TỔNGQUAN
Prebioticvàpecticoligosaccharide
Prebiotic là hợp chất hữu cơ thuộc nhóm carbohydrate mà cơ thể vật chủ không tiêuhóa đƣợc, chúng kích thích sự phát triển và hoạt động của vi khuẩn có lợi trong ruột. Nhƣvậy,nhờcóprebioticmàvisinhvậthữuíchcóđiềukiệnpháttriểnmạnhmẽhơn,dođócảit hiện hệtiêu hóachovật chủ [42].
Hiện nay, nhu cầu sử dụng prebiotic tăng dần theo từng năm dẫn tới sự phát triểnmạnhmẽsốlƣợngcôngtysảnxuấtcácchếphẩmprebioticsvànghiêncứusảnxuấtcácthếhệ prebiotic mới Năm 2006 trên thị trường thế giới chỉ có 160 sản phẩm prebiotic nhưnghiện nay đã có hơn 400 loại từ hơn 20 công ty sản xuất Sản lƣợng prebiotic trên toàn thếgiớiđạt 167 triệu tấn năm 2008 [10].
Theo báo cáo của các nhà phân tích, thị trường dành cho prebiotic ở Châu Âu vàMỹ dự kiến đạt 1,17 tỷ và 225,31 triệu USD tương ứng vào năm 2015 [135] Nhu cầuprebiotic trên toàn thế giới ước đạt 4,5 tỷ USD trong năm 2018 và tốc độ tăng trưởng đạt11,4% từ năm 2012 đến 2018 [122] Trong khi thị trường châu Âu thúc đẩy ứng dụngprebiotic vào lĩnh vực mới như thịt và các sản phẩm ăn nhẹ, thị trường Mỹ tiếp tục thúcđẩy sản xuất loại prebiotic có nguồn gốc fructans, vì đó là phân khúc sản phẩm lớn nhấttrongthị trườngprebioticcủaMỹ[135].
Báo cáo của GIA cũng dự đoán nhu cầu prebiotic bổ sung vào thực phẩm và đồuống dự kiếns ẽ đ ạ t 3 , 7 t ỷ U S D t r o n g n ă m 2 0 1 8 [ 1 2 2 ] B ổ s u n g p r e b i o t i c v à o s ữ a c ô n g thức cho trẻ sơ sinh cũng là một hướng phát triển mạnh. Phân tích cho thấy rằng thị trườngsữa công thức cho trẻ sơ sinh được dự kiến sẽ tăng trưởng với tốc độ 11,3% từ năm 2012đến
2018 Các ứng dụng mới nhất của prebiotic trong lĩnh vực thức ăn chăn nuôi đã trởthànhmộtthịtrườngsinhlợicao.Nhucầuprebioticchocácứngdụngthứcănchănnuôidựki ến sẽvƣợt qua70.000tấn vàonăm 2018[122].
Việcnghiêncứupháthiện,đánhgiávàthươngmạihóacácsảnphẩmmớicónhữngthuộc tính ưu việt nhƣ khả năng điều biến hệ vi sinh vật cao, giảm nguy cơ ung thƣ ruộthiệu quả đang giành đƣợc sự quan tâm ngày một tăng của cả giới khoa học lẫn giới doanhnghiệp.Xylooligosaccharide(XOS),soyaoligosaccharide(SOS)vàP e c t i c oligosacchar ides(POS) lànhữngví dụ đại diệncho cácdòngsản phẩm dạngnày. Ở Việt Nam, trong những năm gần đây đã có một số cơ sở trong nước nghiên cứu vàđƣa vào sản xuất một số sản phẩm prebiotic Tại Viện Công nghiệp thực phẩm, Trịnh ThịKimVânvàNguyễnHoàngAnhđãthựchiệncácđềtàinghiêncứusảnxuấtfructooligosaccharide (FOS) bằng enzyme để ứng dụng sản xuất một số thực phẩm chứcnăng [6].Lê ThịH ồ n g Á n h ( Đ ạ i h ọ c B á c h K h o a T h à n h p h ố H ồ C h í M i n h ) c ũ n g đ ã á p dụng kỹ thuật lọc pha loãng với màng lọc DS-5-DL đển â n g c a o đ ộ t i n h k h i ế t c ủ a s ả n phẩm FOS [4] Nguyễn Thị Vân Anh đã nghiên cứu ứng dụng endoxylanase để sản xuấtarabinoxylan từ cám gạo làm thực phẩm chức năng [5] Nhóm nghiên cứu của Viện Côngnghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã sử dụngendo-1,4-β-mannosidase từAspergillus nigerBK01 để thủy phân bã cơm dừa, thu chếphẩm đường chức năng Mannooligosaccharide (MOS) ứng dụng cho sản xuất thực phẩmchứcnăng[1].Vớicácđặctínhưuviệtcủaenzymetáitổhợp,cùnghiệusuấtbiểuhiệ ncao, quá trình ứng dụng enzyme tái tổ hợp này trong sản xuất chế phẩm MOS cao độ đãđƣợcnghiêncứu bổsung vàothứcăn nuôitôm[2]….
Hình1.1 Sốcơ sởsản xuất(A)vàsố lượng sảnphẩmprebioticởViệtNam(B)[3]
Tuy nhiên với nhu cầu trong nước ngày một gia tăng, sản lượng và chủng loạiprebiotic không đủ cung cấp cho thị trường [3] Do đó, việc nghiên cứu các sản phẩm mớikhông chỉ để cung cấp dinh dƣỡng thiết yếu mà còn có thể đồng thời phòng chống bệnh tậtđượckhuyếnkhíchvàtăngcường.
Pectic oligosaccharide là các oligosaccharide có nguồn gốc từ pectin, cấu tạo từ 2 -10 đơn phân D - Galacturonic acid nối với nhau bằng liên kết α (1 - 4) glucoside (hình 1.1)[93].
POS có phân tử lƣợng không lớn lắm và chúng có một số tính chất của một acidhữu cơ Chúng dễ tan trong nước và khi thủy phân giải phóng các đơn phân galacturonicacidv à o l i g o s a c c h a r i d e m ạ c h n g ắ n h ơ n P O S m a n g đ i ệ n t í c h â m , c ó đ ộ n h ớ t t h ấ p v à í t nănglƣợng.
Một số nghiên cứu về hoạt tính sinh học cho thấy POS có tính chất của mộtprebioticnhư:đượclên menchọnlọcbởivi sinhvậtcólợiđườngruộtvà sảnphẩmcủasựlênmennàycóảnhhưởngtíchcựcđốivớisứckhỏecủavậtchủ[51].
Theo Olano-Martin E và cộng sự, POS có khả năng kích thích sự tăng sinh của vikhuẩnBifidobacterium lactis, B infantis, B pseudolongum, B adolescentis,
Lactobacilluscasei shirota, L acidophilus, L casei subsp cremoirisLC5, làm giảm sự phát triển của vikhuẩnBacteroides distasonis, B ovatus, B fragilis, Clostridium perfringens,
EnterococcusfaecalisvàứcchếsựsinhtrưởngcủaBacteroidesthetaiotaomincrom,Clostridiumra mosum, C inocuum[92] POS kích thước nhỏ (DP2%) sẽ ức chế sựtổng hợp cảm ứng PG Cũng cần lưu ý rằng tỷ lệ giữa pectin và carbohydrate cũng có ýnghĩa,đặcbiệtlàcáctỷlệ1:2,3:2và4:2thườngcótácdụngtốtchosựsinhtrưởngcủa
Nitơ cũngcó vai tròrấtq u a n t r ọ n g t r o n g s ự s i n h t ổ n g h ợ p E P G b ở i v i s i n h v ậ t Nguồnnitơvôcơchủyếudướidạngmuốinitratevàmuốiamonium.ĐốivớiA.nigersử dụng sulphate amonia là hiệu quả hơn cả Khi sử dụng nguồn nitơ này, dịch canh trường bịacid hóa đến pH 2,5 -3,0 ỞpH nàycó sựtích lũyEPG tốt hơn [13].
Tuy nhiên, muối nitrate của kim loại kiềm sẽ ức chế sự tổng hợp EPG Khi sinhtrưởng trên môi trường có thêm muối nitrate của kim loại kiềm sẽ làm pH tăng 5,5 - 5,8nênkhảnăngtiêu thụ nitơ nitrate củaA nigersẽgiảm [87].
Các dạng nitơ hữu cơ (dịch whey, pepton, cám…) phối hợp với nguồn nito vô cơ cótác dụng tốt đến sự tổng hợp EPG [100] Trong môi trường có muối amonium sulphate ảnhhưởng đến sự tổng hợp EPG của chủngA nigercó thể tăng từ 7 - 10% Tỷ lệ tối thích giữaCvàN cho sựtổnghợp enzymenằm tronggiới hạn 7:1 đến 13:1 [87].
1.3.2.3 Ảnhhưởng của cácyếu tố khác
Các nguyên tố vô cơ có ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp EPG bởiA nigermà trướctiênlàtrạngtháisinhlýcủaA.niger.Nóichunghàmlượngphosphotrongmôitrườngphảikhông được ít hơn 8 - 10 mg Khi sử dụng nguồn nitơ của phosphate diamonium thì nhucầu về phosphor củaA nigerhoàn toàn đƣợc thỏa mãn Môi trường tổng hợp EPG có tỷ lệtối ưu giữa nitơ và carbon, pectin và carbohydrate bã củ cải là 3 - 4%, bột ngô 0,5%,(NH4)2HP040,7%, MgS040,05%[106].
CácyếutốkhácnhưpHcủamôitrườngdinhdưỡng,phươngphápnuôicấy,nhiệtđộ,thờigiannuôicấy vàđiềukiệnnuôicấy,…đềucóảnhhưởngđếnsựtổnghợpEPG[133].
Sự sinh trưởng cực đại củaA nigervà sự tổng hợp polygalacturonase diễn ra ở điềukiệnnhiệt độ 30 o C, trong 2 -5 ngày, còn polymethylesterasetrong5-7 ngày[81,133].
1.3.3 Độtbiếncảitạochủng Để nâng cao khả năng sinh tổng hợp EPG kỹ thuật đột biến bằng hóa chất N-methyl- N’-nitro-N-nitrosoguanidine(NTG)vàtiacựctím(UV)thườngđượcsửdụng.
Antier P và cộng sự đã tiến hành đột biếnA nigerbằng UV để thu đƣợc pectinasecó kiểu hình kháng deoxyglucose Sử dụng môi trường có nồng độ ethylene glycol khácnhau, độ ẩm thấp, giúp phân lập đƣợc các thểđột biến có khả năng sản xuất pectinase trêncác môi trường rắn, độ ẩm thấp, như vỏ cà phê [14] Loera O và Viniegra - González sửdụng kỹ thuật phân tíchhìnhả n h đ á n h g i á s ự p h á t t r i ể n c ủ a s ợ i n ấ m đ ể t h u đ ƣ ợ c c á c t h ể đột biến liên quan đến tốc độ tăng trưởng và khả năng tổng hợp pectinase Họ nhận thấymộtsốthểA.niger độtbiếnquasinh sảnhữutính cókhảnăng sinhtổng hợppectina setănggấpđôisovớicácchủnggốc[71].Vìvậy,chọnlọccácthểđộtbiếnkhángdeoxyglucosevàtáitổh ợpquasinhsảnhữutính,cùngvớiphântíchhìnhảnhcáckhuẩnlạclàmộtphươngpháphiệuquảđ ểtăngcườngkhảnăngsảnxuấtpectinase.
Nghiên cứu đột biếnA nigercó khả năng sản xuất pectinase cao và sử dụng hiệuquả phế phẩm nông nghiệp là hướng nghiên cứu được rất nhiều nhà khoa học quan tâm.Uzoma O.A và cộng sựđã tiến hành đột biến chủngA.nigerbằng UVv à c h ọ n l ọ c t r ê n môitrườngchứa2deoxyDglucoseđãthuđượcchủngcókhảnăngtổnghợppectinasecaonhấttron gmôitrườngcámlúamì(348,54 IU/mgprotein).Chủngđộtbiến nàycókhảnăngsản xuất pectinase cao hơn chủng gốc trong cả phương thức lên men rắn (SSF) và chìm(SMF)tươngứng465%và230%[123].
Cải thiện di truyền để nâng cao khả năng sản xuất pectinase bằng các kỹ thuật độtbiến và dung hợp tế bào trần cũng đã đƣợc thực hiện thành công Cao J.W và cộng sự đãdùng giá trị P/C (tỷ lệ đường kính của vòng thủy phân (P) với đường kính của khuẩn lạc(C)) trên đĩa pettri để xác định các thể đột biến siêu tổng hợp pectinase Tác giả đã sử dụngrifampinđểcôlậpcácđộtbiếntựphát củaBacillussp.NTT33vàthuđƣợc haithểđộtbiếncó khảnăngtổnghợp polygalacturonasecao hơn chủngtựnhiên 82,4% [23].
Hadj – Taieb N và cộng sự thực hiện đột biếnPenicillium occitanisbằng acid nitơ,thu đƣợc chủng có khả năng sản xuất endo và exo polygalacturonase cao hơn 15 lần [45].Cũng trên chủng này Jain S và cộng sự đã tiến hành đột biến với N-methyl- N - nitro -N- nitrosoguanidine (NTG), ethyl methane sulphonate và UV đã thu đƣợc các chủng có khảnăngtổnghợp cellulase vàpectinasecao hơnchủnggốc[55].
Dung hợp tế bào trần cũng được sử dụng để tạo chủng lai có khả năng tăng cườngsản xuất polygalacturonase Một dạng lai thu đƣợc sau khi dung hợp tế bào đột biếnAspergillussp.CH-Y-
1043vàA.flavipesATCC16.795cókhảnăngsảnxuấtendopolygalacturonase cao hơn 1,5 lần, trong khi khả năng sản xuất exopolygalacturonasechỉ tương tự như chủng gốcAspergillussp.
[105] Thể dung hợp củaA nigervàA.carbonariuscũng có khả năng sản xuất pectinase cao hơn 6 lần và phát triển tốt trên môitrườnglênmenrắnvớicámlúamìlànguồndinh dưỡngduynhất [100].
Cải biến chủngA nigerbằng UV để nâng cao khả năng sinh tổng hợp EPG trải qua3 giai đoạn:gây đột biến ngẫu nhiên bằng UV,tuyểnc h ọ n c h ủ n g c ó k h ả n ă n g s i n h t ổ n g hợpEPG cao vàđánhgiásựổn định củachủngđột biến quacáclần cấytruyền.
Nghiên cứu thu nhận pecticoligosaccharide(POS)
Pectic oligosaccharide là một prebiotic có nguồn gốc từ pectin Hiện nay có một sốphương pháp sản xuất POS bao gồm: tách chiết từ thực vật [34], tổng hợp và phân cắtpectin tạoPOS [25].
Việc chuyển hóa nguồn cơ chất pectin bởi các chủng vi sinh vật hoặc các chế phẩmpectinase hiện đang đƣợc coi là những quá trình sinh học có nhiều hứa hẹn bởi chúng chophépthuđƣợcnhữngoligosaccharidemongmuốnvàkhôngtạosảnphẩmphụ.
Bên cạnh đó, enzyme hoạt động trong điều kiện êm dịu, thân thiện với môi trường,cường lực xúc tác của enzyme mạnh,… nên thủy phân giới hạn pectin bằng enzyme làphươngphápđơngiản,hiệuquảvàkhắcphụcđượcnhượcđiểmcủaphươngphápvậtlývàhóahọc.Cơchấ tpectincóthểđƣợcchuyểnhóathànhPOSnhờendopolygalacturonase[15,26,29,75,78,91,92].
QuytrìnhchungđểsảnxuấtPOStheophươngphápthủyphân giớihạnnhƣhình1.9.Vớimỗicôngđoạnđềuphải khảo sát,lựachọn các thôngsốkỹthuậtph ùhợpđảmbảo hiệuquảcaovàđạtchấtlƣợngnhƣmongmuốn.
(Nồng độ pectin, enzyme, pH, to, thời gian)
Tách tinh sạch, cô đặc
(ly tâm, kết tủa, sắc kí, lọc màng)
(sấy, bao gói, bảo quản)
Hình1.9 Sơ đồquitrìnhchung sảnxuấtPOS bằng pectinase Nguyên liệu đầu : Mục đích của quá trình xử lí hoặc loại bỏ các đường tan có trongnguyên liệu hoặc khử gốc methyl nhằm làm tăng tốc độ phản ứng của quá trình thủy phântiếp theo hay cải thiện thuộc tính sinh học cho sản phẩm Nguồn enzyme cũng đƣợc lựachọntheocáctiêuchínhƣtínhđặchiệu,điềukiệnhoạtđộng,giá cả…
Thủy phân giới hạn pectin : công đoạn này đóng vai trò quyết định hiệu suất quátrình và chất lƣợng sản phẩm hơn cả, chúng phụ thuộc vào các điều kiện thủy phân nhƣnhiệt độ, pH, thời gian phản ứng, tỷ lệ enzyme/cơ chất, nồng độ cơ chất, vận tốc khuấy haysựphối trộn cácloạienzymethủyphâncơ chất [22]
Cô đặc,tinh sạchvàhoànthiệnsảnphẩm:lànhữngcôngđoạnthôngthườngchohầuhết cácqui trình sảnxuất cácdạngsản phẩmoligosaccharide[15,25,66].
Cho tới nay, đã có khá nhiều công trình nghiên cứu đã đƣợc công bố về các điềukiệnthủyphângiới hạn pectin tạo POS.
SabajanesM.M.vàcộngsựdướicácđiềukiệnlựachọn(37 o C,pH5)thủyphânpecti n từvỏcam sau 20giờ thu đƣợc13 kg POS/100 kg nguyên liệu(hiệusuất 13%)[112]. Nhóm nghiên cứu của Concha J và cộng sự cũng đã tiến hành nghiên cứu chiết rútpectintừbãcủcảiđường đểsản xuấtPOS[29].
Nikolic M.V và cộng sự thủy phân pectin táo ở điều kiện (1% pectin, enzyme 162U/l, pH 4,5, 50 o C) sau 12 giờ đạt hiệu suất thủy phân khoảng 29% với dạng trimer chiếm28,4%. Trong đó giá trị pH tối ƣu của polygalacturonase đƣợc sử dụng là 4,5 nằm trongkhoảngpHtốiưuđã khảosátlà3,8 –
Trên nguồn cơ chất pectin củ cải đường Martinez M và cộng sự đã thí nghiệm trênmô hình tối ƣu cho thấy sử dụng hỗn hợp polygalacturonase 10 U/g pectin, cellulase 0,725U/ gtrong12,8giờtừ100kgpectinthuđƣợc26,7kgoligosaccharide[78,79].
Trong sáng chế châu Âu số EP 0 868 854 A2 các nhà nghiên cứu đã thủy phân dịchpectin3%lầnlƣợtvới3loạienzyme:polygalacturonase,polygalacturonatelyasevàpectinesterase thu đƣợc hỗn hợp cácpectic oligosaccharide với mức độ trùng hợp nằmtrongkhoảngtừ2 đến 10đạt hiệu suất gần 67%[22].
ComboA M M v à c ộ n g s ự đ ã t i ế n h à n h t h ủ y p h â n 0 , 2 % p o l y g a l a c t u r o n i c a c i d bằng endopolygalacturonase trong 2giờ ở40 o C tại pH 5,5, thu đƣợc cáco l i g o s a c c h a r i d e có hàm lƣợng DP 3> DP 2> DP 1 lần lƣợt là 58%, 18% và 13% Tác giả cũng đã tiến hành thử nghiệm với sáu loại enzyme thương phẩm (Endopolygalacturonase M2, Pectinase,Viscozyme L, Pectinex Ultra SP-L, Pectinase 62L vàMacer8 FJ) để thủy phân pectin tạoPOS Kết quả phân tích dịch thủy phân bằng sắc kí trao đổi anion với detector điện hóa(HPEAC-PAD) cho thấy cả sáu chế phẩm đều tạo ra các oligogalacturonic với các mức độtrùng hợp khác nhau và endopolygalacturonase M2cho hiệu suất tạo POS cao nhất 76%[26].
Các mảnholigogalacturonic cóDP