcnghiệmđãphân lập được12 chủngAspergillusspp.

Aspergillusparasiticuscókhảnăngsinhrađộctốaflatoxingâyungthư,dovậychúngtôi tiến hành sàng lọcA.oryzaetừ các nấm mốc phân lập được dựa theo khóa phân loạiAspergilluscủa Klich [107] (mục 2.3.2.1) Các chủng nấm mốc phân lập được phân loại vềđặc điểm phát triển của nấm trên môi trường CZ, CYA25, CY20S và MEA (màu sắc bàotử, đường kính khuẩn lạc, màu sắc hệ sợi, dịch tiết, hạch nấm) và các đặc điểm hình tháinấmm ố c (h ìn h d ạ n g bông nấm, k í c h t h ư ớ c và h ì n h d ạn g bàot ử tr ần , c ấ u t rú ct hể b ìn h, kíchth ướ c và h ì n h d ạ n g b ọn g đỉnh gi á, cu ốn g sinh b à o t ử ) Đặ cđiểm n ổ i b ậ t k h á c bi ệt giữaA.oryzaevớiAspergillus flavusvàAspergillus parasiticuslà khuẩn lạc phát triển tohơn trên môi trường nuôi cấy (đường kính khuẩn lạc từ 50-70mm), hệ sợi dài, dạng lôngnhung, khuẩn lạc trên môi trường Czapek-Dox có mầu vàng xám đến vàng hoa cau, kớchthước bào tử lớn hơn (4-10àm) Từ 6 mẫu mốc tương, 6 mẫu đỗ đen mốc, 3 mẫu đỗ xanhmốc, 2 mẫu đỗ tương mốc đen và 2 mẫu gạo đã phân lập được 12 chủngAspergillusspp đãđược mô tả chi tiết ở phần phụ lục (bảng PL.1).Aspergillusspp có đặc điểm đặc trưng là:sinhsản vô tính bằng bào tử trần, cơquan sinhsản bào tử trần baogồmtế bào chân,g i á bào tử trần có đỉnh phòng lên tạo thành bọng đỉnh giá, hình cầu hoặc hình quả lê ngược,trên bọng đỉnh là cơ quan sinh bào tử trần một tầng hoặc hai tầng Bào tử trần được sinh ratừcácphyalidetạo thànhcácchuỗi dài ngắn khác nhau.

Từ 12 chủngAspergillusspp phân lập được, tiến hành nuôi cấy trên các môi trườngCZ, CY20S và CYA25 trong 7 ngày để quan sát đặc điểm hình thái bằng mắt thường.

40 và 100 lần Các chỉ tiêu quan sát để định loạiAspergillus: Hình dáng bông nấm, kíchthước và hình dạng bào tử trần, cấu trúc thể bình, kích thước và hình dạng bọng đỉnh giá,cuốngsinh bào tử.

TuyểnchọnA.oryzaecóhoạttính kìmhãmα-glucosidasecao

3.1 Tuyểnchọn A.oryzaecó hoạttínhkìmhãmα-glucosidaseglucosidaseα-glucosidasecao

Ngũ cốc và đậu đỗ là nguồn cơ chất thuận lợi cho sự phát triển của nấm mốc. NhiềucôngtrìnhnghiêncứuđãchỉrasựcómặtcủamộtsốloạinấmmốcnhưA.oryzae,A niger,

A flavus… trên các loại đậu đỗ, gạo Jing chen và cộng sự[99] đã khảo sát cho thấyA.oryzaecho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao,A.oryzaelà loài mốc chính trong quátrình chế biến tương và đậu xị Từ những lý do trên, nên mẫu mốc tương, gạo mốc, đỗtương mốc, đỗ đen mốc và đỗ xanh mốc (mục 2.1.1) được tiến hành phân lập theo phươngpháp phân lậpA.oryzae(mục 2.3.2.1) Thu nhận các chủng nấm có đặc điểm hình tháigiống nhóm nấmA.oryzaetừ mẫu tương, mẫu đỗ đen mốc, đỗ xanh mốc, đỗ tương mốc vàgạo mốc Định loại được hình thái, vi thể các chủng nấm đã phân lập và lựa chọn đượcchủngcó đặcđiểmgiốngA.oryzae Kếtquảnêu trongBảng3.1.

Bảng3.1K ế t quảphânlập Aspergillusspptừcác nguồn khác nhau

Nguồn phân lập Sốmẫu Aspergillussppphânlập

MốctươngCựu Đà,ThanhOai,Hà Nội 3 3 Đỗđenmốcở Bần YênNhân,HưngYên 3 1 ĐỗđenmốcởCựuĐà,Thanh Oai,HàNội 3 3 Đỗxanh mốcởCựu Đà,Thanh Oai,HàNội 3 1 Đỗtươngmốc ở ChợĐồngXuân –HàNội 2 1

Từ 19 mẫu mốc tương, gạo và đỗ tương thu thập ở các địa điểm khác nhau, thựcnghiệmđãphân lập được12 chủngAspergillusspp.

Aspergillusparasiticuscókhảnăngsinhrađộctốaflatoxingâyungthư,dovậychúngtôi tiến hành sàng lọcA.oryzaetừ các nấm mốc phân lập được dựa theo khóa phân loạiAspergilluscủa Klich [107] (mục 2.3.2.1) Các chủng nấm mốc phân lập được phân loại vềđặc điểm phát triển của nấm trên môi trường CZ, CYA25, CY20S và MEA (màu sắc bàotử, đường kính khuẩn lạc, màu sắc hệ sợi, dịch tiết, hạch nấm) và các đặc điểm hình tháinấmm ố c (h ìn h d ạ n g bông nấm, k í c h t h ư ớ c và h ì n h d ạn g bàot ử tr ần , c ấ u t rú ct hể b ìn h, kíchth ướ c và h ì n h d ạ n g b ọn g đỉnh gi á, cu ốn g sinh b à o t ử ) Đặ cđiểm n ổ i b ậ t k h á c bi ệt giữaA.oryzaevớiAspergillus flavusvàAspergillus parasiticuslà khuẩn lạc phát triển tohơn trên môi trường nuôi cấy (đường kính khuẩn lạc từ 50-70mm), hệ sợi dài, dạng lôngnhung, khuẩn lạc trên môi trường Czapek-Dox có mầu vàng xám đến vàng hoa cau, kớchthước bào tử lớn hơn (4-10àm) Từ 6 mẫu mốc tương, 6 mẫu đỗ đen mốc, 3 mẫu đỗ xanhmốc, 2 mẫu đỗ tương mốc đen và 2 mẫu gạo đã phân lập được 12 chủngAspergillusspp đãđược mô tả chi tiết ở phần phụ lục (bảng PL.1).Aspergillusspp có đặc điểm đặc trưng là:sinhsản vô tính bằng bào tử trần, cơquan sinhsản bào tử trần baogồmtế bào chân,g i á bào tử trần có đỉnh phòng lên tạo thành bọng đỉnh giá, hình cầu hoặc hình quả lê ngược,trên bọng đỉnh là cơ quan sinh bào tử trần một tầng hoặc hai tầng Bào tử trần được sinh ratừcácphyalidetạo thànhcácchuỗi dài ngắn khác nhau.

Từ 12 chủngAspergillusspp phân lập được, tiến hành nuôi cấy trên các môi trườngCZ, CY20S và CYA25 trong 7 ngày để quan sát đặc điểm hình thái bằng mắt thường.

40 và 100 lần Các chỉ tiêu quan sát để định loạiAspergillus: Hình dáng bông nấm, kíchthước và hình dạng bào tử trần, cấu trúc thể bình, kích thước và hình dạng bọng đỉnh giá,cuốngsinh bào tử.

Qua quan sát đặc điểm phát triển và hình thái của 12 chủngAspergillusspp đã đượcmô tả chi tiết ở phần phụ lục (bảng PL.2) Đặc điểm vi thể và đối chiếu với khóa phân loạiAspergilluscủaKlich[107], cho thấy 12 chủngAspergillusspp phân lập được đều có đặcđiểm giốngloàiA.oryzaevàđượckýhiệu từT1-T12.

Với mục tiêu chủ yếu của đề tài là tuyển chọn đượcA.oryzaecó hoạt tính kìm hãm α- glucosidase cao cho lên men tạo AGIs, bước tiếp theo sau quá trình phân lập là lựa chọncác chủng nấm đã phân lập có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao trước khi tiến hành xácđịnhkhảnănghình thànhAGIscủachủngthích hợp nhất.

Từ 12 chủng nấm mốc phân lập được, tiến hành nuôi cấy 12 chủng nấm mốc ký hiệutừT1-

T12phân lậpđược, trênmôi trường đỗtương lênmen bềmặtg i á thểrắn,sau đó chiếtx u ấ t , l y t â m t h u d ị c h c h i ế t đ ể x á c đ ị n h h o ạ t t í n h k ì m h ã m α - g l u c o s i d a s e c ủ a c á c chủngtheo phươngphápcủaYamaki và Mori [162] (mục2.3.2.2).

Hình3.1H o ạ t tínhkìmhãmα-glucosidase củamộtsố A.oryzaephân lập được

Kết quả (Hình 3.1) cho thấy 12 chủngA.oryzaetừ các nguồn khác nhau có khả nănghình thành AGIs khác nhau, điều này cũng phù hợp kết quả nghiên cứu củaJing Chen vàcộng sự[99] cho thấy sự khác nhau khả năng hình thành AGIs, ngoài các yếu tố của côngnghệ nuôi cấy, chế biến… có thể do các chủng vi sinh vật Mức độ hình thành AGIsc ủ a cácchủngdaođộngtừ16,22±0,74%đến37,52±1,13%hoạttínhkìmhãmα-glucosidase, cao hơn so với đối chứng (môi trường đỗ tương chưa lên men bề mặt có hoạttính kìm hãm α-glucosidase là 6,2 ± 0,58% ). Trong số các chủng phân lập được cho thấychủng T6 và T12 cóhoạttính kìmhãm α - g l u c o s i d a s e c a o h ơ n , đ ạ t l ầ n l ư ợ t l à 3 7 , 5 2 ± 1,23 % và 33,51± 1,07%, caonhất làchủng T6 Kết quả thu được soc á c v ớ i k ế t q u ả nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nước trong các khảo sát cho thấy hoạt tính kìmhãm α- glucosidase của T6 cao hơn so vớiA.oryzae3.951 đã được công bố trong sản xuấtsản phẩm đỗ tương lên men (hoạt tính kìm hãm α-glucosidase là 0,296 ± 0,05 % sau 48 giờ lên menbềmặt,sovớimôitrườngđỗtươngtrướckhilênmenbềmặt(đốichứng)là0,116 ± 0,01 % ) [99] và từ đỗ tương lên men bằngA.oryzaeTBV1 (hoạt tính kìm hãm α- glucosidaseđạt 32%)[17].

Dịch chiết của môi trường đối chứng có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase, có thể là dotrong đỗ tương nguyên liệu có khoảng 3% genistein – một isoflavons dạng aglycon có hoạttính kìm hãm α-glucosidase Đỗ tương sau lên men có hoạt tính kìm hãm α-glucosidasetăng lên đáng kể, điều này có thể lý giải là có thể có thể trong đậu đỗ có các tiền chất chonấmmốchình thành AGIs…hiện vẫn chưaxácđịnh được.

Từ kết quả thu được, bước đầu tuyển chọn được chủng T6 cho khả năng hình thànhAGIs cao nhất (hoạt tính kìm hãm α-glucosidase đạt 37,52 ± 1,23 %) sử dụng cho nghiêncứu điều kiện sinh trưởng và khả năng hình thành AGIs với việc điều khiển cơ chất và quátrình lênmen.

Chủng T6 tuyển chọn cho khả năng hình thành AGIs cao và định loại theo đặc điểmhình thái, được tiến hành định danh bằng phương pháp giải trình tự gen vùng ITS1 -

ITS2t h e o p h ư ơ n g p h á p c ủ aF e r r e C v à c ộ n g s ự ( 2 0 0 1 ) v à P l a y f o r d E G v à c ộ n g s ự , (2006)(mục2.3.2.3). a) KếtquảPCRkhuếchđạigenvùng ITS1-5,8S-ITS2

Trong đó: M: Maker (Thang chuẩn 100 bp), 3 giếng còn lại tương ứng với N: Đối chứng âm,P:Đốichứng dương, T6: mẫu nấm

Từ kết quả điện di (Hình 3.2) có thể thấy, đã khuếch đại được đoạn gen trong vùngITS1 - 5,8S - ITS2 có kích thước khoảng 500bp như mong muốn Sản phẩm hiệu quả, nồngđộtốt Có thể tinh sạch sảnphẩm PCR đểgiải trìnhtự gen. b) ĐọctrìnhtựgenvùngITS1-5,8S-ITS2

Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch tiến hành đọc trình tự bằng bộ kít Bigdye

3.1trênmáy3100 (ABI-Mỹ) c) Kếtquả định danh

Saukhi phântích trìnhtựgencủachủngT6, cókết quảsau:

GTCCAGCCGGACCAGTACTCGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGACCCAAGGTT CAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGG CTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAGATTGTACTCATTCCAATTACGAGACCCAAA AGAGCCCCGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCGGGATTGGGTAATTTGCGCG CCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC CTAATTCCCCGTTACCCGTTGCCACCATGGTAGGCCACTATCCTACCATCGAAAGTTGATA GGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCGGCGCAAGGCCATGCGATTCGTTAAGTTATTATGAATCACCAA GGAGCCCCGAAGGGCATGGGTTTTTTATCTAATAAATACACCCCTTCC

Bảng 3.2Kết quả đánh giá mức độ tương đồng của trình tự đoạn vùng ITS1 - 5,8S - ITS2 củachủng T6vớiGenBank databasesửdụngcôngcụ BLAST

TênNấmmốc Mã sốtruycập Độ tương đồng(%)

Kết quả (Bảng 3.2) cho thấy trình tự nucleotide này có độ tương đồng cao đạt tới99%sovớitrìnhtựđoạngencủaA.oryzaeđãđượccôngbốtrênNgânhàngdữliệuge n

Quốc tế với mã sốgbJX489381.1; embFN823241.1 vàgbHM064501.1 Kết quả định tênbằng phương pháp sinh học phân tử hoàn toàn phù hợp với kết quả phân loại dựa trên cácđặcđiểm phát triển vàhìnhthái học.

Sau khi kết hợp cả hai phương pháp: phân loạiAspergillustheo khóa phân loại củaKlich[107]và phân loại dựa trên so sánh trìnhtự gen,c h ú n g t ô i k h ẳ n g đ ị n h c h ủ n g T 6 chính là loàiA.oryzae, ký hiệu làA.oryzaeT6, chủngA.oryzaeT6 được sử dụng trongnghiên cứu tiếp theo, xác định các điều kiện sinh trưởng trong nhâng i ố n g b ằ n g n u ô i b ề mặttrên môi trườngrắnvàlênmen bềmặttrên môi trườngrắn cho hìnhthành AGIscao.

Mộtsốyếutốảnhhưởngđếnsinhtrưởngcủa A.oryzaeT6trongnhângiốngtrên môitrườngrắn

Sau quá trình tuyển chọn để có lượng giống dùng cho sản xuất được tiến hành nhângiống nấm mốc tuyển chọn được Trong quá trình nhân giống cần lựa chọn môi trường, vìthành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến quá trinh sinh trưởng của visinh vật Thành phần môi trường phải đáp ứng đầy đủ các dinh dưỡng và sự phát triển hiếukhícủachủngnấm mốcA.oryzae.

Nghiên cứu tiến hành nhân giống nấm mốcA.oryzaeT6 tuyển chọn được trên cácmôi trường khác nhau để kiểm tra khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng (mục2.3.1). Nhằm tìm ra được cơ chất môi trường phù hợp cho nhân giốngA.oryzaeT6 đạt hiệuquả cao từ các cơ chất nguyên liệu phổ biến là bột ngô, bột đỗ tương, cám gạo và gạo.Thành phần cơ chất phù hợp cho quá trình nhân giống nhân giốngA.oryzaeT6 cho pháttriển mật độ tếbào cao đượcchọn làm thôngsố cho nhân giốngA.oryzaeT6.

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng nhân giống được trìnhbày (Hình 3.3) cho thấyA.oryzaeT6 có thể phát triển trên tất cả các môi trường khảo sát,tuy nhiên do thành phần dinh dưỡng của môi trường khác nhau nên mật độ tế bào củaA.oryzaeT6 thay đổi từ 31 × 10 6 đến 68 × 10 6 CFU/g, đáng chú ý là trên môi trườngM5(thành phần (g/g) gồm cám gạo : gạo : trấu = 2 : 2 : 1; độ ẩm 50%) mật độ tế bào đạt caonhất68×10 6 CFU/g.

Hình3.3Ảnh hưở ng của thành phầncơchấtmôitrường rắnđếnmậtđộtế bàocủa A.oryzae T6Ghi chú:

- M1có tỷlệ:Bộtngô :trấu là 4:1

- M3 có tỷlệ:Cámgạo :trấu là 4:1

- M5 có tỷlệ:Cámgạo :gạo :trấulà 2:2:1 Các môitrườngnàyđều cóđộẩm50% vàpH 5,5.

Vì vậy, lựa chọn môi trường M5 làm môi trường nhân giốngA.oryzaeT6 Kết quảcũng tương đồng với một số nghiên cứu chỉ ra gạo và cám gạo là môi trường thuận lợi chosựpháttriểncủa nhiềuloại nấmmốc nhưA.oryzae, A.awamorrii,A.Kawachi

Kết quả tổng hợp ởHình 3.3cũng góp phần khẳng định tầm quan trọng của thànhphần cơ chất đến quá trình sinh trưởng củaA.oryzaeT6 Ở tỷ lệ phối trộn giữa cám gạo vàgạo là

2 : 2 , mật độ tế bào củaA.oryzaeT6 trong cám gạo và gạo là nguồn cơ chất thíchhợp nhất choA.oryzaeT6 phát triển Bên cạnh các thành phần dưỡng chất như khoáng,nguồnnitrogen c ủ a cơ c h ấ t thìđột h o á n g khíc ũ n g cót á c độngtíchc ự c đến q u á tr ìn h tăngtrưởng,pháttriểncủanấmmốc[6,8].Trongmôitrườngnhângiốngcóthà nhphần trấuđểtăngđộxốpcủamôitrườngđảmbảolượngoxycầnthiếtchonấmmốcsinhtrưởng,thànhphần nàycần đượckhảo sát với từngtrường hợp cụthể.

3.2.2 Ảnhhư ởn g củathành p hầ n tỷlệtrấutrongmôitr ư ờ n g rắnđếnsin htrưởngcủa A.oryzaeT6

A.oryzaelà loài hô hấp hiếu khí vì vậy việc cung cấp oxy đầy đủ trong quá trìnhsinh trưởng và phát triển là yêu cầu quan trọng và cần thiết [6] Do đó trong quá trình nhângiống bổ sung thêm trấu để tăng độ xốp của môi trường đảm bảo lượng oxy cần thiết chonấmmốcsinh trưởng.

Tuy nhiên yêu cầu đặt ra tỷ lệ trấu phối trộn bao nhiêu để có thể đảm bảo lượng oxy,độ xốp môi trường nhưng vẫn đảm bảo được nguồn dinh dưỡng cho quá trình sinh trưởngbình thường của chủng Vì vậy, tiến hành khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ trấu phối trộn đếnsinhtrưởng củaA.oryzaeT6 theo phương phápđã trìnhbày (mục2.2.3.2) nhằmtìmr a được tỷ lệ trấu phù hợp trong môi trường cho nhân giốngA.oryzaeT6 đạt hiệu quả cao làmthôngsố cho nhângiốngA.oryzaeT6.

Kết quả nghiên cứu cho thấy (Hình 3.4), ở các tỷ lệ trấu khác nhau sự phát triển củanấm mốc khác nhau, ở tỷ lệ trấu từ 5 - 20%, sự phát triển của chủng tăng nhanh từ 41 x 10 6 CFU/g đến 66 × 10 6 CFU/g Khi tỷ lệ trấu tăng trên 20% (25 - 40%) thì khả năng sinhtrưởngcủanấm mốcgiảm xuốngrõ rệttừ64 ×10 6 CFU/gxuống36×10 6 CFU/g.

Hình 3.4còn cho thấy tỷ lệ trấu trong môi trường nhân giống từ 15% đến 30 % làthích hợp cho sự phát triển của chủng, trong khoảng này mật độ tế bào cũng rất khác nhau:Tỷ lệ trấu 15% cho mậtđộ tế bào đạt 54 x 10 6 CFU/g, tỷ lệ trấu 25% cho mật độ tế bào đạt64×10 6 CFU/g,tỷlệtrấu30%chomậtđộtếbàođạt61×10 6 CFU/gvàtỷlệtrấu20%mật độ tế bào cao nhất đạt 66 x 10 6 CFU/g Vì vậy, bên cạnh nguồn dinh dưỡng như nguồncarbon, khoáng chất thành phần môi trường tạo được độ thoáng khí là một trong các điềukiệnthiếtyếuchoquátrình sinh trưởngcủavi sinh vật, đặcbiệt lànấm mốc.

Tóm lại tỷ lệ trấu 20 % trong môi trường rắn có thành phần cám gạo và gạo (tỷ lệ1:1), cho mật độ tế bào cao nhất trong nhân giốngA.oryzaeT6 đạt 66 x 10 6 CFU/g sau 72giờnuôi ở nhiệt độ 30 ± 2 0 C.

3.2.3 Ảnhhưởngđộẩmbanđầucủamôitrườngnhângiốngđếnsinhtrưởngcủa A.oryz aeT6 Độ ẩm bên trong môi trường nhân giống nấm có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinhtrưởng phát triển của nấm mốc Độ ẩm thấp thường sẽ kìm hãm sự phát triển, còn độ ẩmcao quá sẽ làmgiảm độthoáng khí,ảnh hưởng tới sinh trưởng phát triểnc ủ a v i s i n h v ậ t [6]. Để xác định ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng sinh trưởng của chủng nấn mốcA.oryzaeT6 trên môi trường rắn, ở nghiên cứu này tiến hành khảo sát độ ẩm môi trườngnhân giống trong khoảng 45 – 70% theo phương pháp đã trình bày (mục 2.2.3.3) nhằm tìmđượcđộẩmphù hợptrongmôitrườngnhângiốngA.oryzaeT6chophát triển mậtđ ộtếbàocao.

Hình3.5cho thấy độẩmmôitrường rắnảnhhưởng tớit ố c đ ộ p h á t t r i ể n c ủ aA.oryzaeT6, ở độ ẩm 45% và 70% cho thấyA.oryzaeT 6 p h á t t r i ể n v ớ i m ậ t đ ộ t ế b à o í thơnnhiềuso với ởcác độẩmkhác được khảosát, trong khiđộ ẩm ở5 5 % c h o t h ấ yA.oryzaeT6 phát triển với mật độ tế bào lớn hơn cả (65×10 7 CFU/ g) Vì vậy, bên cạnhnguồnd i n h d ư ỡ n g n h ư n gu ồn c a r b o n , k h o á n g ch ất , đ ộ t h o á n g k h í c ủ a môit r ư ờ n g r ắ n độẩmmôi trường làmộttrong cácđiềukiện thiếty ế u choquá trìnhsinh tr ưởng củavisinhvật,đặcbiệtlànấmmốc.

Vì vậy độ ẩm 55% ban đầu ở môi trường rắn nhân giống cho mật độ tế bào cao nhấttrongnhângiốngA.oryzaeT6 đạt 65x10 7 CFU/gsau 120 giờ nuôi ở nhiệt độ 30 ± 2 0 C.

A.oryzae T6 pH là yếu tố quan trọng trong quá trình sinh trưởng của nấm mốc, pH thích hợp sẽthuận lợi cho nấm mốc phát triển, thực nghiệm tiến hành nghiên cứu khảo sát pH thích hợpcho nấm mốcA.oryzaeT6 phát triển từ là từ pH 3,5 đến pH 7,0 theo phương pháp đã trìnhbày (mục 2.2.3.4) nhằm tìm được pH phù hợp trong môi trường cho nhân giốngA.oryzaeT6cho pháttriển mật độtếbàocao đượcchọnlàm thôngsốcho nhângiốngA.oryzaeT6.

Kết quả thu được (Hình 3.6) cho thấy pH môi trường có ảnh hưởng đến sinh trưởngcủaA.oryzaeT6, ở pH 4,5 - 6,0 cho mật độ tế bàoA.oryzaeT6 lớn, tuy nhiên ở điểm pH5,5tốcđộ phát triển củaA.oryzaeT6l ớ n n h ấ t , m ậ t đ ộ t ế b à o đ ạ t

JeaLinvàcộngsự(2010)[149].Vìvậy,pH 5,5 ban đầu của môitrường nhângiống choA.oryzaeT6s i n h t r ư ở n g đ ạ t m ậ t đ ộ t ế bàolớnnhất,đạt 67x10 6 CFU/gsau72giờ, ở nhiệt độ 30 ± 2 0 C.

Hình3.6Ả n h h ư ở n g p H banđầucủamôi trường nhân giống đếnmậtđộtếbào của A.oryzae T6

Mộtsốyếutố ảnh hưởngđếnkhảnănghình thànhAGIsbằngA.oryzaeT6

Nghiên cứu lựa chọn nguyên liệu thích hợp làm môi trường rắn cho hình thành AGIscao từA.oryzaeT6 Đỗ đen trắng lòng, đỗ đen xanh lòng, đỗ tương VN93-4 của Việnnghiên cứu ngô được dùng trong nghiên cứu làmm ô i t r ư ờ n g l ê n m e n b ề m ặ t g i á t h ể r ắ n choA.oryzaeT6, xác định cơ chất môi trường lên men cho hình thành AGIs theo phươngpháp đã trình bày (mục 2.3.4.1), xác định hoạt tính kìm hãm α- glucosidase của sản phẩmsau lên men tương ứng với từng thí nghiệm, từ đó xác định được cơ chất phù hợp cho lênmenA o ry za eT 6c h o h o ạ t t í n h k ì m hãm α - g l u c o s i d a s e ca o đ ư ợ c chọn là m t h ô n g sốl ê n menhình thành AGIs.

Từkế t q u ả tổ ng hợp ( Hình3 1 0 )ch ot hấ y, k h ả n ă n g sinh t r ư ở n g củaA o r y z a e

T 6trên tất cả các nguyên liệu môi trường rắn được khảo sát, sinh trưởng củaA.oryzaeT6 kháổn định và không có sự khác biệt lớn Mật độ tế bào của chủng đều đạt trong khoảng 10 6 CFU/g Khi lên menA.oryzaeT6 trên môi trường rắn với các cơ chất là đỗ đen trắng lòng,giống đỗ đen xanh lòng, giống đỗ tương VN93-4 thì khả năng hình thành AGIs bằngA.oryzaeT6 là khác nhau đáng kể, hoạt tính kìm hãm α-glucosidase dao động từ 45,13 đến68,63%, đỗ đen xanh lòng sử dụng trong nghiên cứu là nguồn cơ chất rất thích hợp cho quátrình lên men hình thànhAGIs, thể hiện ở hoạt tính kìm hãm α-glucosidase thu được là68.63%, cao hơn khoảng 1,3 lần so với đỗ đen trắng lòng (52,93%), khoảng 1,52 lần so vớihoạttínhkìmhãmα- glucosidase ởmẫuđỗtương VN93-4(45,13%),khoảng26,1lầnso với mẫu cơ chất lên men là cám gạo (2,26%), khoảng 1,1 lần so với đỗ xanh (62,13%) vàmẫu ở môi trường có cơ chất là gạo nếp cái hoa vàng cho thấy không có hoạt tính kìm hãmα-glucosidase.

Hình 3.10Ảnh hưởng của nguồn cơ chất môi trường lên men bằng A.oryzae T6 đến hoạt tính kìmhãmα– glucosidase và mậtđộtếbào của A.oryzae T6

Sự tăng trưởng và phát triển của nấm mốc rất cần sự hiện diện của các nguyên tố đalượcngvà vi lượcng, trong đócarbohydrate,proteinlà hai thành phầnc ó ả n h h ư ở n g l ớ n nhất(Benenv à c ộ n g s ự, (2003)) [47] Đây cũng chính là nguyên nhân dẫn đến sự pháttriểnnhanhchóngcủanấmmốctrênbềmặtmôitrườnglênmenởmôitrườngcủa6loại cơchấtnày.

Kết quả tổng hợp (Hình 3.10) cũng góp phần khẳng định tầm quan trọng của cơ chấtđến quá trình hình thành AGIs bằngA.oryzae Bên cạnh thành phần cơ chất cảm ứng thíchhợp thì các thành phần dưỡng chất khác như khoáng, nguồn nitrogen cũng có tác động tíchcực đến quá trình tăng trưởng, phát triển của nấm mốc cũng như ảnh hưởng đến hiệu quảhìnhthành AGIs.Dođó,cácthành phầnnàycần đượckhảo sát vớitừngtrườnghợpcụ thể.

Vì vậy, đỗ đen xanh lòng là thích hợp làm môi trường rắn lên menA.oryzaeT6 hìnhthành AGIs vớihoạttínhkìmhãmα-g l u c o s i d a s e đ ạ t 6 8 , 6 3 % s a u 4 8 g i ờ l ê n m e n ở nhiệt độ 30 ± 2 0 C.

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nguồn cơ chất môi trường đến khả năng hình thànhAGIsbằ ngA.oryzaeT 6( Hình3 1 0 )đã ch ot hấ y đỗđ en x a n h lò ng là ng uồ n c ơ ch ấ t r ấ t thích hợp cho quá trình lên menhìnhthành AGIsvà cámgạo là nguồn cơchấtrấtt h í c h hợpchoquátrình phát triển củachủngnấm mốcA.oryzaeT6.

Sự tăng trưởng, phát triển và hình thành AGIs của nấm mốc cần sự hiện diện của cácnguyên tố đa lượng và vi lượng Đây có thể chính là nguyên nhân dẫn đến phát triển nhanhchóng cũng như khả năng hình thành AGIs trên các nguồn cơ chất khác nhau thường làkhácnhaudocơchấtcảmứngchoquátrìnhsinhtrưởngcủachủngvàhìnhthànhAGIs.

Do đó ở nghiên cứu này tiến hành khảo sát lên men bề mặtg i á t h ể r ắ n đ ỗ đ e n x a n h l ò n g với công thức phối chế thành phần cám gạo bổ sung vào môi trường đỗ đen xanh lòng là: 0 (đối chứng); 5; 10; 15; 20 và 25% trọng lượng, kết quả cho thấy tuy bổ sung cùng hàmlượng muối khoáng (K 2 HPO40,4 g/kg; KCL 0,4 g/kg và MgSO40,08 g/kg), độ ẩm và duytrì cùng điều kiện nhiệt độ (30±2 0 C), thời gian, độ thoáng khí cho quá trình lên menA.oryzaeT6 Khi xác định được hoạt tính kìm hãm α- glucosidase ở sản phẩm sau lên mentương ứng vớitừng thí nghiệm,từđóxác định được tỷ lệcámgạobổsung trong môitrường lên men phù hợp cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao được chọn làm thông sốcholên menhình thànhAGIsbằngA.oryzaeT6.

Khi kết hợp hai loại cơ chất đỗ đen xanh lòng và cám gạo, kết quả (Hình 3.11) chothấy, trên môi trường đỗ đen xanh lòng có cámg ạ o ở c á c t ỷ l ệ k h á c n h a u c h o k h ả n ă n g hìnhthànhAGIslàkhácnhau,chothấyhoạttínhkìmhãmα- glucosidasetăngởcáctỷlệ5,10,15và20%cám gạo,caohơnso vớimẫuđốichứng khil ênmenbềmặtA.oryzaeT6 (57,33 ± 0,46 %), so với đối chứng hoạt tính kìm hãm α-glucosidase tăng ở mẫu 5%cámgạo(61,30 ±1,05%)caohơnkhoảng1,07lần, tăngởmẫu10%cámgạo(68,40 ±1,24 % ) cao hơn khoảng 1,19 lần, hoạt tính kìm hãm α-glucosidase ở mẫu 15% cám gạo(63,53 ± 0,83 %) cao hơn khoảng 1,11 lần, hoạt tính kìm hãm α-glucosidase ở mẫu 20%cámgạo(58,27 ±0,74 %) cao hơn khoảng 1,02 lần so vớiđ ố i c h ứ n g v à h o ạ t t í n h k ì m hãmα - g l u c o s i d a s e ở m ẫ u 2 5 % c á m g ạ o ( 5 3 , 3 7 ± 1 , 2 8 % ) t h ấ p h ơ n k h o ả n g 0 , 9 3 l ầ n s o vớiđốichứng.

Hình 3.11Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ cám gạo bổ sung vào môi trường lên men bằngA.oryzaeT6 đến hoạttínhkìmhãmα-glucosidase

Vậy việc kết hợp tỷ lệ cám gạo bổ sung vào môi trường rắn đỗ đen xanh lòng có tầmquan trọng của thành phần cơ chất đến hình thành AGIs bằngA.oryzaeT6 trong quá trìnhlên men, ở tỷ lệ phối trộn môi trường đỗ đen xanh lòng có 10% cám gạo thì khả năng hìnhthànhhoạt tính kìm hãm α-glucosidaseđạt cao hơn cả.

Vì vậy, cámgạo làcơchất tốt trong thành phần môi trường lên menh ì n h t h à n h AGIs Môi trường đỗ đen xanh lòng có 10% cám gạo được chọn làm môi trường lên menchoA.oryzaeT6 hình thành AGIs với hoạt tính kìm hãm α-glucosidase đạt 68,40 ± 1,24 %sau48giờlênmenởnhiệtđộ 30±2 0 C.

3.3.3 ẢnhhưởngcủathànhphầnK 2 HPO 4 ,KCLvàMgSO 4b ổ sungvàomôitrư ờnglênmeα-glucosidasenđếnkhảnănghìnhthànhAGIsbằng A.oryzaeT6

Thành phần của các chất khoáng trong môi trường nuôi cấy có ý nghĩa và ảnh hưởnglớn đến khả năng sinh trưởng cũng như sinh tổng hợp hoạt chất sinh học của vi sinh vật.Các chất khoáng ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh sản của sợi nấm, kích thích sự tạo hoạtchất sinh học Ảnh hưởng của các loại khoáng (K2HPO4; KCL và MgSO) với các nồng độbổ sung khác nhau được khảo sát trong thí nghiệm này nhằm tìm ra nồng độ thích hợp cholên menA.oryzaeT6 hình thành AGIsc ó h o ạ t t í n h k ì m h ã m α - g l u c o s i d a s e c a o Đ ể n â n g caohoạt tínhkìm hãmα-glucosidasetrongmôi trườngđỗđenxanh lòng bằngA.oryzaeT6, dựa trên cơ sở chuyển hóa tinh bột thành glucose và chuyển tiếp các nguyên tố vô cơ (đalượng và vi lượng) ảnh hưởng tới sự phát triển của nấm mốc P, S rất cần cho vi sinh vật.Việc chọn nồng độ K 2 HPO4; KCL và MgSO4thích hợp trong môi trường lên men, chúngtôi tiến hành lên men rắn trong các điều kiện giống nhau, chỉ khác nhau về lượng

K2HPO4;KCL và MgSO4trong môi trường mỗi khay đã được trình bày ởBảng 2.1(mục 2.3.4.3).Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của sản phẩm sau lên men tương ứng với từngthí nghiệm, từ đó xác định được tỷ lệ thành phần K2HPO4; KCL và MgSO4bổ sung trongmôi trường lên men phù hợp lên menA.oryzaeT 6 c h o h o ạ t t í n h k ì m h ã m α - g l u c o s i d a s ecaođượcchọn làm thông số lênmenhình thành AGIs.

Hình 3.12Ảnh hưởng của thành phần K 2 HPO 4 , KCL và MgSO 4 bổ sung vào môi trường lên menbằng A.oryzaeT6 đếnhoạttínhkìmhãmα-glucosidase

Kết quảHình 3.12cho thấy, khi lên menA.oryzaeT6 trên môi trường đỗ đen xanhlòng ban đầu có thành phần tỷ lệ K2HPO4; KCL và MgSO4khác nhau cho khả năng sinhtổng hợp hoạt tính kìm hãm α-glucosidase là khác nhau, trên môi trường bổ sung K2HPO4;KCL và MgSO4cho năng hình thành AGIs với hoạt tính kìm hãm α-glucosidase đạt caohơnkhôngbổsung.Hoạttínhkìmhãmα-glucosidasedaođộngtrongkhoảng61,30±0,81

% ở môi trường MT0 (không bổ sung thành phần K2HPO4; KCL và MgSO4) đến 72,60 ±0,78 %ở môi trườngMT3.

Kết quả cho thấy nên sử dụng lượng S, P, K thích hợp với tỷ lệ như ở môi trườngMT3,c ó n g h ĩ a l à t ỷ l ệ k h ố i l ư ợ n g đ ỗ đ e n x a n h l ò n g : c á m g ạ o : K 2 HP

MgSO4là 900: 100 : 0,4 :0,08 : 0,4cho lênm e n h ì n h t h à n h A G I s c a o n h ấ t b ằ n gA.oryzaeT6, hoạt tính kìm hãm α-glucosidase đạt 72,60 ± 0,78 % sau 60 giờ lên men ởnhiệt độ 30±2 0 C.

3.3.4 ẢnhhưởngpHbanđầucủamôitrườnglênmeα-glucosidasenđếnkhảnănghìnhthànhAGIsbằ ng A.oryzaeT6 Để xác định pH ban đầu trong môi trường đỗ đen xanh lòng thích hợp cho hình thànhAGIs, tiến hành thí nghiệm lên men bề mặt ở các môi trường có pH ban đầu khác nhau từpH 3,5 đến pH 7,5 cố định điều kiện lên men bề mặt là sử dụng môi truờng rắn - đỗ đenxanh lòng có bổ sung 10% cám gạo Thực nghiệm xác định pH ban đầu trong môi trườngđỗ đen xanh lòng thích hợp cho hình thành hoạt tính kìm hãm α-glucosidase theo phươngpháp ở mục 2.3.4.5 Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của sản phẩm sau lên mentương ứng với từng thí nghiệm, từ đó xác định được pH ban đầu trong môi trường lên menA.oryzaeT 6c ho h o ạ t t í n h k ì m h ã m α - g l u c o s i d a s e c a o đư ợc ch ọn là m th ôn g sốl ên m e n hìnhthành AGIs.

Hình3.13Ảnh hưở ng pH banđầucủamôitrườnglênmenbằngA.oryzae T6 đến hoạt tínhkìm hãmα-glucosidase

Hình 3.13cho thấy kết quả thực nghiệm được biểu diễn cho thấy khi lên menA.oryzaeT6 trên môi trường đỗ đen xanh lòng có bổ sung cám gạo ở các pH ban đầu khácnhauchokhảnăngsinhtổnghợphoạttínhkìmhãmα-glucosidaselàkhácnhau.Hoạttính kìm hãm α-glucosidase dao động khoảng 22,37 ± 1,51% (ở pH 7,5) đến 68,27 ± 0,71% (ởpH 5,5) Khả năng hình thành hoạt tính kìm hãm α-glucosidase bằngA.oryzaeT6 tăng từpH 3,5 (hoạt tính kìm hãm α-glucosidase 32,23 ± 1,07 %) đến pH 5,5 và hoạt tính kìm hãmα-glucosidase giảm khi tăng từ pH 6 đến 7,5 Lên menA.oryzaeT6 ở pH 5,5 thì khả nănghìnhthành hoạt tính kìmhãm α-glucosidaseđạt cao nhất.

Vậy pH 5,5 ban đầu của môi trường đỗ đen xanh lòng là thích hợp nhất đểA.oryzaeT6l ê n m e n h ì n h t h à n h h o ạ t t í n h k ì m h ã m α - g l u c o s i d a s e c a o , h o ạ t t í n h kìmh ã m α - glucosidaseđạt 68,27 ± 0,71%sau60giờlênmenởnhiệt độ 30±2 0 C.

Tinhsạch vàđịnh lượngAGIs từđỗ đen lênmen

Thực nghiệm kết tủa để tinh sạch sơ bộ AGIs từ chế phẩm AGIs bằng các dung môiethanol, methanol và isopropyl alcohol theo phương pháp đã được trình bày (mục 2.3.6.1).Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase và lượng chất khô trong phần kết tủa của dịchtương ứng với từng thí nghiệm, từ đó xác định được dung môi phù hợp cho tinh sạch AGIsđạthiệu quảcao.

Hình 3.24Sosánh giátrịIC 50 của AGIs thu đượcở phầnkếttủavà phầntankhisử dụng methanol,ethanolvàisopropylalcohol

Chế phẩm AGIs chiết xuất từ đỗ đen lên men sau khi kết tủa bằng các dung môimethanol,ethanolvàisopropylalcohol(Hình3.24)chothấy,hoạttínhkìmhãmα-glucosidase tập trung chủ yếu ở phần tan trong dung môi, còn phần kết tủa có hoạt tính kìmhãm α- glucosidase rất thấp Lượng chất khô ở phần kết tủa lớn hơn nhiều so với phần tantrong dung môi Hoạt lực kìm hãm α- glucosidase ở phần tan có giá trị IC50(nồng độ hoạtchất để kìm hãm enzyme 50%) theo thứ tự: methanol, isopropyl alcohol và ethanol lần lượtlà0,072;0,064và0,058mg/ml,mạnhhơnnhiềusovớiđốichứng(chếphẩmAGIschi ết xuất có IC50là 0,23 mg/ml) Như vậy, cả ba loại dung môi khảo sát đều có thể sử dụng đểtinh sạch AGIs sơ bộ, trong đó ethanol cho khả năng tinh sạch sơ bộ với hoạt tính kìm hãmα-glucosidase cao nhất Điều này có thể giải thích là do các dung môi có độ phân cực khácnhau nên có khả năng kết tủa tạp chất cho tinh sạch AGIs khác nhau của dung môi Từ kếtquảtrên, chúngtôi lựa chọn ethanol đểtinh sạchsơ bộAGIs từchếphẩmAGIs chiết xuất.

Thực nghiệm khảo sát nồng độ ethanol để tinh sạch sơ bộ AGIs từ chế phẩm AGIs ởcác nồng độ ethanol 70, 75, 80, 85, 90 và 95% theo phương pháp đã được trình bày (mục2.3.6.2) Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase và lượng chất khô trong phần kết tủacủa dịch tương ứng với từng thí nghiệm, từ đó xác định được nồng độ ethanol phù hợp chotinhsạch AGIs đạt hiệu quảcao.

Với các dung môi ethanol có nồng độ khác nhau, kết quả nghiên cứu (Hình 3.25) chothấy, hoạt tính kìm hãm α-glucosidase ở phần tan càng tăng lên khi nồng độ ethanol tăngtrongkhoảngkhảosát(70-95%).Hoạttínhkìmhãmα-glucosidasecaonhấtởnồngđộ90 và 95% ethanol (đều cóI C50l à 0 , 0 5 8 m g / m l ) , t r o n g k h i đ ó ở n ồ n g đ ộ 8 5 % e t h a n o l t h ấ phơn (IC50là 0,085 mg/ml), thấp nhất là mẫu đối chứng (IC50là 0,230 mg/ml) Kết quảnghiên cứu cho thấy khả năng tủa tạp chất để tinh sạch AGIs phụ thuộc vào nồng độethanol Lượng chất khô hòa tan ở trường hợp sử dụng ethanol 90% (là 14,04 % chất khôchế phẩm AGIs) lớn hơn ở trường hợp sử dụng ethanol 95% (13,95 % chất khô chế phẩmAGIs) Nhận thấy độ chênh lệch về nồng độ chất tan ở hai nồng độ 90% và 95% ethanol làkhôngđángkể Dođó cóthểlựachọn nồngđộ ethanol 90% đểtinh sạch sơbộ AGIs.

3.5.3 TinhsạchAGIs Để chứng minh bản chất của chất có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase từ đỗ đen lênmen,t ừ c h ế p h ẩ m A G I s t i n h s ạ c h s ơ b ộ , x ử l ý b ằ n g c á c e n z y m e t h ủ y p h â n k h á c n h a u theo phương pháp củaMin-Gu-Kang và cộng sự, năm 2013đã được trình bày (mục2.3.6.3). Các dịch có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase từ đỗ đen lên men được xử lý thủyphânl ầ n l ư ợ t b ằ n g p e p s i n , t r y p s i n , p a n c r e a t i n , α - a m y l a s e v à m a l t a s e ở đ i ề u k i ệ n p h ả n ứngtốiưuch o thấy hoạttí nh kìm hãmα - g l u c o s i d a s e t ă n g sauk hi xửl ý (IC50trướckhixửlýlà57,84àg/ mlvàsauxửlýlà41,5àg/ ml).Điềunàychothấy AGIschiếtxuấttừ đỗđ e n l ê n m e n k h ô n g b ị t h ủ y ph ân b ở i c á c e n z y m e n à y K ế t q u ả n à y p h ù h ợ p s o v ớ i công bố củaMin–Gu Kang và cộng sự(2013) về AGIs từ đỗ tương lên men củaA.oryzaeN159-1cóbảnchấtlàpeptide[124].

Tinh sạch AGIs bằng RP - HPLC theo phương pháp đã được trình bày (mục2.3.6.4.)Các phân đoạn hoạt tính kìm hãm α-glucosidase tách bằng RP - HPLC được kiểm tra độtinh sạch bằng RP – HPLC,xác định được hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của AGIs Chếphẩm AGIs chiết xuất sau khi tinh sạch sơ bộ bằng ethanol 90% và xử lý bằng pepsin đãđược phân tích hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cho IC50là41,52 àg/ ml Dịch chiết nàyđược tỏch phõn đoạn bằng RP - HPLC Cỏc phõn đoạn thu được bằng chương trìnhgradient Sau đó, từng phân đoạn được kiểm tra lại độ tinh sạch bằng RP - HPLC và phântích hoạt tính kìm hãm α-glucosidase Kết quả thu được cho thấy chỉ có một phân đoạn cópíc như trên sắc ký đồ tại khoảng thời gian 23,5 đến 24 phút(Hình 3.26a), có bước sóng ởchân đỉnh là 232 nm, đỉnh là 266 nm (Hình 3.26b) cho hoạt tớnh kỡm hóm α-glucosidasecaonhất (IC50l à 8 , 2 1 à g / m l ) v àcú một pớcduynhất so với cácphânđoạn còn lại.

23.5 24.0 24.5 min a)Sắckýđồ có píc củaAGIs

200 300 400 500 600 700 nm b)Hình dạngpíc củaAGIs Hình3.26Sắc k ý đồ cópíccủa AGIs(a) Hình dạng píccủa AGIs(b)

280nm,4nm (1.00) a) Sắcký đồmôitrườngđỗđenxanh lòng trước khilênmen mAU

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min b) Sắckýđồdịchsaukhilênmen(trướctinh sạch) mAU

Hình3.27Sắc ký đồ môitrường đỗđen xanhlòngtrướckhi lên men(a) Sắcký đồdịch saukhilênmen,trước tinhsạch (b).Sắc ký đồ AGIssaukhitinh sạch (c)

Kết quả ởHình 3.27cho thấy: Sắc ký của mẫu đỗ đen sau lên men, trước tinh sạch(Hình 3.27b) thu được một số píc mới so với sắc ký đồ của mẫu đỗ đen trước khi lêm men(Hình 3.27a) không có và kết quả sắc ký đồ ở mẫu sau khi tinh sạch có một píc ở thời giankhoảng 24 phút(Hình 3.27c) cóhoạt tính kìm hãm α-glucosidase, pícn à y t r ù n g v ớ i p í c mới ở sắc ký đồ dịch sau khi lên men, trước tinh sạch (Hình 3.27b) Kết quả này cho thấynguồn gốc của peptide AGIs là được hình thành bằng lên menA.oryzaeT6 trên môi trườngđỗđen xanh lòng.

Kếtquả(Bảng3.4)chothấy hoạttính kìmhãmα- glucosidase tănglờnởcỏc bướctinh sạch lần lượt là chiết xuất đỗ đen lờn men (IC50là 230 àg/ml), tinh sạch sơ bộ bằngethanol 90% (IC50là 57,84 àg/ml), xử lý pepsin (IC50là 41,52 àg/ml) và cao nhất ở bướctinhs ạc hb ằn g RP - HP LC ( I C50là8, 12 àg /m l) Ởn gh iờ nc ứu nà y, ch o t h ấ y AGIs t i n h sạch từ đỗ đen lên men (đỗ đen xanh lòng lên men bằngA.oryzaeT6) có hoạt tính kìm hãmα-glucosidase cao hơn so với

AGIs từ đỗ tương lên men bằngA.oryzaeN159-1 (IC50là 3,1mg /mL) [124], thấp hơn so với AGIs của nấm linh chi (cú IC50của SKG-3 là 4,6 àg/ml)[105],chiếtxuất từvỏ cõythụng(IC50l à 5 μ g / m l )

3.5.4 Xácđịnhkhốilượngphântửvàtrìnhtựaxitamincủapeα-glucosidaseptideα-glucosidaseAGIstừđỗđeα-glucosidasenlênmeα-glucosidasenb ằngkhốiphổ

Hình3.28Khối lượngphântửvà trìnhtựaxitamincủapeptideAGIstừđỗđenlên menđược thựchiệnbằngkhối phổ.R.YIYEIAR.R

Mẫu chế phẩm AGIs tinh sạch được phân tích bằng thiết bị MALDI-TOF/TOF massspectrometer theo phương pháp củaBringans và cộng sự 2008[49] đã được trình bày (mục2.3.6.5), thực hiện bằng khối phổ cho thấy chất tinh sạch này có khối lượng phân tử926,4861 Da tương ứnglà mộtđoạn peptide có trình tự axitamin làYIYEIAR( P h ụ l ụ c KQ KP) Khi so sánh với ngân hàng giữ liệu của LudwigNR thì không thấy có sự trùng lặpnào của đoạn peptide này trong các protein đã được công bố. Ngược lại, bằng sử dụng dữliệu của SwissPro cho thấy chất tinh sạch AGIs này là một đoạn peptide, có trình tự axitaminYIYEIARtrùngvớitrìnhtựaxitamintrongđoạnpeptidecủaFETA_BOVIN(Alpha- fetoprotein từ huyết thanh bào thai bò) là R.YIYEIAR.R (Hình 3.28và Phụ lục KQKP). Nghiên cứu này cho thấy peptide AGIs tinh sạch từ đỗ đen lên men được lên menbằngA.oryzaeT6 cho khối lượng phân tử lớn hơn so với peptide AGIs thu được từ dịch lênmen lỏngbằngA.oryzaeN159-1 (360,1 Da) đãđượccôngbố [124].

3.5.5 Địnhlượngpeα-glucosidaseptideα-glucosidaseAGIscủađỗđeα-glucosidasenlênmeα-glucosidasenbằng A.oryzaeT6

AGIs sau khi tinh sạch, dùng peptide AGIs này làm chất chuẩn để định lượng peptideAGIs trong mẫu đỗ đen lên men bằng RP - HPLC thông qua diện tích píc thu được (HìnhPL.4;HìnhPL.5;HìnhPL.6;BảngPL.3vàBảngPL.4).XácđịnhđượclượngpeptideAGIstrong đỗ đen sau lên men bằngA.oryzaeT6 là 1,83 mg/g (0,183%) Kết quả xác định hiệusuấttinhsạchAGIscủasảnphẩmsaucácbướctinhsạchđượctrìnhbày(Bảng3.4).

Bảng3.4Đ á n h g i á sản phẩmsau cácbước tinhsạch AGIs từđỗđen lên men

) Độ tinh sạch(% peptideAGIs) Đỗđenlênmen - 100 - 0,183

Tinh sạch sơ bộ bằngethanol 90%

Sau khi tinh sạch sơ bộ bằng ethanol 90%, hiệu suất đạt 87,81 %, sau xử lý bằngpepsin–đạt86,46%vàtinhsạchbằngRP-HPLC-hiệusuất57,92%.Cácsảnphẩmsau cácbướctinhsạchcóđộtinhsạchtăngdần,cóhàmlượnglầnlượtlà:50,216;56,501và99,99

ỨngdụngAGIs

Khảosátxácđịnhcôsấy ởcácnhiệtđộkhácnhau:50±2;60±2;70±2;80±2;90 ±2 và 100±2 0 C theo phương pháp đã được trình bày (mục 2.3.7.1), chế phẩm AGIs thuđược đem xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase (mục 2.2.2) và cảm quan chế phẩmAGIs tạo ra Hoạt tính kìm hãm α-glucosidase, độ ẩm, lượng chất khô và chỉ tiêu cảm quanvề mầu sắc, mùi và vị của chế phẩm AGIs thu được tương ứng với từng thí nghiệm, từ đóxácđịnh đượcnhiệt độ phù hợp cho cô, sấytạochếAGIs chất lượng.

Bảng 3.5Ảnh hưởng của nhiệt độ cô sấy chân không đến chất lượng cảm quan, hoạt tính kìmhãmα-glucosidasevàthờigian côđếnchấtlượng chếphẩmAGIs

Màu sắc Mùi Vị Trạng thái

Kếtquảthí nghiệm( Bảng3.5)chothấy nhiệtđộcôsấy chânkhông tăngcho thời giansấygiảmvàởkhoảngnhiệtđộcôsấyđượckhảosát(từnhiệtđộ50±2đến100±20C) đều cho chế phẩm thu được có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase ổn định (IC50đạt từ231,72±0,12đến229,07±0,38àg/ml),nhưngvềcỏcchỉtiờucảmquanchếphẩmAGIs thu được cho thấy nhiệt độ sấy càng cao thì có điểm cảm quan chế phẩm tạo ra lại giảmxuống, điểm cảm quan cao nhất là cô sấy duy trì ở nhiệt độ 50±2 0 C và nhiệt độ 60±2 0 C(đạt 29,5 điểm) Điều này có thể giải thích hoạt tính kìm hãm α-glucosidase không bị mấthoạt tính ở nhiệt độ từ 50 -100 0 C, nhưng trong chế phẩm AGIs ngoài AGIs còn có các tạpchất khác như protein, polysacharide của đỗ đen lên men do đó khi sấy ở nhiệt độ cao thìthường các tạp chất bị biến tính, caramen hóa làm cho các chỉ tiêu cảm quan về mầu sắc,mùivị củachếphẩm AGIsthu đượcbị giảm.

Kết quả cho thấy nhiệt độ 60±2 0 C là tối ưu để cô sấy tạo chế phẩm AGIs cho hiệuquảcao vềchất lượngcảm quan sản phẩm và thờigian sấy.

Chỉ tiêu chất lượng về hàm lượng AGIs, hoạt tính kìm hãm α-glucosidase, độ ẩm,hàmlượngprotein,lipit,trotổngsố ,chỉ tiêuantoànthựcphẩmvềkimloạinặng,visinh vật và chỉ tiêu độc tố aflatoxin của chế phẩm AGIs được xác định (mục 2.3.7.2) Hoạt tínhkìm hãm α-glucosidase, độ ẩm, lượng chất khô và chỉ tiêu cảm quan về mầu sắc, mùi vàvị của chế phẩm AGIs tương ứng với từng chỉ tiêu, từ đó xác định được chất lượng củachếphẩmAGIs tạo ra

Kết quả (Bảng 3.6) cho thấy chế phẩm AGIs từ đỗ đen lên men có hoạt lực kìm hãmα-glucosidase với giá trị IC 50 = 0,23 mg/ml, kết quả cũng phù hợp với một số nghiên cứucủa các tácgiả khác đã công bố ởcác sản phẩmchế phẩm thương mại là cógiá trịcI C50của chếphẩmthường daođộng trong khoảng 0,05đến0,55mg/ml,hàmlượng proteintrong chế phẩm khoảng 55 đến 68%, lipit khoảng 0,1–1% [50]K ế t q u ả n à y c ũ n g c h o thấy

IC50của chế phẩm AGIs từ đỗ đen lên men thấp hơn so với giá trị IC50của sản phẩmacarbose (Glucobay, 100mg) của Bayer Medical Co (Leverkusen, Đức) với giá trị

IC50là0,04 mg/ml Tuy nhiên, hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của chế phẩm cao hơn gấp đôi sovới hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của chất chiết touchi (từ đỗ tương lên men bề mặt)công bố với giá trị IC 50 là 0,54 mg/ml [34], cao hơn so với hoạt lực kìm hãm α- glucosidasecủa một số loại thực phẩm như dịch chiết trà xanh và trà ô long có hoạt lực kìm hãm α-glucosidasevới giá trịIC50lầ n lượt là73,5 và134mg/ml[153].

Bảng3.6K ế t quảphântíchhoạttínhkìmhãmα-glucosidase, dinhdưỡng và cácchỉtiêulýhóa củachế phẩmAGIs

TT Tênchỉtiêu Đơnvị tính Kếtquả

9 Cảmquan Khảnănghòatan Tan, có mầu be

Bảng3.7Kếtquảphântíchcácchỉ tiêu visinh vật,kimloại nặng vàcác chất không mongmuốn trongsảnphẩmchếphẩmAGIs

Tổngsố vi khuẩn hiếukhí cfu/g KPH 10 4 TCVN4884:2005

Tổngsố bàotử nấmmen – mốc cfu/g KPH 10 2 TCVN6265:2007

Coliforms(37 0 C/48 giờ) cfu/g KPH 10 TCVN4882:2007

E Coli(37 0 C/96 giờ) cfu/g KPH 0 TCVN6846:2001

S.aureus(37 0 C/48giờ) cfu/g KPH 3 TCVN4830:2005

Cl.Perfringens cfu/g KPH 10 TCVN4991:2005

Salmonella(37 0 C/48giờ) cfu/25g KPH 0 TCVN4829:2005

Hàmlượng chì (Pb) mg/kg KPH ≤10,0 AOAC994,02

Hàmlượng Asen(As) mg/kg KPH ≤5,0 AOAC952,13

HàmlượngCadimi (Cd) (mg/kg) KPH ≤0,3 AOAC2000(F-AA)

Hàmlượngthủyngân(Hg) (mg/kg) KPH ≤0,5 AOAC-1997

Hàmlượngđồng(Cu) (mg/kg) KPH ≤5,0 ISO8.294:1994

Aflatoxin àg/kg KPH ≤5,0 HPLC

3-MCPD àg/kg KPH 50 GCMS

Ghichú: KPH:Khôngpháthiện (nghĩalàdướingưỡngpháthiệncủaphươngpháp(0,002 mg/kg))

* Quy định giới hạn tối đa nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm, mục Quy định giớihạn cho phép vi sinh vật trong thức ăn đặc biệt (dung trực tiếp, không qua sử lý nhiệt trướckhi sử dụng) (Ban hành kèm theo Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT ngày 19 tháng 12 năm2007củaBộ trưởngBộY Tế)

Sản phẩm tạo ra được đánh giá một số các chỉ tiêu hàm ẩm và lượng tro tổng số chothấy kết quả cũng tương tự so với chỉ tiêu về hàm ẩm và lượng tro tổng số của chất chiếttouchi (từ đỗ tương lên men bề mặt) do Công ty CBC Co Ltd (Trung Quốc) công bố. Kếtquả phân tích kim loại nặng và vi sinh vật cho thấy sản phẩm chế phẩm AGIs có hoạt tínhkìm hãm α-glucosidase được tạo ra từ đỗ đen lên men đã đáp ứng được các yêu cầu về giớihạnkim loại nặngvàvi sinh vật cho phép trongthựcphẩm.

Thử độc tính cấp chế phẩm theo phương pháp củaĐỗ Trung Đàm, 1996được xácđịnh(mục2.3.7.2).

Bảng3.8S ố l i ệ u thửđộctính cấp của chế phẩmAGIs

Bảng 3.8cho thấy theo dõi chuột được cho uống bột chế phẩm AGIs với các liềukhácnhau, từthấp đến cao, thấyrằng, với nhữngchuột uốngcácliều:

Liều8g,10gvà12gbột/ kgthểtrọng,chuộtvẫnkhỏemạnh,hoạtđộngănuốngbìnhthường.

Liều 12 g bột/ kg thể trọng chuột tương đương với liều gấp 60 lần liều uống trênngười 1 g/ ngày, tương đương với liều gấp 196 lần liều uống trên người 300 mg/ ngày,tươngđươngvới liềugấp996 lần liều uốngtrên người 60 mg/ ngày.

Như vậy, đã cho chuột uống bột chế phẩm AGIs ở liều rất cao so với liều tươngđương trên người mà chuột vẫn khỏe mạnh, hoạt động ăn uống, bài tiết bình thường. Bộtchếphẩm AGIscó độ antoàn cao (Hình PL11).

Xác định và đánh giá được chỉ tiêu độc tính cấp của chế phẩm AGIs trên chuột vớiliều tương đương gấp 996 lần liều uống trên người 60 mg / ngày, cho thấy chuột vẫn khỏemạnh, hoạt động ăn uống và bài tiết bình thường Bột chế phẩm chế phẩm AGIs có độ antoàncao.

Công bố khác,Hiroyuki Fujita và cộng sự[83] đã thử nghiệm những đối tượng cónguy cơ mắc ĐTĐ được cho uống chất chiết từ đỗ lên men bề mặt bởiA.oryzaevới liềulượng từ 0,1 đến 10,0 g trước khi ăn 75 g sacarose Kết quả cho thấy sự kìm hãm hàmlượngglucose trong máusaubữa ănđược quansátthấy sau60và 90phúttiêut h ụ sacarose. Ở nhóm bệnh nhân ĐTĐ được dùng 0,3g chất chiết từ đỗ lên men bề mặt bởA.oryzaetrước khi ăn 200g cơm, chất chiết từ đỗ lên men bề mặt thể hiện tác dụng giảmđườnghuyếtcóýnghĩavớiliềusửdụngthấpnhấtlà0,3g,đườnghuyếtsaubữaăngiảmcó ý nghĩa tại thời điểm 60 phút và 120 phút sau khi ăn, so sánh với đối chứng không uốngchất chiết từ đỗ lên men bề mặt Tác giả khuyến cáo chất chiết từ đỗ lên men bề mặt có thểđượcsửdụngđểổn địnhđườnghuyết ở người bệnh ĐTĐtrongthời gian dài.

Theo các công trình đã công bố về các nghiên cứu khảo nghiệm lâm sàng cho thấychế phẩm AGIs là loại thực phẩm bổ sung không có độc tính cấp đối với người sử dụng, làloại thực phẩm bổ sung an toàn, có hiệu quả giảm cân, giảm đường huyết, kết quả khảonghiệm trên người cho thấy dùng 0,3 g chế phẩm AGIs /lần / người trước khi ăn cho hiệuquả.VớihàmlượngchếphẩmAGIs0,3g/ngườisửdụngtừ1đến3lần/ngày,tươngđương0,3 – 1,20gchếphẩmAGIs(cóIC 50 là0,5mg)/ ngàyhiệnđangđượcmộtsốcơsởsảnxuấtthựcphẩmbổxungtrênthếgiớisảnxuấtvàhiệnđanglưuhànhtrê nthịtrường,vớihàmlượnglàphùhợpchongườidùngởliềuthấplà0,3gamchếphẩmAGIs/ liều,còncóthểdùngtrên10g/lầntrước khi ăn Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm của Mỹ, Hội Bảo vệ sức khoẻcủa Nhật Bản đã khuyến cáo sử dụng sản phẩm có chứa AGIs từ đỗ lên men bề mặt nhưmộtTPCN đểphòngchốngbệnhĐTĐ

Các tá dược sorbitol, manitol, dextrose, xylitol, fructose,maltose, isomalt, maltitol, lactose,tinhbộtthủyphânvàpolydextrose,đườngtừcỏngọt… đãđượcsửdụngnhiềulàmtádượcđộn.Dựavàotínhtan,cóvịngọtđemlạicảmgiácdễchịutrongmiệng, chegiấuđượcmùivịdượcchất,khảnăngchịunén

Steviosidelàđườngtừcỏngọt,cóvịngọtgấp300lầnhơnđườngthường(saccharose,sucrose).Đặcbi ệtlànguồnđườngtạocalorierấtthấpvàrấtổnđịnhởnhiệtđộcao,giúplàm lànhcácvếtthươngngoàida,bổtim,lợitiểuvàđặcbiệtnhấtlàđốivớinhữngngườibịbệnhĐTĐ, cỏ ngọt giúp tụy tạng trong việc tiết chất insulin, ứng dụngnhiều trong các sản phẩm thựcphẩm,dượcphẩm… đặcbiếtnóđượcứngdụnglàmtádượcchocácsảnphẩmdànhchongườiĐTĐ,béophì…[48,74,64].

Lactose là đường chínhtrong sữa và do đó là nguồn năng lượng chínhc h o t r ẻ s ơ sinh Sữa có chứa 4,8% lactose.Lactose Là loại đường có lợi cho người rối loạn chuyểnhóa đường huyết Lactose cung cấp một số lợi ích dinh dưỡng không tìm thấy trong nguồnđường khác Nó tạo ra một nguồn cung cấp năng lượng kéo dài do làm chậm quá trình thủyphântrongcơthể, làmtăngsựhấpthu cáckhoángchấtnhưmagiê, canxivàkẽm,đ ónggóp một hệ đường ruột khỏe mạnh và có tác dụng tối thiểu sâu răng so với đường khác.Hàmlượng proteintrong lactoserấtthấp,tương đốikhông đáng kể.Lactoselàmộtcarbohydrate và đóng góp khoảng 4 calo mỗi gam Lactosekích thích đường ruột hấp thucanxi, độc lập của sự hiện diện vitamin D Bởi vì lactose tiêu hóa chậm hơn nhiều soglucose hoặc sucrose, do vậy lactose được coi là tương đối an toàn cho bệnh nhân ĐTĐ, nókhông gây ra sự gia tăng đột ngột lượng đường trong máu như chất làm ngọt khác, nó cholợi thế dinh dưỡng trong chế độ ăn uống ở người bệnh ĐTĐ, giúp hỗ trợ giảm cân Lactosecó một chỉ số đường huyết thấp (65) so với glucose (138) hoặc mật ong (104) hoặc sucrose(87) Chế độ ăn uống đó nhấn mạnh các loại thực phẩm chỉ số đường huyết thấp có thểkhông chỉ giúp làm giảm nguy cơ phát triển bệnh ĐTĐ và cải thiện việc kiểm soát lượngđường trong máu ở bệnh nhân ĐTĐ và hỗ trợ giảm cân, nhưng chế độ ăn như vậy cũng cóthể có các lợi ích sức khỏe khác.Bằng cách cải thiện độ nhạy insulin và làm giảm mức độlipid trong máu, chế độ ăn chỉ số đường huyết thấp có thể giúp giảm nguy cơ bệnh tim Bởivì tính chất hoạt tính sinh học, sản phẩm lactose đang ngày càng được sử dụng trong cácsản phẩm được sản xuất để cải thiện và giữ gìn sức khỏe Lactose làm tăng sự hấp thu cáckhoáng chất như magiê, canxi và kẽm ở động vật trong phòng thí nghiệm và trẻ sơ sinh củacon người. Bằng cách kích thích sự tăng trưởng của vi khuẩn đường ruột có lợi nhưBifidobacteriavàLactobacillivà kìm hãm vikhuẩng â y b ệ n h , t á c d ụ n g t í c h c ự c c ủ a lactose đến hệ vi sinh vật đường ruột So với các loại đường khác chẳng hạn như sucrose,lactose có khả năng tối thiểu để tạo ra sâu răng [152] Từ những đặc tính và tính chất sinhhọc của các tá dược, để tạo được sản phẩm uống liền có hàm lượng hoạt chất sinh họcAGIs,cógiá trịcảm quan vềmùi vị,dễsửdụng.

Định dạng
Số trang	178
Dung lượng	5,07 MB