Nghiên cứu thu nhận coenzyme q10 từ chủng agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp

MỞĐẦU Ubiquinone-10 hay Coenzyme Q10 (CoQ10), loại coenzymetham gia vào chuỗi vận chuyển điện tử prokaryote eukaryote CoQ10 có vaitrị quan trọng việc sản xuất ATP - nguồn lượng sinh học thể.CoQ10n g y c n g đ ợ c s d ụ n g n h i ề u l m n g u n t h ự c p h ẩ m c h ứ c n ă n g , g i ú p c ả i thiệnsứckhỏevàđượcđưavàocácmỹphẩmlàmđẹpnhưmộtchấtchốngoxyhóa,chống lão hóa; ứng dụng y tế nhằm ngăn ngừa ung thư, điều trị nhiều bệnh vềtimmạch,tiểuđường,Parkinson,tănghệthốngmiễn dịch,giảmhuyếtáp Với nhiều ứng dụng có lợi nên nhu cầu CoQ10 ngày tăng lên Đểđápứngnhucầuđóđãcónhiềugiảiphápđượcđưaranhưtổnghợphóahọc,bántổng hợp cơng nghệ sinh học Do CoQ10 cóc ấ u trúc phức tạp nên n a y CoQ10đượcsảnxuấtchủyếubằngconđườnglênmennhờvikhuẩnnhưAgrobacteriu mtumefaciens,Escherichia.coli,Sporobolomycessalmonicolor,Rhodobactersphaeroid es,Paracoccus denitrificans… A tumefacienslà vi khuẩn sử dụng để sản xuấtCoQ10 chúng có nhiều ưu điểm có hàm lượng CoQ10 tương đối caosovớicácvisinhvậtkhác,chỉtổnghợpCoQ10,mơitrườngniđơngiản,rẻtiền,phù hợp sản xuất quy mô công nghiệp Xuất phát từ sở lý luận thựctiễnnêutrênchúngtôitiếnhànhnghiêncứuđềtài:“NghiêncứuthunhậnCoenzymeQ 10 từchủngAgrobacteriumtumefacienstáitổhợp”  Mụctiêunghiêncứu - NghiêncứutạochủngA.tumefacienstáitổhợpsinhtổnghợpCoenzymeQ10 - NghiêncứuquytrìnhcơngnghệthunhậnCoenzymeQ10 - Ứngd ụ n g C o e n z y m e Q v o s ả n x u ấ t m ộ t s ố s ả n p h ẩ m t h ự c p h ẩ m c h ứ c  Nộidungnghiêncứu - Phânlập,tuyểnchọnchủngA.tumefacienssinhtổnghợpCoenzymeQ10 - NghiêncứutạochủngA.tumefacienstáitổhợpsinhtổnghợpCoenzymeQ10 - NghiêncứuthunhậnCoenzymeQ10vàxácđịnhđặctínhcủaCoenzymeQ10từchủ ngA.tumefacienstáitổhợp - KhảosátkhảnăngứngdụngcủaCoenzymeQ10trongsảnxuấtsảnphẩmthựcphẩmchứ c năngdướidạngviênnang  Nhữngđóng gópmới củaluậnán - Đãp h â n l ậ p v t u y ể n c h ọ n đ ợ c c h ủ n g A t u m e f a c i e n s T T s i n h t ổ n g h ợ p CoQ10cao - Đã tách dịng giải trình tự gendpsvàdxsmã hóa cho enzyme chìakhóa đường sinh tổng hợp CoQ10 từ chủngA t u m e f a c i e n s TT4 phânlập VN tạo chủngA tumefacienstái tổ hợp mang gen cho năngsuất sinhtổnghợpCoQ10cao - Xâydựngquytrìnhtách chiết CoQ10 từA.tumefaciens - Bước đầu ứng dụng Coenzyme Q10 sản xuất sản phẩm thực phẩm chứcnăngdướidạngviênnang  Bốcục củaluậnán - Luận án trình bày 123 trang: mở đầu (2t r a n g ) , t ổ n g q u a n t i l i ệ u (32 trang), vật liệu phương pháp nghiên cứu (20 trang), kết thảo luận(58 trang với 11 bảng, 50 hình), kết luận kiến nghị trang), danh mục cáccơngt r ì n h đ ã c ô n g b ố ( t r a n g ) v t i l i ệ u t h a m k o ( t r a n g v i t i l i ệ u tiếngViệtvà107tàiliệutiếngAnh) CHƢƠNG1.TỔNGQUAN 1.1 CấutạoCoenzymeQ10 1.2 NguồnthuCoenzymeQ10 1.2.1 Tổnghợphóahọc 1.2.2 CoenzymeQ10từđộngvật,thựcvật 1.2.3 CoenzymeQ10từvisinh vật 1.3.ConđườngtổnghợpCoenzyme Q10từvisinhvật 1.4 LênmensinhtổnghợpCoenzymeQ10từA.tumefaciens 1.4.1 Ảnhhưởng củanguồncacbon vànồngđộcacbon 1.4.2 Ảnhhưởng củanguồnnitơvà nồngđộnitơ 1.4.3 Ảnhhưởng củanguồnkhoáng 1.4.4 Ảnhhưởng củanhiệtđộ 1.4.5 ẢnhhưởngcủapH 1.4.6 Ảnhhưởng củanồngđộoxyhòa tan 1.5 KỹthuậtlênmensinhtổnghợpCoenzymeQ10 1.5.1 Lênmengiánđoạn 1.5.2 Lênmengián đoạncóbổsung dinhdưỡng (Fed–batch) 1.6 Táchchiếtvà đặctínhCoenzymeQ10 1.6.1 TáchchiếtCoenzymeQ10 1.6.2 TinhsạchCoenzymeQ10 1.6.3 ĐặctínhcủaCoenzymeQ10 1.7 Cải biếnchủngvisinhvậtsinhtổnghợpCoenzymeQ10 1.7.1 Độtbiếnchủng 1.7.2 Chủngtáitổhợp 1.8 VaitròvàứngdụngcủaCoenzymeQ10 1.8.1 VaitròcủaCoenzymeQ10 1.8.2 ỨngdụngcủaCoenzymeQ10 CHƢƠNG2.VẬTLIỆUVÀPHƢƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 2.1 VẬTLIỆU Các mẫu nốt sần hoa hồng thu thập từ Tây Tựu Mê Linh, Hà Nội.ChủngA.tumefaciensEHA105 từViện CôngnghệSinhhọc,VAST Cáccặp mồi đượcsửdụng trongnghiêncứu táchdịngvàbiểuhiện: Mồi xi (DpsF): 5’-ATAGAGCTCATTGCCGCGCAAGGCGTCAGTT3’;Mồingược(DpsR):5’-TTTGGATCCTCAGTTGAGACGCTCGATGCA-3’.Mồixi (DxsF):5’-TAAGGATCCACGCATAGAACAGGCCAAAC3’;Mồingược(DxsR):5’-ATTGTCGACTCAGCCGGCGAAACCGACGC-3’; Cặpmồi 16 Sđượcsửdụngtrong giải trình tự: Mồixi27F:5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’; Mồingược1492R:5’TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’ Cácp l a s m i d đ ợ c s d ụ n g t r o n g n g h i ê n c ứ u : p J e t / B l u n t ( T h e r m o S c i e n t i f i c , Mỹ),pCAMBIA1301(Viện CôngnghệSinhhọc,VAST.) 2.2 PHƢƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU - Phương pháp phân lập tuyển chọn chủngA tumefacienssinh tổng hợpCoQ10theoIslam(2010) - Ni cấychìmchủngA.tumefaciensDPXS12sinhtổnghợp CoenzymeQ10 - Tách chiết DNA tổng số,DNA plasmid từ vi khuẩn, khuếch đại gendps,dxs,16S kỹ thuật sốc nhiệt, biến nạp DNA plasmid vàoE Colibằng sốcnhiệt, theo SambrookvàRussel(2001) - Phương pháp biến nạp plasmid vàoA tumefaciensbằng phương pháp xungđiện - PhươngpháptáchchiếtCoQ10từA.tumefacienstheoRanadive(2011) - Xácđịnh hàmlượngCoQ10 phươngpháp Craven - Phươngphápphântích CoenzymeQ10 bằngHPLC - Phươngpháptạophứcβ-cyclodextrin -CoQ10 theoFirvàcộngsự(2009) - PhươngphápxácđịnhhoạttínhsinhhọccủaCoQ10theoFir(2009),Hisavàcộng sự(2014) - Phươngphápđiều chếviênnang cứngchứaCoQ10 - PhươngpháptốiưuhóađiềukiệnsinhtổnghợpCoQ10bằngquyhoạchbậch aitheo Box– Behnken - Phươngpháptinsinhhọc CHƢƠNG3.KẾTQUẢVÀTHẢOLUẬN 3.1 PHÂNLẬP,TUYỂNCHỌNA.TUMEFACIENSSINHTỔNGHỢPCOENZ YMEQ10 Kếtquảtừ13mẫunốtsầnkhácnhauthuthậptừvùngtrồnghoahồngMêLinhvà Tây Tựu -Hà Nội phân lập được12 chủng vi khuẩn môi trường chọn lọcMacConkey, bao gồm chủng từ nốt sần hoa hồng phường Tây Tựu, chủng từ nốtsần hoa hồng huyện Mê Linh Để chứng minh vi khuẩn phân lập làA.tumefaciens, chủng phân lập tiến hành sàng lọc dựa theo số đặc điểmhình thái,sinhlý,sinhhóavà sinhhọcphântử Kết từ 12 chủng phân lập sàng lọc chủng làA tumefaciens.Từ cácchủngphânlậptrênvà3chủngchuẩnA tumefacienstiến hành tuyển chọn thông quakhả sinh tổng hợp CoQ10 Kết cho thấy, chủng vi khuẩn TT4 có khả năngsinh tổng hợp CoQ10 cao (13 mg/l) sau 96 nuôi cấy so với chủng khác.Từ kết phân tích hình thái, sinh lý, sinh hóa sinh học phân tử chủng vikhuẩn phân lập TT4 định danh làA tumfaciensTT4 Chủng sửdụng chocácnghiêncứu tăngcườngsựsinhtổng hợpCoQ10 3.2 NGHIÊN CỨU CẢI BIẾNAGROBACTERIUM TUMEFACIENSSINHTỔNGHỢPCOENZYMEQ10 3.2.1 TáchdònggendpsvàdxstừA tumefaciensTT4 DNA tổng số tách chiết từ chủngA tumefaciensTT4 dùng làm khuôn đểkhuếch đại hai đoạn gendpsvàdxsmã hóa hai enzyme chìa khóa đường tổnghợpCoQ10làdecaprenyldiphosphatesynthasevà1-deoxy-D-xylulose5phosphate A synthase B dps M dxs Kb Kb -3,0 -2,0 1077bp -1,2 M 2100 bp -3,0 -2,0 -1,2 -0,5 -0,2 -0,5 Hình 3.1.Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A) dxs (B) từ DNA tổng số A.tumefaciensTT4 M,thang DNA chuẩn100bp(Thermo Scientific, Mỹ) Kết phổ điện di sản phẩm PCR cho thấy xuất băng DNA xấp xỉ 1,2kb (hình 3.1A) băng kích thước khoảng 2,1 kb (hình 3.1B) sử dụng cặpmồi DpsF/R DxsF/R tương ứng Kích thước sản phẩm PCR thu làhồn tồn phù hợp với kích thước hai đoạn gen đích cần khuếch đại Từ kết quảnày cho thấy hai đoạn gendpsvàdxsđã khuếch đại từ khuôn DNA tổng số củachủngA.tumefaciensTT4bằng kỹthuật PCR Sản phẩm PCR hai gendpsvàdxsđược xử lý enzyme Klenow gắnvào vector tách dòng pJET1.2/blunt (Thermo Scienctific, USA) Sản phẩm nối ghépđược biến nạp vàoE coliDH10b để chọn dòng mang vector tái tổ hợp Kết biếnnạp cho thấy xuất 10 khuẩn lạc mơi trường LB thạch chứa ampicilin(100 µg/ml) tương ứng với hai gendpsvàdxs Plasmid tách chiết từ nhữngkhuẩnlạcvàđượcsửdụngchosànglọcsơbộđểchọnramộtdịngtươngứngv ớimỗigenđểnghiêncứutiếptheo.Trướctiên,plasmidđượcsửdụnglàmkhnchophản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu gendpsvàdxstương ứng Kết cho thấyđều xuất băng sản phẩm PCR phổ diện di với kích thước phù hợp với kíchthước gendps(hình 3.2A) vàdxs(hình 3.2B) Kích thước sản phẩm PCR từkhn DNA plasmid tương đương với kích thước sản phẩm PCR từ khuôn DNA tổngsốcủachủngA tumefaciensTT4 ban đầu (hình 3.2) Kết nhận chứng tỏ haidịng lựa chọn mang gen đích tương ứng làdpsvàdxs Tuy nhiên, để chắnhơn DNA plasmid hai dòng tiếp tục xử lý bẳng enzyme hạn chếthích hợp A C3 TT4 M B C6 Kb TT4 M Kb -3,0 -2,0 1077bp -1,2 2100 bp -0,5 -3,0 -2,0 -1,2 -0,2 -0,5 Hình 3.2.Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A) dxs (B) từ DNA plasmid củacácdịngtáitổhợp.C3,C6làkhnDNAplasmidtáchchiếttừclonesố3vàsố6.TT4làkhn DNA tổng số tách chiết từchủng A tumefaciens TT4 Đường chạy M thang DNAchuẩn100bp(Thermo Scienctific, Mỹ) Theo thiết kế hai trình tự cắt enzyme hạn chếSacI vàBamHI đưa vàođầu 5’ cặp mồi DpsF/R tương tự trình tự cắt củaBamHI vàSalI đưa vàocặpmồiDxsF/R Kết xử lý enzyme cắt hạnc h ế c h o t h ấ y đ ố i v i c ả h a i clone văng băng DNA có kích thước tương ứng với kích thước gendpskhoảng 1077 bp (hình 3.3A) gendxskhoảng 2100 bp (hình 3.3B) Từ kết quảthu khẳng định hai dịng số dòng tái tổ hợp mang haigen đíchtươngứnglàdpsvàdxs A M B -3,0 -2,0 1077bp M Kb Kb 2100bp -3,0 -2,0 -1,2 -1,2 -0,5 -0,5 -0,2 -0,2 Hình 3.3.Phổ điện di sản phẩm cắt DNA plasmid enzyme hạn chế dòng số 3manggendps(A)vàdòng6manggendxs(B).Đườngchạy1,3làDNAplasmidchưacắt;đường chạy 2, DNA plamid cắt cặp enzyme SacI/BamHI BamHI/SalI tươngứngvới clone3 và6 Đường chạyM làthang DNA chuẩn100bp(Thermo Scienctific, Mỹ) Để kiểm tra trình tự khung đọc hai gen đíchdpsvàdxsđã tách dịnghai plasmid tái tổ hợp sử dụng làm khn cho phản ứng xác định trình tự Trìnhtự nuclecotide axit amin suy diễn gend p s vàdxsđã xác định Kết quảcho thấy gen tách dòng chứa khung đọc mở cho phép dịch mãt ổ n g h ợ p proteinnguyênvẹn 3.2.2 Tạocấutrúcbiểuhiệnmanggendpsvàdxs Trong nghiên cứu vector pCAMBIA1301 với kích thước 11837 bp sửdụng làm vector biểu phù hợp chủng chủA tumefaciens Hai gendpsvàdxssẽđược đưa độc lập đồng thời vào vector pCAMBIA1301 để tạo cấu trúc biểuhiệnpCAM-dps,pCAM-dxsvàpCAM-dps-dxs 3.2.2.1 Tạocấutrúcbiểuhiệnmanggendpsvàdxsđộclập Hai gend p s vàdxsđược cắt khỏi vector tách dòng hai cặp enzyme cắthạn chế tương ứng làSacI/BamHI vàBamHI/SalI Hai gendpsvàdxsthu đãđượcgắnvàovectorbiểuhiệnpCAMBIA1301đã đượcmởvòngbằngcặpenzy me Từ kết hình 3.11D cho thấy, thời gian lên men tăng hàm lượngCoQ10 sinh tổng hợp tăng Tuy nhiên hàm lượng CoQ10 thu từ 96giờđến144giờtăngkhôngđángkể,sau144giờhàmlượngCoQ10chỉtăng1,03% (tăng2,57mg/ L)sovới96giờlênmen.Từkếtquảthuđượcthờigian96giờđượclựachọnđểthunhậnCo Q10trongquá trìnhlênmen 80 60 CoQ10(mg/L) CoQ10(mg/L) 120 A 70 50 40 30 20 80 60 40 20 10 6.0 6.5 7.0 pH 7.5 8.0 B 120 100 80 60 40 20 20 0.050.1 CoQ10(mg/l) 140 CoQ10(mg/L) C 100 25 28 30 Nhiệtđộ(độC) 140 120 100 80 60 40 20 37 0.2 0.4 0.8 OD giống 1.2 1.6 2.0 D 24 48 72 96 120144 Thờigian(giờ) Hình3.11.ẢnhhưởngcủapHđầumơitrường(A),ODgiống(B),nhiệtđộnicấy(C),thờigian (D)đến lênmensinh tổng hợpCoQ10 từA tumefacienstái tổ hợp 3.4 TỐIƢUHÓAĐIỀUKIỆNLÊN MENSINHTỔNG HỢP CO Q 10 TỪA T UMEFACIENS 3.4.3.TốiƣuhóaqtrìnhsinhtổnghợpCoQ10 từA.tumefacienstái tổhợp Dựa sở khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến trình lên men sinhtổng hợp CoQ10từ A tumefacienstái tổ hợp, tiến hành xác định ảnh hưởng đồng thờicủa nồng độ đường sucrose (X1), nồng độ cao ngô (X2), nhiệt độ (X3) Kết đượcthểhiệntrênbảng3.3 Phương trình hồi quy biểu diễn hàm lượng CoQ10 mô tả ảnh hưởng yếutốđộc lậpvàcác mốitươngtácgiữa chúngđượcbiểudiễnnhưsau: Hàm lượng CoQ10= - 634,73 + 36,11.X1+ 32,92.X2+ 344,62.X3+ 4,2.X1X20,32.X1X3+3,66.X2X3–2,78.X12– 75,27.X22–81,98.X32 Bảng3.1.Matrận thựcnghiệmBox-Behnken bayếu tốvà hàmlượng CoQ10thuđược TN 10 11 12 13 14 15 16 17 Nồng độsucrose( %) 2,5 2,5 7,5 7,5 5,0 5,0 5,0 5,0 2,5 7,5 2,5 7,5 5,0 5,0 5,0 5.0 5.0 Nồng độ caongô(%) Nhiệt độ(oC) 0,5 1,5 0,5 1,5 0,5 1,5 0,5 1,5 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1.0 1.0 28 28 28 28 24 24 32 32 24 24 32 32 28 28 28 28 28 Hàm lượng CoQ10(mg/l) 82,885 78,048 90,872 107,285 93,571 85,433 93,571 109,518 78,912 101,791 95,831 105,901 127,177 124,478 126,506 126,58 125,35 Từkếtquảtrêndựavàophươngpháptốiưuhóatìmđượcđiềukiệnlênmentốiưunhất: nồng độ sucrose5%,nồngđộbộtcaongơ1%vànhiệtđộ28oC Khi đó,hàmlượng CoQ10đạtđược 127,18mg/l 3.5 NGHIÊNCỨUQUYTRÌNHTÁCHCHIẾTCOENZYMEQ10TỪCHỦNG A.TUMEFACIENSTÁITỔHỢP 3.5.1 Đánhgiácácphƣơngphápphávỡtếbào Hiệu phá vỡ tế bào ảnh hưởng lớn đến hiệu suất tách chiết CoQ10.Trong nghiên cứu màng tế bàoA tumefaciensđược phá vỡ bốn phươngpháp khác bao gồm siêu âm, xử lý axit HCl theo mô tả Tian, xử lýbằng ethanol theo mô tả Ranadive xử lý enzyme theo mô tả Zahiriakếthợpvới bước tách chiết.Kếtquảđược biểudiễntrênhình3.12 Kết cho thấy phương pháp xử lý tế bào ethanol cho hiệu thu nhậnCoQ10 cao so với phương pháp khác sử dụng Tương tự vikhuẩn Gram âm khác,A tumefacienscó chứa lớp màng màng ngồimỏng tác động ethanol làm tương tác kỵ nước màng bị yếuđidẫnđếncấutrúcmàngtếbàobịphávỡvàgiảiphóngcácthànhphầnnằmtrênmàng màng mơi trường Vì vậy, phương pháp xử lý tế bào ethanolđãđượclựachọnđểtiếptụcnghiêncứutốiưuvà sửdụngtrongcácnghiêncứutiếptheo 0.60 COQ10 (mg/g) 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 Siêu âm HCl EtOH Enzyme Phƣơngphápxửlýtếbào Hình3.12.Cácphươngpháp xử lýphávỡtếbào 3.5.2 Xácđịnhđiềukiệnxửlýtếbàobằngethanol 3.5.2.1 Xácđịnhtỷlệethanol/sinhkhối KếtquảchothấyhàmlượngCoQ10đượcchiếtxuấttănglênkhitỷl ệ ethanol/sinh khối tăng (hình 3.13A) Khi so sánh hàm lượng CoQ10 thu với cáctỷlệchiếtkhácnhauchothấytỷlệ10:1caohơn1,32lần(tươngđương24,3%) s ovới tỷ lệ 5:1, hàm lượng CoQ10 thu tỷ lệ 15:1 cao so vớitỷlệ10:1là1,08lần.Từkếtquảthuđượctỷlệethanol/sinhkhối(10ml/g)sẽđượcsử dụngđểtáchchiếtCoQ10trong nghiêncứutiếp theo 3.5.2.2 Xácđịnhthờigianđồnghóa Kết hình 3.13B cho thấy hàm lượng CoQ10 thu tăng lên thời gianđồng hóa tăng đạt cao thời gian phút Tuy nhiên thời gian đồng hóatăng tiếp hiệu thu hồi CoQ10 lại giảm Sự giảm tác động củasóng siêuâmtrongthờigian dàiđã làmpháhủycấutrúc CoQ10 3.5.2.3 Xácđịnhnhiệtđộxửlý Kết hình 3.13C cho thấy nhiệt độ ủ tăng lên hàm lượng CoQ10 thuđược tăng (1,15 1,17 lần 37 oC 60oC tương ứng so với điều kiện 25oC.Từ kết nhận được, thấy nhiệt độ 37 oC phù hợp để thực xửlýtế bàobằngethanol 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 A 0.8 CoQ10(mg/g) CoQ10(mg/g) Từc c k ế t q u ả t h u đư ợ c t r o n g n g h i ê n c ứ u n y , q u y t r ì n h t c h c h i ế t C o Q t sinh khốiA tumefaciensđã xác lập mô tả tóm tắt sau: trộnsinh khối vikhuẩn với ethanol 100% theo tỷ lệ 10:1 (v/w), đồng hóa siêu âm phút, ủ ởnhiệt độ 37oC giờ,l y t â m l o i b ỏ x c t ế b o , c h i ế t v i h e x a n e t h e o t ỷ l ệ : , cô đặc chânkhôngở45oC 5:1 10:1 15:1 Tỷlệethanol/sinhkhối(ml/g) 0.6 0.2 25 37 60 Nhiệtđộ(oC) 0.8 10 0.6 15 Thờig ian(p hút) 0.4 0.2 C CoQ10(mg/g) 0.4 B Hình3.13.Ảnhhưởngcủatỷlệethanol/ sinhkhối(A),thờigianđồnghóa(B),nhiệtđộxửlý(C)đếnhàm lượng CoQ10tách chiết từA tumefaciens tái tổ hợp 3.5.3 NghiêncứutinhsạchCoenzymeQ10 3.5.3.1 Đánhgiásosánhđộsạchcủadịchchiết CoenzymeQ10 CoQ10 thu theo quy trình phân tích định lượng hệ thốngHPLC với điều kiện sắc ký sau: Pha động A: Metanol 100% Pha động B:Ethanol 100% Cột C18 kích thước 250 mm x mm nhồi hạt với kích thước 5μm.Nhiệt độ cột 35m.Nhiệt độ cột 35oC, tốc độ dòng 0,5 ml/phút, thể tích tiêm 10 μm.Nhiệt độ cột 35l, detector UV – Vis tạibướcsóng275nm.Kết quảđược thểhiệntrênhình3.14A,3.14B A B Hình3.14 Phổ sắc kýHPLCcủa CoQ10 chuẩn (A)và dịchchiếttừA.tumefaciens táitổ hợp (B) Kết cho thấy với bước sóng hấp thụ cực đại CoQ10 (275 nm), thấyxuấthiệnmộtsốđỉnhphụrấtnhỏsovớiđỉnhchínhCoQ10trênphổsắckýHPLC SosánhvớiphổCoQ10chuẩncủahãngSigmacóthểthấyrằngdịchchiếtCoQ10làtương đốisạchkhisosánh ởbước sóng275nm Tuynhiên,trongdịchchiếtcịncóthểcóchứacáchợpchấtkháckhơnghấpt hụcựcđạitạibướcsóng275nm.Dođóđểđánhgiáđộsạch,dịchchiếtđượcphântích phương pháp qt phổ với bước sóng từ 200 – 800 nm so sánh vớiCoQ10 chuẩn Kết cho thấy phổ hấp phụ dịch chiết CoQ10 CoQ10 chuẩnđều xuất đỉnh hấp thụ cực đại bước sóng 275 nm, đỉnhCoQ10 Khi so sánh phổ hấp thụ so với dịch CoQ10 chuẩn chúng tơi thấy hồntồntươngtự.Tuynhiên,ngồiđỉnhchính(bướcsóng247–309)thìcườngđộhấp